guÍa bÁsica de uso del - unam
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GUÍA BÁSICA DE USO DEL
MICROSCOPIO CONFOCAL
LSM 5 DE ZEISS
Dra. Angélica Zepeda R.
Responsable Académico de la Unidad de Microscopía
Instituto de Investigaciones Biomédicas
Universidad Nacional Autónoma de México
Fecha de elaboración: Enero del 2009
1ª revisión: Abril del 2010
Esta guía describe la operación básica del microscopio confocal LSM 5 para
observación de tejido o células montadas en vidrio e inmunohistoquímicamente
procesadas (marcaje fluorescente de uno, dos y tres fluoróforos).
Este manual pretende cubrir todos los aspectos básicos de adquisición de imágenes. Sin
embargo, si se requiere información mas precisa que no se incluya en la guía, se podrá
solicitar asistencia tanto a la Técnica, como al Investigador Académico responsable de
la Unidad para recibir asesoría individual.
Contactos: Técnico Responsable LIIB. Miguel Tapia
Cubículo C003, Planta Baja, Torre C. Sede Circuito Exterior.
Tel. 5622-9185
Investigador Responsable Dra. Angélica Zepeda R.
Cubículo C211, 2º piso, Torre C. Sede Circuito Exterior.
Tel. 5622-8222 ext. 46811
SOFTWARE
El software LSM 5 PASCAL, Versión 2.8 controla el microscopio, los láseres, el
módulo de escaneo, el proceso de adquisición, las herramientas de adquisición y el
despliegue de las imágenes.
El software del microscopio confocal cuenta con tres láseres de un fotón (Ar, HeNe
543 y HeNe 633) que permiten al usuario seleccionar entre longitudes de excitación de
458, 488, 514, 543 y 633nm, y el software LSM (propio de Zeiss) provee diversas
funciones para la adquisición de imágenes, que incluye la adquisición con diferentes
resoluciones de imágenes en 2D y 3D (x, y, z).
El software se puede operar empleando el mouse y el teclado de la computadora y se
usan de la misma manera en la que opera WINDOWS.
MICROSCOPIO
El microscopio cuenta con los siguientes juegos de filtros para observar las muestras
empleando la lámpara de mercurio:
1) Filtro FITC
Pase de banda de excitación: 450-490nm
Espejo Dicróico: FT 510
Emisión: LP 515
2) Filtro DAPI (Las muestras marcadas con DAPI solo se podrán observar al
microscopio, no con el sistema confocal)
Pase de banda de excitación: 365nm
Espejo Dicróico: FT 395
Emisión: LP 397
3) Filtro Rodamina
Pase de banda de excitación: 546nm
Espejo Dicróico: FT 580
Emisión: LP 590
ENCENDIDO DEL EQUIPO
1. Prender el equipo (conformado por el CPU, monitor, láseres, microscopio y,
multi-punto) por medio de los 2 interruptores que se encuentran detrás de la
puerta de entrada del cuarto del microscopio (a la izquierda del microscopio).
Ambos interruptores deberán estar en posición I/ON.
2. En caso de que el microscopio se este en posición de apagado, prenderlo por
medio del botón verde que se encuentra al lado derecho del estativo.
3. En caso de que la computadora esté apagada, prender el CPU.
4. Una vez encendida la computadora, esperar a que inicie el sistema operativo
Windows.
a. Aparecerá la ventana “Begin logon”. Presionar simultáneamente la
combinación de teclas Ctrl+Alt+Del
b. Aparecerá la ventana “Service Control Manager”. Esta ventana no se
puede desplazar, solo presione ENTER
c. Aparecerá la ventana “Logon information”. Presionar la tecla “OK”
cuando se le solicite el usename / password (no teclear nada en los
campos). El “username” predeterminado es: administrador
d. Aparecerán dos ventanas simultaneas:
i. en “Enter network password”, ingresar la palabra confocal.123
seguido de la tecla Enter. Esta ventana reaparece, volver a
ingresar la palabra confocal.123 seguido de la tecla Enter.
ii. la segunda ventana desaparecerá al ingresar el password anterior.
Con esto se actualizará la red interna del Instituto y podrá guardar los datos
adquiridos en unidad de red correspondiente (X para la Sede de Circuito Escolar; W
para la Sede de Circuito Exterior) al término de la sesión.
5. Haga doble click en el ícono PASCAL para iniciar el software que opera el
confocal y aparecerá el panel de operación “LSM 5 Pascal Switchboard”.
Presione el ícono “Online mode” (en caso de que no esté presionado) y después
el botón “Start”. Si presiona “Offline mode” o trabaja en esta modalidad, las
funciones del sistema operativo no estarán disponibles y no podrá hacer
adquisición de imágenes.
6. Se abrirá la ventana “Hardware initialization”. Espere a que el programa
reconozca todos los componentes del sistema.
OBSERVACION DE LA MUESTRA AL MICROSCOPIO
Asegúrese de que el deslizante plateado que se encuentra al lado derecho del
microscopio esté en posición “VIS” (metido hasta el fondo). Para ubicar el campo
de interés a analizar en su muestra, emplee el campo claro. Para ello, se deberá
presionar el botón HAL ubicado al lado derecho del estativo del microscopio (el
foco correspondiente se enciende en color verde). Se puede regular la cantidad de
luz por medio de la perilla que se encuentra al lado del botón de encendido.
Nota: Antes de analizar una muestra en el confocal, se pide que los usuarios hayan
revisado que sus muestras efectivamente presentan el marcaje de fluorescencia
esperado, ya que el uso de la lámpara de fluorescencia asociada al microscopio
confocal estará restringido. En caso de no contar con un microscopio de
fluorescencia, los usuarios podrán emplear los microscopios de fluorescencia que
sen encuentran a su disposición en la Unidad de Microscopía.
1. Selección del objetivo: El revolver de los objetivos NO se mueve manualmente.
Para evaluar su muestra: Coloque la laminilla en la platina con el cubreobjetos
hacia arriba; seleccione el objetivo 10x presionado alguno de los 2 botones en
arreglo horizontal marcados con puntas de flecha negras que se encuentran del
lado derecho en la base del estativo debajo del tornillo micrométrico; enfoque la
preparación y siga los siguientes pasos para obtener una iluminación de campo
claro uniforme (Iluminación Köhler).
a. Revise que el disco horizontal localizado debajo de la platina, que indica
el tipo de iluminación a emplear, esté en la posición I/H. De no ser así,
gire el disco manualmente hasta dejarlo en esa posición.
b. Suba el condensador hasta el tope superior girando el tornillo negro
mediano que se encuentra debajo de la platina
c. Gire el disco pequeño vertical que se encuentra en el lado derecho de la
base del estativo (diafragma de campo) y cierre el campo visual hasta
que solo se vea la parte central de la muestra (que quede iluminada
aproximadamente 1/3 de la muestra)
d. Enfoque los bordes del diafragma ajustando la altura del condensador
hasta que los bordes del octágono aparezcan nítidos.
e. Abra el diafragma de campo hasta que los bordes desparezcan del
campo visual
ADQUISICIÓN DE IMÁGENES
1. Prender los láseres que se vayan a emplear por medio de los interruptores
correspondientes:
f. Encender el o los láseres He/Ne que se vayan a emplear girando hacia la
derecha la llave correspondiente. La fuente de alimentación del láser
marcada con el No. inventario UNAM 1050375 genera luz verde de
543 nm (se usa para detectar fluoróforos como ioduro de propidio,
Rodamina, Texas Red, CY3, Alexa Fluor 546, etc) mientras que la
fuente de alimentación del láser marcada el No. inventario UNAM
1050376 , genera luz roja de 633 nm (se usa para detectar fluoróforos
como Alexa Fluor 633, BODIPY, CY5, etc) . El foco rojo en cada caja
significa que el láser está prendido.
g. Encender el láser Ar que genera luz azul-verde de longitudes de onda
de 458, 488 y 514 nm. Colocar el interruptor (botón con la leyenda
“power enable”) en la posición “I” y posteriormente girar la llave a la
posición “I”. Cuando este láser se enciende, se observa una luz
naranja debajo del ventilador y solo cuando la luz se torna morada,
el láser estará listo para usarse (Aprox. 5 min. después de haber sido
encendido).
2. Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo del
microscopio a la posición “LSM” y asegúrese de que el obturador (shutter)
ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo (entre los dos
deslizantes ubicados con las letras F A) esté completamente metido
3. Presione el botón “Micro” que aparece en el submenú de la ventana “LSM 5
Pascal”. La ventana “Axioplan control” aparecerá en la pantalla.
4. Seleccione el objetivo 40X presionando en la zona blanca de la ventana que
indica “Objective”
5. Cierre la ventana “Axioplan control”
6. Presione con un solo click el botón “Acquire” en la barra del menú principal
que aparece en la pantalla de la computadora
7. Presione el botón “Config”. Aparecerá la ventana “Configuration Control”.
8. Presione el botón “Single Track” si desea evaluar un solo fluorocromo o
“Multi Track” si desea evaluar dos o más flurocromos.
9. Si usa “Multi Track” se recomienda que por cada canal pase una sola línea de
laser para evitar “sangrado (bleeding)” de los canales (ver pasos siguientes).
10. Presione el botón “Store/Apply” en el panel “Track”. Se abrirá la ventana
“Track Configurations”.
11. Al presionar la flecha, usted encontrará configuraciones predeterminadas para la
detección diferentes fluoróforos.
12. Escoja la combinación de fluoróforos de su muestra y presione el botón
“Apply”.
Nota importante: El botón “Store” solo se usa para guardar configuraciones con
parámetros que el usuario ha establecido para sus propios experimentos. Si lo presiona por
error, la configuración predeterminada se guardará con nuevos parámetros y podría dejar
de funcionar óptimamente para el resto de los usuarios.
Debido a que las configuraciones que aparecen en este menú han sido
estructuradas por cada usuario, la configuración puede no representar lo que
usted desea evaluar. Así lo más recomendable es que usted defina los
párametros para la configuración de sus fluorocromos basándose en la “Tabla
de Configuraciones” que se encuentra anexo al final de este manual.
Cada parámetro se puede cambiar dando 1 click en la figura de los espejos,
los filtros y el círculo de color que representa el color de su fluoróforo.
Para evaluar más de 1 fluoróforo, configúrelos en la opción “Multi track” pero
cada fluoróforo por separado como se indica en la sección “Un solo
fotomultiplicador” de la tabla de configuraciones anexa al final de este manual.
Para añadir “tracks” al evaluar fluoróforos múltiples, presione botón “Add
track” en la ventana configuration control y configúrelo con respecto a los
datos proporcionados en la tabla de configuraciones anexa al manual. Para
nombrar el “track”, de 1 click, espere 2 segundos y de otro click, la ventana se
activará para que usted escriba.
13. Presione el botón “Scan” que aparece en el submenú en la ventana “LSM 5
Pascal”.
14. Aparecerá la ventana “Scan Control”.
15. Presione el botón “Mode”
Para iniciar su sesión, se recomienda que,
a. En el panel “Objective lens and Image Size” escoja:
Frame Size: x: 512 y: 512 (A medida que este número aumenta,
también aumenta la resolución espacial)
b. En el panel “Speed” escoja “Scan Speed”: 8 (velocidad máxima,
mientras mayor sea la velocidad de escaneo menor será la resolución
del barrido de la muestra.)
c. En el panel “Pixel Depth...” escoja los siguientes parámetros:
i. Data Depth: 8 bit
ii. Scan direction: Flecha unidireccional
iii. Mode: Frame
iv. Method: Mean v. Number: 1 (A medida que este número incrementa, también
aumenta la proporción señal/ruido y se obtiene mayor resolución.
Sin embargo, la adquisición de la imagen se lentifica y la muestra
se blanquea mas rápidamente)
d. En el panel “Zoom, Rotation & Offset” escoja: zoom 1 y rotación 0. (Si
aumenta el valor en la opción “Zoom” puede hacer un acercamiento
óptico de la imagen que está adquiriendo).
La opción “Offset” le permite mover su muestra en el plano XY, sin
necesidad de emplear los tornillos del microscopio
NOTA: Estos son los valores que se recomiendan para iniciar la sesión. Sin
embargo, una vez que inicie la adquisición de la imagen, el usuario podrá ir
determinando los parámetros óptimos para disminuir el ruido de fondo y aumentar
la ganancia en su muestra a medida que vaya explorando diferentes planos focales
empleando para ello el tornillo micrométrico (ver inciso 21a). Asimismo, podrá
cambiar de objetivo dependiendo de sus necesidades como se describe en el paso 1
de la sección “Adquisición de imágenes”; los objetivos 40x y 100x son de inmersión
en aceite (el aceite se los proporcionará el Técnico académico de la Unidad).
El aceite se deberá poner sobre la muestra mientras no haya objetivos
posicionados sobre la muestra. Para poner el revolver de los objetivos en posición
“sin objetivo”, presione alguno de los 2 botones marcados con puntas de flecha
negras que se encuentran en la base del estativo debajo del tornillo micrométrico.
Una vez que colocó la gota de aceite, regrese al objetivo a emplear asegurándose de
pasar por los objetivos de aire, NO por el resto de los objetivos de aceite.
Se recomienda dejar abierta la ventana “Scan control” con el objeto de
modificar los parámetros que se requieran a lo largo del experimento.
16. Presione el botón “Channels” de la ventana “Scan control” y se desplegará un
panel que permitirá establecer los parámetros de los canales a usar (Channel
settings) así como determinar las líneas de excitación del/los láseres a usar
(Excitation of Track).
17. En el panel “Channel Settings”, aparecen los parámetros del Pinhole (apertura
confocal). Presione el botón marcado con el número “1”. Esta es la apertura
óptima que el sistema genera automáticamente para el objetivo que se está
empelando.
18. En el panel “Excitation of Track” la configuración predeterminada debe
mostrar marcadas con palomita las líneas de láser propias de la configuración
que usted eligió en los pasos 11-12 de la sección “Adquisición de Imágenes”.
De no ser así, márquelas manualmente presionando sobre la ventana cuadrada
que aparece a la izquierda de cada láser y palomee únicamente las líneas de láser
que utilizará.
Nota importante: Si usted está usando la configuración “Multi track”
asegúrese de que estén palomeadas las líneas del laser correspondiente a cada
canal por separado.
EJEMPLO PARA SINGLE TRACK
EJEMPLO PARA MULTI TRACK
19. Posicione el botón marcado “Detector Gain” a la mitad de la barra de cada
línea(s) seleccionada(s) (esta es solo una posición inicial para empezar la
adquisición y se podrá modificar hasta que el investigador considere que está en
el nivel óptimo para sus condiciones experimentales).
20. Posicione el botón indicador del % de transmisión a un tercio de la barra (en el
caso de las líneas 458, 488 y 514) y a la mitad o ¾ de la barra (en el caso de las
líneas 543 y 633). Esta es solo una posición inicial para empezar la adquisición
y se podrá modificar hasta que el investigador considere que está en el nivel
óptimo para sus condiciones experimentales).
21. Presione el botón “Fast XY” (adquisición rápida de baja resolución) que se
encuentra en la columna de íconos en el extremo derecho de la ventana “Scan
control”. La adquisición continua de la imagen iniciará y se puede parar en
cualquier momento presionando el botón Stop. Si logra ver la imagen esperada,
pero con poca resolución, asegúrese de usar el objetivo de 40x de inmersión en
aceite. Si no logra ver la imagen esperada, puede intentar las siguientes
opciones:
a. mueva el micrométrico hasta que encuentre señal en el plano focal
deseado mientras el sistema esté adquiriendo continuamente la imagen y
cuando logre ver la imagen esperada, continúe la configuración de sus
parámetros
b. presione el botón “Find” que se encuentra en la ventana “Scan control”.
Esta función encontrará automáticamente los parámetros de contraste y
brillantez óptimos para su muestra.
c. asegúrese de que no haya burbujas en la gota de aceite
d. continúe afinando la configuración de parámetros como se describe en
los puntos siguientes
22. En el menú que aparece del lado derecho de la ventana en la que se está
desplegando la imagen adquirida, puede seleccionar la ventana “Split xy” para
evaluar cada canal por separado, así como la mezcla de ambas imágenes.
23. Inicie la configuración de los parámetros para la adquisición de las imágenes
mientras el sistema está en el modo de adquisición rápida continua (Fast XY).
En el panel superior “Channel Settings” aparecerán 2 recuadros de colores,
con las siglas “Ch1” y “Ch2” que corresponden al color de la línea de láser que
se esté empleando (los colores de los recuadros, generalmente, coinciden con el
color de la emisión de los fluoróforos que usted evaluará empleando las líneas
de láser que seleccionó). Presione el botón Ch1 y mueva el botón de la barra
“Detector Gain” a la mitad de la barra. Esta es la función que le permitirá
modificar contraste y brillantez de la imagen a adquirir (hacia la derecha
aumenta la brillantez, hacia la izquierda la disminuye), mientras que la barra
“Ampl Offset” modula el ruido de fondo (hacia la derecha lo aumenta y hacia la
izquierda lo disminuye) y la barra “Ampl Gain” modula el factor de
amplificación de la señal. Presione el botón Ch2 y siga el mismo procedimiento.
Si no logra ver la imagen esperada, mueva el micrométrico hasta que encuentre
señal en el plano focal deseado mientras el sistema esté adquiriendo
continuamente la imagen y cuando logre ver la imagen esperada, continúe la
configuración de sus parámetros. En caso de no encontrar el campo ideal para
adquirir, puede volver a ver su muestra en capo claro presionando en botón HAL
del microscopio y metiendo la barra plateada hasta la posición “Vis”. Una vez
determinado el nuevo campo, inicie el proceso desde el paso 20
24. Cuando haya optimizado los parámetros de adquisición, presione el botón
“Single” de la ventana “Scan control” para obtener una imagen de mayor
resolución. Generalmente, esta imagen aparecerá mucho menos brillante que la
adquirida con “Fast XY”. Si este es el caso, presione el botón “Cont”
(adquisición continua de mediana resolución) que se encuentra en el menú a la
derecha dentro de la ventana “Scan control” y continúe modificando los
parámetros de adquisición hasta que la imagen le parezca satisfactoria.
25. Si esta imagen le es satisfactoria, podrá almacenarla (ver “Almacenamiento de
imágenes”). De lo contrario, continúe modificando los parámetros hasta que
obtenga la imagen óptima.
26. Algunas formas de mejorar la señal:
a. Aumentar la resolución de la imagen presionando el botón 1024 o 2048
en la opción “Frame Size” del submenú “Mode” en la ventana “Scan
control” b. Disminuir la velocidad de barrido en la opción “Scan Speed” del
submenú “Mode” en la ventana “Scan control”
c. Aumentar el número de promedio de barridos de la muestra en la
opción “Number” del submenú “Mode” en la ventana “Scan control”
Para revisar si la señal de su muestra está saturada, presione el ícono “Palette” que se
encuentra en el menú de la ventana en la que está desplegada la imagen adquirida
mientras esté trabajando en el modo de ADQUISICIÓN CONTINUA. Se recomienda
hacer este procedimiento empleando la resolución final que se vaya a emplear (512,
1024, 2048 pixeles).
a. Aparecerá la ventana “Color Palette”. Elegir la opción “Range indicator”.
Para evaluar la intensidad en imágenes con múltiples colores, seleccione el
botón “Split xy” que se encuentra en el menú derecho de la ventana donde
se despliega la imagen.
b. Presionar el botón “Cont” de la ventana “Scan Control”. Los pixeles rojos
indican saturación de color en su muestra, mientras que los azules indican
baja señal.
c. La brillantez adecuada para cada canal en la imagen la podrá ajustar
presionando el botón “Ch1” y “Ch2” del panel “Channel Settings” en la
ventana “Scan control” y modificando los valores de las opciones
“Detector Gain” y “Ampl Offset” de la ventana “Scan Control” de cada
canal mientras el sistema está adquiriendo.
d. Se recomienda que ajuste la ganancia de forma que haya entre un 15 y 20%
de pixeles rojos en la imagen y que ajuste el valor “Offset” hasta que todo o
que usted considera ruido de fondo esté marcado en azul.
Al finalizar el procedimiento de ajuste, presione el ícono “Palette” y seleccione
la opción “No Palette” para desplegar los colores de sus fluoróforos. Cierre la
ventana “Color Palette”.
Reconstrucción de imágenes en el plano z
Este procedimiento permite producir un apilado de imágenes en el plano XY en
diferentes planos focales (secciones ópticas).
Para producir un apilado de imágenes en el plano z:
1. Presione el botón “Mode” ubicado dentro de la ventana “Scan Control” e
ingrese: Scan Speed: 8 y Number: 1. Con ello evitará que su muestra se
fotoblanquee rápidamente.
2. Presione el botón “Z stack” que se encuentra en el menú de la ventana “Scan
control”. Automáticamente se desplegará el panel “Z Settings”.
3. Presione sobre la pestaña “Mark First/Last” del panel “Z Settings”
4. Se recomienda determinar el tamaño óptimo del apilado mientras se esté
haciendo un barrido continuo de la muestra. Para ello, presione el botón “XY
Cont” de la ventana “Scan Control”.
5. Gire el tornillo micrométrico para enfocar uno de los límites del apilado.
6. Presione el botón “Mark First”
7. Continúe girando el tornillo micrométrico en la misma dirección o en dirección
contraria (según sea su caso) para enfocar el otro límite del apilado
8. Presione el botón “Mark Last”
9. Presione el botón “Stop”
10. Determine la resolución con la que obtendrá el apilado (512, 1024, 2048) del
menú “Mode” que se encuentra en la ventana “Scan control”. Usted podrá
obtener una imagen más limpia de ruido a medida que aumente el número de
escaneos que se encuentra en la ventana “Number” en el submenú “Pixel depth,
Scan direction and Scan average”
11. Presione el botón “Start” para iniciar el barrido de las secciones que componen
su apilado. Usted podrá ver el avance del apilado por medio de la barra negra
que se encuentra en la parte inferior de la imagen.
Nota: La barra “Num Slices” le permite determinar el número de secciones
ópticas que desea que contenga el apilado; los límites del apilado se mantendrán
constantes. Si usted desea obtener un mayor o menor número de secciones de las
que detectó el sistema, ingrese el número deseado en la casilla “Num slices”
seguido de la tecla Enter.
12. Si desea guardar el apilado con mejor resolución, modifique los parámetros
“Scan Speed” y “Number” del submenú “Mode” en la ventana “Scan
Control”.
13. Para ver la galería de secciones que componen el apilado, presione el ícono
“Gallery” que aparece en el menú de la derecha de su imagen
14. Para ver el apilado presione el botón “3D view” de la ventana LSM 5 Pascal
menú principal, ventana “LSM 5 Pascal”. Aparecerá un submenú, presione
“Projection”. Se abrirá la ventana “Projection”. Elija el plano en el que desea
ver la reconstrucción presionando en la ventana circular “x” “y” o “z” según sea
el caso y presione “Apply”.
15. Aparecerá una nueva ventana con la imagen reconstruida del apilado. Si desea
cada uno de los pasos de la rotación de su imágen, presione la ventana
“Gallery” que aparece a la derecha de la ventana de la imagen adquirida.
16. Para volver a la función de escaneo en un solo plano focal, presione el botón “z
stack”
Almacenamiento de imágenes y reconstrucciones
Las imágenes se almacenan en bases de datos creadas por los usuarios.
Para guardar una imagen, primero deberá generar una base de datos:
1. De doble clic en el ícono “My Computer” que se encuentra en el escritorio de la
computadora
2. De doble clic en la unidad D:
3. Presione File, aparecerá un submenú, presione New, aparecerá un submenu a la
derecha, presione Folder
4. Grupo Escriba el nombre del Jefe de grupo en la ventanilla que indica el nombre
del Fólder
5. Ubique el cursor sobre la ventana de la imagen a guardar
6. Presione el botón “Save As” que se encuentra en el menú de la derecha de la
imagen a guardar
7. Aparecerá la ventana “Save Image and Parameter As”
8. Presione el botón “New MDB” que se encuentra a la derecha de esta ventana
9. Aparecerá la ventana “Create New Database”
10. Ubique el cursor sobre la ventana que indica “Create in” y de un clic. Se
desplegará la lista de unidades que contiene la computadora
11. Ubique el cursor sobre la flecha que marca hacia arriba de la ventana hasta que
vea la unidad D: y de doble clic sobre el icono de esta unidad
12. Aparecerá una lista de folders. Localice su fólder y de de doble clic en él
13. Aparecerá la ventana “Create New Database”
14. Escriba un nombre para su base de datos en el espacio “File name” y presione
el botón “Create”
15. Aparecerá la ventana “Save Image and Parameter As”. En la parte inferior
aparece la subventana “Database (MDB)”. Asegúrese de que el nombre del
fólder donde guardará su imagen este resaltado en azul. Si no es así, de doble
clic sobre el nombre de su fólder
16. En la parte superior de la venta aparece la opción “Name”. Borre el contenido
de esa ventana e introduzca el nombre de su imagen. Presione Ok.
17. Su imagen habrá quedado guardada y lo podrá rectificar por que el nombre de la
imagen aparecerá en la barra superior azul que enmarca a su imagen.
18. Las imágenes almacenadas las deberá copiar a las carpetas de red X: o W: si
esta en la Sede de Circuito Escolar o Exterior respectivamente. Asegúrese de
copiar todo el contenido de su base de datos (archivos “.mdb” “.ldb” y “.lsm”)
a su fólder en red. Los datos almacenados en estas unidades se borrarán
automáticamente los días martes y viernes a las 6:00 AM. Por favor tómelo
en cuenta para evitar la pérdida de sus datos. 19. Las imágenes almacenadas en este formato se pueden desplegar para su
posterior procesamiento empleando programas de análisis de imágenes como los
siguientes: LSM VisArt, Image J, Image Pro e Imaris entre otros. Usted
encontrará software de uso libre en la página electrónica de la Unidad, bajo el
ícono de análisis de imágenes:
http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/unidad_mi
croscopia.html
Para finalizar el programa, cierre todas las ventanas excepto la “LSM pascal”. Oprima
el botón “File” y después el botón “Exit”
aparecerá la ventana switch off light manager, presione “No”.
SOLUCION DE PROBLEMAS COMUNES
1) No logro observar la muestra en el microscopio
Posibles soluciones:
Mueva el deslizante plateado ubicado al lado derecho del estativo del
microscopio a la posición “LSM” y asegúrese de que el obturador
(shutter) ubicado del lado derecho en la parte superior del estativo
(entre los dos deslizantes ubicados con las letras F A) esté
completamente metido
Posicione los pasos de luz marcados con F A en la posición mas
superior
Mueva el plano focal girando lentamente el tornillo micrométrico
mientras continúa la adquisición
Asegúrese de que los láseres estén encendidos
Asegúrese de que la configuración que escogió tenga marcadas (con
palomita) las líneas de láser de interés
Asegúrese de que el botón indicador de ganancia “Detector Gain”
esté posicionado como mínimo a la mitad de la barra
2) Veo mi muestra con el objetivo de 20X al microscopio, pero no veo nada en
empelando el sistema confocal
Posible solución:
Cambie al objetivo de 40X
3) La imagen adquirida se ve muy “pixelada”
Posibles soluciones:
Aumente la resolución espacial del “Frame Size” a 1024 y si usa un
objetivo de 100X, use 2048 del submenú “Mode” en la ventana
“Scan control”
Aumente el número de escaneos en la opción “Number” del menú
antes mencionado
Asegúrese de estar adquiriendo con el modo “Single” o “Cont”, no
con “Fast XY”
4) Muy baja señal aun con los valores de ganancia de detección y de
amplificación altos
Posible solución:
Aumentar el tamaño del pinhole, aunque con ello perderá
confocalidad
ANEXO: TABLA DE CONFIGURACIONES
Láser Emisión (nm) HFT NFT Ch1 Ch2
Un solo fotomultiplicador
FITC (CY2, Alexa 488) Argón 488 488 None LP505
Enhaced GFP (EGFP) Argón 488 488 None LP505
Enhaced Cyan FP (ECFP) Argón 458 458 None LP475
Enhanced Yellow FP (EYFP) Argón 514 514 None LP 530
Lucifer Yellow Argón 458 458 None LP 475
Cy3 (Rhodamine, Texas Red) He-Neón Verde 543 543 None LP560
DS Red He-Neón Verde 543 543 None LP560
Alexa 633, Cy5 He-Neón Rojo 633 488 / 543 /
633 None LP650
Dos fotomultiplicadores
FITC / Cy3 Argón+He-Ne
Verde 488 / 543 488 / 543 /
633 545 LP560 BP 505-530
FITC / Cy5 Argón+He-Ne
Rojo 488 / 633 488 / 543 /
633 545 LP650 BP 505-530
CY3 / Cy5 He-Ne Verde +
Rojo 543 / 633 488 / 543 /
633 635 LP650 BP 560-615
Enhaced GFP (EGFP) Argón 488 488 plate LP505
Enhaced Cyan FP (ECFP) Argón 458 458 plate LP475
Enhanced Yellow FP (EYFP) Argón 514 514 plate LP 530
Lucifer Yellow Argón 458 458 plate LP 475
DS Red He-Neón Verde 543 543 plate LP560