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Guía de PCR en tiempo real Michelle C. Chirinos-Arias
Índice
Introducción…………………………………………………………………………………………………………. 2
Algunos conceptos…………………………………………………………………………………………………. 2
PCR (reacción en cadena de la polimerasa)……………………………………………………………... 2
PCR en tiempo real (qPCR)…………………………………………………………………………………….. 3
Tipos de sondas……………………………………………………………………………………………………... 3
Cuantificación absoluta………………………………………………………………………………………….. 4
Cuantificación relativa…………………………………………………………………………………………… 4
Procedimiento práctico………………………………………………………………………………………….. 5
Problemas de cálculo en la PCR………………………………………………………………………………. 8
Solución de los problemas de cálculo en PCR……….………………………………………………….. 9
Interpretación avanzada de curvas de qPCR…………………………………………………………. 15
¿cómo citar la siguiente publicación?............................................................................................... 22
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Guía de PCR en tiempo real Michelle C. Chirinos-Arias
Introducción
La siguiente guía contiene conceptos y fundamentos de la PCR en tiempo real. En un
principio se describe conceptos básicos de la reacción en cadena de la polimerasa,
luego se orienta a la parte experimental y por último a la parte de interpretación de
resultados.
Como usted podrá ver a lo largo de la guía, en ella se encuentran problemas de
cálculo básico para cualquier tipo de PCR, pero que son muy importantes en el manejo
del laboratorio de biología molecular.
Es necesario entender los conceptos básicos descritos aquí para poder realizar
investigación y/o diagnóstico molecular. Ya que la PCR en tiempo real es una técnica
muy usada en el laboratorio por ser más sensible y exacta que una PCR convencional.
Sin embargo, tiene limitaciones relacionadas más que nada a la contaminación, por lo
que es necesario mantener los materiales e instrumentos estériles para evitar falsos
positivos.
Algunos conceptos
PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
Es una técnica en biología molecular, la cual utiliza gradientes de temperatura para la
amplificación de un segmento de ADN. Para lo cual se necesita de ciertos reactivos
entre ellos los iniciadores o primers, la enzima polimerasa, el buffer de la enzima,
MgCl2, dNTPs, ADN molde (template) y agua.
Este método tiene tres etapas que forman un ciclo el cual se repite. Usualmente la PCR
posee entre 30 a 40 ciclos.
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La primera etapa es la denaturación. En ella las hebras de ADN se separan. Esto
debido a que se rompen los puentes de hidrógeno que las unen debido a la alta
temperatura a la que es sometida la reacción (94-95 °C).
La segunda etapa es la hibridación o annealing. En la cual el primer o iniciador se une
al ADN molde. Esta es la etapa crucial, ya que si el primer no se ancla, no se
producirá la amplificación, pudiéndonos dar resultados falsos negativos. Para lo cual
es necesario encontrar la temperatura de hibridización correcta, que usualmente
oscila entre 45-65 °C.
La tercera etapa se conoce como extensión. En ella la polimerasa sintetizará una
nueva hebra de ADN a partir del primer anclado. Está fase usualmente se produce a
una temperatura de 72 °C.
PCR en tiempo real (qPCR)
Es el monitoreo continuo de la acumulación del producto amplificado durante una
PCR. Se basa en la detección y cuantificación de la fluorescencia de una molécula
reportera (sonda), medida a lo largo del ciclaje.
Una curva típica de PCR en tiempo real debe tener las siguientes partes:
• Línea base (Background): son los niveles de señal de fluorescencia durante los
primeros ciclos (lo que se conoce como ruido, pues no pasa el umbral).
• Ct= threshold cycle: es el primer incrementó significativo en la cantidad de
producto de PCR, medido por el aumento de fluorescencia. No significa que no
exista fluorescencia antes, solo que no es detectada por el termociclador.
• Fase logarítmica: incremento exponencial del producto de PCR.
• Meceta: Tope de la amplificación.
Como se puede apreciar una curva típica de PCR en tiempo real se parece a una curva
de crecimiento microbiano. Es decir de forma sigmoidea.
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Tipos de sondas
Existen distintos tipos de sondas para la PCR en tiempo real. Pueden ser reversibles
(es decir que se pueden unir al ADN más de una vez) o pueden ser irreversibles (es
decir que una vez unidas al ADN son hidrolizadas). Las más conocidas son:
SybrGreen
• Se une a cualquier ADN de doble hebra (dsADN), por lo que es una sonda
reversible.
• Su fluorescencia se incrementa unas 1000 veces cuando esta unido al dsADN.
• Ventajas: Simple, rápida optimización, bajo costo.
• Desventajas: Inespecificidad, mayor ruido, no se puede hacer una PCR
multiplex en un mismo tubo de reacción.
Sonda TaqMan
• Específica para la secuencia target. Tiene un reportero fluorescente en el
extremo 5´ y un quencher (apagador) en el extremo 3´. Cuando el reportero se
libera exhibe fluorescencia, esta señal es proporcional a la cantidad de
producto amplificado. Para poder liberar al reportero es necesario la hidrólisis
de la sonda, por lo que es del tipo irreversible.
• Ventajas: Alta especificidad, se puede realizar PCR multiplex.
• Desventajas: Costo y optimización.
La técnica de PCR en tiempo real usualmente se utiliza para cuantificación. Los tipos
de cuantificación que se puede realizar con este método son los siguientes:
Cuantificación absoluta: en base a estándares.
Cuantificación relativa: en base a la cuantificación por estándares de un gen de
referencia.
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Procedimiento práctico
I.- Objetivo:
Identificar la presencia de M. tuberculosis de muestras de Biopsia por PCR en tiempo
real.
II. Equipos y reactivos requeridos
a. Equipo
Termociclador en tiempo real. Ej: Light Cycler (ROCHE).
b. Materiales y reactivos
Capilares Light Cycler
Agua Grado Molecular
Control no relacionado
Control positivo
Blanco (mix sin DNA)
SybrGreen.
Primers Mtb
Primers de Actina
III. Preparación de la PCR
Se usa un control positivo, un control no relacionado, un control negativo. A
parte también se corren las muestras con actina (gen de referencia).
Soluciones de Trabajo Volumen (µl) x Rx [ ] Final
Sybrgreen 10ul 1X
Primers Forward y reverse 01ul 250nM
ADN Muestra o Controles 01ul 100ng
Agua grado Molecular Csp ---
Volumen Final 20ul -*-
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En caso de no tener sonda, se puede usar Sybgreen, pero se le agrega al
protocolo de amplificación una curva de melting (análisis post-PCR que
ayudará a discriminar entre positivo y negativo).
IV. Protocolo de amplificación por PCR
V. Resultados
La tecnología Taqman es más específica por lo que es solo necesario observar las
curvas de amplificación. Sin embargo, el hecho de usar SYBRgreen puede dificultar el
análisis, ya que es más probable que se amplifique productos inespecíficos o dímeros
de primers, por lo que es necesario la curva de melting que ayude a discriminar el
Las muestras
que amplifican
son positivas
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resultado. Si el patrón de melting se asemeja al control (+) la muestra es positiva. Por
el contrario si se asemeja al patrón del control (-) la muestra es negativa. Esto solo se
aplica para sondas reversibles como el SYBRgreen, SYTO9, EvaGreen, etc.
Concepto clave:
El SYBRgreen es una sonda inespecífica, pues se une a cualquier ADN de doble hebra.
Esto incluye dímeros de primers y productos específicos. Además el SYBRgreen es
una sonda reversible, ya que cuando el ADN se encuentra en hebra simple el
SYBRgreen deja de unirse y por tanto no fluorece. Esto ocurre por ejemplo en la etapa
de denaturación. Mientras que en la etapa de extensión, el ADN se encuentra en hebra
doble y el SYBRgreen se une a este fluoresciendo.
¿por qué se utiliza como gen de referencia la actina en TBC?, ¿acaso la TB
codifica para actina?
Respuesta: lo que uno extrae es ADN humano predominantemente, ya que la
muestra de diagnóstico es tejido humano. Lo que se quiere determinar es si en esta
muestra se encuentra presente la micobacteria, puede que se encuentre presente
como ausente. Pero para ello se debe tener un control de la extracción de ADN. Por lo
que se corre este gen de referencia. Ya que sirve como control de que realmente si se
ha logrado la extracción del ADN. Evitando que se puedan dar resultados falsos
negativos debido al método de extracción. Esto más que nada porque la extracción del
ADN de la micobacteria será mínima ya que predominará el ADN humano. Correr este
gen de referencia es muy importante sobretodo en muestras embebidas en parafina,
donde la cantidad y calidad de ADN es baja. Obviamente la micobacteria no codifica
para este gen.
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PROBLEMAS DE CÁLCULO EN LA PCR
1.- Se hace una extracción de ADN utilizando columnas de unión a ADN (Qiagen) para
el estudio molecular de mutaciones K-RAS. Al medir en el biofotómetro se obtiene una
concentración de 700 ng/ul en 60 ul de volumen de elución. Para la PCR se debe
trabajar con un mix de primers (Forward y Reverse) que están a una concentración de
100 uM y estos deben trabajarse a 500 nM como concentración final.
a. Llevar el ADN a una concentración de 100 ng/ul
b. Indicar que volumen de ADN se debe tomar de la concentración final para la PCR si se
desea tener 150 ng de ADN en la reacción.
c. Indicar el volumen final que se debe tomar de los primers (100 uM) para prepararlos a
500 nM como concentración final en la reacción.
2. Se tiene un primer liofilizado, pero para poder utilizarlo se requiere diluirlo en
agua ultra pura, Para lo cual es necesario hacer unos cálculos. Por ejemplo si mi
primer tiene una masa molecular de 6 848.5, una temperatura de melting de 58. 2 °C,
un OD 260 igual a 30.8 nm y el peso es de 0.21 mg. Si quiero diluir mi primer a 100uM,
para utilizarlo como stock ¿cuál es la cantidad de agua ultra pura qué debo agregar al
tubo que contiene el liofilizado de primers?
3. De la pregunta anterior, si desea una concentración de primer en el mix de PCR de
0.5uM, teniendo una reacción final de 20 uL. ¿cuál debe ser la concentración de la
dilución para agregar siempre 1uL en el mix de PCR?
4. Se desea hacer la cuantificación absoluta usando PCR en tiempo real para EBV, para
lo cual se corrió la muestra por duplicado y se usó estándares. Se obtuvo que, el
estándar de 1 millón de copias amplificó en el ciclo 21, el estándar de 100 000 copias
amplificó en el ciclo 24, el estándar de 10 000 copias amplificó en el ciclo 27, el de
1000 copias amplificó en el ciclo 30 y el de 100 copias en el ciclo 32. Si la muestra
amplificó en el ciclo 27.5 y su repetición en el ciclo 28. ¿cuál es la cantidad de copias
de virus en la muestra?
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SOLUCIÓN DE LOS PROBLEMAS DE CÁLCULO EN PCR
Pregunta 1
a. Llevar el ADN a una concentración de 100 ng/ul
Tengo 700 ng/ul en 60 ul, para llevarlo a una concentración menor como 100 ng/ul
debo diluirlo.
C1xV1 = C2xV2
C1= 700 ng/ul (concentración inicial)
V1= es el volumen que debo tomar de mi concentración inicial, es decir mi incógnita.
C2= 100 ng/ul (la concentración a la que quiero llevar el reactivo, conc. Final)
V2= el volumen final, por ejm 500 ul
Reemplazando en la fórmula:
C1xV1 = C2xV2
700 ng/ul x V1 = 100 ng/ul x 500 ul
V1= 71.43 ul
Por tanto para llevar al ADN a una concentración de 100 ng/ul debo usar 71.43 ul de
mi stock de ADN y enrazarlo hasta 500 ul con agua ultra pura (500-58.82= 441.18ul)
b. Indicar que volumen de ADN se debe tomar de la concentración final para la
PCR si se desea tener 150 ng de ADN en la reacción.
Por el enunciado anterior ahora tengo el ADN a una concentración de 100 ng/ul (esta
concentración ahora es mi concentración inicial), pero deseo 150 ng en mi mix de
PCR.
100 ng_____ 1ul
150 ng_____ xul X= 150/100= 1.5 ul
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c. Indicar el volumen final que se debe tomar de los primers (100 uM) para
prepararlos a 500 nM como concentración final en la reacción.
Los primers están a 100 uM (concentración inicial) pero los quiero a una
concentración final (en el mix) de 500 nM. Lo primero que debo recordar es que para
hacer los cálculos las concentraciones deben estar EN LAS MISMAS UNIDADES.
500 nM= 500 x 10-9 =0.50x 10-6 o sea uM
C1xV1 = C2xV2
C1= 100 uM (concentración inicial de primers)
V1= es el volumen que debo tomar de mi concentración inicial, es decir mi incógnita.
C2= 0.50 uM (la concentración a la que quiero llevar el primer, conc. Final)
V2= el volumen final del mix, por ejm 20 ul
Reemplazando en la fórmula:
100 uM x V1= 0.50 uM x 20ul
V1= 0.1 ul
El volumen a usar sería de 0.1 ul por reacción, pero usualmente se corre la muestra
por duplicado, un control no relacionado, un control negativo (sin ADN) y un control
positivo, es decir en este caso 5 reacciones, por lo que debería ser 0.1 x 5= 0.50 ul en el
mix.
Si la cantidad de volumen en uL a tomar fuera más pequeña que 0.5uL (cantidad
imposible de tomar usando una micropipeta), una solución sería hacer otra dilución
de los primers a menor concentración. Por ejemplo ya tenemos el stock de 100uM,
pero a partir de ese stock podemos hacer uno de 50uM y a partir de esta nueva
dilución hacer la de 500nM.
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Pregunta 2
¿cuál es la cantidad de agua ultra pura qué debo agregar al tubo que contiene el
liofilizado de primers?
M= (n/v)=((wg/PM)/V)
siendo:
M= molaridad
n= número de moles
Wg= peso en gramos
PM= peso molecular
V= volumen en litros
Reemplazando los datos
100x 10^-6 M=((0.21x 10^-3)/6848.5)/VL)
V= 0.000306636L (pero la cantidad a usar se mide en microlitros, mas no en litros)
Por lo que multiplicamos por 10^6
V= 306.64uL
Al tubo que contiene los primers liofilizados, se le debe agregar 306.64uL de agua
ultrapura, para tener un stock a 100uM. Este procedimiento debe realizarse en una
cabina de flujo laminar que se encuentre estéril y sin el flujo prendido. Ya que la
cantidad de los primers es muy pequeña y al encontrarse liofilizado, es decir en polvo
puede volarse con el aire de la cabina encendida. Así mismo es recomendable utilizar
tips con filtro.
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Pregunta 3
¿cuál debe ser la concentración de la dilución para agregar siempre 1uL en el mix
de PCR?
C1xV1 = C2xV2
C1= mi incógnita.
V1= 1uL (lo que deseo tomar siempre para mi mix)
C2= 0.50 uM (la concentración a la que quiero llevar el primer, conc. Final)
V2= el volumen final del mix, por ejm 20 ul de mix
Reemplazando en la fórmula:
C1 x 1uL= 0.50 uM x 20ul
V1= 10 uM
Por tanto, debo preparar un stock de 10uM para tomar solo 1uL de este y colocarlo
directo del mix de PCR.
NOTA: no se ha tomado la concentración inicial de 100uM, que era la concentración
del stock. Porque la pregunta me indica que debo buscar una nueva concentración de
primers (una alícuota). Para que a partir de esta nueva concentración (C1), se pueda
tomar solo 1uL y colocarlo directo en el mix de PCR.
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Pregunta 4
¿cuál es la cantidad de copias de virus en la muestra?
Primero hago una tabla de concentración vs. Ct (ciclo umbral). Luego realizó una
regresión lineal con las curvas del PCR en tiempo real. Para ello puedo utilizar el
programa de excel. El cual nos dará un gráfico de línea recta, una ecuación y un valor
de R2. Este último debe ser lo más cercano a uno posible.
Para obtener el gráfico se plotea el 10^n en el eje de las abcisas y el ciclo umbral (es
decir el ciclo en el que amplificó la muestra o el estándar)
Concentración Ct 10^n
1000000 21 6
100000 24 5
10000 27 4
1000 30 3
100 32 2
y = -2.8x + 38R² = 0.99492
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3 4 5 6 7
Ct
Concentración (10^n)
qPCR para detección de EBV
Series1
Lineal (Series1)
Lineal (Series1)
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Para hallar el número de copias del virus, se utiliza el promedio del ciclo umbral de las
repeticiones de la muestra. Este valor representa el eje y.
Data 1 28
Data 2 27.5
Promedio 27.75
Por lo tanto, se debe reemplazar en la fórmula que en este caso es y = -2.8x + 38.
Entonces se halla x.
Reemplazando la fórmula x =3.660714286
Pero este valor representa el n en la fórmula 10^n.
Remplazando 10^3.66 se logra tener el número de copias del virus.
10^3.66 = 4578.405828
Es decir, la muestra procesada tiene 4578.405828 copias del virus EBV.
Nota: los programas del termociclador en tiempo real con el que se trabaje, ya dan
estos cálculos. Pero es necesario entender cómo se realizan, lo cual es uno de los
objetivos de esta guía.
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INTERPRETACIÓN AVANZADA DE CURVAS DE qPCR
Ejercicio 1
La muestra M1 (naranja) es…
La muestra M1 (Verde) es…….
El control positivo amplifica en un ciclo……… Y tiene una curva…………
El control negativo no amplifica lo cual es ……….
¿Es la muestra repetible?………..
Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a que se puede deber el problema?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿cómo se puede solucionar?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
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Ejercicio 2
El control positivo….
La muestra M1 es…
El control negativo….
La repetición de la muestra amplifica a un ciclo similar…….
Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a qué se puede deber el problema con el control positivo?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿cómo se puede solucionar?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
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Ejercicio 3
El siguiente resultados obtuvo con SYBRGREEN
Adicionalmente se realizó una curva de melting
Se deduce que la muestra es…..
Según el primer gráfico el control negativo es….
Si hubiera sido una sonda TaqMan la muestra M1 sería…..
¿En este último caso hubiera sido necesario correr una curva de melting? ….
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Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a qué se puede deber el problema?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿cómo se puede solucionar?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
Ejercicio 4
Se corre una muestra por duplicado usando SYBRGREEN y si obtuvo lo
siguiente:
Adicionalmente con un gen de referencia como la actina, para lo cual se uso la
sonda TaqMan y se obtuvo lo siguiente:
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La muestra M1 es….. Y la muestra M2 es….. De acuerdo al primer gráfico.
La muestra es…. De acuerdo al segundo gráfico.
¿qué más puedo concluir con respecto al segundo gráfico?.................
Entonces, ¿qué puedo concluir de mi muestra de acuerdo al primer gráfico?
¿qué puedo concluir de las sondas en cuanto a su especificidad?.............
Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a que se puede deber el problema?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
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Ejercicio 5
Las siguientes curvas de melting muestran:
Que mi muestra es…….
Que mis primers son….
¿Se espera que el control negativo salga igual que la figura?
Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a que se puede deber el problema?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿cómo se puede solucionar?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
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Ejercicio 6
Las siguientes curvas de melting muestran:
Que mi muestra es……..
Que los primers son……
Que mi Control positivo está…..
¿sería fiable este resultado?
Conclusión:
……………..……………………………………………………………………………………………………………
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿a que se puede deber el problema?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
¿cómo se puede solucionar?
………………………………………………………………………………………………………………………….
……………..……………………………………………………………………………………………………………
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Citar este artículo como:
Chirinos-Arias, M. 2015. Guía práctica de PCR en tiempo real. Figshare.
http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1417599