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Evaluación del estatus taxonómico del cocodrilo del orinoco Crocodylus intermedius
(Graves, 1819) en Colombia mediante marcadores mitocondriales como herramienta
para establecer estrategias de conservación de la especie
Carolina Posso Peláez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá D.C., 2013
[1]
Evaluación del estatus taxonómico del cocodrilo del orinoco Crocodylus intermedius
(Graves, 1819) en Colombia mediante marcadores mitocondriales como herramienta
para establecer estrategias de conservación de la especie
Carolina Posso Peláez
Tesis de Maestría en Biología
Línea Manejo y Conservaci6n de la Vida Silvestre
Director
Paul Bloor, Ph.D.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología
Bogotá D.C., 2013
[2]
A mi esposo,
mi amor y apoyo incondicional.
A mi familia,
quienes me motivan para seguir creciendo.
A la vida,
por seguirme sorprendiendo con personas y lugares increíbles.
[3]
TEXTO DE AGRADECIMIENTOS
Todo mi agradecimiento a mi director de tesis, Paul Bloor por haberme dado la oportunidad
de pertenecer a su grupo, quien creyó en mis capacidades para desarrollar este proyecto a
pesar de los muchos tropiezos y brindó todo su conocimiento y experiencia.
A la Universidad Nacional de Colombia y el programa de posgrado por haber contribuido
enormemente a mi formación académica.
A la Profesora María Cristina Ardilla y la Estación de Biología Tropical Roberto Franco
por la recolección de las muestras de tejido.
Al Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, Medio Ambiente, por la financiación
del presente trabajo a través del CONVENIO INTERADMINISTRATIVO NO. 38 DE
2012, SUSCRITO ENTRE EL MINISTERIO DE AMBIENTE Y DESARROLLO
SOSTENIBLE Y LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA - INSTITUTO DE
GENÉTICA para “La Caracterización Molecular de ADN de las Poblaciones de
Crocodylus intermedius, Validar el Protocolo Nacional de Reintroducción de Individuos de
esta Especie y Elaborar una Estrategia de Comunicación del Riesgo, en el Marco de la
Implementación del Programa Nacional para la Conservación del Caimán Llanero en
Colombia . Este trabajo se llevó a cabo bajo CONTRATO No. 48 DE 2012 ACCESO A
RECURSOS GENÉTICOS PARA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA SIN INTERÉS
COMERCIAL.
A Thomas Viloria, por ser un compañero incondicional y compartir desinteresadamente sus
conocimientos, tiempo, experiencia y apoyo en los momentos difíciles, un muy especial
agradecimiento.
[4]
A Carolina Ibañez, por su dedicación, paciencia, enseñanza y apoyo en el desarrollo de las
actividades de laboratorio sin que este trabajo no hubiera sido posible.
A Tatiana, Angélica, Sandra, Manuel, Sebastián, Gonzalo, Carlos, Jefferson y todas las
personas que compartieron conmigo sus opiniones, pensamientos, conocimientos y
consejos, en diferentes momentos durante el trabajo en el laboratorio y en conversaciones
casuales del día a día.
Y finalmente, a Argelina y María Inés quienes además de ser mis amigas, son un modelo a
seguir de tenacidad y dedicación.
A todos, muchas gracias.
[5]
RESUMEN
La correcta identificación taxonómica de poblaciones de especies en peligro para
programas de reproducción en cautiverio y de reintroducción es fundamental para su éxito.
El cocodrilo del orinoco, Crocodylus intermedius es uno de los dos representantes del
género Crocodylus presentes en el territorio colombiano. Esta especie, endémica de Sur
América, se distribuye en el curso medio e inferior del río Orinoco y sus afluentes en
Venezuela y Colombia. Actualmente está catalogado como en Peligro Crítico (CR) por la
Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales
(UICN) e incluida en el Apéndice I de la Convención sobre el Comercio Internacional de
Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES), y desde principios de los años
70 ha sido incluido en programas de reproducción en cautiverio y reintroducción en ambos
países. Sin embargo estudios recientes han puesto en duda su estatus taxonómico. Se
analizó la relación taxonómica de Crocodylus intermedius basado en 2722 pares de bases
de secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt) (genes completos de citocromo b y
citocromo oxidasa I) para 76 individuos de Crocodylus intermedius de la Estación de
Biología Tropical y los individuos de Crocodylus acutus (taxón hermano) de sitios en
Colombia. Los haplotipos de individuous de Crocodylus intermedius son divergentes
(1,29%) y recíprocamente monofiléticos con respecto a los haplotipos de individuos de
Crocodylus acutus. Estos datos indican que las poblaciones en cautiverio identificadas
previamente como C. intermedius ubicadas en la Estación de Biología Tropical Roberto
Franco para reproducción en cautiverio son altamente relevantes para la conservación de la
especie.
[6]
CONTENIDO
Pág.
Resumen……………………………………………………………………………….. 04
Contenido………………………………………………………………………………. 06
Lista de figuras………………………………………………………………………… 08
Lista de tablas………………………………………………………………………….. 09
1. Introducción…………………………………………………………………………. 10
2. Objetivos…………………………………………………………………………..... 13
2.1. Objetivo general……………………………………………………………… 13
2.2. Objetivos específicos…………………………………………………………… 13
3. Marco teórico……………………………………………………………………….. 14
3.1. Crocodylus……………………………………………………………………… 14
3.2. Crocodylus intermedius (Graves, 1819)……………………………………….. 14
3.2.1. Clasificación taxonómica………………………………………………….. 14
3.2.2. Nombre común…………………………………………………………….. 14
3.2.3. Ecología e historia natural………………………………………………… 14
3.2.4. Distribución……………………………………………………………… 15
3.2.5. Estado de conservación…………………………………………………… 17
3.3. Crocodylus acutus (Cuvier, 1807)……………………………...……………… 18
3.4. Marcadores moleculares……………………………………………………….. 20
3.5. Unidad evolutivamente significativa (ESU) y Unidades de conservación…… 21
4. Metodología…………………………………………………………………………. 23
4.1. Muestras……………………………………………………………………… 23
4.2. Trabajo de laboratorio………………………………………………………… 23
4.2.1. Extracción y cuantificación……………………………………………… 23
4.2.2. Amplificación……………………………………………………………… 24
4.2.3. Purificación y secuenciación……………………………………………… 24
[7]
4.3. Análisis de datos……………………………………………………………… 25
5. Resultados………………………………………………………………………… 27
5.1. Variación de la secuencia...……...…………………………………………… 27
5.2. Análisis filogenético………..………………………………………………… 29
6. Discusión…………………………………………………………………………..... 34
6.1. Estatus taxonómico de C. intermedius………………………………………… 34
6.2. Variabilidad genética…….…………………………………………………… 35
6.3. Conservación e implicaciones en manejo……………………………………… 36
7. Conclusiones…………………...……………………………………………………. 39
8. Bibliografía………………………………………………………………………….. 40
[8]
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Distribución Crocodylus intermedius……………………………………… 17
Figura 2. Distribución Crocodylus acutus……………………………………………. 20
Figura 3. Frecuencia (número de individuos) de los haplotipos de los 76 individuos
de C. intermedius encontrados en la Estación Biológica Roberto Franco…………….. 28
Figura 4. Máxima Parsimonia, árbol consenso (50% majority-rule) con los soportes
correspondientes a bootstrap. El clado correspondiente a Crocodylus intermedius se
indica con el color azul, el correspondiente a Crocodylus acutus con el color
rojo.……………………………………………………………………………………. 31
Figura 5. Inferencia bayesiana, árbol consenso del con los datos combinados de
citocromo b y citocromo oxidasa I. EI número sobre las ramas indica la probabilidad
posterior. El clado correspondiente a C. intermedius se indica con el color azul, el
correspondiente a C. acutus con el color rojo.………………………………………. 32
Figura 6. Red de haplotipos basada en los dos genes mitocondriales citocromo b y
citocromo oxidasa I. Los haplotipos observados están representados por círculos
rojos y azules. Los círculos azules corresponden a la especie C. intermedius y los
rojos a C. acutus. Los puntos negros indican haplotipos ausentes. Las líneas entre los
puntos negros indican el número de pasos mutacionales que los separan…………….. 33
[9]
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Polimorfismo de las 5 posiciones variables que componen los cuatro
haplotipos mitocondriales de C. injtermedius, la muestra de referencia,
polimorfismos de COXI y Cytb y frecuencia por haplotipo……………….……….. 28
Tabla 2. Distancia genética entre las secuencias analizadas mediante el número de
diferencias (número de sitios en que las dos secuencias comparadas difieren)………. 29
[10]
1. INTRODUCCIÓN
Sudamérica presenta la más alta diversidad de cocodrilos y al mismo tiempo es la región
que ha soportado la mayor explotación de ellos en el mundo (Rueda-Almonacid 2007).
Entre los países sudamericanos, Colombia presenta una alta diversidad de Crocodilidos,
representada en dos subfamilias, Crocodylinae y Alligatorinae. La subfamilia Crocodylinae
está representada por dos especies en Colombia Crocodylus acutus y Crocodylus
intermedius (Larriera et al 2004). La distribución histórica natural de C. intermedius se
extendían a lo largo de la cuenca del río Orinoco en Colombia y Venezuela, ocupando
principalmente ríos de gran cauce y aguas turbias. Sin embargo, su distribución actual se
encuentra fragmentada.
Entre los años 1930 y 1960, esta especie estuvo sometida a una intensa caza para
comercializar sus pieles hasta el punto de llevarla casi al borde de la extinción, tanto en
Colombia como en Venezuela (Mondolfi 1965, Medem 1981, Medem 1983, Baptiste et al
2001). Por este motivo el Ministerio de Agricultura estableció una veda para la captura de
C. intermedius en el año 1976; por tiempo indefinido en todo el territorio nacional; fue
incluida en el apéndice I por la Convención sobre el comercio Internacional de Especies
Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres, CITES en el año 1975. Actualmente se encuentra
catalogada como una especie en peligro crítico (CR) por la Unión Internacional para la
Conservación de la Naturaleza y los Recursos Naturales (UICN). Adicionalmente el
Ministerio de Medio Ambiente en su resolución 0676 del 21 de Julio de 1997 “La declara
como una especie en peligro de extinción en el territorio nacional y se dictan medidas para
su protección”. Para este propósito, se identificó la necesidad de implementar como
estrategia de conservación el rescate de individuos del medio natural para su reproducción
en cautiverio y finalmente, el repoblamiento al hábitat natural para recuperar así las
poblaciones naturales (Ramírez-Perilla 2000). Tarea llevada cabo en la actualidad por la
[11]
Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF) de la Universidad Nacional de
Colombia.
Los programas de cría en cautiverio y reintroducción, son un enfoque costoso y de alto
perfil para la conservación de las especies, por lo que la decisión de iniciar estas medidas
debe estar basada en información precisa (Snyder et al 1996). En particular, el
conocimiento de la sistemática del taxón es crucial. En el peor de los casos, una
identificación errónea o una taxonomía confusa, podría conducir a la crianza y
reintroducción de la especie equivocada, aumentando el riesgo de hibridaciones, pudiendo
conducir a la extinción (Rhimer & Simberloff 1996).
En los últimos años ha habido muchos estudios sobre la evolución del género Crocodylus
(Brochu 2000, Brochu et al 2010, Brochu & Densmore 2001, Gatesy et al 2004, McAliley
et al 2006, Willis et al 2007, Gatesy & Amato 2008, Meganathan et al 2010). Esto ha
permitido la descripción de los principales patrones filogenéticos dentro del género,
incluyendo la relación monofilética de los representantes de las especies Crocodylus
intermedius y Crocodylus acutus. Sin embargo, en un análisis de ADN mitocondrial
reciente Venega-Anaya y coautores (2007) reportó que la designación de la especie C.
intermedius no estaba justificada sobre la base de la ausencia de monofilia de los individuos
de C. intermedius y C. acutus. La ausencia de monofilia de las dos especies tendría
importantes implicaciones para las políticas de conservación y programas de manejo en
cautiverio de C. intermedius. Desafortunadamente, estos estudios se han hecho sobre la
base de un muestreo parcial de la distribución de C. acutus (América central) y/o en la
ausencia de información sobre el origen geográfico de las muestras de C. intermedius. Así,
el patrón filogenético actual, como la validez y utilidad de las denominaciones taxonómicas
propuestas son todavía difíciles de evaluar. Por este motivo se hace necesaria la validación
de esta información para dar continuidad a las acciones propuestas en el Programa Nacional
de Conservación del Caimán Llanero.
Como consecuencia, el Ministerio de Medio Ambiente sugirió una evaluación global del
Programa Nacional para la Conservación de C. intermedius, a partir de la identificación de
[12]
la validez taxonómica de la especie. Atendiendo a la inquietud del Ministerio y de las
entidades comprometidas con el programa, la Universidad Nacional de Colombia, a través
del Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos del Instituto de Genética y de la Estación
de Biología Tropical Roberto Franco perteneciente a la Facultad de Ciencias, se ha
comprometido a caracterizar mediante marcadores moleculares mitocondriales la población
de Crocodylus presente en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco, y muestras de
individuos de referencia C. acutus de poblaciones del territorio colombiano, iniciativa que
enmarca el presente proyecto.
[13]
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
• Evaluar el estatus taxonómico de la especie C. intermedius mediante marcadores
moleculares mitocondriales.
2.2. Objetivos específicos
• Describir la diversidad genética y la estructura poblacional de la especie y
relacionar esta información con la ubicación geográfica de los individuos y
poblaciones.
• Identificar los diferentes linajes evolutivos intra específicos de esta especie de
cocodrilo.
• Proponer las posibles unidades de manejo dentro de la especie basadas en la
información obtenida con las secuencias de los dos marcadores, citocromo b y
citocromo oxidasa I.
[14]
3. MARCO TEÓRICO
3.1. Crocodylus (Crocodylia: Crocodylidae)
Crocodylus es un género de reptiles, pertenecientes a la familia Crocodylidae que incluye
aproximadamente una docena de especies de cocodrilos existentes que habitan en las
regiones tropicales y subtropicales de Asia, Australia, África y el Nuevo Mundo (Brochu
2003, McAliley et al 2006).
3.2. Crocodylus intermedius (Graves, 1819)
3.2.1. Clasificación taxonómica
Phylum: Chordata
Clase: Sauropsida
Orden: Crocodylia
Familia: Crocodylidae
Género: Crocodylus
Especie: Crocodylus intermedius
3.2.2. Nombre común
Orinoco crocodile, Caimán del Orinoco, Caimán llanero.
[15]
3.2.3. Ecología e historia natural
El cocodrilo del Orinoco es un gran cocodrilo, de nariz relativamente larga, restringido a la
parte media y baja del río Orinoco y sus afluentes en Venezuela y Colombia
(Thorbjarnarson y Franz 1987). A pesar de que esta especie puede ser encontrada en una
gran variedad de hábitats, incluyendo los ríos de los bosques tropicales de hojas perennes y
las corrientes de piedemonte en las estribaciones de los Andes, alcanza su mayor número en
los ríos estacionales de la región de los Llanos (Medem 1981, 1983).
Las hembras maduran a aproximadamente 2,5 m de longitud total (Thorbjarnarson y
Hernández 1993a), la postura de huevos se da en los bancos de arena expuestos
estacionalmente y riberas de los ríos a principios de la temporada seca anual (enero-
febrero). El tamaño promedio de nidada en las poblaciones silvestres varía entre 38 y 44
huevos, con una máxima registrada de 66 huevos (Jiménez-Oráa et al 2007, Navarro 2007).
Las crías emergen durante el aumento de los niveles de los ríos asociados con la temporada
de lluvias (Thorbjarnarson 1993a, Hernández et al. 2002, Antelo 2008). Los reportes de
concentraciones de esta especie durante la época seca, facilitó su caza (Medem 1981,
1983). En los ríos más pequeños que se reducen a una serie de piscinas interconectadas o
aisladas durante la estación seca, C. intermedius estiva en madrigueras excavadas en riberas
(Medem 1981, Antelo 2008).
3.2.4. Distribución
La distribución de C. intermedius está limitada únicamente a la cuenca del rio Orinoco en
Colombia y Venezuela, su presencia esporádica en la Isla de Trinidad se atribuye a
individuos extraviados procedentes del delta del Orinoco. En Colombia el límite de
distribución a occidental actual es el río Duda en el departamento del Meta y penetra por el
sur hasta el río Guaviare, el bajo río Inírida y San Fernando de Atabapo. En Venezuela
[16]
habita en los Llanos, el delta del Orinoco y algunos tributarios del escudo de Guayana
(Figura 1) (Rueda-Almonacid 2007).
Los movimientos de la especie en su hábitat natural se han estudiado principalmente en
Venezuela. Antelo (2008), ha registrado movimientos de individuos sub adultos desde
centenares de metros hasta cuatro kilómetros en la época de lluvias, también menciona que
los adultos pueden dispersarse distancias considerables durante la misma época. Otros
estudios C. intermedius muestran que individuos de 120 cm de tamaño pueden dispersarse
hasta 11.6 kilómetros del sitio de la liberación (Muñoz & Thorbjarnarson 2000). No
obstante, Muñoz & Thorbjarnarson (2000) también advierten que se deben tomar con
precaución la extrapolación de los datos dispersión de los individuos porque la capacidad
de dispersión depende de las condiciones locales del hábitat así como el tamaño y sexo de
los individuos. Así en otros sitios se ha encontrado evidencia de dispersiones de hasta 80
kilómetros (Muñoz & Thorbjarnarson 2000).
3.2.5. Estado de conservación
CITES: Appendix I
Lista Roja de la UICN (2009): CR (En Peligro Crítico, criterio A1c, deterioro inferido >
80% en 3 generaciones, reducción del área de ocurrencia. C2a. Población adulta silvestre
puede ser menos de 250 individuos, con descensos continuos y fragmentación) (última
evaluación en 1996).
El cocodrilo del Orinoco es una de las especies de cocodrilo más amenazada del Nuevo
Mundo. La Sobreexplotación comercial comenzó a fines de la década de 1920, tanto en
Colombia como en Venezuela. La caza fué particularmente intensa entre 1930 y 1935
(Mondolfi 1965) y continuó en las décadas siguientes hasta que las poblaciones fueron
completamente diezmadas hacia la década de 1960 (Medem 1981, 1983).
[17]
Figura 1. Distribución Crocodylus intermedius
[18]
En Colombia, se estima que existen al menos 4 importantes relictos de la especie C.
intermedius: 1) Red fluvial de los ríos Lipa, Cuiloto, Ele y Cravo norte; 2) En los ríos Santo
Domingo, Duda, Lozada y Alto Guayabero (Serranía de la Macarena); 3) En la zona media
del río Meta, entre la Primavera y la Culebra; y 4) a lo largo del río Vichada. Hasta la fecha
no se conocen la estructura genética histórico entre los núcleos.
El Ministerio de Medio Ambiente, en la resolución 0676 del 21 de Julio de 1997 “Por la
cual se declara una especie en peligro de extinción en el territorio nacional y se dictan
medidas para su protección”, declara la especie C. intermedius en peligro de extinción, por
esta razón diversas entidades públicas y privadas lideradas por el Instituto von Humboldt y
el Ministerio de Medio Ambiente, elaboran el Programa Nacional para la Conservación del
Caimán Llanero y en el año 2002 se pone en marcha con una vigencia de 10 años. En la
actualidad el Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos, Instituto de Genética y la
Estación de Biología Tropical Roberto Franco, Facultad de Ciencias, forman parte del
comité del Programa Nacional para la Conservación del Caimán Llanero.
3.3. Crocodylus acutus (Cuvier, 1807)
C. acutus o cocodrilo americano, es un cocodrilo de hocico no alargado, angosto y
puntiagudo en individuos jóvenes, pero ancho en los machos viejos; es uno de los
cocodrilos de mayor talla en el Neotrópico, si bien el tamaño cuando maduro puede oscilar
entre 2,3-7,3 m en los machos y entre 2,3-4 en las hembras.
El escamado dorsal se encuentra separado de las cervicales, y poseen inclusiones laterales
sobre el lado ventral de la cola. Los adultos tienen un color verde-grisáceo, verde oliva o
café grisáceo con barras oscuras sobre el dorso y la cola, en tanto que las superficies
abdominales son blanco amarillentas. La coloración del cuerpo puede pasar de un gris claro
en los juveniles (que se mantiene hasta alcanzar la madurez sexual) hasta un gris oscuro o
[19]
negruzco en los individuos más viejos, con bandas transversales oscuras. El iris es de color
verde-argénteo (Rueda-Almonacid et al 2007).
Esta especie gusta asolearse durante el día sobre las playas de los grandes ríos y caños,
aunque despliega una mayor actividad en la noche. Suele excavar grandes madrigueras y
socavones en los bancos de los ríos con entradas sumergidas, muy cerca de la zona de
anidamientos. Como en todos los miembros de este orden existe una marcada diferencia
entre la dieta predominante insectívora de los neonatos y la de los adultos que es
esencialmente piscívora. Cuando pequeños se alimentan de insectos acuaticos, anfibios,
cangrejos y peces pequeños, en tanto que cuando adultos capturan moluscos, crustáceos,
peces, tortugas, iguanas, caimanes, aves y mamíferos, entre otros (Rueda-Almonacid et al
2007).
Crododylus acutus es otra especie de cocodrilo de amplia distribución, que se extiende
desde una población relicta en Florida (EE.UU.), a través de las islas del Caribe y en la
costa de América Central hasta la costa norte de América del Sur. Durante gran parte de
este rango, los números se han reducido en gran medida, a pesar de importantes
poblaciones registradas en Haití, la República Dominicana y Cuba. La especie ocupa los
hábitats costeros, como los manglares y bahías, grandes lagos salobres, y puede extenderse
aguas arriba de los ríos costeros. Estos cocodrilos son capaces de moverse a distancias
considerables, y algunos individuos se han desviado de su rango normal y se han
encontrado en las Islas Caimán y Trinidad (Figura 2) (Rueda Almonacid 2007).
En Colombia esta especie está distribuida en las áreas hidrográficas del Caribe, Magdalena,
Cauca y el Pacífico. También se halla en la Ciénaga Grande de Santa Marta, en los caños
Limón y Los Frailes de la Ciénaga de Zapatosa y en el caño el Venado de la Ciénaga de
Chilloa. Habita igualmente en el Canal del Dique, las ciénagas de la Caimanera y
Playoncito así como en Cispatá. Adicionalmente, se pueden encontrar poblaciones aisladas
como las de Bahía Portete, Honda y Hondita (Barrera 2004, Rueda-Almonacid et al 2007).
[20]
Globalmente el cocodrilo americano se considera en la categoría Vulnerable: VU (IUCN),
en Colombia (Larriera et al 2004) es considerada En Peligro Crítico: CR. Aparece en el
Apéndice I de CITES, y se considera que no existen más de 50 individuos adultos por
relicto, en poblaciones severamente fragmentadas. Actualmente la principal amenaza para
la especies es la perdida de hábitat y la fragmentación de las poblaciones. Aunque la caza
ilegal y los accidentes con barcas o coches también acaban con algunos ejemplares (UICN)
(Rueda-Almonacid et al 2007).
Figura 2. Distribución de Crocodylus acutus
3.4. Marcadores moleculares
El desarrollo de técnicas moleculares ofrece metodologías más precisas para la
identificación de especies, poblaciones e individuos. La tipificación a partir de secuencias
de ADN mitocondrial (mtADN) proporciona una huella genética de la especie y su origen
[21]
geográfico (Palomares et al., 2002). Las secuencias de mtADN surgieron como una opción
popular dentro de los marcadores moleculares, para la discriminación de especies y la
identificación de estructura filogeográfica, dado que los niveles de polimorfismo son
capaces de proporcionar la identificación de especies y relaciones entre distintas áreas
geográficas.
Por estas razones, las secuencias de mtADN han sido ampliamente usadas para
identificación de especies y la descripción de variación geográfica, para el control de tráfico
de especies, programas de rehabilitación, manejo y conservación (Eizirik et al 1998, Haag
et al 2009, Palomares et al 2002, Roques et al 2010).
3.5. Unidad evolutivamente significativa (ESU) y Unidades de conservación
Con la reciente expansión de la genética de la conservación (DeSalle & Amato 2004), el
diagnóstico de las unidades de conservación ahora normalmente incluye el reconocimiento
de la diversidad genética y, en concreto, los linajes evolutivos únicos o unidades
evolutivamente significativas (ESUs; Ryder 1986; Vogler & DeSalle 1994). Las ESUs son
grupos monofiléticos de poblaciones genéticamente diferenciadas dentro de una gran
especie monofilética que muestra una larga historia de evolución independiente (Ryder
1986, Vogler & DeSalle 1994), y son a menudo caracterizadas por monofilia recíproca en
loci mitocondriales (mtDNA) y divergencia significativa de las frecuencias alélicas en loci
nucleares (Moritz 1994). Crandall et al. (2000) sugirieron que las ESUs deben ser definidas
en términos más generales utilizando los conceptos de intercambiabilidad genética y
ecológica. La intercambiabilidad se rechaza cuando existe evidencia "significativa" para la
diferenciación ecológica o genética entre poblaciones, y estas poblaciones deben ser
reconocidos como ESUs separadas (Crandall et al 2000). Los linajes evolutivos únicos
deben ser reconocidos como unidades de planificación de conservación para evitar la
hibridación y el potencial de depresión por exogamia (DeSalle & Amato 2004, Templeton
1986), y también porque se trata de especies filogenéticas que no se puede recuperar si se
[22]
pierden (Cracraft 1983, Moritz 2002). En efecto, el manejo de varios taxones
genéticamente distintos como una sola unidad puede resultar en la extinción local de los
linajes únicos (Daugherty et al 1990).
[23]
4. METODOLOGÍA
4.1. Muestras
Se obtuvieron muestras de 76 individuos de Crocodylus intermedius, ubicados en la
Estación de Biología Tropical "Roberto Franco", pertenecientes al programa de cría en
cautividad de la especie, y contienen individuos que representan a los fundadores originales
(F0) y su descendencia (F1), e individuos que han llegado de diferentes edades y
localidades que se incorporaron a la estación de diferentes fuentes.
Todas las muestras entregadas (por la profesora María Cristina Ardila-Robayo) consistían
de escama caudal, incluyendo músculo y sangre. Las muestras fueron preservadas en tubos
con etanol al 95% y almacenadas a 4°C, para su ´posterior depósito y preservación en el
laboratorio a -20ºC hasta realizar la extracción de ADN. Las muestras fueron etiquetadas de
manera individual con un código de barras y fueron incluidas en el banco de tejidos y ADN
del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia.
4.2. Trabajo de laboratorio
4.2.1. Extracción y cuantificación
El ADN genómico total fue aislado de las muestras de tejido de Crocodylus intermedius
entregadas por la Estación de Biología Tropical Roberto Franco, mediante la digestión con
proteinasa K y su posterior extracción con el protocolo de sílice y tiocianato de guanidino
(Hoyos, M., Tusso, S., Bloor, P. en preparación). Se evaluó la calidad y cantidad del ADN
aislado mediante geles de agarosa al 0,8% y SYBR® Safe.
[24]
4.2.2. Amplificación
Se amplificaron los genes mitocondriales completos de citocromo b (cyt b) con los
cebadores o primers Croc-GluL2 (5′-AATTCCCATTATTCTCACTTGG-3′) y Croc-ThrH2
(5′-GGAATACACACACCTTCCCAA-3′), y citocromo oxidasa I (COXI) con los
cebadores o primers Croc-CysL1 (5′-CGAGTTTGCAGTTCGTCGTG-3′) y Croc-SerH1
(5′-CAACCGCAATACGACATGCT-3′). Los primers fueron diseñados utilizando el
programa PRIMER3 (Untergrasser et al 2012) y secuencias disponibles en GENBANK
para las especies Crocodylus. Estos marcadores (citocromo b y citocromo oxidasa I) han
sido previamente utilizados en otros estudios para la descripción de estructura filogenética,
identificación taxonómica y filogeografía dentro del género Crocodylus.
Las amplificaciones fueron realizadas en volúmenes finales de 30 µL con 1x Standard PCR
buffer (Fermentas), 2.0 mM MgCl2, 0.1 mM de cada dNTP, 0.1 µM de primers o cebadores
y 0.75 unidades de Taq polimerasa (Fermentas). Las condiciones de amplificación para
ambas regiones fueron: desnaturalización 94°C – 2 minutos, 34 ciclos de desnaturalización
94°C – 30 segundos, acople cebadores y ADN molde (annealing) 55°C – 30 segundos
(citocromo b) y 51°C – 30 segundos (citocromo oxidadsa I), extensión 72°C – 2 minutos y
la extensión final 72°C – 10 minutos.
4.2.3. Purificación y secuenciación
Los fragmentos amplificados fueron purificados con el protocolo de purificación por
precipitación con etanol y resuspendidos en agua ultrapura. Posteriormente, se obtuvo
secuencias con los mismos primers utilizados para la amplificación mediante el kit BigDye
Terminator 3.1 y el secuenciador automático de análisis genético ABI 3500 (Servicio de
Secuenciación y análisis Molecular – SSiGMol – Instituto de Genética, Universidad
Nacional de Colombia).
[25]
4.3. Análisis de datos
Las secuencias fueron alineadas utilizando el algoritmo CLUSTALW (Thompson et al
1994) aplicado en el programa BioEdit (Hall 1999). No se detectaron codones de parada
prematuros después de la traducción de la secuencia codificante en secuencia de
aminoácidos utilizando el programa MEGA versión. 2.0 (Kumar et al 2001). No se
detectaron indels en las secuencias citocromo b o citocromo oxidasa I. Las secuencias de
los dos genes fueron unidas y analizadas en conjunto para todos los análisis.
Para cada gen se calculó por separado, el “mejor” modelo de sustitución de ADN usando
para ello el programa JModeltest (Darriba et al 2012). Las relaciones filogenéticas fueron
reconstruidas por Máxima parsimonia (MP) e Inferencia Bayesiana (IB). La Máxima
Parsimonia fue inferida con PAUP* (Swofford 1999). Las búsquedas heurísticas consisten
en 10.000 secuencias aleatorias repetitivas adicionales con TBR branch-swapping. Se
calculó un estricto consenso de todos los árboles más parsimoniosos de este análisis. Se
evaluó el soporte relativo de los clados utilizando bootstrap no paramétrico (Felsenstein
1985), sobre la base de análisis que comprenden 10.000 réplicas de búsqueda heurística,
como anteriormente, utilizando 200 repeticiones para cada nuevo muestreo de los datos. La
Inferencia Bayesiana se llevó a cabo utilizando el programa MrBayes3.1.2 (Huelsenbeck &
Ronquist 2001). Las particiones de datos de citocromo b y citocromo oxidasa I se utilizaron
con sus respectivos modelos (los parámetros fueron desvinculados). 10.000.000 MCMC
(Markov Chain Monte Carlo) se ejecutaron en paralelo (4 cadenas de cada uno), a partir de
un árbol al azar, hasta 1.000 generaciones (muestras registraron cada 100 generaciones).
Para evaluar mono-especificidad de la especie C. intermedius se incorporaron en los
análisis secuencias homólogas de individuos de Crocodylus acutus provenientes de varias
fincas de la Región Caribe colombiana (números de accesión de GenBank citocromo
oxidasa I: KF273834- KF273841; citocromo b: KF273842-KF273849) (Viloria et al en
preparación).
[26]
Adicionalmente se realizó un análisis de redes de haplotipos, con el fin de obtener una
mayor resolución de las relaciones intraespecíficas de C. intermedius. Las secuencias que
diferían en una sustitución nucleotídica fueron consideradas como haplotipos distintos. El
análisis de las genealogías se realizó mediante la construcción de una red de haplotipos
utilizando el programa TCS 1.21 (Clement et al 2000) empleando el criterio de conexión
bajo 85 pasos mutacionales, con el fin de extender al máximo la red de haplotipos sin
excluir ninguno.
[27]
5. RESULTADOS
5.1. Variación de las secuencia
Para los 76 individuos de Crocodylus intermedius se obtuvieron secuencias de los genes
completos de citocromo b (1165 pb) y citodromo oxidasa I (1557 pb). Se identificaron 5
sitios polimórficos para C. intermedius que generaron 4 haplotipos distintos (Tabla 3). El
haplotipo más frecuente para C. intermedius es e1 H3 (n = 56), seguido del H2 (n = 15). El
haplotipo H1 presento la menor frecuencia, siendo solamente encontrado en un individuo
(Figura 4).
Adicionalmente se calcularon las estimaciones de la divergencia evolutiva sobre la
secuencias entre y dentro de las dos especies (Tabla 2). Se muestra el número de bases
diferentes por secuencia del promedio de todas las secuencias pareadas entre y dentro de los
clados. La estimación del error estándar (S) se obtuvo por medio de un procedimiento de
arranque “bootstrap” (1000 repeticiones) mediante el programa MEGA. La máximo de
divergencia obtenido entre C. intermedius y C. acutus es de 1.29%. Y entre los haplotipos
de C. intermedius es de 0.21%.
[28]
Tabla 1. Polimorfismo de las 5 posiciones variables que componen los cuatro haplotipos mitocondriales de C.
injtermedius, la muestra de referencia, polimorfismos de COXI y Cytb y frecuencia por haplotipo.
Haplotipo Muestra Número de la posición variable n
COXI CytB
1 1 1 1
9 1 1 5 9
9 0 5 0 2
6 1 8 1 9
H1 IGUNdna0006047
G T G C A 1
H2 IGUNdna0006048
A C . .
G
15
H3 IGUNdna0006049 A C A . G 56
H4 IGUNdna0006060 A C . T G 4
Figura 3. Frecuencia (número de individuos) de los haplotipos de los 76 individuos de C. intermedius
encontrados en la Estación Biológica Roberto Franco
[29]
Tabla 2. Distancia genética entre las secuencias analizadas mediante el número de diferencias (número de
sitios en que las dos secuencias comparadas difieren).
Comparaciones Secuencias comparadas Distancia
Entre C. intermedius y C. acutus 116 35.099 ± 6.018
Dentro de C. intermedius 76 0.573 ± 0.384
Dentro de C. acutus 40 6.473 ± 1.536
5.2. Análisis filogenético
La matriz analizada incluye 118 secuencias con una longitud de 2722 pares de bases, 76
pertenecientes a la especie Crocodylus intermedius, 40 pertenecientes a la especie
Crocodylus acutus. Dos correspondieron a secuencias del grupo externo, Crocodylus
moreletii (Accesion number: HQ585889.1 (Meganathan, Dubey et al 2011) y Mecistops
cataphractus (Accesion number: EF551000) (Li et al 2007).
El análisis de Máxima Parsimonia consistió en un análisis heurístico que tuvo en cuenta 88
sitios informativos, adicionalmente se obtuvieron soportes con 1000 réplicas de bootstrap.
El análisis de parsimonia recuperó e1 árbol más parsimonioso. Esta topología y los soportes
de bootstrap representan 2 clados correspondientes a C.intermedius y C. acutus (Figura 4),
evidenciado la existencia de las dos especies como grupos monofiléticos. El Clado I
contiene las muestras de C. intermedius con un soporte del 100% y el Clado II contiene las
muestras de C. acutus con un soporte del 93%.
Basado en el criterio de selección de inferencia bayesiana -BIC-, se seleccionó mediante el
programa Jmodeltest el modelo de evolución nucleotídica Hasegawa-Kishino-Yano (HKY)
(Hasegawa & Kishino et al 1985) para ambos genes. Para este análisis se realizaron dos
corridas de 10.000.000 de generaciones y cuatro cadenas MCMC (Markov Chain Monte
[30]
Carlo). El árbol resultante del análisis bayesiano (Figura 5) muestra los dos clados antes
observados en el árbol de parsimonia, C. intermedius y C. acutus, con probabilidad
posterior de 1.0 y 0.99 respectivamente. El análisis de inferencia bayesiana corrobora lo
obtenido en el de máxima parsimonia, al evidenciar la monofilia de C. intermedius con
valores bien soportados, conformando un solo linaje evolutivo. Ambos análisis fueron
consistentes en estas agrupaciones con altos valores de bootstrap y probabilidad posterior
(Figura 4 y 5).
En el análisis de redes de los haplotipos mitocondriales para las dos especies se muestran
dos haplogrupos, consistentes con los resultados obtenidos en los análisis filogenéticos, en
donde se obtuvo un solo linaje para C. intermedius y dos linajes divergentes para C. acutus
(Figura 6). A su vez se puede ver la conexión entre ambas especies y el número de pasos
mutacionales mínimos entre ellas (23).
[31]
Figura 4. Máxima Parsimonia, arbol consenso (50% majority-rule) con los soportes correspondientes a
bootstrap. El clado correspondiente a C. intermedius se indica con el color azul, el correspondiente a C.
acutus con el color rojo.
[32]
Figura 5. Inferencia bayesiana, árbol consenso del con los datos combinados de citocromo b y citocromo
oxidasa I. EI número sobre las ramas indica la probabilidad posterior. El clado correspondiente a C.
intermedius se indica con el color azul, el correspondiente a C. acutus con el color rojo.
[33]
Figura 6v . Red de haplotipos basada en los dos genes mitocondriales citocromo b y citocromo oxidasa I.
Los haplotipos observados están representados por círculos rojos y azules. Los círculos azules corresponden a
la especie C. intermedius y los rojos a C. acutus. Los puntos negros indican haplotipos ausentes. Las líneas
entre los puntos negros indican el número de pasos mutacionales que los separan.
[34]
6. DISCUSIÓN
Los análisis aquí presentados se desarrollan con base solamente en secuencias de ADN
mitocondrial, por lo que pueden no representar con exactitud un panorama completo de la
historia evolutiva de la especie. Sin embargo, no solo proporciona la caracterización de dos
genes mitocondriales completos (citocromo b y citocromo oxidasa I), de una especie de la
que no se cuenta con secuencias de precedencia conocida disponible. Si no que evidencia la
variabilidad genética no reconocida con anterioridad en poblaciones en cautiverio de
Crocodylus intermedius en Colombia, por lo tanto, en las poblaciones silvestres.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo son relevantes para tres planteamientos. El
primero es la posición filogenética de C. intermedius y su carácter distintivo taxonómico de
C. acutus. El segundo es la variación haplotipica presente en la Estación Biológica Roberto
Franco. Y el tercero cómo se requiere de medidas de conservación específicas a la especie y
la importancia de las poblaciones en cautiverio de la misma.
6.1. Estatus taxonómico de C. intermedius
En la última década, la filogenia de los cocodrilos ha sido examinada por muchos autores
(Brochu 2000, Brochu et al 2010, Brochu & Densmore 2001, Gatesy et al 2004, McAliley
et al 2006, Willis et al 2007, Gatesy & Amato 2008, Meganathan et al 2010, Milián-garcía
et al 2011), proporcionando en algunos casos resolución frente a las posiciones
filogenéticas de algunas de las especies, cómo es el caso de Gavialis gangeticus especie
hermana de Tomistoma schlegelii (Janke et al, 2005), Mecistops cataphractus como un
pariente lejano al género Crocodylus (Brochu 2000, McAliley et al 2006) y Crododylus
porosus como especie hermana de C. siamensis (Meganathan et al 2010). Sin embargo, las
relaciones entre los miembros del género Crocodylus siguen siendo bastante confusas y
estudios recientes sugieren la realización de nuevos análisis de la filogenia del género y la
utilización de secuencias completas del genoma mitocondrial para tal fin. Por lo tanto, el
[35]
principal objetivo del presente estudio fue evaluar el estatus taxonómico de C. intermedius,
ya que existe incertidumbre acerca del mismo, derivado de los resultados socializados en el
Third International Workshop on Crocodilian Genetics and Genomics provenientes de un
estudio desarrollado por Venega-Anaya y Co-autores (2007), poniendo en duda la validez
de los esfuerzos de conservación que desde la década del 70, vienen realizándose en
nuestro país a través de la Estación Biológica Roberto Franco.
Los análisis a partir de los datos obtenidos de los genes completos de citocromo b y
citocromo oxidasa I, mostraron soportes robustos, confirmando la monofila de ambas
especies, recuperando en ambos casos sus clados correspondientes. Ratificando que C.
intermedius, a pesar de una bajo nivel de divergencia, es una especie diferenciada de C.
acutus, en contraste con lo sugerido por Venega-Anaya (2007), despejando cualquier
incertidumbre y apoyando la teoría que estos marcadores (marcadores mitocondriales),
tienen la suficiente variación inherente, para resolver este tipo de filogenias, y aclarar las
relaciones inter específicas. Adicionalmente, se recuperó la conspicua relación hermana
entre estas especies (Schmitz et al 2003, McAliley et al 2006, Li et al 2007, Meganathan et
al 2010, Oaks 2011).
6.2. Variabilidad genética
La consideración de la variación genética en el manejo de pequeñas poblaciones se está
convirtiendo en una práctica estándar para las poblaciones silvestres y los programas de
cría en cautiverio. Entre más pequeña sea la población, más importante es la adopción de
prácticas de manejo que maximicen el tamaño efectivo de la población, y por lo tanto,
reducir al mínimo la pérdida de la diversidad (El Alqamy et al 2012). En ninguna parte es
esto más evidente que en los proyectos de reintroducción, donde típicamente menos de 100
individuos y, a veces menos de 20 individuos, se liberan para fundar nuevas poblaciones
(Greth and Schwede 1993, Ogden et al 2005).
[36]
Para el presente estudio, no se tuvo información sobre el posible origen de los individuos
que conforman la población ex situ presente en la Estación Biológica Roberto Franco y los
individuos que conforman el presente estudio (posteriormente se espera tener estos datos
disponibles para realzar un análisis e interpretación más robusto de los resultados). Por lo
tanto, los resultados de variabilidad genética y los haplotipos obtenidos no pudieron ser
extrapolados a poblaciones naturales.
La variabilidad de la población de la Estación Biológica Roberto Franco en el nivel
mitocondrial (número de haplotipos y diversidad de haplotipos) fue mayor que en otras
especies de cocodrilos estudiados en su hábitat natural, como es el caso de Crocodylus
rhombifer (Milián-García et al 2011).
El análisis de red de haplotipos muestra que 3 de los 4 haplotipos están estrechamente
relacionados (Figura 7), con un máximo de dos pasos mutacionales entre sí. Sin embargo,
el haplotipo 1 (H1: 6047) se mantiene a 3 pasos mutacionales del haplotipo más cercano,
conectado a través de dos haplotipos inferidos, que faltan o permanece no muestreados.
Este haplotipo corresponde a un solo individuo, y puede ser evidencia de una población que
aún no se ha establecido en la Estación Biológica Roberto Franco, por lo que a través de un
estudio genético de las poblaciones silvestres se obtenga una mayor frecuencia al interior
del haplotipo y quizás la aparición de nuevos haplotipos que aumenten la variabilidad
genética dentro de la especie.
6.3. Conservación e implicaciones en manejo
La genética de la conservación tiene importantes implicaciones para la conservación de la
biodiversidad mediante la aclaración de las relaciones taxonómicas (Avise 1989). El uso de
marcadores moleculares ha aumentado la capacidad de identificar no sólo las especies, sino
subespecies y poblaciones (Avise 2004). Igualmente, ha sido útil para la determinación de
[37]
las poblaciones o individuos de los programas de cría en cautiverio para futuras
reintroducciones (Vogler & DeSalle 1994).
Los estudios basados en el ADN mitocondrial han tenido un impacto considerable en el
campo de la conservación de los animales en los que se han puesto de manifiesto casos de
diversidad genética previamente no identificado (Carvalho et al, 2012; Cosson et al, 2007;
Pestano et al, 2003; Russello et al, 2010; Sinclair et al, 2011; Terrasa et al, 2009). Estos
estudios se hacen necesarios en poblaciones en cautiverio donde el conocimiento de las
relaciones genéticas entre los individuos y la diversidad genética de las diferentes
poblaciones cautivas pueden ayudar a minimizar la pérdida de potencial evolutivo, lo que
se ve directamente reflejado en mejores decisiones al momento de establecer estrategias de
conservación (Frankham, Ballou y Briscoe, 2002; Marshall & Spalton, 2000; Tenhumberg
et al, 2004).
Diferentes autores en sus estudios genéticos, advierten a los conservacionistas sobre la
aplicación de técnicas de genética molecular, haciendo énfasis en la necesidad de evaluar el
valor de la información genética obtenida frente a usos alternativos de los recursos
económicos limitados para la conservación. Si bien es cierto que no es posible ni pertinente
realizar estudios genéticos en el marco de todas las iniciativas de conservación, en muchos
casos la decisión de utilizar el análisis genético para la toma de decisiones en materia de
conservación es soportada por los mismos resultados, como es el caso claro del estudio que
aquí se presenta.
Con el objetivo que las repoblaciones de especies nativas puedan tener éxito, sólo los
individuos plenamente identificados deben ser liberados en su hábitat natural (Allendorf et
al. 2001). Este estudio proporciona una evaluación genética inicial del caimán del Orinoco,
especie en peligro crítico y revalida su estatus taxonómico. Se espera que estos datos
puedan ser utilizados para identificar individuos, que puedan tenerse en cuenta si una
repoblación se llevara a cabo.
[38]
La concordancia entre los resultados de los diferentes análisis de redes de haplotipos y
filogenéticos sobre la existencia de una sola historia evolutiva de la especie C. intermedius
en Colombia, permite distinguir a la especie cómo una unidad significativa evolutiva siendo
a su vez una única unidad de manejo. Sin embargo, se necesitan evaluaciones genéticas
completas de las poblaciones naturales de C. intermedius para proporcionar una mejor
referencia genética para pruebas de asignación y confirmar la asignación de la unidad única
de manejo.
[39]
7. CONCLUSIONES
Los genes completos de ADN mitocondrial citocromo oxidasa I (COXI) y citocromo b (cyt
b), muestran ser eficaz para la diferenciación de las dos especies de Crocodylus presentes
en Colombia.
Los resultados de los análisis filogenéticos de las secuencias de mtADN (cyt b, COXI) de
los individuos de Crocodylus intermedius de la Estación Biológica Roberto Franco fueron
congruentes y permiten concluir que: (1) C. intermedius es una especie monofilética, (2)
Existe un solo linaje evolutivo o unidad de conservación dentro de la estación, (3) la
relación entre C. intermedius y C. acutus está fuertemente resuelta y soportada.
A pesar de la existencia de diferentes haplotipos de C. intermedius, su baja divergencia
intraespecífica justifica su tratamiento como un solo linaje mitocondrial, que se traduce a
una única unidad de manejo para la especie en cautiverio.
[40]
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