Facultad de Farmacia Guía de laboratorio 3Cátedra de Microbiología

LABORATORIO Nº 3

Observación macro y microscópica de cultivos

1. Observación Macroscópica

1.1. Cultivos sólidos

Cuando una célula microbiana se siembra sobre un medio de cultivo sólido, ésta se desarrolla multiplicándose varias veces hasta formar una estructura macroscópica denominada colonia. Así, se puede definir una colonia como el desarrollo aislado de una cepa microbiana, la cual crece hasta alcanzar un tamaño determinado que se mide en milímetros. Una colonia está formada por aproximadamente 108 células (clones de la célula original que dio origen a la colonia). Su aspecto macroscópico es característico de cada especie, siempre y cuando se siembre en el mismo medio y se incube bajo las mismas condiciones ambientales. La caracterización de colonias se hace en base a los siguientes criterios:

5) TAMAÑO grande, mediana, pequeña, puntiforme6) CONSISTENCIA blanda, firme, mucosa a viscosa (propia de bacterias capsulazas)7) SUPERFICIE lisa, rugosa, brillante, seca, opaca, húmeda8) OLOR aromático, desagradable, ausente 8) COLOR ausente o presente. Se debe considerar color de la colonia (endopigmento), pero también la producción de pigmentos que difunden al medio (exopigmento), ej. Pseudomonas aeruginosa.

Facultad de Farmacia Guía de laboratorio 3Cátedra de Microbiología

1.2. Observación macroscópica en medios líquidos

En la mayoría de los casos el desarrollo de las bacterias en medios líquidos se aprecia por la aparición de turbidez en el caldo sembrado. Sin embargo, para ciertos microorganismos, el medio puede permanecer transparente con un crecimiento que se aprecia como migajas en suspensión. En el caso de bacterias aerobias estrictas, se genera un velo en la superficie del medio, o un anillo cuando éstas son capsuladas o presentan slime (cápsula laxa poco organizada).

En cultivos líquidos también se puede observar características como olor y cambio de color si la bacteria produce exopigmantos.

2. Observación microscópica

Los microorganismos pueden ser observados directamente usando un instrumento de precisión, el microscopio. Si la finalidad es ver microorganismos vivos, para observar su movilidad o su reacción frente a elementos químicos, se les debe observar SIN teñir. Por el contrario, si se desea observar detalles de forma, estructuras o agrupación, es necesario tratar los microorganismos con colorantes, proceso llamado tinción.

2.1. Observación de microorganismos sin tinción

Preparación húmeda: es la forma más simple de observar células vivas. Esta técnica consiste en suspender un inóculo del cultivo en suero fisiológico estéril (0,5-0,8% NaCl). Luego se deposita una gota de ésta suspensión sobre un portaobjeto limpio. Finalmente la gota se cubre con un cubreobjeto y se observa al microscopio.

2.2. Tinciones

Preparación de la muestra a teñir: Para teñir microorganismos se debe depositar una pequeña cantidad de la muestra a examinar sobre un portaobjeto limpio (1 – 2 gotas de cultivo líquido). Si la muestra proviene de un medio sólido, esta se emulsiona con unas gotas de suero fisiológico estéril. La muestra se extiende con el asa, hasta que quede una fina película sobre el portaobjeto. Esta película se denomina frotis.

Para teñir el frotis, éste debe estar seco. Esto se logra mediante un procedimiento llamado fijación, que puede realizarse usando sustancias químicas o calor. Lo más usado es la fijación por calor que consiste en pasar el portaobjeto, con el frotis, varias veces sobre la llama del mechero. Este procedimiento deshidrata y mata las células presentes en el frotis y hace que se adhieran al porta objeto.

Coloración de la muestra: Una vez fijado el frotis, se procede a aplicar el o los colorantes, esto depende del tipo de tinción que se desea realizar. Los colorantes son compuestos químicos, generalmente sales, que tienen afinidad por ciertas estructuras celulares a las cuales se fijan.

Se pueden diferenciar tres tipos de tinciones:1. Tinción simple hace uso de un solo colorante. Permite ver forma y

tamaño.

Facultad de Farmacia Guía de laboratorio 3Cátedra de Microbiología

2. Tinción diferencial permite separar (diferenciar) las bacterias en grupos de acuerdo a su reacción diferencial frente a dos colorantes. Ej. tinción de Gram y tinción de Ziehl-Neelsen.

3. Tinción especial útil para observar estructuras celulares (ej. cápsula, esporas y flagelos) o microorganismos difíciles de teñir (ej. Micoplasma y Rickettsias).

2.2.1. Tinción diferencial de Gram

Es la tinción de uso corriente en microbiología y permite dividir las bacterias en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.

Técnica: 1. realizar frotis y fijación de la muestra 2. teñir con cristal violeta por 1 min

3. lavar con agua y aplicar lugol* por 1 min4. lavar con agua y decolorar con alcohol por 30 seg5. lavar con agua y teñir con fucsina básica6. lavar con agua y dejar secar al aire7. observar al microscopio con objetivo de inmersión

* El lugol es un mordiente que tiene por función aumentar la afinidad del colorante (en este caso cristal violeta), por las estructuras celulares a las cuales éste se une.

Fundamento de la tinción de Gram

Probablemente la diferencia entre bacterias grampositivas y gramnegativas se debe a la naturaleza física de sus paredes celulares. Parece ser que, en grampositivas, durante la etapa de decoloración, el alcohol contrae los poros de la gruesa capa de peptidoglucano; y en consecuencia el complejo cristal violeta-lugol queda retenido dentro de la célula y las bacterias adquieren un color azul-violeta. Por el contrario la capa de peptidoglucano de las gramnegativas es más fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que el alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa gramnegativa como para aumentar su posterior porosidad. Por este motivo el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta-lugol en las bacterias granmegativas.

2.2.2. Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las demás bacterias. La pared de micobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con la coloración de Gram. Para teñir micobacterias se usa el método de Ziehl-Neelsen (o Tinción Acido-Alcohol Resistente), el cual utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

Técnica de Tinción Ziehl-Neelsen

1. Verter sobre el frotis previamente fijado, de 10 a 15 gotas de carbol fucsina.

Facultad de Farmacia Guía de laboratorio 3Cátedra de Microbiología

2. Calentar hasta emisión de vapores. Repetir 1 a 4 veces el mismo procedimiento.

3. Decolorar con alcohol clorhídrico (HCl-etanol).4. Lavar con agua.5. Teñir con azul de metileno, durante un minuto.6. Lavar con agua y dejar secar.7. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.

Fundamento y resultados de la tinción

Las micobacterias debido a su alto contenido lipídico a nivel de pared celular, son relativamente impermeables a los colorantes. Por ello, el colorante carbol fucsina se aplica con calor de modo de “ablandar” y permeabilizar la pared celular. Por otra parte, el colorante en forma de vapor posee un mayor poder de penetración y además, el carbol fucsina tiñe los ácidos micólicos propios de la pared celular de micobacterias. Al agregar la solución decolorante (HCl-etanol), se produce un efecto de deshidratación, lo cual “cierra” las vías de entrada, quedando el colorante al interior de las células. Finalmente al agregar azul de metileno, en frío, este no penetra al interior de las células. De este modo, las micobacterias se observan de color rojo, mientras que otros géneros bacterianos aparecen teñidos de azul.

2.2.3. Tinción especial: Esporas

Técnica: 1. realizar frotis y fijación de la muestra 2. cubrir el frotis con papel filtro

3. teñir con verde malaquita a emisión de vapores por 10 a 15 min4. dejar enfriar el porta objeto y lavar con agua5. teñir con safranina por 1 min6. lavar con agua y dejar secar al aire7. observar al microscopio con objetivo de inmersión

Fundamento de la tinción de esporasLas endoesporas son estructuras de resistencia a condiciones adversas como

por ejemplo: altas temperaturas, radiaciones UV, etc. Como estructuras de resistencia, poseen, entre otras características, tres gruesas cubiertas protectoras, las cuales las hacen impermeables a los colorantes. Debido a esto, para teñir una endoespora es necesario aplicar el colorante con calor para “ablandar” sus capas protectoras. Además, el colorante vaporizado penetra, los microporos que se forman con el calor, más fácilmente que en estado líquido. Al enfriar y lavar el portaobjeto con agua, los microporos se cierran quedando el colorante (verde malaquita), atrapado dentro de la endoespora. Finalmente, en esta tinción se usa un colorante de contraste, la safranina, que tiñe la célula vegetativa de color rojo, contrastando con las endoesporas que se observan de color verde.