Hemostasis

y

Coagulacin

Departamento de

Bioqumica y

Departamento de

Inmunobiologa

2013

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Discusin grupal sobre HEMOSTASIS PRIMARIA

1.- Mediante la evaluacin de los cambios en la transmitancia de la luz, es posible evaluar la dinmica de la agregacin plaquetaria en un plasma rico en plaquetas (PRP). Ante la adicin de un estmulo agonista, las plaquetas agregan y la transmitancia aumenta. A continuacin se muestran los resultados obtenidos utilizando dos agonistas plaquetarios fisiolgicos a tres concentraciones diferentes cada uno: colgeno (figuras A, B y C) y ADP (figuras D, E y F). A B C

D E F

Cul es el inters biolgico de los agonistas utilizados para este estudio? De acuerdo con estos resultados, sera correcto afirmar que para ambos agonistas la agregacin plaquetaria es dependiente de la concentracin utilizada? Se puede concluir que el colgeno es un agonista plaquetario ms potente que el ADP? Se observaron situaciones de agregacin plaquetaria irreversible? Si se evala la presencia de receptores gpIIb/IIIa de alta afinidad en la superficie plaquetaria, en qu muestras no seran detectables? Empleando anticuerpos anti-trombospondina, podramos detectar su presencia en la superficie de algunas de las plaquetas estudiadas? Qu significado tiene su presencia? Si se detecta la trombospondina en el exterior de la plaqueta, se puede afirmar que ya se sintetiz tromboxano A2 por parte de la misma? Puede modificarse el resultado de estos estudios si se adiciona previamente factor de von Willebrand al medio?

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2.- El siguiente es un esquema sobre la formacin de tromboxano A2 (Tx A2): ____________________

Fosfolipasa A2 ____________________

Ciclo-oxigenasa ____________________

Tromboxano-sintetasa ____________________ a) Indique a que sustancias corresponden los espacios libres. b) En qu tipos celulares se desarrolla esta va metablica? c) Es posible que la presencia de calcio inico influya sobre la actividad cataltica de alguna de estas enzimas? En caso afirmativo, indique como repercute sobre la actividad de la va. d) Cul es la regulacin fisiolgica de la formacin de Tx A2? e) Existen posibilidades de regulacin farmacolgica? 3.- La prostaciclina ( PG I2) es un antiagregador plaquetario. a) Cmo y dnde es producida? b) Cmo explica a nivel molecular su accin como antiagregador plaquetario? c) Es posible que algn inhibidor farmacolgico de la sntesis de Tx A2 afecte tambin la formacin de prostaciclina? Discuta su significado en la regulacin de la hemostasis. 4.- Un individuo tiene un trastorno de la hemostasis caracterizado por: - tiempo de sangra aumentado - en el PRP no se observa aglutinacin en presencia de ristocetina - las plaquetas aglutinan cuando al PRP se le adiciona plasma fresco de un individuo normal. Indique lo correcto sobre el individuo estudiado: a) las plaquetas poseen la glicoprotena Ib.

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b) carece de los receptores plaquetarios para el fibringeno. c) tiene hemofilia. d) tiene afectada la hemostasis primaria. e) tiene una deficiencia (cuantitativa o cualitativa) en el factor de von Willebrand. Luego de cumplida la primera etapa de diagnstico, se efectu la dosificacin del factor de von Willebrand (VWF) en el plasma, observndose que el paciente presentaba valores dentro del rango de normalidad. Ante ello se efectu un estudio de electroforesis de baja resolucin, para evaluar la presencia de agregados del VWF. Los resultados obtenidos se muestran en la figura. En el carril 1 se encuentra la muestra del plasma del paciente en estudio; en el carril 2 el plasma de un paciente heterocigoto para una deficiencia cualitativa del VWF; el carril 3 corresponde al VWF normal recombinante; mientras que en el carril 4 se estudi un "pool" de plasma proveniente de individuos controles sanos. Ante el resultado obtenido en la electroforesis, qu opina en relacin al diagnstico del paciente en estudio? Cul es la base molecular de la enfermedad que presenta? 5.- El cido acetilsaliclico ha demostrado un significativo efecto protector en la prevencin secundaria de un accidente isqumico. Ello ha alentado la profundizacin en las lneas de investigacin orientadas al desarrollo de agentes con selectiva actividad anti-plaquetaria. Qu molculas podran constituirse en buenos blancos teraputicos al respecto? Qu estrategias utilizara para actuar sobre ellas?

1 2 3 4

+

-

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6- Una molcula que participa en la hemostasis se caracteriza por:

- Poder unirse a la superficie plaquetaria - Favorecer el desarrollo de la hemostasis. - No ser una enzima. Indique lo correcto: a) Puede ser el factor de von Willebrand. b) Puede ser el fibringeno. c) Puede ser la trombospondina. d) Puede ser el colgeno. e) Puede ser el ADP.

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Discusin grupal sobre COAGULACIN, FIBRINOLISIS, ENDOTELIO

1.- El correcto uso de los anticoagulantes es de fundamental importancia mdica, tanto para obtener muestras de sangre en condiciones apropiadas para estudios de diagnstico, como para su administracin con fines teraputicos a determinados pacientes. A continuacin se indican una serie de sustancias. Indique cules son apropiadas para uso in vitro, cules para uso in vivo, fundamentando la respuesta en base al mecanismo de accin de cada una.

Sustancia Uso in vitro Uso in vivo Mecanismo de accin Heparina Warfarina Ac. acetilsaliclico Prostaciclina EDTA Cmo funciona el sistema anticoagulante de la protena C activa? Su activacin es factible para mantener la sangre anticoagulada in vitro? Por qu? 2.- Existe una variante del factor V de la coagulacin, conocida como factor VLeiden, cuya evaluacin es de inters biomdico. A continuacin se muestran una serie de experimentos realizados a los efectos de comparar la funcionalidad del factor V y del factor VLeiden para la formacin de trombina (Van 't Veer, C. et al. J. Biol. Chem. 272:20721-20729,1997). Se accede a la versin completa del trabajo en la direccin: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=9252393. La muestra de "plasma sinttico" contena las concentraciones normales de los factores de la coagulacin. La reaccin se desencaden mediante activacin de la va extrnseca, con la adicin de factor tisular. La composicin de cada una de las muestras evaluadas fue la siguiente:

N Factor V Factor VLeiden Protena C Trombomod. Protena S 1 + 2 + 3 + + + + 4 + + + 5 + + + + 6 + + +

Los resultados obtenidos se expresan en la figura siguiente

Puede afirmarse que el factor V y el factor Vprocoagulantes, favoreciendo la Cul es la mayor diferencia funcional entre el factor V y el factor V Cul sera la diferencia a nivel molecular entre el factor V y el factor Vexplicar el comportamiento observado? Qu hara usted para demostrar lo que plantea al respecto? En el artculo publicado por Van 't Veer, y cols. existe algn otro resultado que aporte informacin al respecto? 3.- Existen diferentes factores pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de trombosis, pudiendo ser de base gentica, medicamentosa o asociada a enfermedades. El conocimiento de los mismos es importante para prevenir el desarrollo de enfermedades. En la tabla a continuacin, se muestra la influencia del uso de anticonceptivos orales y de la presencidesarrollo de trombosis venosas. Estado tromboflico Normal Uso de anticonceptivos orales (ACO)Factor VLeiden, heterocigoto Factor VLeiden, heterocigoto + ACOFactor VLeiden, homocigoto Factor VLeiden, homocigoto + ACO Podra considerarse que la expresin del factor gentico de trombosis? Por qu?

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Los resultados obtenidos se expresan en la figura siguiente

Puede afirmarse que el factor V y el factor VLeiden poseen similares cualidades procoagulantes, favoreciendo la formacin de trombina?

Cul es la mayor diferencia funcional entre el factor V y el factor VLeiden

Cul sera la diferencia a nivel molecular entre el factor V y el factor Vexplicar el comportamiento observado?

demostrar lo que plantea al respecto?

En el artculo publicado por Van 't Veer, y cols. existe algn otro resultado que aporte

Existen diferentes factores pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de ser de base gentica, medicamentosa o asociada a enfermedades.

El conocimiento de los mismos es importante para prevenir el desarrollo de enfermedades. En la tabla a continuacin, se muestra la influencia del uso de anticonceptivos orales y de la presencia del factor VLeiden sobre el riesgo para el desarrollo de trombosis venosas.

Riesgo relativo de trombosis venosa 1

Uso de anticonceptivos orales (ACO) 4 5-7

o + ACO 30-35 80

, homocigoto + ACO >100

Podra considerarse que la expresin del factor VLeiden constituye un factor de riesgo gentico de trombosis? Por qu?

poseen similares cualidades

Leiden?

Cul sera la diferencia a nivel molecular entre el factor V y el factor VLeiden, que pueda

En el artculo publicado por Van 't Veer, y cols. existe algn otro resultado que aporte

Existen diferentes factores pueden aumentar el riesgo para el desarrollo de ser de base gentica, medicamentosa o asociada a enfermedades.

El conocimiento de los mismos es importante para prevenir el desarrollo de enfermedades. En la tabla a continuacin, se muestra la influencia del uso de

sobre el riesgo para el

Riesgo relativo de trombosis venosa

constituye un factor de riesgo

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De acuerdo con lo expresado en la tabla, cmo se debera actuar ante la identificacin de una persona con dicha mutacin? Ante la identificacin de un individuo con riesgo trombogentico aumentado, es posible que otras personas, integrantes de la misma familia, tambin tengan riesgo trombogentico aumentado? Teniendo en cuenta la informacin que se brinda en el esquema siguiente, sobre el sector del factor V en el que se localiza la mutacin que da lugar a la formacin del factor VLeiden, cmo diseara un procedimiento de diagnstico en vistas a la identificacin de los individuos normales y de los mutados?

Alelo normal Alelo mutado

Sitio de corte con MnII Ausencia del sitio de corte con MnII

4- En la figura adjunta se muestra un esquema de la protombina cuyo peso molecular es 72 kDa (579 aminocidos) y los sitios de corte de la protrombinasa (Arg 320 y Arg 284) y un gel desnaturalizante, sin agentes reductores, de la activacin fisiolgica de la protrombina. El gel fue revelado con un anticuerpo policlonal contra la protombina.*

Esquema de Protrombina

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a) A qu podran corresponder las bandas a, b y c en el gel? Cmo es la curva de activacin de protrombina en el tiempo? Qu sucede si el gel se realiza en condiciones reductoras con el agregado de beta-mercaptoetanol? b) Cules son los componente de la protrombinasa?A nivel fisiolgico quin activa la protrombinasa? c) Dnde se ubican los residuos de Gal (gama-carboxiglutmico) en la protrombina y cul es la consecuencia funcional de este hecho sobre la trombina? *Este problema se basa en siguiente artculo cientfico: The Prothrombinase-catalyzed Activation of Prothrombin Proceeds through the Intermediate Meizothrombin in an Ordered, Sequential Reaction, de Sriram Krishnaswamy et al., Journal of Biological Chemistry (1986) 261, 8977-8984.

5.- La fibrinolisis es el mecanismo de control final que limita la formacin del cogulo. El control de la misma es fundamental para mantener el balance hemosttico. Por otra parte, algunos componentes de este sistema pueden ser utilizados en el tratamiento de algunas enfermedades. Cul es, en condiciones fisiolgicas, el principal activador del sistema fibrinoltico? Qu es lo que determina que su actividad tenga lugar fundamentalmente en el sitio de formacin del cogulo? La 2-antiplasmina es el principal inhibidor fisiolgico de la plasmina. Qu factor determina que la unin 2-antiplasmina-plasmina sea rpida o lenta?

Tiempo

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Qu otro tipo de factores pueden ser de relevancia en la inhibicin de la fibrinolisis? Cul puede ser su funcin biolgica? Qu componente del sistema fibrinoltico puede ser de utilidad para el tratamiento de un infarto agudo de miocardio? Por qu? Cul podra ser una limitante para su utilizacin? 6.- Las clulas endoteliales son activas protagonistas de todas las etapas de la hemostasis. A continuacin se indican diversas sustancias presentes en las mismas. Comente sobre qu tipo de molculas (o clulas) actan y qu acciones biolgicas determinan.

Sustancia Blanco molecular Efecto biolgico Prostaciclina CD39 Trombomodulina Antitrombina tPA Factor de von Willebrand Inhibidor del activador del plasmingeno (PAI-1)

Heparina xido ntrico (NO)