guía de problemas para dg- bioquimica 2015 · pdf...

Bioquímica-‐BCM-‐BCC1 2015

1

Problemas de Bioquímica para el Curso de Biología Celular y Molecular

Modulo I -‐ CBCC

Guía de Problemas para las Discusiones Grupales

Departamento de Bioquímica

Facultad de Medicina

2015


2

Tubo 2

Tubo 1

I. Enzimas Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a: Aspectos moleculares de las reacciones enzimáticas: sustrato, centro activo, grupos prostéticos, coenzimas. Medida de la actividad enzimática: Definición de enzima. métodos de medida, definición de unidades. Cinética de las reacciones enzimáticas: Cinética química. Velocidad inicial de reacción (v0), dependencia de la velocidad inicial con la concentración de enzima y sustrato. Formación del complejo enzima-‐sustrato. Ecuación de Michaelis-‐Menten. Representaciones gráficas. Significado de Vm, Km, y constante catalítica Kcat. Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática. Gráfico de doble recíprocas: determinación de Vm y Km. Inhibidores. Control de la Actividad Enzimática: Modulación alostérica, covalente y mediada por proteólisis. Enzimas alostéricas: velocidad en función de concentración de sustrato, efecto de los moduladores. 1-‐ Dada la siguiente reacción donde (E) es enzima, (S) el sustrato y (P) el producto de la reacción (modelo simplificado de reacción catalizada por enzima).

k1 k2 E + S ↔ ES → E + P

k-‐1 Indique:

a) qué es ES? Plantee la ecuación para la misma reacción en ausencia de enzima. b) Plantee la ecuación de velocidad para cada uno de los pasos de la reacción. Iguale la velocidad de

formación y de deformación del complejo ES, tal como ocurre en el estado estacionario. (ejemplo: para una reacción del tipo: A + B à C, la velocidad de formación de C es: v = k [A][B])

c) Plantee la ecuación para el cálculo de Km en el estado estacionario. d) Calcule Km para los siguientes valores: k1 = 1 x 107 M-‐1s-‐1, k-‐1 = 2 x 104 s-‐1 y k2 = 4 x 102 s-‐1.

2. En el laboratorio se realiza un ensayo para determinar la velocidad de formación de B catalizada por una

enzima. Observando el gráfico indique cuáles podrían ser las diferencias entre el tubo 1 y tubo 2.

a. ¿Cómo se calcula la velocidad de reacción? ¿Porqué se le denomina velocidad inicial (Vo)?

b. Represente sobre el mismo gráfico lo que observaría poniendo la mitad de enzima que en el tubo 2.


3

Cinética de Michaelis-‐Menten. Indique cual es la relación entre el gráfico del problema anterior y el gráfico de velocidad inicial (vo) en función de [S]. Discuta como se construye un gráfico como el de la figura adyacente. 4. Considerando una enzima con cinética Michaeliana y sabiendo que la velocidad máxima (Vmax) para esa

concentración de enzima es de 100 μM/min, determine la velocidad inicial (Vo) de la reacción para los siguientes valores de concentración de sustrato: [S]= 1/3 Km y [S] = 10 Km .

5. Considerando que una enzima con cinética Michaeliana cuyo Km para el sustrato es 2 x 10-‐5 M, cataliza la reacción a una velocidad inicial de 35 μM/min para una concentración de sustrato de 0.01M. ¿Cuál será la velocidad inicial para las siguientes concentraciones de sustrato: 2 x 10-‐6 M, 2 x 10-‐5 M, 2 x 10-‐4 M, 2 x 10-‐3 M y 2 x 10-‐2 M? ¿Qué observa en los valores de velocidad obtenidos? Represente esquemáticamente estos valores en un gráfico Vo = f [S].

6. Aplicando la ecuación de Michaelis-‐Menten defina qué fracción de la velocidad máxima (Vmax ) se alcanza

cuando la concentración de sustrato corresponden a los siguientes valores: [S] = 2Km, [S] = 6 Km, [S] = 10 Km y [S]= 14 Km. En los ensayos enzimáticos se trabaja con una [S]= 10 Km para asegurar que se trabaja en Vmax; discuta esa estrategia en función de sus cálculos del ejercicio 6 y 7

7. Los siguientes resultados de velocidad inicial fueron obtenidos a partir de una reacción catalizada

enzimáticamente, con la utilización de diferentes concentraciones de sustrato:

[S] (mM) vo (mmol/L/min)

0.50 8.0 0.75 10.0 1.00 11.4 1.50 13.0 2.00 15.0

a. Determinar gráficamente los parámetros Vmax y Km utilizando el gráfico de los dobles recíprocos, en que se representa: 1/Vo = f(1/[S]) b. ¿Cuál sería la velocidad de reacción para [S] = 600 mM y [S] = 1200 mM? c. Calcular k2 (kcat) si la concentración de enzima en el ensayo es 8 nM, sabiendo que Vo= kcat [ES] y que por lo tanto: Vmax= kcat [Et]


4

La kcat es la cantidad de sustrato transformado por molécula de enzima por unidad de tiempo y se conoce como el número de recambio de la enzima. Es el numero de S convertidos en P en el sitio activo por unidad de tiempo. La unidad de kcat es la inversa de la unidad de tiempo (s-‐1, min-‐1).

El recíproco de kcat (1/kcat) corresponde al tiempo que dura un ciclo catalítico, es decir el tiempo que transcurre entre la unión de un sustrato al sitio activo y el siguiente en condiciones de saturación.

Para conocer la eficiencia de una enzima se recurre a la relación kcat/KM – Una enzima de una kcat alta y un bajo KM es una enzima de “gran eficiencia”. Mayor número de S transformados y a menores concentraciones de sustrato.

d. Determinar la proporción de enzima libre (EL) cuando [S] = 1 mM y cuando [S] = 100 mM. Debemos considerar que para cada valor de concentración de S se cumple que ETotal = ES + ELibre e. Estas velocidades de reacción fueron obtenidas en presencia de una concentración 8 x 10-‐9 M de la enzima. ¿Cuál sería la velocidad de reacción para [S] = 10 mM si la concentración de enzima hubiese sido 1 x 10-‐8 M? Justifique su respuesta.

8. Se purificó una enzima a partir de un cultivo de bacterias que cataliza la reacción A→P. Se estudió la cinética de dicha enzima y el efecto de una molécula J, siendo [J] = 0,25mM.

a. Determinar Km y Vmax en las condiciones del estudio en ausencia y en presencia de J.

b. ¿Cuál es el efecto de J sobre los parámetros cinéticos evaluados? ¿A qué tipo de modulador corresponde J?

c. ¿Cuál seria el efecto de aumentar la concentración de J sobre la Vmax?

Cooperatividad y alosterismo 9. En la figura se representa velocidad inicial (Vo) en función de concentración de S ([S]) para una enzima

de la glucólisis. a. Indique cuales son las diferencias con los gráficos anteriores y discuta

el significado de este comportamiento. ¿Con qué tipo de enzimas se relaciona esta cinética?

b. Dibuje sobre la gráfica el efecto de un modulador negativo y de un modulador positivo para esta enzima.

c. Identifique gráficamente el K0.5 y discuta su significado.

[A] mM Vo (nmol P/ min) Vo (nmol P/min) en presencia de J

(0.25 mM)

1,00 1,00 0,66

0,55 0,71 0,41

0,25 0,50 0,25

0,20 0,41 0,20


5

II. Bioenergética Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a:

-‐ La célula como un sistema termodinámico: Sistema, entorno y universo. Primera y segunda ley de la termodinámica. La energía libre como energía capaz de efectuar trabajo (ΔG =ΔH -‐ TΔS). Relación entre el equilibrio y la energía libre estándar (ΔGo = -‐RTlnKeq). Criterio de espontaneidad. Sistemas acoplados. Naturaleza aditiva de los cambios de energía libre en una vía metabólica. Utilización de los enlaces de alta energía del ATP para realizar trabajo. Bioenergética de reacciones de óxido-‐reducción. -‐ Termodinámica de las reacciones catalizadas por enzimas. Energía libre de activación y efecto de catalizadores, ΔG de activación. Ley de acción de masas, orden de una reacción. Teoría del estado de transición. 10. Cálculo de ΔGo’ a partir de constantes de equilibrio (Keq). Calcular las variaciones de energía libre estándar

de las siguientes reacciones, a 25oC y pH 7, a partir de las constantes de equilibrio dadas. a. L-‐glutamato + oxalacetato <-‐> aspartato + α-‐cetoglutarato K’eq= 6,8 b. L-‐glutamato + H2O + NADP+ <-‐> α-‐cetoglutarato + NH3 + NADPH K’eq= 0.0038 Compare los valores de ΔGo’. ¿Qué significado tienen estos valores? ¿Sirven para predecir qué ocurre con el glutamato en una célula? Justifique su respuesta. 11. Cálculo de Keq a partir de ΔGo’ . Para cada una de las siguientes reacciones a pH=7 y 25oC, utilizando los valores de ΔGo’, indique si la constante de equilibrio (Keq) será mayor, igual o menor de 1 para cada una y luego calcule el valor de estas contantes. a. ATP + H2O → ADP + Pi ΔGo’= −30.5 kJ/mol b. ADP + Pi → ATP + H2O ΔGo’= 30.5 kJ/mol c. 1,3-‐bifosfoglicerato + ADP à 3-‐fosfoglicerato + ATP ΔGo’= −18.8 kJ/mol 12. Si consideramos una reacción hipotética donde X à Y con ΔGo’= −20 kJ/mol, indique cual es la relación

de concentraciones entre X y Y en el equilibrio. Si la concentración de X en el equilibrio es igual a 1M, cual será la concentración de Y?

13. Reacciones acopladas. Se sabe que la variación de la energía libre estándar (∆Go´) de la hidrólisis de glucosa-‐6-‐fosfato es –12.4 kJ/mol y la variación de energía libre estándar de la hidrólisis de ATP es -‐30.5 kJ/mol. a. Plantee las ecuaciones de ambas reacciones. b. Calcule la variación de energía libre estándar para la reacción catalizada por la hexoquinasa: GLUCOSA + ATP → GLUCOSA-‐6-‐P + ADP


6

14. Calcule la variación de energía libre estándar para la siguiente reacción, buscando los valores de ΔGo’

que considere necesarios; Fosfocreatina + ADP → creatina + ATP 15. Diferencia entre ΔGo’ y ∆G. Calcule la variación de energía libre de hidrólisis (∆G) del ATP a pH 7 y 25oC bajo condiciones de estado estacionario (tal como existen en las células), en las cuales las concentraciones de ATP, ADP y Pi son mantenidas en 1.0 mM, 0.1 mM y 10 mM, respectivamente. La variación de energía libre estándar (ΔGo’) de la hidrólisis de ATP a 25oC y pH 7 es -‐30.5 kJ/mol. El ∆G real de una reacción depende de las características de la reacción (ΔGo’) de las condiciones en que se produce la reacción y de la relación de concentraciones de los productos y los reactivos de esa reacción. Esto se establece en la ecuación: El gráfico representa lo que ocurre con la energía libre de una reacción cuando pasamos de 100 % reactivos a 100% producto. Esta representación nos permite comprender en forma gráfica porqué la reacción ocurre hasta alcanzar el equilibrio, dado por una determinada relación de productos/reactivos que es característica de cada reacción.

Recordemos que el equilibrio está dado por la igualdad de las velocidades de formación de productos y de reactivos y NO por la igualdad de las concentraciones de estos.

16. Si analizamos la energía libre de la reacción de isomerización de la glucosa 6 fosfato (G-‐6-‐P) en fructosa 6 fosfato (F-‐6-‐P) catalizada por la glucosa-‐fosfato isomerasa:

Glucosa -‐6-‐P ⇔ Fructosa-‐6-‐P a. Utilizando el gráfico, calcule la constante de equilibrio, Keq, y

ΔGo’ para la reacción descrita, considerando la temperatura como 25oC. b. Si se tienen iguales cantidades de G-‐6-‐P y F-‐6-‐P y se agrega la

enzima, ¿hacia dónde se desplaza la reacción? c. ¿Cuál será el ∆G real de esta reacción en la célula si las

concentraciones intracelulares medidas en estado estacionario de G-‐ 6-‐P y F-‐6-‐P son de 83 y 14 µM respectivamente?

17. Saccharomyces cereviseae (levadura) es un organismo eucariota unicelular que se caracteriza por tener como principal ruta catabólica la fermentación alcohólica. En esta vía la glucosa se degrada hasta etanol y anhídrido carbónico:

Glucosa → 2Etanol + 2CO2 ∆Go´ = -‐ 186.2 kJ/mol a) ¿Qué tipo de sistema termodinámico es la levadura: cerrado, abierto o aislado? b) ¿En qué utiliza la célula la energía libre obtenida de la fermentación alcohólica?


7

c) Calcule cuántos moles de ATP podría sintetizar con la energía que obtiene de la fermentación por mol de glucosa si los procesos ocurrieran en condiciones estándar. d) En estado estacionario las levaduras tiene una concentración de glucosa de 5 mM y de etanol y dióxido de carbono de 50 y 5 mM, respectivamente. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi son mantenidas en 1.0 mM, 0.1 mM y 10 mM, respectivamente. ¿Cuántos moles de ATP se podrían formar por mol de glucosa oxidado en estas condiciones? ¿Cuántos moles de ATP forma por mol de glucosa si el rendimiento en utilización de la energía de la fermentación alcohólica es del 31%? 18. Los eritrocitos obtienen energía de la oxidación de la glucosa por la via glucolítica. Uno de los pasos de síntesis de ATP es el de la transformación del fosfoenolpiruvato en piruvato. Fosfoenolpiruvato + ADP ó Piruvato + ATP En el estado estacionario la concentración de ATP es de 2.25 mM, la de ADP de 0.25 mM y la de piruvato de 0.051 mM. a-‐ Calcule la concentración de fosfoenolpiruvato asumiendo que dicha reacción se encuentra en equilibrio en la célula. b-‐ La concentración en el estado estacionario de este metabolito es de 0.023 mM, compare este valor con el obtenido en el punto (a). ¿Considera que la reacción está cerca del equilibrio en las condiciones planteadas? 19. Bionergética de las reacciones redox . Calcular el ∆Go´ para las siguientes hemi-‐reacciones de reducción a

partir de su Potencial Estándar de reducción (Eo´) a pH 7.0 y 25oC. Piruvato + 2H+ + 2 e-‐ <-‐> Lactato Eo´ = -‐0.185 V NAD+ + 2H+ + 2 e-‐ <-‐> NADH + H+ Eo´ = -‐0.320 V

Escribir la ecuación equilibrada para la reacción global de transferencia de electrones entre los pares redox Piruvato/Lactato y NADH/NAD+ y determine su ∆Go´. ¿En qué dirección es espontánea bajo condiciones estándar?


8

III. Introducción al metabolismo intermediario y Glucólisis Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a: Metabolismo intermediario: Rutas centrales del metabolismo energético celular. Anabolismo y catabolismo. Estructura y propiedades del ATP. Topografía del metabolismo: principales organelos y compartimientos celulares, asociación de estructuras y funciones celulares. Glucólisis: Localización subcelular, etapas, balance y regulación de la glucólisis. Destinos del piruvato. Estudio de una enzima alostérica: Fosfofructoquinasa 20. Explique la siguiente figura extraída del texto Lehninger. Principios de Bioquímica.

a. Discuta el rol central que ocupa el ATP. b. Busque los valores de ∆Go´ para cada uno de los

compuestos representados en la figura. c. Explique porqué se les denomina compuestos de

“alta energía” y compuestos de “baja energía”.

21. La glucosa entra en la vía glucolítica por su fosforilación a glucosa-‐6-‐fosfato catalizada por dos enzimas:

la hexoquinasa, presente en todas las células y la glucoquinasa exclusiva del hígado. a) ¿Cuáles son los posibles destinos (rutas metabólicas) de la glucosa 6-‐P en los distintos tejidos? b) Altos niveles de ATP y bajos de AMP inhiben a la fosfofructoquinasa. ¿Qué sucede con la actividad de la hexoquinasa y glucoquinasa en esta situación? Analice la regulación de ambas isoformas. 22. La glucólisis es una secuencia de 10 reacciones catalizadas por enzimas por la cual una molécula de

glucosa se convierte en 2 moléculas de piruvato. Con el objetivo de estudiar termodinámicamente la vía se determinaron los valores de variación de energía libre (ΔG) para todas las reacciones en el músculo cardíaco. En la tabla se presentan estos valores y las variaciones de energía libre estándar a pH 7 (ΔGo’)


9

Reacción Enzima ΔGo’ (kJ/mol) ΔG (kJ/mol) 1 Hexoquinasa -‐20.9 -‐27.2 2 Fosfoglucosa isomerasa +2.2 -‐1.4 3 Fosfofuctoquinasa -‐17.2 -‐25.9 4 Aldolasa +22.8 -‐5.9 5 Trisoa fosfato isomerasa +7.9 +4.4 6+7 Gliceraldehído-‐3-‐PDH

+ Fosfogliceratoquinasa -‐16.7 -‐1.1

8 Fosfoglicerato mutasa +4.7 -‐0.6 9 Enolasa -‐3.2 -‐2.4 10 Piruvato quinasa -‐23.0 -‐13.9

a) ¿Qué reacciones se encuentran cercanas al equilibrio y cuáles se encuentran alejadas del equilibrio, en el músculo cardíaco? b) ¿Qué enzimas serían candidatas a controlar el flujo de metabolitos por la vía glicolítica? ¿Por qué? c) ¿Cómo se explica la diferencia de energía en condiciones estándar y fisiológicas, de la reacción catalizada por la aldolasa? 23. Como podemos observar en la tabla del ejercicio anterior la reacciones 6 y 7 de la glucólisis se colocan

juntas. Esto se debe a que una reacción que no es favorable puede ser acoplada a una altamente favorable de forma que la suma de las reacciones ocurra en la dirección favorable (reacciones acopladas) a. Plantee las reacciones 6 y 7 y la suma proveniente de ambas. b. ¿Qué nombre recibe esta reacción de síntesis de ATP? ¿Qué otro mecanismo de síntesis de ATP posee la célula?

24. El arsénico pentavalente o arsenato (HAsO4

2-‐) puede sustituir al fosfato (HPO42-‐) y formar ésteres de

arsenato que se hidrolizan espontáneamente. Su efecto se puede observar en la reacción catalizada por la gliceraldehído-‐3-‐P deshidrogenasa. Plantee la reacción catalizada por esta enzima durante una intoxicación por arsenato. a. Plantee un balance para la transformación de una molécula de glucosa en dos moléculas de piruvato

en presencia de ATP, ADP, NAD+ y a) fosfato b) arsenito b. Si se cultivan células en presencia de Pi o de As, consumen igual cantidad de glucosa? c. El efecto de esta exposición es el mismo en los distintos tipos celulares?, cuáles se verían mas

afectadas por la presencia del As?

25. Durante la actividad intensa el tejido muscular demanda altas cantidades de ATP comparado con el tejido en reposo. Este proceso se produce casi exclusivamente por fermentación láctica y el ATP es producido por las reacciones catalizadas por las enzimas fosfogliceratoquinasa y piruvato quinasa. ¿Si el músculo esquelético fuera desprovisto de la enzima lactato deshidrogenasa podría llevar a cabo actividad física intensa, es decir, generar ATP a alta velocidad por la glucólisis? Explique.


10

26. Análisis cinético y termodinámico de la fosfofructoquinasa (PFK). Modulación alostérica. La PFK cataliza la fosforilación de la fructosa-‐6-‐fosfato (F-‐6-‐P) para formar fructosa-‐1,6-‐bifosfato (F-‐1,6-‐BP) reacción catalizada por la fosfofructoquinasa-‐1 (PFK-‐1).

Fructosa-‐6-‐P + ATP Fructosa-‐1,6-‐BP + ADP

I. A continuación se muestran las concentraciones intracelulares de los sustratos que intervienen en la fosforilación de la fructosa-‐6-‐fosfato en tejido cardíaco de rata, medidas por técnicas de criocompresión:

Metabolito Concentración (mM) Fructosa-‐6-‐P 0.087

Fructosa-‐1,6-‐BP 0.022 ATP 11.4 ADP 1.32

a) Calcular la relación de acción de masas: [F-‐1,6-‐BP][ADP]/[F-‐6-‐P][ATP] b) Dado que el ΔGo’= -‐14.2 kJ/mol, calcular la Keq. Comparar la relación de acción de masas y la Keq.¿Se encuentra en equilibrio esta reacción?¿Qué nos dice esto sobre el papel de la PFK1 como enzima reguladora? Se presentan a continuación datos experimentales que ilustran su rol en la regulación de la vía glucolítica. Se pide que las gráficas sean realizadas en el domicilio previo a la discusión de los resultados. II. Cinética de la PFK en función de la concentración de ATP y de F-‐6-‐P. El ensayo cinético consistió en medir la desaparición de NADH (0.2 mM) a 340 nm en función del tiempo en presencia de fructosa 6-‐fosfato, ATP, MgCl2, NADH y Pi, así como de las siguientes enzimas acopladas: aldolasa, triosafosfato isomerasa y glicerol-‐3-‐fosfato deshidrogenasa. El ensayo fue realizado a pH 7.0 con una concentración fija de F-‐6-‐P 2 mM o a una concentración fija de ATP 3 mM. En ambos casos se inició el ensayo con el agregado de 0.1 µg/ml de PFK-‐1. a) Gráfico de v en función de [ATP] y [GTP] a una concentración fija de F-‐6-‐P 1-‐ ¿Cual es la secuencia de reacciones en el ensayo acoplado para medir la velocidad de la PFK? ¿Porqué se mide la desaparición del NADH para determinar la velocidad de la reacción si en la glucólisis no se consume NADH?¿Por qué se agrega MgCl2 en el ensayo enzimático? 2-‐ Analice el diferente comportamiento de los sustratos ATP y GTP.

Mg2+


11

3-‐ ¿Cual es la concentración intracelular de ATP en estado estacionario? ¿Cómo será la actividad de la enzima en estas condiciones? 4-‐ Si la concentración de ATP baja en la célula desde 2.5 mM a 1 mM, ¿qué sucede con la actividad de la PFK? b) Velocidad de la PFK en función de la concentración de F-‐6-‐P a una concentración fija de ATP (3 mM). v (U/mg) F-‐6-‐P (mM) v (U/mg) F-‐6-‐P (mM) V (U/mg) F-‐6-‐P (mM) 1.5 1 15 5 63 12 2 2 30 6 68 14 4.5 3 48 8 69 15 8.5 4 60 10 70 20 1 unidad (U) es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato por minuto. 1-‐ Graficar la velocidad en función de concentración de F-‐6-‐P. (Asistir a la discusión grupal en computadora) 2-‐ ¿Cómo es la cinética de la PFK en función de F-‐6-‐P?. ¿Cómo es la unión de la F-‐6-‐P a la enzima? ¿Cuál es su K0.5? III-‐ Cinética de la PFK en presencia de citrato y AMP. a) Efecto del AMP:

¿Cuál es el efecto de AMP sobre la cinética de la PFK? ¿Como describiría el rol del AMP para la reacción?


12

b) Efecto del citrato Citrato (mM)

F6P (mM) 0 0.2 1 5

v (U/mg)* 2 2 1.8 0.5 0.2 4 8 7.5 1 0.45 6 25 20 8 2 8 50 42 18 3 10 65 60 30 8 12 69 65 45 10 14 70 69 58 18 16 72 70 62 28 20 -‐ -‐ 65 45 25 -‐ -‐ 66 55 30 -‐ -‐ -‐ 60

*Una unidad de actividad enzimática (U) es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de S por minuto. 1-‐ Graficar velocidad de la PFK en función de concentración de citrato. (Asistir a la discusión grupal con las gráficas realizadas en computadora) 2-‐ ¿Cuál es el efecto del citrato sobre la cinética de la PFK? 3-‐ En las células hepáticas, ¿cuál es el principal modulador alostérico de la PFK y cómo se regula su síntesis?


13

IV. Ciclo de Krebs. Cadena Respiratoria. Fosforilación Oxidativa Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a: Ciclo de Krebs. Localización subcelular del Ciclo de Krebs. Panorámica general del ciclo. Decarboxilaciones oxidativas: isocitrato deshidrogenasa y a-‐cetoglutarato deshidrogenasa. Fosforilación a nivel de sustrato: succinil-‐CoA sintetasa. Balance energético del ciclo. Regulación del ciclo. El ciclo de Krebs como ruta anabólica y reacciones anapleróticas. Reacciones de oxidación-‐reducción: Potencial redox estándar. Cambios de energía libre en las reacciones de oxidación reducción (ΔGo

ʹ′ʹ′ = -‐ nF ΔEoʹ′ʹ′). Cadena Respiratoria. Componentes de la cadena de transporte de electrones: flavoproteínas, citocromos, ferro-‐sulfo proteínas y coenzima Q. Secuencia del transporte de electrones: complejos de la cadena respiratoria. Ingreso de electrones a la cadena respiratoria. Lanzaderas para el ingreso del NADH. Fosforilación oxidativa. Síntesis de ATP acoplado al flujo de electrones. Hipótesis quimiosmótica: generación del gradiente de protones. Mecanismo de la síntesis de ATP; estructura de la ATPasa. Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa e inhibidores. Balance y regulación global. Índice P/O. Utilización del ATP por la célula: transporte de metabolitos a través de membranas, trabajo mecánico y síntesis de biomoléculas. 27. La formación de acetil-‐CoA a partir de piruvato es una decarboxilación oxidativa catalizada por el

complejo piruvato deshidrogenasa. a) ¿Qué ventajas presenta el hecho que el complejo piruvato deshidrogenasa sea multienzimático? b) ¿Cuáles son los componentes del complejo y qué reacciones catalizan? c) ¿Cuál es el sustrato oxidado y cual el reducido? d) ¿En qué compartimiento subcelular ocurre la decarboxilación oxidativa del piruvato 28. El Ciclo de Krebs cataboliza el Acetil-‐ CoA: a) Escriba una ecuación equilibrada que describa la reacción catalizada por cada enzima del ciclo b) ¿Qué cofactores son necesarios para cada reacción? ¿Cuándo es necesario un cofactor en una reacción enzimática? c) Identifique qué tipo de reacción cataliza cada enzima: condensación (formación de enlace C-‐C), deshidratación, hidratación, descarboxilación, óxido-‐reducción, fosforilación a nivel de sustrato. d) Escriba la ecuación que describe la oxidación de Acetil-‐CoA a CO2. (Balance global del Ciclo). 29. En los experimentos que permitieron dilucidar el ciclo del ácido cítrico, Krebs observó que la adición de malonato a extractos de músculo esquelético de paloma inhibe la utilización de piruvato y provoca la acumulación de succinato. a. ¿Por qué inhibe el malonato?


14

b. ¿Qué fue capaz de concluir cuando encontró que se acumulaba el succinato en las preparaciones tratadas con malonato, luego de la adición de citrato, isocitrato o α-‐cetoglutarato? c. ¿Por qué fue también significativa la acumulación de succinato en las preparaciones tratadas con malonato cuando el sustrato añadido era fumarato, malato u oxalacetato? d. Explique por qué cuando las preparaciones son tratadas con un exceso de oxalacetato se puede superar la inhibición causada por malonato. 30. Los enfermos de Beri-‐beri, enfermedad ocasionada por un déficit de tiamina en la dieta, tienen niveles sanguíneos de piruvato y α-‐ cetoglutarato elevado, en especial después de comidas ricas en glucosa. ¿Qué relación existe entre esos efectos y el déficit de tiamina? 31. Existen vías metabólicas que consumen intermediarios del Ciclo de Krebs. Un ejemplo es la síntesis del neurotransmisor ácido γ-‐aminobutárico (GABA) a partir de glutamato en el tejido nervioso.¿A partir de que intermediario del ciclo se sintetiza el neurotransmisor? ¿Cómo se repone el intermediario para que el ciclo siga funcionando? 32. Aunque el oxígeno no participa directamente del ciclo de Krebs, explique porqué el ciclo sólo opera en condiciones aeróbicas. ¿Cuál es la molécula reguladora? 33. El dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD+) es la principal molécula transportadora de electrones a nivel celular que luego puede cederlos a la cadena respiratoria y de este modo al oxígeno. Dadas las siguientes semi-‐reacciones y sus potenciales redox estándar (Eº):

NAD+ + 2H+ + 2e-‐ → NADH + H+ Eº = -‐ 0.315 V ½ O2 + 2H+ + 2e-‐ → H2O Eº = 0.815 V

a) Si el par NAD+/NADH y el par ½ O2/H2O reaccionan directamente en condiciones estándar ¿quién se lleva los electrones, es decir quién es el agente oxidante? Plantee la reacción global y determine la variación de energía libre. b) ¿Cuántos moles de ATP se podrían formar por mol de NADH oxidado en esta reacción? ¿Coincide este dato con lo que ocurre en la cadena respiratoria? ¿Qué rol cumplen en la cadena respiratoria mitocondrial las vitaminas y minerales ingeridos en la dieta? 34. Un mitoplasto es una mitocondria sometida a permeabilización con detergentes de forma que se le extrae selectivamente la membrana externa. Por lo tanto, la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa no se alteran. Si a un mitoplasto (mitocondria sin membrana externa) se le elimina el citocromo c por extracción salina dejando intactos el resto de los componentes y luego se le adicionan sustratos generadores de NADH y succinato: a) ¿Cuál será el estado redox de la NADH deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa, CoQ, Cit b y a? b) ¿Consume O2? Justifique su respuesta. 35. ¿Cómo entran a la cadena respiratoria los equivalentes de reducción provenientes de: glucólisis, β-‐oxidación y Ciclo de Krebs? Realice un esquema con todos los sitios de ingreso de electrones a la cadena.


15

36. La isocitrato deshidrogenasa se localiza a nivel mitocondrial, en cambio la malato deshidrogenasa se ubica a nivel mitocondrial y citosólico. ¿Cuál es el rol de la malato deshidrogenasa en el citosol?. 37. En 1961 Mitchell desarrolló la denominada hipótesis quimiosmótica para explicar la génesis mitocondrial de ATP. Postuló que la energía libre del transporte mitocondrial de electrones es conservada “bombeando” H+ desde la matriz mitocondrial al espacio intermembranoso, creándose así un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana mitocondrial interna. El retorno exergónico de los protones a la matriz mitocondrial impulsa la síntesis de ATP, es decir que el potencial electroquímico de dicho gradiente es utilizado para sintetizar ATP.

a) Sabiendo que el potencial de membrana a través de la MMI de una mitocondria de hígado es 0.168 V (interior negativo) y el gradiente de pH 0.75 (pH matriz – pH espacio intermembranoso), calcule el ΔG asociado al transporte de 1 mol de protones hacia afuera de la matriz mitocondrial. b) Si las concentraciones intracelulares en estado estacionario de ATP, ADP y Pi son 5, 0.5 y 1 mM respectivamente, ¿la reentrada de 1 protón a la matriz mitocondrial es suficiente para impulsar la síntesis de ATP? 38. Mucha de la información acerca de la cadena respiratoria se obtuvo utilizando inhibidores, los cuales pueden ser inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de la fosforilación oxidativa y desacoplantes, ¿cuál es la diferencia entre ellos y a qué nivel actúan? 39. Estudio de una enfermedad mitocondrial: análisis de las bases moleculares de una patología OxPhos Un niño que nació luego de 40 semanas de gestación desarrolló en las primeras 24 horas de vida problemas respiratorios y a las 6 semanas problemas neurológicos y cardíacos, revelando los exámenes la existencia de una miocardiopatía. Entre las 15 y las 16 semanas se detectó además una acidemia láctica progresiva, con un valor de pH de 7.30 (rango normal 7.38-‐7.44), con valores de piruvato y de la relación lactato / piruvato elevados. La acidemia láctica persistió hasta que el niño murió de un paro cardio respiratorio a las 16 semanas de vida.


16

A fin de comprender las bases moleculares de la patología que provocó la muerte de este niño se evaluó la funcionalidad de las vías del metabolismo energético en el tejido cardíaco con los siguientes resultados:

• Las actividades de las enzimas de la vía glucolítica y de la piruvato deshidrogenasa eran normales. • Estudios de resonancia paramagnética de electrones (EPR) indicaron que el contenido de hierro de

las mitocondrias era menor al normal y lograron identificar qué tipo de grupo prostético se hallaba afectado.

Se purificaron mitocondrias de músculo cardíaco y se valoró su funcionalidad: La gráfica A presenta el consumo de oxígeno mitocondrial en función del tiempo en presencia de piruvato y malato, antes y después de agregar 7.2 µmoles de ADP La gráfica B presenta el consumo de oxígeno mitocondrial en función del tiempo en presencia de succinato antes y después de agregar 7.2 µmoles de ADP. a) ¿Estas mitocondrias se encuentran desacopladas? ¿Son capaces de sintetizar ATP? Esquematice un

registro de respiración mitocondrial en ausencia y presencia de un agente desacoplante y un registro en presencia y en ausencia de un inhibidor de la cadena respiratoria.

b) ¿Cuál es la relación P/O con succinato? ¿Es la esperada? ¿Se puede calcular la relación P/O con

piruvato/malato? ¿Cuál es la relación P/O esperada en mitocondrias normales con NADH como sustrato? ¿Y con FADH2?

c) ¿Qué conclusiones pueden sacar con respecto a la funcionalidad mitocondrial del tejido cardíaco de este

niño? d) Diseñe un esquema que presente las principales vías metabólicas mitocondriales y contenga a los

principales complejos enzimáticos. A partir de los datos obtenidos con las mitocondrias plantee a que nivel podríamos encontrar un defecto en el metabolismo mitocondrial.

Succinato

ADP

1 min

1 µmol de O2

A

B

Piruvato/Malato ADP


17

e) ¿Cómo puede explicar la debilidad muscular y los problemas neurológicos del niño tomando en cuenta los datos aportados?

f) La enfermedad de este niño se encuentra dentro del grupo de las acidosis lácticas congénitas. ¿Porqué?

¿A que se debe el aumento del ácido láctico en sangre? g) Las enfermedades que involucran a componentes de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa se

conocen como enfermedades OXPHOS, y se encuentran entre las enfermedades degenerativas más comunes. Algunos de los componentes de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa son codificados por el ADN mitocondrial: 7 subunidades del complejo I, 1 subunidad del Complejo III, 3 subunidades del complejo IV y 2 subunidades del complejo ATP sintasa. El resto son codificados por el ADN nuclear. • Plantee una hipótesis sobre la causa de la enfermedad de este niño y que experimentos realizaría

para probarla.

• La mayoría de los casos reportados hasta el momento se deben a fallas en los componentes codificados por el ADN mitocondrial. ¿A qué puede deberse esto?


18

V. Ruta de las pentosas fosfato. Gluconeogénesis Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a: Ruta de las pentosas fosfato: Etapa oxidativa y no oxidativa, regulación y balance de la ruta de las pentosas fosfato. Utilización del NADPH y de la ribosa 5 fosfato por la célula.

Gluconeogénesis. Reacciones de la gluconeogénesis. Relación con la glucólisis. Balance y regulación 40. Explicar el destino metabólico de la glucosa 6-‐fosfato bajo cada una de las siguientes condiciones: a) las necesidades de NADPH son mayores que las de ribosa 5-‐fosfato b) las necesidades de ribosa 5-‐fosfato son mayores que las de NADPH c) las necesidades de ribosa 5-‐fosfato y de NADPH son del mismo orden. 41. Se realizó un estudio sobre los niveles de actividad de enzimas del metabolismo de la glucosa en los eritrocitos. Se estudio una población de 100 individuos sanos de características comparables (edad, peso). En 3 de ellos se detectó una actividad de la enzima glucosa –6-‐fosfato deshidrogenasa 10 veces menor a la del resto de los individuos. a) ¿Cómo serán los niveles de ATP, NADH y NADPH de estos individuos comparados con el resto? b) ¿Cómo puede afectar esto al eritrocito y su función? c) Si la actividad glucosa-‐6-‐fosfato deshidrogenasa se encontrara disminuida en otros tejidos ¿qué vías metabólicas podrían estar afectadas? 42. Por cada glucosa 6-‐P que es completamente oxidada a CO2 por la ruta de las pentosas, ¿cuál es el rendimiento en NADPH? ¿En qué tejidos espera encontrar un mayor consumo de glucosa por esta ruta? 43. El músculo esquelético libera grandes cantidades de alanina (Ala) y lactato en distintas condiciones metabólicas. A nivel hepático éstos son captados y utilizados para formar glucosa, la que es entonces liberada desde el hígado al torrente sanguíneo. a) ¿Qué reacciones sufren la Ala y el lactato para superar las etapas fuertemente exergónicas de la glucólisis y formar glucosa? b) ¿En qué compartimentos se produce este proceso? c) Señale en que etapas se podrían producir ciclos fútiles. ¿Cuál sería el efecto a nivel celular de tales ciclos y cómo se evitan? 44. A partir de hígado de rata se obtuvieron, por centrifugación diferencial fracciones subcelulares enriquecidas en: núcleo, mitocondrias, fragmentos de membrana (retículo y membrana plasmática) y citosol. Se determinó la actividad de las enzimas de la gluconeogénesis en las distintas fracciones a) ¿Qué actividades se encontrarán en las distintas fracciones? b) Si agregamos oxalacetato y ATP marcado con fósforo radioactivo a la fracción citosólica ¿Qué metabolitos marcados con fósforo se acumularán? c) Si agregamos oxalacetato y ATP marcado a la fracción mitocondrial ¿Qué metabolitos marcados se acumularán?


19

d) Si realizamos el mismo proceso de obtención de fracciones subcelulares a partir de músculo esquelético ¿obtendremos las mismas actividades enzimáticas en las mismas fracciones? 45. Un paciente presenta una infección bacteriana que produce una endotoxina que inhibe a la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. Analice que ocurrirá con la síntesis de glucosa a partir de los siguientes precursores: alanina, glicerol, fosfoenolpiruvato y galactosa.


20

VI. Síntesis y degradación de los ácidos grasos. Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a:

Síntesis de ácidos grasos. Etapas de la síntesis de ácidos grasos (acetil-‐CoA carboxilasa y complejo ácido graso sintasa). Localización subcelular, regulación y balance. Reacciones de elongación e insaturación de ácidos grasos. Almacenamiento de ácidos grasos como triacilglicéridos.

Oxidación de ácidos grasos: Localización subcelular. Órganos que obtienen su energía predominantemente por esta ruta. Etapas: Activación de ácidos grasos, transporte a través de la membrana mitocondrial interna, b-‐oxidación propiamente dicha: ruta de los carbonos y de los electrones. Balance global y regulación. 46. A una fracción soluble de hígado se le agrega [14C]acetil-‐CoA (marcada radiactivamente en todos los carbonos) resultando en la formación de ácido palmítico con todos los carbonos marcados. Sin embargo si al mismo preparado de hígado se le agregan pequeñas cantidades de [14C]acetil-‐CoA y un exceso de malonil-‐CoA sin marcar, obtenemos ácido palmítico marcado solamente en los carbonos 15 y 16. Utilizando sus conocimientos sobre las síntesis de ácidos grasos explique estas observaciones. 47. Plantee la ecuación de la síntesis de ácido palmítico en el hígado de la rata a partir de acetil CoA mitocondrial, NADPH citosólico, ATP y CO2. 48. ¿Cuál sería el efecto sobre la síntesis de ácidos grasos de un aumento de la concentración intramitocondrial de oxalacetato? 49. Franz Knoop en 1904 propuso el nombre de β-‐oxidación para el proceso biológico de oxidación de ácidos grasos, mucho antes que se conociera la CoA y las enzimas involucradas (descubrimiento que ocurre por 1950). Knoop alimentó perros con ácidos grasos modificados en el último carbono, llamado carbono ω, con un anillo de benceno. Utilizó dos tipos de ácidos grasos: con número par de carbonos y con número

impar. Aisló de la orina de los perros los productos que poseían un grupo fenilo. Los perros alimentados con ácidos grasos de número impar originaron ácido benzoico. Los perros alimentados con ácidos grasos de número par produjeron en

su orina ácido fenilacético: a) ¿Por qué ambos grupos de perros no originaron el mismo producto final, ácido benzoico o fenilacético? b) ¿Por qué Knoop utilizó el nombre de β-‐oxidación? c) ¿Cómo son la mayoría de los ácidos grasos de la dieta, de número par o impar de átomos de carbono? ¿Cuáles son los productos finales de oxidación para ambos casos? 50. Explique el rol de la carnitina acil transferasa en la compartimentalización de la β-‐oxidación de los ácidos grasos.

COOH

COOH

COOH

COOH

ácido fenilacético

ácido benzoico


21

51. Los ácidos grasos son convertidos a sus ésteres de coenzima A por una reacción reversible catalizada por la acil:coenzima A sintetasa: R-‐COO-‐ + ATP + CoA R-‐CO-‐ CoA + AMP + PPi Si bien esta reacción posee una constante de equilibrio cercana a 1, la célula posee un mecanismo que favorece la formación de acil-‐CoA. Explique.


22

VII. Integración del metabolismo. Al finalizar el tema, el estudiante debe conocer los fundamentos teóricos referidos a: Metabolismo intermediario e integración del metabolismo. Naturaleza convergente del catabolismo y divergente del anabolismo. Glucosa-‐6-‐fosfato, piruvato y acetil-‐CoA como encrucijadas metabólicas. Roles del ATP, NADH Y NADPH. Acción coordinada de las rutas metabólicas en distintas situaciones celulares. Roles de la compartimentalización y la regulación coordinada de las vías de producción y almacenamiento de energía. Especialización metabólica de los distintos órganos 52. Durante el ayuno se hidrolizan triglicéridos presentes en el tejido adiposo. Los ácidos grasos viajan por la sangre a los tejidos donde son oxidados en la mitocondria, produciendo grandes cantidades de acetil CoA a) ¿Qué ocurre en estas condiciones con la velocidad del flujo de metabolitos por el Ciclo del Ácido Cítrico? b) ¿Qué enzimas son responsables de esta variación en el flujo? c) ¿Cuáles son los mecanismos de regulación de estas enzimas? 53. Es bien conocido que las dietas ricas en carbohidratos se asocian con aumento de peso debido principalmente a un aumento del tejido adiposo. a) Explique esquemáticamente el mecanismo por el cual la glucosa se transforma en ácidos grasos. b) ¿En qué órgano se produce principalmente dicha reacción? c) ¿Es posible sustituir totalmente los carbohidratos de una dieta por lípidos? 54. El consumo de glucosa por el músculo cardíaco puede ser medido haciendo circular artificialmente sangre a través de un corazón intacto aislado y midiendo la concentración de glucosa antes y después de que la sangre pase por el corazón. Si la sangre es desoxigenada, el músculo cardíaco consume glucosa a un nivel estacionario. Cuando se adiciona oxígeno a la sangre, la velocidad de consumo de glucosa cae dramáticamente y luego continúa a una velocidad menor. ¿Por qué? 55. Analice las similitudes y diferencias, estructurales y funcionales, del NADH y NADPH. 56. Plantee cuáles pueden ser los diferentes destinos metabólicos de la glucosa 6-‐fosfato, el piruvato y la acetil CoA en un hepatocito, en condiciones de ayuno y después de una comida abundante. 57. Análisis de las bases moleculares de la intoxicación alcohólica

Las células animales (principalmente los hepatocitos) contienen la enzima citosólica alcohol deshidrogenasa (ADH) que cataliza la oxidación del etanol a acetaldehído. El acetaldehído entra a la mitocondria donde es oxidado a acetato por la enzima acetaldehído deshidrogenasa (AcDH). CH3 – CH2 – OH + NAD+ -‐> CH3 – HCO + NADH ADH CH3 – HCO + NAD+ -‐> CH3 – COOH + NADH AcDH Los efectos metabólicos de la intoxicación con alcohol surgen de las acciones de estas dos enzimas que


23

llevan a un desbalance de la relación NADH/NAD+ en la célula. A continuación presentamos algunos datos de la historia clínica de un paciente alcohólico, Alberto Martini, a fin de que sean analizados desde una perspectiva molecular. Alberto Martini es alcoholista, llegó a la emergencia del hospital confuso y tembloroso. Su vecina le dijo al médico que había estado tomando mucho durante la última semana. En este tiempo su apetito había disminuido y casi no había comido en los últimos tres días. Su nivel de glucosa en sangre era de 28 mg/dl (niveles normales luego del ayuno nocturno 80-‐100 mg/dl), y el de alcohol en sangre de 295 mg/dl (niveles de intoxicación 150-‐300 mg/dl). Los exámenes de laboratorio revelaron que tenía una acidemia, acompañada de niveles altos del cuerpo cetónico ß-‐ hidroxibutirato (40 veces mayores a los normales) y de ácidos grasos en sangre. El análisis de acetona en orina dio negativo. a. ¿A que se deben los niveles bajos de glucosa en sangre del Sr Martini? ¿Cómo se encontrarán los depósitos de glucógeno hepático de Alberto Martini?¿Porqué? b. ¿Qué ocurrirá con la gluconeogénesis a partir de lactato, a partir de glicerol y a partir de oxalacetato? Cuál es la diferencia entre el ayuno con consumo de alcohol y sin consumo de alcohol en estas vías? c. ¿Qué vías metabólicas utilizará Alberto Martini para la síntesis de ATP en cerebro y músculo?¿Qué ocurrirá en el hígado? c. Indique cuáles son los cuerpos cetónicos, su síntesis y metabolismo. ¿A qué se debe la presencia de niveles altos de ß-‐hidroxibutirato y de ácidos grasos en la sangre de Alberto Martini? ¿Cómo explica que el test de acetona en la orina diera negativo y que el cuerpo cetónico predominante sea el ß-‐hidroxibutirato? d. ¿A qué se debe la acidemia? e. ¿Por qué es frecuente que los alcohólicos desarrollen depósitos de triglicéridos en el hígado (síndrome de hígado graso)? f. ¿Qué vías metabólicas hepáticas serán inhibidas por este aumento de la relación NADH/NAD+? ¿Cuáles son los puntos claves (enzimas) de estas vías que serán responsables de la inhibición?


24

58. Análisis del metabolismo intermediario de una célula cancerígena.

Existen puntos clave de varias de las vías de señalización cuyas mutaciones convergen en la adaptación del metabolismo de las células tumorales al objetivo de apoyar su crecimiento y supervivencia, siendo, aparentemente, algunas de estas alteraciones metabólicas necesarias para la malignidad. Las células con alta tasa de división (ya sean tumorales o no) presentan tres necesidades básicas: (1) la generación rápida de ATP para mantener el estado energético (2) el aumento de la biosíntesis de macromoléculas (3) mantenimiento del estado redox En función de estas características analice y explique la siguiente figura.

1-‐ Explique el efecto Warburg y el efecto Warburg reverso. Ver material adjuntado en EVA para la discusión. 2-‐ Indique como cuál o cuáles de las vías de la figura están implicadas en resolver las tres necesidades básicas planteadas.

guía de problemas para dg- bioquimica 2015 · pdf...

Documents