GUIN

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1. A continuacin voy a realizar la presentacion de mi trabajo final de carrera el cual ha consistido en la formulacion de un medio de crecimiento para L.lactis que permita alcanzar una optima actividad antilisteria

2. Actualmente las investigaciones en la industria alimentaria se dirige a reemplazar las tcnicas de conservacin de alimentos tradicionales por nuevas tcnicas debido a la creciente demanda del consumidor por productos mas naturales (sin aditivos) y saludables.

Es as como surge el trmino de BIOCONSERVACIN que se refiere a una extensin de la vida til y a un incremento de la seguridad de los alimentos utilizando la microbiota natural y/o sus productos antibacterianos.

En este trabajo se plantea la posibilidad de utilizar bacterias cido lcticas como BIOCONSERVANTE. Este efecto se dara gracias a la produccin de diferentes metabolitos como cido lctico, peroxido de hidrgeno, BACTERIOCINAS, etc. A la vez que el crecimiento de este microorganismo creara una competencia por los nutrientes con la flora patgena/alterante.

El crecimiento de estas bacterias cido lcticas le conferiran al alimento el carcter de probitico, por el hecho de ser microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades adecuadas ejerceran una influencia positiva en la salud del consumidor.

3. El objetivo general fue formular un medio de crecimiento optimo para L.lactis que permita alcanzar la mxima actividad bactericida de dicho microorganismo y que pueda ser incorporado a alimentos.

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4. El plan de trabajo seguido se divide como podemos ver en 3 fases.

FASE1: En esta primera fase se cuantifico la capacidad bactericida de un patron de nisina.

FASE 2: Se modelizo la curva de crecimiento del L.lactis y se determino su actividad antilisteria.

FASE 3: Formulamos un medio optimo para la produccin de metabiltos con actividad antilisteria a partir de L.lactis

5. Para la realizacin del patrn dosis respuesta se prearararon diferentes disoluciones de nisina a diferentes concentracin y se observo la respuesta frente al m.o indicador L.innouca.

Utilizando la metodologa de difusin en agar se prepararon unas placas. con el m.o indicador de L.innocua (106 ufc/mL) y se verti BHI agar (45C). Las placas se dejaron solidificar en nevera (4C) durante 30min. A continuacin, en cada placa se realizaron 5 pocillos de 9mm de dimetro y en los pocillos 1, 2, 3 y 4 se inocularon 100L de las diferentes concentraciones de nisina a testar (25-1200mg/L), quedando el pocillo 5 sin muestra. Las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37C. Posteriormente se midio el dimetro de los halos de inhicion.

Utilizando la tcnica de la dilucin en la dilucin en caldo se prepararon una serie de tubos ensayo en los que se mezclaron 1mL de las distintas disoluciones de nisina indicadas en la figura con 1mL de L.innocua (106 ufc/mL). Tras una incubacin de 20 horas a 37C se determino la carga microbiana resultante mediante recuento en placa BHI agar Obteniendose la dosis minima de nisina con actividad frente a L.innocua.

La finalidad de este patrn dosis consiste en trasladar la respuestas observadas por L.lactis frente a L.innucua a una actividad equivalente de nisina.

6. Con la finalidad de determinar en que momento del desarrollo el L.lactis produca la mayor actividad bactericida a) se determino su curva de crecimiento y B) se evalu la actividad antilisteria de los metabolitos producidos (SPP) a lo largo de su desarrollo.

a) A partir de un inoculo de L.lactis se determino su curva de crecimiento tras representar los valores obtenidos de ufc/mL frente al tiempo. Posteriormente, la curva se modelizo segn los modelos cinticos de Gompertz y Baranyi y se obtuvieron los parmetros caractersticos del desarrollo microbiano.

b) La actividad antimicrobiana del SPP se determino a lo largo del crecimiento del L.lactis utilizando la tcnica de difusin en agar

Para la obtencin del sustrato parcialmente purificado (SPP) rico en sustancias antimicrobianas fundamentalmente bacteriocinas y libre de clulas microbianas se procedi como se indica en el esquema. En primer lugar, el L.lactis se inoculo en caldo y se dejo incubar durante 21 horas. A cada hora se extrajo una muestra a la que MRS y a cada hora se extrajo muestra a la que se le realizo un proceso de pasteurizacin con el fin de inactivar las clulas microbianas y un proceso de centrifugacin obtenindose asi el Sustrato parcialmente purificado (SPP) o sobrenadante libre de clulas.

7. En la tercera fase se testaron diferentes formulaciones con la finalidad de obtener un medio que permitiese un ptimo desarrollo de la actividad antilisteria del L.lactis.

Se trabajo con dos cepas de L.lactis (CECT 539 y CECT 4434) y los componentes utilizados en las formulaciones fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, fosfato potsico, cloruro sdico y sulfato de magnesio. La variable dependiente o respuesta considerada fue la actividad del L.lactis.

Para la formulacin del medio optimo se utilizo la metodologa de la superficie de respuesta.

8. La cuantificacin del L.lactis se realizo en base a un patrn de nisina utilizando dos metodologias diferentes:a) La propuesta por Delgado y b) La basada en la curva de calibrado.

a) Segn Delgado la actividad antimicrobiana se puede expresar como potencia segn la formula P=

Donde Am: Area del halo del L.lactis,

Ae: Area del halo de la nisina

m: es la pendiente de la recta que relaciona el el ln C de nisina con al area del halo de inhibicion para el m.o indicador L.innocua (el area del halo se obtiene a partir de la tecnica de la difusion en agar)

b ) Segn la metodologia basada en la curva de calibrado

Existe una relacion lineal entre el log C de nisina y el diametro halo de inhibicion obtenidos a partir de la tecnica de la difusion en agar. Al representar esta relacion se obtuvo la ecuacion de una recta.

Por otro lado existe una relacion lineal entre la C de nisina y la carga microbiana (ufc/mL) presente obtenida a partir de la tecnica de la dilucion en caldo. Como se puede observar en la fig la nisina es muy efectiva frente a L.innocua, siendo la CMI de 300UI/mL. La concentracion minima inhibitaroria es la dosis minima de nisina que genero la mortalidad total de 106 ufc/mL de L.innocua. La ampliacion del intervalo prctico de accion nos da la ecuacion de una recta que relaciona la carga microbiana presente con la C de nisina.

A partir de estas dos ecuaciones se pudo calcular la actividad antimicrobiana de los metabolitos producidos por L.lactis, relacionando el halo de inhibion generado por estos con la carga microbiana presente en base a un patron de nisina.

9. En esta figura se puede muestran los datos experimentales y las modelizaciones de Gompertz y de Baranyi. Como se puede observar la curva obtenida se correspondi con un modelo clsico de crecimiento microbiano en el que se distinguen 3 fases bien definidas.

En la tabla se muestra los parmetros cinticos de crecimiento y los coeficientes de correlacin obtenidos a partir de las 2 modelos. Como se puede observar con los valores de R2 el crecimiento de L.lactis se ajusta perfectamente a los dos modelos utilizados. La fase de latencia se sita en torno a las 2 h. La velocidad de crecimiento es del orden de 0,5.La MDP es algo superior a las 10 log ufc/mL

10. Segn los resultados obtenidos en las tres figuras la mayor actividad antilisteria de L.lactis se logra tras incubar el m.o entre 10-15 horas.

Por lo tanto, y en base a estos resultados se considera un tiempo de incubacin de 12 horas para los siguientes ensayos, puesto que la brusca caida de la actividad antimicrobiana observada a partir de las 15 horas no aconseja apurar hasta dicho limite.

11. En la fase inicial de este estudio se utiliz un diseo factorial fraccionado (DFF), Los ingredientes o factores del medio de crecimiento considerados fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl y MgSO4.7H2O Para cada uno de estos factores se consideraron 2 niveles (inferior y superior) (tabla),

De acuerdo con los diseos factoriales y teniendo en cuenta que en el presente diseo se han considerado 6 factores con dos niveles, se tratara de un diseo 26 siendo necesarios la realizacin de 64 experimentos. Este nmero se redujo utilizando un diseo factorial fraccionado (DFF) de tipo 26-2 siendo en este caso necesarios 16 experimentos En la tabla. se muestra el diseo utilizado

La variable dependiente o respuesta considerada fue la actividad antilisteria del SPP extrado cuando el L. lactis se desarrollaba en los diferentes medios testados durante 12 horas de incubacin (tiempo optimo de incubacin que se estableci en el apartado anterior para una mayor produccin de metabolitos antimicrobianos y por tanto mayor actividad).

12. Aqu se muestran los resultados de actividad antilisteria para las 16 formulaciones ensayadas y las dos cepas de L.lactis consideradas.

Los resultados obtenidos muestran que los valores mas altos de actividad para la cepa 539 fueron las formulaciones 8, 2, 14 y 3. Para el caso de la cepa 4434 fueron las formulaciones 8, 14, 7 y 9.

En esta tabla podemos observar a priori la influencia de los factores en el medio de cultivo.

13. Aqu se muestra el diagrama de pareto estandarizado para la cepa 539 y la cepa 4434.

El diagrama de pareto es una representacin grfica del anlisis de varianza donde igualmente se observa los factores ms influyentes, en su respectivo orden sobre la actividad antilisteria. Los efectos de color azul (-) son inversamente proporcionales a la variable de respuesta (actividad), mientras que los de color gris (+) son efectos directamente proporcionales a la variable respuesta. El diagrama incluye una lnea vertical cuya ubicacin depende del intervalo de confianza determinado (95% en este caso). Todo efecto que pase sobrepase esta lnea ser de considerable significancia para la actividad antimicrobiana

En este caso, ninguno de los factores del medio tiene efecto significativo y esto tanto para la cepa 539 como para la 4434.

Para la cepa 539 en el diagrama de pareto se observa claramente como se los seis factores del medio son el sulfato potasico de forma negativa y el extracto de levadura de forma positiva los que han resultado afectar en mayor medida a la actividad. Esto indica que niveles altos de fosfato potasico en le medio de cultivo dan lugar a actividades menores, mientras que mientras que el extracto de levadura, sacarosa y el Na Cl favorecen la obtencin de niveles mayores de actividad. Por otro lado, las concentraciones de MgSO 4 y la peptona no parecen afectar apenas a la actividad.

Para la cepa de Lactococcus lactis CECT 4434, en el diagrama de pareto mostrado en la figura IV.9. se observa claramente que el factor ms influyente sobre la actividad fue el extracto de levadura. Adems, la actividad tiende a disminuir al aumentar las concentraciones de KH2PO4 y el NaCl (coeficientes negativos), dndose el efecto opuesto en el resto de los factores (coeficientes positivos). Por el contrario las concentraciones de MgSO 4 7 H2O no parecen afectar apenas a la actividad.

Hay que considerar, que para el anlisis de varianza se ha medido la contribucin de cada factor eliminando las interacciones entre los factores presentes en el medio, es decir, la sinergia, el antagonismo o la adicin crticos en los procesos bioqumicos. Por tanto, para que estas interacciones sean consideradas, se tendran que utilizar modelos matemticos de orden superior para cuyo clculo sera necesario la realizacin de ms ensayos, y/o la reduccin del nmero de factores para simplificar el modelo matemtico empleado.

14. En la segunda fase del estudio se trato de describir la naturaleza de la superficie de respuesta en la region del optimo utilizando un diseo central compuesto (DCC) para dos factores, 22 en estrella rotable y ortoganal.

Aunque en la primera fase de optimizacion del medio ninguno de los componentes del medio resulto ser significativo para una maxima actividad antilistera, en esta etapa se considero el extracto de levadura y el KH2PO4.

En la tabla se muestra el diseo DCC rotable y ortogonal, asi como los valores codificados y sin codificar de los dos factores del medio considerados y los valores de actividad para cada una de las cepas de L.lactis.

15. Aqu se muestra el diagrama de pareto estandarizado para la cepa 539 y 4434.

En la figura. se muestra el diagrama de pareto para la cepa de Lactococcus lactis CECT 539. En este se observa como la levadura afecta de forma positiva a la actividad y el KH2PO4 de forma negativa como observ antes de la reoptimizacin del medio si bien la influencia del KH2PO4 en este caso es menor. Adems, las interacciones BB (KH2PO4 - KH2PO4) y AA (extracto de levadura extracto de levadura) resultaron afectar negativamente, incluso en mayor medida que el KH2PO4 a la actividad antilisteria. Los trminos AA y BB indican que los factores considerados tienen un comportamiento cuadrtico respecto a la actividad.

En el caso de la cepa Lactococcus lactis CECT 4434, al igual que se haba observado antes de la reoptimizacin del medio (figura IV.9.), el extracto de levadura fue la variable ms influyente, siendo en este caso significativamente influyente (P-value