GUA DE PRCTICAS PARA ANLISIS DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSUniversidad del Per, DECANA DE AMRICAFacultad de Farmacia y BioqumicaCtedra de Bromatologa

PRCTICA N1: CUANTIFICACIN DE VITAMINA B3 (NIACINA) EN HARINA DE TRIGO POR MTODO DE HPLC

I. INTRODUCCINLa vitamina B3 o niacina pertenece al grupo de vitaminas del complejo B y adems es hidrosoluble.1 Este se encuentra de manera natural en muchos alimentos, pero tambin podra obtenerse a partir de un exceso de triptfano que es un aminocido esencial. La CDR (cantidad diaria recomendada) es aproximadamente de 6.6 mg/1000 caloras, un hombre adulto necesita alrededor de 19 EN (equivalentes de niacina) y la mujer 15 EN.2 Las principales fuentes alimentarias contienen esta vitamina en forma de NAD+ y NADP+, estas a su vez participan en procesos bioqumicos de xido-reduccin como transportadores de dos electrones y un protn, equivalentes a un ion hidruro (H-), desde el sustrato oxidable correspondiente, con liberacin al medio de un H+ en el curso de la reaccin.3 A nivel ms general acta en el metabolismo de los macronutrientes, as como tambin en el de la vitamina A y el etanol; se le asocia tambin con la sntesis de cidos grasos, colesterol y algunas hormonas esteroidales.4Las principales fuentes alimentarias de la niacina podemos considerar al hgado de ternera o de cerdo ya que contienen alrededor de 15 mg/100g de vitamina B3. La carne muscular magra posee una concentracin elevada de niacina (5-6mg/100g), los cereales enteros contienen 5 mg de niacina cada 100 g pero la mayor parte se elimina junto con el refinamiento. Los granos de caf contienen una cantidad elevada de cido metilnicotinico y a partir de l se libera NA durante el tostado, por lo que una taza de caf proporciona entre 1 y 2 mg de niacina.5La enfermedad caracterstica de su deficiencia es la pelagra, denominado en sus inicios mal de la rosa. Se caracteriza por presentarse trastornos cutneos (dermatitis), digestivos (diarreas) y nerviosos (irritabilidad, alucinaciones). Esta enfermedad aparece cuando la base de alimentacin es el maz, que contiene niacina no utilizable y poco triptfano; adems se da en personas con enfermedad de Hartnup (deficiencia absorcin aminocidos), carcinoides de intestino y en pacientes tratados con isoniazida, bencerazida y carbidopa dndose en este ltimo caso una interaccin frmaco-alimento.6 En la siguiente prctica se evaluar la concentracin de vitamina B3 presente en un producto alimentario como lo es la harina de trigo utilizando un mtodo por HPLC.II. MATERIALESMtodo: Tcnica cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)7

a) Muestra: Harina de trigo sin adicin de vitaminas.b) Recursos: Cromatgrafo lquido de alta resolucin con detector UV/visible. Matraces volumtricos de 100,50 y 25 mL. Columna: C-18 o RP-18 5m, 15cm x 4.6mm Discovery (Supelco) Cartucho Sep Pak C-18 Balanza analtica sensibilidad 0.1mg Sonicador Centrfugac) Reactivos: Estndar de niacina Solucin de cido clorhdrico 0.005M Solucin de fosfato monobsico de potasio 0.1M pH 7.0. Solucin de agua calidad HPLC acidificada pH 4.2 Metanol HPLC Fase mvil de KH2PO4 0.1M - metanol 90:10 (pH:7) Acetonitrilo Acetato de amonio Hidrxido de amonio cido frmico Agua HPLC

III. PROCEDIMIENTO

a) Preparacin del estndar.Solucin madre de niacina (550ppm):

Pesar en un matraz volumtrico de 100mL, exactamente 55mg de estndar de niacina. Agregar 50mL de agua HPLC. Agitar hasta que la niacina se disuelva por completo. Llevar a volumen con agua HPLC y agitar.

b) Preparacin de la muestra.

Pesar 5 gramos de harina de trigo en un matraz volumtrico de 100mL y diluirlo en 60mL de agua HPLC. Sonicar la muestra por 10 minutos. Llevar la muestra a volumen con agua desionizada. Centrifugar la muestra por 20 minutos.

c) Extraccin por fase slida.Preparar agua acidificada (pH 4.2), mediante la adicin de una solucin 0.005M de HCl, gota a gota, sin dejar de agitar hasta alcanzar el pHpredeterminado. Activar la fase slida con 10mL de metanol y luego10mL de agua acidificada (pH 4.2). Cargar la fase slida con 10mL del sobrenadante del centrifugado de la muestra. Lavar con 5mL de agua acidificada (pH 4.2). Eluir con 10mL de metanol (caudal de 1mL/min). Recolectar la elucin e inyectarla.

d) Condiciones cromatogrficas.

Fase mvil: Fase mvil KH2PO4 0.1M (pH 7) metanol 90:10. Flujo o caudal: 0.7mL/min. Inyeccin: 20L. Columna: Supelco Discovery C 18 fase reversa (150mm x 4.6mm, 5m) # 504955. Temperatura de columna 25C. Detector UV/VIS con arreglo de diodos: 261 nm.

IV. RESULTADOSVerificar el tiempo de retencin del pico, comparado con el de referencia, comparar rea vs Concentracin.

Donde:c = concentracin en g/mL.v= volumena = masa de la muestra en gramos

V. PROTOCOLO DE ANLISIS

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSFACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICABROMATOLOGAPROTOCOLO DE ANLISIS POR HPLC

1. Datos de la muestra.Muestra

Cantidad

Nmero de lote

Presentacin

2. Preparacin de la muestra y estndares.

3. Condiciones cromatogrficasFase mvil

Flujo

Volumen de inyeccin

Columna

T columna

Detector

3. Resultados

ANALISTA

VI. COMENTARIOS

A diferencia del mtodo explicado con anterioridad hay otras formas de extraer la vitamina B3 de la matriz alimentaria en la que se encuentra, uno de ellos involucra la hidrolisis con 125 ml de cido sulfrico 0,1 M durante 15 minutos a 110C. Despus de enfriar, el pH se ajusta a 4,5 utilizando acetato de sodio, se agregan 500 mg de Takadiastasa y la mezcla es incubada durante 20 minutos a 45C. La solucin es acidificada con 25 ml de cido sulfrico 30%, es diluida a 250 ml con agua y filtrada. 50 ml del filtrado se acidifican con 1 ml de cido sulfrico 30% y se agrega gota a gota (2-6 ml) de una solucin de permanganato de potasio 3% hasta que permanezca el color rosado. El exceso de permanganato es destruido por la adicin de una solucin de perxido de hidrgeno 3% hasta que desaparezca el color rosado. Se suspende 1 g de slice tratada (tierra de diatomeas) con 25 ml de la solucin oxidada, se agita vigorosamente durante 1 minuto, se centrifuga y se deja decantar. La niacina absorbida en la slice tratada es lavada con 25 ml de cido sulfrico 0,1 M, se centrifuga y se deja decantar. Se agregan 25 ml de hidrxido de potasio 0,5 M, se agita durante 1 minuto y se centrifuga. Se colocan 20 ml del sobrenadante en un vaso precipitado, se cubre con un vidrio de reloj y se calienta durante 10 minutos en una autoclave a 110 C para hidrolizar la nicotinamida a cido nicotnico. La solucin enfriada se ajusta a un pH de 4,5 con cido clorhdrico (0,1 M), se transfiere a un matraz volumtrico de 50 ml y se agregan 3 ml de una solucin de bromuro de ciangeno 3% y se ajusta a volumen con agua.

Precaucin: no inhalar el vapor de esta solucin. Tomar todas las precauciones necesarias para trabajar con compuestos txicos.

El matraz se coloca en un bao de agua durante 10 minutos a 75-85C, y se enfria a temperatura ambiente. 10 ml de la solucin se pipetean en la cubeta del fotmetro, se agrega 1 ml de cido clorhdrico 1M y el espectrmetro se ajusta a absorbancia cero. Se agrega 1 ml de una solucin de procana 5% (5 g en 100 ml de HC1 1M), se mezcla y se mide la absorcin dentro de 15-20 segundos a 420 nm.8 Con este mtodo los clculos seran los siguientes:

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Medline Plus [Internet]. Washington: ADAM, 2013 [citado 13 Ab 2015]. Niacina. Disponible en: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002409.htm2. Williams M. Nutricin. Para la salud, condicin fsica y deporte. [Internet].1 ed. Barcelona: Ed. Paidotribo ; 2002 [Citado 13 Ab. 2015]. Disponible en: https://books.google.com.pe/books?id=8rSpvU2FISMC&pg=PA220&dq=niacina&hl=es- 419&sa=X&ei=qpksVY6kCYHRgwSi5YLACA&ved=0CBsQ6AEwAA#v=onepage&q=niacina&f=false3. Hernandez M,Sastre A. Tratado de nutricin. [Internet].1 ed. Madrid: Editorial Daz de Santos; 1999 [citado 13 Ab. 2015]. Disponible en: https://books.google.com.pe/books?id=SQLNJOsZCIwC&pg=PA157&dq=niacina&hl=es-419&sa=X&ei=E5wsVbmCCYSzggTE5oC4Dg&ved=0CCAQ6AEwAQ#v=onepage&q=niacina&f=false4. Marin S. Elementos de nutricin humana. [Internet].1ed. San Jos: Editorial Euned; 2000 [citado 13 Ab. 2015]. Disponible en:https://books.google.com.pe/books?id=txKXD0mWGhoC&pg=PA90&dq=niacina&hl=es-419&sa=X&ei=SfMsVbfmAYarggSXgoTYDQ&ved=0CCsQ6AEwAw#v=onepage&q=niacina&f=false5. Biesalski H. Nutricin. Texto y atlas. [Internet]. 1 ed. Madrid: Editorial Mdica Panamericana; 2009 [citado 13 Ab. 2015]. Disponible en:https://books.google.com.pe/books?id=9XqTwTkBh4QC&pg=PA178&dq=niacina&hl=es-419&sa=X&ei=SfMsVbfmAYarggSXgoTYDQ&ved=0CC8Q6AEwBA#v=onepage&q=niacina&f=false6. Gil A. Tratado de nutricin. [Internet].Vol. 2. 2 ed. Madrid: Editorial Mdica Panamericana; 2010 [citado 13 Ab. 2015]. Disponible en:https://books.google.com.pe/books?id=64x-gRS5520C&pg=PA512&dq=niacina&hl=es-419&sa=X&ei=SfMsVbfmAYarggSXgoTYDQ&ved=0CE0Q6AEwCQ#v=onepage&q=niacina&f=false7. Mencos M. Evaluacin de dos mtodos; cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) y cromatografa lquida de ultra rendimiento (UPLC); para la cuantificacin simultnea de cuatro vitaminas hidrosolubles en harina de trigo. [Tesis de pregrado]. Guatemala: Universidad de San Carlos de Guatemala, 2011.8. Bell, J.G. 1984. Microbiological assay of vitamins of the B-group in foodstuffs. (Laboratory Practice 23:235-242).