herramientas analiticas - cromatografia liquidos.pptx

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BT2008Diagnós.coMolecular1

HerramientasAnalí.cas–Cromatogra>adeLíquidos

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Cromatogra>a‐Historia  MikhailSemenovichTsweH(1872‐1919)trabajóenlaseparacióndefragmentos(clorofilaycarotenoides)  En1903publicó“Onanewcategoryofadsorp.onphenomenaandtheirapplica.ontobiochemicalanalysis”

  En1906reportóhaberseparadoloscons.tuyentesdelashojaspasándolosporunacolumnadecarbonatodecalcio,aluminaysucrosa.

  Acuñolapalabra“Cromatography”depalabrasgriegasindicando“color”y“escritura”

  Trabajosolvidados

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Cromatogra>a‐Historia  “Forprac.calpurposes,chromatographybeganwiththeBri.shbiochemist,A.J.P.Mar.n,intheearly1940s.ApparentlyMar.nhadmadesomenoteswithafountainpenonapapernapkin.Whensomespilledteawetacornerofthenapkin,itspreadacrossthepaper,someofthecoloreddyesintheinkmovedwithitandMar.ndiscoveredpaperchromatography.Healsorediscoveredcolumnchromatography(apparentlyindependently).Theartiss.llprogressing.”

hHp://www.dyerlabs.com/chemistry/chromatography.html

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Cromatogra>a‐Principios  Laideaesqueelanalito“interaccione”condiferentessolventesomatricesyqueexistaunaaHracciónoretencióndiferencial

  Sielanalito“interacciona”igual,laseparaciónnoesposible

Analy.calChemistry,GaryD.Chris.an,Wiley

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Cromatogra>aesunatécnicadeSeparación1.  Con.ene2solventesinmiscibles,se

agregaelanalitoysemezclan.Enequilibrioelanalitosedistribuyeenlafasedondesedisolvióoretuvomejor.

  Extracción

2.  Pordistribucióndesuscomponentesendosfases,unaquesemueveyotraqueestáestacionaria(.picamenteunacolumna)

hHp://zyklon1985.blogspot.com/2007_06_01_archive.html Modernanaly.calchemistry(HarveyD.)(MGH,2000)

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Cromatogra>aesunatécnicadeSeparación1.  Con.ene2solventesinmiscibles,se

agregaelanalitoysemezclan.Enequilibrioelanalitosedistribuyeenlafasedondesedisolvióoretuvomejor.

  Extracción

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Cromatogra>ade2fases–EjemploDNA

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2Fases

Modernanaly.calchemistry(HarveyD.)

“MasA,menospuro”

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2Fases

Modernanaly.calchemistry(HarveyD.)

“MasPuro,menosA”

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Cromatogra>aesunatécnicadeSeparación1.  …


Analy.calChemistry,GaryD.Chris.an,Wiley

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Cromatogra>aesunatécnicadeSeparación1.  …


Modernanaly.calchemistry(HarveyD.)(MGH,2000)

(2)

(a)(b) (c) (d)

(e)Cromatograma

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Cromatogra>a–TiempodeRetención  Tiempoderetención:.empodesdela

inyecciónhastalaeluciónmáxima

  Tiemponulo(void.me):Tiempohastaleprimeraelución

  Volumenderetención:volumendefasemóbilnecesarioparahacerqueelanalitoeluya

  Anchobase(baselinewidth)w:rangode.empoenelquesedetectaelanalito

  Volumennulo:Volumendefasehastalaprimeraelución


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Cromatogra>a‐Resolución  Elobje.vodecromatogra>aessepararcomponentesdeunamuestra.

  Resoluciónesunamedidacuan.ta.vadelgradoocalidaddelaseparaciónentre2picos


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Cromatogra>a–FactordeCapacidad

M‐mobile,S‐Sta.onary

CoeficientedeDistribuciónoPar.ción CapacityFactor

FácilmenteMedible


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Cromatogra>a–FactordeSelec.vidad  FactordeSelec.vidad:Relacióndelosfactoresdecapacidadde2analitos


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Cromatogra>a–EficienciadelaColumna  SeccionesCromatográficasTeóricas(Theore.calPlates)esunamedidadelaeficienciadelacolumna.

(aprox)


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Cromatogra>a‐Resolución


Incrementoeneficienciadelacolumna

IncrementoenSelec.vidaddelacolumna

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Cromatogra>a–ClasificacióndeTécnicas  Absorción,Par.ción,IntercambioIónico,ExclusióndeTamaño,Electroforésis

Modernanaly.calchemistry(HarveyD.)(MGH,2000)Analy.calChemistry,GaryD.Chris.an,Wiley

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Cromatogra>adeAbsorción  Elanalito/solutoes“absorbido”enlasuperficie

  Separaciónpordiferentescapacidadesdeabsorción

hHp://www.rensselaer.org/dept/chem‐eng/Biotech‐Environ/CHROMO/be_types.htm

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Cromatogra>adePar.ción  Elanalito/solutoesretenidoenunsoportesólido–superficiedeunapelículadelgada‐


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Cromatogra>a–Par.ción/Absorción(eje.enpapel)

hHp://commons.wikimedia.org/wiki/Category:ChromatographyhHp://liston.50megs.com/unit3.html

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Cromatogra>adeIntercambioIónico  Usaunaresina(soportesólido)conca.onesoanionesunidoscovalentemente

  Algunossonatrapadosporlascargasmientrasotrosno


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Cromatogra>adeExclusióndeTamaños  Gelesporosossonusadoscomoelsoportesólido

  Grandessolutosnopenetranfácilmentelosporos,lospequeñospasanlibremente

  Enelectroforésis,nohayfasemóbilsinoqueseusauncampoeléctricoparaproducirelmovimiento.

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Cromatogra>adeAfinidad  Eselmasselec.vo

  Usainteracciónespecíficaentredos.posdemoléculas

  Elsoportesólidoque.eneunidos(covalentemente)lasmoléculasque“atrapan”  P.Ej.An.cuerpos

  Unavezatrapados,lasmoleculasatrapadassepuedeneluirusandounasoluciónespecialque“cancela”lainteracción(cambiodepH,iones,etc).

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(Chem)HandbookofInstrumentalTechniquesforAnaly.calChemistry‐SeHle‐Pren.ceHall

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Cromatogra>adeLíquidos‐HPLC  High‐PerformanceLiquidChromatography

  Cromatogra>aengeneralesbasadaenunfenómenodedifusiónelcualesmuylento

  Seusaunabombaparainyectarlafásemóvil

  Paralograrrapidez:  Elempacadodelacolumnadebeserfinoyaltameneesféricoparaqueseadensoyregular

  Lafaselíquidaestacionariadebeserunapelículadelgadauniforme

  Muchascolumnascomercialescumplenestascarácterís.cas

  UnadelasprimerasmasexitosasesZipaxdeDuPontconporosidadcontrolable

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