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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

IV CICLO

GUIA DE PRÁCTICA

DE

MICROBIOLOGIA MÉDICA

UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

INDICE

Página

Recomendaciones generales 3

Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4

Métodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7 Coloración diferencial de Gram 9

Coloración diferencial de Ziehl-Neelsen 11

Coloración especial: coloración de Leishman y Vago 12

Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14

Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17

Metabolismo bacteriano 19 Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma) 27

Reacción antígeno – anticuerpo: Aglutinación 29

Fagocitosis 31

Reacción de Precipitación 32

Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33

Preparación de Antígenos bacterianos 35 Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38

Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Género Streptococcus 40

Aislamiento e Identificación de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46

Estudio microbiológico de la flora normal de la Secreción Bucofaríngea 48 Aislamiento e Identificación de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50

Aislamiento e identificación de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56

Serología

Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo 59 Estudio e Identificación de Vibrio cholerae 62

Estudio e Identificación del Genero Leptospira 64

Estudio e Identificación de Bartonella 66

Estudio e Identificación de Treponema – Prueba de VDRL ó RPR 67

Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68

Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71 Estudio e Identificación de Hongos Ambientales 74

Estudio e Identificación de Hongos Dermatofitos 78

Estudio de Hongos Levaduriformes: Observación de cortes histopatológicos 81

Estudio de Hongos Dimórficos: Observación de cortes histopatológicos 83

ANEXOS: SEMINARIOS:

Genética Microbiana e Ingeniería Genética 86 Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunación 87

Antibióticos y quimioterápicos 88

Enfermedades de transmisión sexual. SIDA 89

Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90

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ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA 1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas,

mandil, plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores. 2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitar

contaminaciones 3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles

contaminaciones. 4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.

5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura 6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que

se tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos. 7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco. 8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan

debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen. 9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con

desinfectante. 10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes

anotaciones: Nombre o iniciales de los estudiantes Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra

Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC

11. Al finalizar el trabajo:

Limpiar con algodón los objetivos del microscopio

Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no queden láminas sobre la platina Limpiar la mesa de trabajo Comprobar que la llave de gas este cerrada Lavarse prolijamente las manos con jabón.

12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.

El Profesor Responsable del Curso



SIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

PRÁCTICA N° 1

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. OBJETIVO

1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio

compuesto. 2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.

II. MATERIALES

Microscopios Pipeta Pasteur Láminas portaobjetos Plumón indeleble Laminillas cubreobjetos Papel lente Láminas coloreadas Tela de felpa(25 cm) Suero fisiológico Fibra de pelo y lana

III. PARTES DEL MICROSCOPIO Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:

PARTE MECANICA

Tubo portalentes y cremallera Condensador Tornillos macro y micrométrico Brazo y Pie Revolver Charnela Platina

PARTE OPTICA

Ocular Lentes de condensador Objetivos Diafragma Espejo

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma. 3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera 4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los

objetivos de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.


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PRACTICA N° 2

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

Y ESPECIALES. INTRODUCCION La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos: A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados

colorantes ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina. B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de

metileno. C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina

(ácido). En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina.

Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan: A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul

de lactofenol B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -

Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares

como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.

A. COLORACIONES SIMPLES

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los microorganismos.

MATERIAL

Muestra con mezcla bacteriana Láminas portaobjetos Laminillas cubreobjeto Asa bacteriológica de Kolle en aro Colorante Azul de metileno Colorante Tinta China

7

Colorante Azul de lactofenol Mechero de Bunsen Varillas para coloración Aceite de cedro Xylol Papel lente Microscopio de luz con objetivo de inmersión

COLORACIÓN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos 3. Lavar con agua y dejar secar

4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos

2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana 3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto

4. Observar con lente de menor y mayor aumento.

RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus

COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos 2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante

3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto 4 Observar con lente de menor y mayor aumento

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados

8


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B. COLORACIONES DIFERENCIALES

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante es llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente COLORACION DE GRAM

Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano. Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff MATERIAL Muestra con mezcla de bacterias

Solución fisiológica al 0.85%

Láminas portaobjetos

Asa bacteriológica de Kolle en aro

Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:

Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario) Bicarbonato de sodio Lugol (mordiente) Alcohol- acetona (decolorante) Fucsina básica (colorante de contraste)

Mechero de Bunsen

Varillas para coloración

Microscopio de luz con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente

9

PROCEDIMIENTO

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del

frotis. 2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el

centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener una preparación en capa fina.

3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen.

4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración. 5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución

de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos. 6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)

7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua. 8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta

que no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua. 9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua. 10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen 11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas. 10



PRACTICA N° 3

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido de lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula y en esta forma resistir a la decoloración.

MATERIAL Láminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloración Ziehl-Neelsen:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)

Azul de metileno (colorante de contraste)

Mechero de alcohol

PROCEDIMIENTO 1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el

mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por tres veces, evitando que hierva el colorante.

2. Lavar con agua corriente.

3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada. 4. Lavar con agua corriente

5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto. 6. Lavar con agua corriente 7. Secar y observar con lente de inmersión.

RESULTADO Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistentes se tiñen de color azul.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

11



PRACTICA N° 4

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

INTRODUCCION

Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN

Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES Frotis de sangre con Bartonella

Solución de colorante Leishman

Agua destilada tamponada

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO 1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos 3. Lavar con agua de caño y dejar secar

4. Observar con objetivo de inmersión 5. Anotar los resultados en el protocolo. COLORACIÓN DE VAGO

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.

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MATERIALES Lámina portaobjetos

Palito mondadientes


Set de coloración de Vago: Mercuro cromo al 2% Violeta de genciana

Asa de siembra en aro

Microscopio con lentes de 100X


PROCEDIMIENTO 1. En una lamina colocar una gota de suero fisiológico al o.85% 2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa

fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera. 3. Fijar el frotis al calor suave

4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos 5. Lavar con agua corriente

6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos 7. Lavar con agua corriente

8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

RESULTADOS Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

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PRACTICA N° 5

MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y

DIFERENCIALES,

INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales.

MATERIALES

Goteros de vidrio

Probetas de 100 ml.

Trípodes con malla de Asbesto

Balones de 250 ml. Tubos de 16x150 mm

Tiras de Papel indicador de Ph Tubos de 13x100 mm Frasco con solución NaOH (N/10) Placas Petri

Frasco con solución HCl (N/10) Frascos estériles

Pinzas rectas Agua destilada

Bagetas de vidrio Tubo con sangre citratada

Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo

Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g

Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g

Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g

Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g

Agua destilada 100 Ml Agua destilada 100 ml

pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g

pH 7.0 - 7.4

Caldo peptonado

Peptona 2.0 g

Cloruro de sodio 1.0 g 5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.

6.5 gr. de Agar TSI.

2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons

2.1 gr. de Agar Urea.

1.7 gr. de Caldo MR VP

3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

14

PREPARACION

I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es ácido agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solución de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121ºC por 15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37ºC por 24 horas. Luego dejar en refrigeración hasta su utilización.

2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia,

luego agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH ó HCl. Luego envasar y esterilizar a 121ºC por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubación a 37ºC por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.

II. MEDIOS ENRIQUECIDOS

1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar

enfriar hasta una temperatura de 45ºC y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada. Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio debe ser rojo cereza.

2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de

80ºC hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y realizar control de esterilidad y dejarlo después en refrigeración.

III. MEDIOS SELECTIVOS

3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta

su completa disolución. Autoclavar a 121º C por 15 Minutos y repartir en placas estériles.

4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al

calor hasta su completa disolución. Repartir luego en placas estériles. No necesita autoclavar.

IV. MEDIOS DIFERENCIALES

1. Para el Agar TSI (Hierro tres azúcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada,

hervir hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a 121º C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final tendrá un color rojo naranja.

2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá un color

verde.

3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolución

y autoclavar. Después adicionar 5 ml de Solución de Urea al 40% esterilizada por filtración; 15

mezclar homogéneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendrá un color amarillo.

4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de

13x100mm y autoclavar a 121º C por 15 Min.

5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa

disolución y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121º C por 15 min., y dejar enfriar los tubos en plano inclinado.

PROTOCOLO Realizar un cuadro indicando:

A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

C. Materiales que usaron para la preparación.

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PRACTICA N° 6

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las 24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo. Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por el cual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias técnicas de siembra, siendo las más usadas : La siembra por estría, por dispersión-agotamiento, por inoculación y por puntura.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa. ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso. SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.

TAMAÑO : Diámetro en milímetros. CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.

CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

MATERIALES Tubos con suero fisiológico estéril

Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo

Tubos de 16x150 con Agar nutritivo

Placas con Agar nutritivo

Placas con Agar Mac Conkey

Placas con Agar hipertónico de Chapman

PROCEDIMIENTO

A) TIPOS DE SIEMBRA

Tubos con Agar Sabouraud

Tubos de 16x150 con medio hipertónico de Chapman

Torundas estériles

Asas de siembra en aro y punta

Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro. 17

Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º y continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.

Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con ayuda del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.

Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.

B) LECTURA:

Con la ayuda del profesor: 1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de

cultivos sembrados. 2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.

PROTOCOLO

METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA MEDIO DE CULTIVO

SIEMBRA USADO

ESTRIA

DISPERSION

AGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIÓN

CARACTERISTICA OBSERVACION DE MEDIO DE CULTIVO

DE LA COLONIA COLONIAS USADO

FORMA

ELEVACIÓN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAÑO

CONSISTENCIA

CROMOGENESIS

18



PRACTICA N° 7

METABOLISMO BACTERIANO

INTRODUCCION

La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de género y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y sirvan como marcadores de identificación.

En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos específicos.

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.

Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas

(CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.

A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrógeno

(H2S). El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10 respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo). Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en este medio pueden ser fundamentalmente tres: 1. Fermentación de glucosa únicamente. 2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.

3. No fermentación de carbohidratos. 19

Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba del tubo.

El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de

hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL Tubo con medio TSI en plano inclinado.

Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y

estríe la superficie del pico de flauta. 2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

INTERPRETACION Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.

1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo. 2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que

se encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la cantidad de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados. Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.

3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo que el tubo permanece amarillo.

4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.

5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

2. La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) a partir de glucosa. Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo), superando el sistema amortiguador del pH del medio.

20

3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil-carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol. La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción catalítica del Alfa naftol y Creatinina.

MATERIALES Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa bacteriana VP positivo y negativo

Reactivo Rojo de metilo

Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)

Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella

PROCEDIMIENTO

1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y

negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C. 2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo

nombre, cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.

2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es importante añadir los reactivos en el orden específico. Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva. En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.

II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y

amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

21

MATERIALES Cepa indol positivo y negativo.

Medio líquido peptonado y/o Medio SIM

Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).

Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.

PROCEDIMIENTO

La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta una prueba negativa.

III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.

PRINCIPIO

La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno.

Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de

amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en

hidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).

MATERIALES Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnivca de estría en cada tubo

la cepa citarto positiva y negativa. 2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

22

INTERPRETACION

Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio

inclinado. Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:

O

║

NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH ═ (NH4)2 CO3

Ureasa

El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.

MATERIALES Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Medio Agar urea según Christensen

PROCEDIMIENTO

1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular

en el fondo. 2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C

INTERPRETACION

Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio. Prueba negativa: El medio permanece del color original

V. PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas anaerobias.

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:

2 H2O2 --------> 2 H2O + O2

La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).

23

MATERIALES Cepas Control: S. aureus, Streptococcus ó Enterococcus

Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%

Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.

PRUEBA EN LÁMINA

a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una

colonia bien aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio. b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3% c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo. d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.

PRECAUCIONES

1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya

que puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la prueba.

2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.

3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso que ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO DEBE USARSE AGUA.

INTERPRETACION

Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas

diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30’, éstas no son catalasa positivas.

VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios estrictos.

En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados comúnmente oxidasa).

MATERIAL Cepa control: sembrada en Agar nutritivo Reactivo de oxidasa

24

PROCEDIMIENTO

1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo. 2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los

discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa

INTERPRETACIÓN Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un intenso color azul oscuro.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de

gases (CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina

Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas: a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta

la glucosa: superficie purpura/fondo amarillo. b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo

(superficie violeta/fondo amarillo). c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.

d) Producción de gas: ruptura del medio. e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA

Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias tóxicas que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.

MATERIALES Cepa bacteriana Placas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO 1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre

2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C 25

INTERPRETACIÓN Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos del tipo de la biliverdina Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara alrededor de la colonia

VIII. PROTOCOLO

PRUEBAS MEDIO DE REACTIVO Y /O LECTURA

BIOQUÍMICAS CULTIVO INDICADOR

TSI

(Fermentación-

H2S)

VP

VOGES-

PROSKAUER

MR

ROJO DE

METILO

INDOL 0

CITRATO

CATALASA

UREASA

CITOCROMO

OXIDASA

LIA

(Agar Lisina

Hierro)

HEMOLISINA

26



PRACTICA N° 8

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCION

Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los antibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:

Método de dilución

Método de Difusión en Agar

OBJETIVOS 1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los

antibióticos. 2. Interpretar los resultados del método utilizado. 3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.

DILUCION EN TUBO

Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la concentración inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro” bacteriano. Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.

DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)

Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se observan las zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el disco difiere para los distintos fármacos.

MATERIALES Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya

Tubos con caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con cultivo bacteriano

Asas de siembra

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Torundas estériles

Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).

Pinzas

Mecheros

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar

uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar. 2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente. 3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes

antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm. 4. Incubar a 37°C durante 24 horas.

LECTURA

a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano

alrededor de los discos, incluyendo el diámetro del disco. b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el

microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes antimicrobianos utilizados. Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede responder a dosis altas del antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su capacidad de difusión en el Agar.

c) Anotar e interpretar los resultados.

Antimicrobiano Código Resistente Sensible Antimicrobiano Código Resistente Sensible

Gram negativo Gram positivo

Amikacina AK-MK ≤ 14 ≥17 Ac.nalidixico NA ≤ 21 ≥ 16 Amoxicilina +

clavulanico AM ≤ 13 ≥ 18 Cefepima FEP ≤ 14 ≥ 18 Ampicilina AMP ≤ 13 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Cefalotina CFM ≤ 14 ≥18 Clindamicina CM-DA ≤ 14 ≥17 Cefotaxima CTX ≤ 14 ≥ 23 Cloranfeicol C ≤ 12 ≥18 Ceftazidima CAZ ≤ 14 ≥ 20 Eritromicina E ≤ 13 ≥18 Ceftriaxona CRO ≤ 13 ≥17 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Cefuroxina RBA ≤ 14 ≥18 Nitrofurantoina FD ≤ 14 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Norfloxacin NOR ≤ 12 ≥17 Cloranfenicol C ≤ 12 ≥18 Oxacilina AO ≤ 10 ≥13 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Penicilina P ≤ 19 ≥20 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Rifampicina RIF ≤ 16 ≥ 20 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Tobramicina NN ≤ 12 ≥15 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19

Vancomicina V ≤ 9 ≥12

PROTOCOLO Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la práctica desarrollada.

28



PRACTICA N° 9

REACCION ANTIGENO – ANTICUERPO: AGLUTINACIÓN La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción antígeno-anticuerpo en el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas pueden ser bacterias, eritrocitos, partículas de látex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple vista o con lentes de poco aumento.

AGLUTINACION BACTERIANA

Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana, uno de los más simples es la aglutinación en lámina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del antígeno con el suero del paciente en una lámina. Esta técnica ofrece un método de muestreo rápido para análisis de rutina.

MATERIALES Lámina para aglutinación ( láminas excavadas)

Antígeno bacteriano

Suero de paciente

Pipetas serológicas de 0.2 ml

Palitos mondadientes

PROCEDIMIENTO

1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lámina

de vidrio excavada. 2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero de un mismo paciente.

3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota. 4. Hacer rotar suavemente la lámina por espacio de 2 a 3 minutos.

RESULTADO

La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tienden a agruparse en la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.

PROTOCOLO:

Realizar una aglutinación cualitativa y una cuantitativa 29

Aglutinación cuantitativa

TUBOS

REACTIVOS

1 2 3 4 5

ANTISUERO 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005

ANTIGENO AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

TITULO 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320

RESULTADO:

Título del suero: …………………………………………………………. Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en práctica

30



PRACTICA N° 10

FAGOCITOSIS

La línea celular de defensa está íntimamente asociada con la línea humoral. La fagocitosis o el englobamiento de partículas extrañas por ciertas células es un fenómeno no específico, pero se incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos o complementos. Entre las células fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos (monocitos libres). A estas sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antígenos más susceptibles a la fagocitosis se les llama OPSONINAS.

FAGOCITOSIS “IN VITRO” Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difíciles de realizar, en comparación con otras pruebas serológicas, pero en ciertos sistemas es la única a ser utilizada. El antígeno y la sangre total (conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de estas mezclan se colorean. El índice fagocítico es el número promedio de partículas ingeridas por cada 100 Neutrófilos de la sangre.

MATERIAL Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o

Klebsiella

Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sódica al 1%

Una jeringa de 5 ml con aguja N° 20

Pipetas Pasteur con perilla de jebe


PROCEDIMIENTO

Colorante Wright

Agua tamponada

Baño María a 37°C

Centrífuga

Gradilla

Microscopio con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

1. Con la jeringa hipodérmica recolectar 5 ml de sangre venosa. 2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.

3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente. 4. Llevar los tubos a Baño María por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.

5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo. 6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glóbulos blancos de

cada tubo. 7. Realizar los frotices y colorear con Wright:

Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.

Añadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.

Después de 15 minutos, lavar con agua de caño.

Secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADO Se observará la presencia de gérmenes intracelulares que han sido fagocitados. 31



PRACTICA N° 11

REACCION DE PRECIPITACION

INTRODUCCION Es una reacción antígeno- anticuerpo, en el que el antígeno es de naturaleza soluble. Cuando se mezcla un antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de equivalencia y visibles por lo general macroscópicamente. Las reacciones de precipitación pueden realizarse en un gel como el Agar.

INMUNODIFUSION SIMPLE Llamada técnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentración de Inmunoglobulinas en el suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antígeno, procediéndose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observándose la formación de un halo circular de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración antigénica.

INMUNODIFUSION DOBLE Llamada también método de Ouchterloni, es útil para comparar antígenos, detectar anticuerpos precipitantes, anticuerpos antinucleares y antígenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar semi-sólido en portaobjetos, en el cual se efectúan perforaciones, los cuales se llenan con los elementos reaccionantes (antígeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubación a temperatura ambiente, observamos la aparición de bandas de precipitación.

MATERIALES

Suero positive Placas Petri

Antígeno Pipetas capilares

Láminas de vidrio con Agar noble al 1% Láminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO 1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central. 2. Depositar en los orificios periféricos los antígenos a estudiar.

3. Colocar las láminas en una cámara húmeda.

RESULTADO Observar las bandas de precipitación que se forman: Identidad total : Las bandas de precipitación se unen.

Identidad parcial : Se observa un espolón. No identidad : Las bandas se cruzan. 32

INMUNOELECTROFORESIS Es útil para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, permitiendo medir e identificar

componentes séricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.

Resulta de la combinación de la electroforesis con la inmunodifusión. En una primera fase los

antígenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su

movilidad en un campo eléctrico, luego de una corrida electroforética, se coloca el antisuero en una

especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las proteínas que han migrado. Luego de

incubar, se forman bandas de precipitación frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.

PRACTICA N° 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA

INTRODUCCION

En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos para la detección de antígenos virales como de anticuerpos específicos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales). Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinación o la prueba de Fijación de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).

Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromogénicos, las que producen una reacción de color. Estas pruebas se conocen como “Análisis de Inmunoabsorbencia Ligada a Enzimas” (enzime- linked immunosorbent assay) ó ELISA.

La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran número de muestras simultáneamente en forma rápida y automatizada.

PROCEDIMIENTO

Determinación de Anticuerpo en fase sólida

Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo ó perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el

anticuerpo específico antiviral o anticuerpo de captura.

Luego se añade la muestra clínica, si esta contiene antígeno viral se unirá al anticuerpo de captura

Esta unión se detectará mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas más usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina ó biotina- aviclina.

Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antígeno.

Añadir el sustrato de la enzima.

Observar la presencia de color.

LECTURA

El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colorímetro o un

espectrofotómetro.

A mayor cantidad de antígeno presente en la muestra, más intenso será el color observado.

33

ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA

(Ensayo Inmunoenzimático para la detección de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia humana HIV-1 grupo O y HIV-2)

PLACAS CON SUEROS

GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS +

DEL VHI DE PACIENTE

CONTROL + INCUBAR

30 min a

37°

CONTROL +

Absorber

CONTROL -

LAVAR

twin salino

CONTROL - 1/10

(5 veces)

CONTROL -

PACIENTE

PACIENTE

SECAR

PACIENTE la placa

CONJUGADO

(Peroxidasa con Ig G Antihumana) 5ul

C/ pozo

+

INCUBAR 30 min

a 37°

LAVAR twin salino 1/10

SECAR

la placa

SUSTRATO A 20 ul.

Cromogénico

(Ag-Ac color

celeste) SOLUCION

SUSTRATO B + DE

Buffer Peróxido PARADA Hidrogeno 100

ul

(tomado de Wiener lab.)

34


ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 13

PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS

INTRODUCCION

Antígeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce la formación de anticuerpos o la aparición de fenómenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo específico, dando lugar a fenómenos perceptibles.

Los Antígenos más comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos, hematíes, suero, etc. Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antígeno en dosis adecuadas y generalmente progresivas con las siguientes finalidades. 1. Inducir en el hombre o en los animales, la formación de anticuerpos que los protejan contra

determinados procesos infecciosos. Este método conocido como vacunación confiere inmunidad adquirida activa.

2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales serán empleados en: a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, tétanos,

etc., en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una inmunidad adquirida pasiva.

B) La tipificación de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de clasificación, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.

I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y

FLAGELARES A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.

A. MATERIAL Cultivo bacteriano en medio sólido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio líquido (caldo nutritivo)

Pipetas graduadas estériles de 5 cc.

Suero fisiológico estéril, repartido en frascos de 100 cc.

Embudos y gasa, estériles para filtrar

Acido fénico concentrado en tubos de 13x100 ml.

Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.

Pipetas de Pasteur, estériles

Escala de MacFarland (tubo Nº 3)

Pipetas graduadas de 1 ml.

Tubos vacíos estériles de 16x150 ml.

35

Algodón y Alcohol yodado

Agar nutritivo en placas y tubos

B. PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiológico estéril a los cultivos

bacterianos presentados en medio sólido 2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar 3. Filtrar a través de gasa estéril 4. Separar la suspensión en cantidades iguales en dos tubos de 13x100 5. Para preparar el Antígeno somático "O", medir la cantidad de suspensión bacteriana

de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una concentración de 0.5%. Se puede así mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antígeno a la ebullición durante dos horas, o tratándolo con alcohol absoluto.

6. Para preparar el Antígeno flagelar "H", inactivar las fracciones somáticas en el otro tubo de suspensión bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentración del 0.5%

7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108

gérmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de suero fisiológico, gotas de cada uno de los antígenos concentrados hasta alcanzar una turbidez similar al tubo Nº3 de la Escala de MacFarland.

Este es un Método turbidimétrico de cálculo bacteriano, que consiste en diluir el antígeno y apreciar la turbidez obtenida comparándola con la de los tubos patrones de un nefelómetro o determinándola con exactitud mediante un Espectrofotómetro.

El Nefelómetro más conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:

Preparar una solución de Cloruro de Bario al 1%

Otra de Ácido sulfúrico al 1%.

Colocar una serie de 10 tubos vacíos y estériles

Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cl2Ba 1% 0.1 cc. 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

H2SO4 1% 9.9 cc. 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0

Bacterias 3.0 x 6.0 x 9.0 x 1.2 x 1.5 x 1.8 x 2.1 x 2.4 x

2.7 3.0

108 10

8 10

8 10

9

10 9 10 9 x x

por cc. 10 9 10 9

109

109

36

La unión de ambos reactivos químicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al homogenizarse da una turbidez que es más intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario empleado. A cada tubo corresponde una concentración de gérmenes determinada, de acuerdo a lo señalado en el cuadro. C. CONTROL DE ESTERILIDAD

Sembrar cada uno de los antígenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la finalidad de controlar su esterilidad Realizar la observación a las 18 ó 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.

Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la práctica.

D. INOCULACION

1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc.,

1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antígeno, con intervalo de 4 a 5 días. 2. Realizar la sangría después de 4 días de la última inyección.

E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIÓN (DEMOSTRACION)

37



ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 14

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM

POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS INTRODUCCION

Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales, agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en los cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos, intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S. aureus produce una enzima llamada coagulasa.

MATERIALES Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado

Placas Petri con Agar sangre (AS)

Tubos con Caldo plasma


Set de colorantes para Gram

Asa de platino en aro

Reactivo Catalasa

PROCEDIMIENTO:

1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar

sangre, por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C 2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram. 3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las

características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman (tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)

4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba de la coagulasa)

5. Realizar la prueba de la Catalasa. 6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y

como indicador de pH el rojo de fenol 7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina 38

RESULTADOS:

1. Características macroscópicas de la muestra: 2. Resultado de la coloración realizada 3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus

coagula el plasma. 4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparición

de burbujas en las tres especies. 5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de

S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.

6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre 7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es

sensible y S. saprofiticus resistente.

PROTOCOLO:

Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamaño de la colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.

CEPAS MH AS COAGULASA CATALASA GRAM Característica BACTERIANAS o (Agar morfológica TRABAJADAS Manitol sangre)

salado

39



PRACTICA Nº 15

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS

INTRODUCCION

El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con la coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.

Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite

diferenciar algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,

los glóbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucede en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un

derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus

pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las especies de Streptococcus.

MATERIAL

Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI

Placas con Agar sangre de carnero

Torunda estéril y bajalengua

Tubos con Thioglicolato

Tubos con caldo Inulina

Discos de Bacitracina

Discos de Optochin

Solución de Desoxicolato al 2%

Tubo con ClNa al 6.5%


Set de colorantes de Gram- Kopeloff

Asas de Kolle, pinzas

Microscopio, aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce

turbidez o sedimento. 2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y

agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetos y colorear por Gram.

40

3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el

disco de Optochin, 4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.

5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina. 6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%

7. Realizar la prueba de la catalasa 8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas

bacterias de lisarse en presencia de sales biliares

LECTURA

1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S.

pneumoniae son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram. 2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la

Bacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina 3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de

Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa que las colonias son lisadas (desaparecen)

4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina. 5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el

efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y ácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial de oxido-reducción del medio.

6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D) 7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa

PROTOCOLO Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada

IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS Metabo Desarro Lisis por Bilis SENSIBILIDAD CAMP Hidrólisis lismo llo en

ORGANISMO De de la NaCl

Bacitra Opto Hipu Escu Inulina 6.5% Desoxi cina chin rato lina colato Sodio

- hemolíticos

GRUPO A S R N N N N N N

S. pyogenes

GRUPO B R* R P P N N P* N

S. agalactiae

GRUPO C, F, G R R N N N N N N

- hemolíticos

GRUPO Viridans R* R N N N* N N N

S. pneumoniae R S N N N P N P*

S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reacción variable

41



PRACTICA Nº 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

NEISSERIA

INTRODUCCION

Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con los lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstas N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.

Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin. La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una

tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de 7.2 a 7.6.

Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros microorganismos morfológicamente similares. La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono: Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.

El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el laboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos: a) Recolección correcta de la muestra.

b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio. c) Selección del medio de cultivo apropiado

d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.

MATERIALES Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria

Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria

Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram

Reactivo de Citocromo- oxidasa

Reactivo de catalasa



Set de coloración de Gram

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Colorante de Azul de metileno

Microscopio

Asas de siembra en aro y punta

Solución de alcohol yodado

Algodón y Xilol.

METODOLOGIA

1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circulares

de bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero, circulares, translúcidas o ligeramente opacas.

2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.

3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la lámina control.

4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de metileno.

PROTOCOLO

MEDIO DE CULTIVOCOLONIASTAMAÑOGRAM AZUL DE MUESTRA METILENO

AGAR THAYER MARTIN

AGAR CHOCOLATE

SECRECION ENDOCERVICAL

OXIDASA CATALASA

PRUEBAS

BIOQUIMICAS

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PRACTICA Nº 17

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM

POSITIVOS: GENERO BACILLUS

INTRODUCCION

El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedades en el hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como "carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se encuentran en el suelo, agua y aire. La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se presenta como un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, las colonias son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.

MATERIALES Placas Petri con Agar nutritivo

Placas Petri con Agar sangre

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con gelatina

Láminas para frotices


Set de coloración de Hiss para cápsula

Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas

Asa de Kolle

PROCEDIMIENTO 1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.

2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.

COLORACION HISS (PARA CAPSULA) 1) Preparar un frotis 2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos

3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%. 4) Lavar con agua corriente y secar 5) Observar al microscopio con lente de inmersión

44

COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS) 1) Preparar un frotis 2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos

(adicionar colorante cada vez que falte) 3) Lavar con agua corriente 4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto

5) Lavar y secar 6) Observar al microscopio con lente de inmersión

LECTURA:

EN LOS CULTIVOS En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies patógenas y ß- hemolíticas en las especies saprofitas. En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo. En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido En Gelatina: sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.

EN LAS LAMINAS COLOREADAS

Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el

centro del bacilo. Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro. Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.

RESULTADOS

A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

GENERO BACILLUS

ESPECIE PATÓGENA ESPECIE SAPROFITA

Caldo nutritivo

Agar nutritivo

Agar sangre

Agar semisólido

Hemolisis

Hidrólisis de la gelatina

Prueba de la Catalasa

Fermentación salicina

Movilidad

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PRACTICA Nº 18

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

LISTERIA

INTRODUCCION

El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y

presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V ó

de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo,

en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria

monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los

ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre. El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, desarrolla bien en medios de cultivo comunes.

MATERIAL Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con medios semisólidos (Motilidad)

Placas Petri con Agar sangre

Placas Petri con Agar nutritivo

Tubos de 13x100 con:

Agar urea de Christensen

Citrato de Simmons

Caldo rojo de fenol con glucosa

Caldo rojo de fenol con sacarosa

Caldo rojo de fenol con lactosa

Caldo rojo de fenol con manita

Caldo rojo de fenol con salicina

Caldo esculina

Caldo:

MR-

VP

PROCEDIMIENTO

1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram. 2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina y

laminilla. 46

3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los

diferentes medios diferenciales 4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.

LECTURA FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.

LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.

EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.

EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.

EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar

MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +

HEMOLISINA + SACAROSA - VP +

CATALASA + LACTOSA -

OXIDASA - MANITA -

UREA - SALICINA +

CITRATO - ESCULINA +

47



PRACTICA Nº 19

"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION BUCOFARINGEA”

INTRODUCCION

La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos presentan un gran desarrollo de levaduras. La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos, Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos. La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias anaerobias. La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patógenas como Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus influenzae.

MATERIALES

Caldo nutritivo en tubos (13 x 100) Agar nutritivo en placas Agar sangre en placas Agar chocolate en placas Medio hipertónico de Chapman en placas Agar Mac Conkey en placas Agar Sabouraud en tubos Torundas estériles (2 x tubo) Baja lengua Asa de Kolle en aro Laminas portaobjetos Set de colorante Gram Varillas para coloración

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PROCEDIMIENTO

A. PRIMER DIA

1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe. 2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo. 3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC

B. SEGUNDO DIA

LECTURA

Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de cultivos.

IDENTIFICACION

Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente y pruebas de patogenicidad si se requiere.

Caldo plasma en tubo - Disco de Bacitracina

- Disco de Optochin - Reactivo de Citocromo- oxidasa

- Reactivo de catalasa

PROTOCOLO El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos. 49



PRACTICA Nº 20

AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL- RESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.

INTRODUCCION

Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar, poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamente en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.

Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el aire, en el agua y en la tierra.

Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico específico a través de la baciloscopia. Mycobacterium leprae produce la lepra ó enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia, también, son patógenos.

MATERIALES Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo

Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas

Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis

Láminas con extensión de otros tipos de Micobacterias

Set de colorante de Gram

Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)

Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita

PROCEDIMIENTO 1. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento. 2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la

lámina portaobjetos nueva. 3. Fijar la preparación.

4. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen 50

El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, etc.

LECTURA

Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen porque no son ácidos alcohol resistente. El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en un fondo azul.

EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO

Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los resultados, según el siguiente cuadro:

Negativo : No se observan bacilos en 100 campos. Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.

Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos. Positivo (+++) : Más de 10 bacilos por campo, en 25 campos.

La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que esta en tratamiento y permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.

TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos en grupos. I. Cepas que desarrollan en 8 ó más días. Llamadas de desarrollo lento.

GRUPO I: Pigmentan por estímulo de la luz. Son fotocromógenas.

Ejemplo: M. kansasi , M. simiae

GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estímulo luminoso. Son escotocromógenas. Ejemplo:

M. scrofulaceum

GRUPO III: No pigmentan espontáneamente, ni por estímulo luminoso. Son

no cromógenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y M. tuberculosis var. Bovina

II. Cepas que desarrollan en 7 días o menos.

GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita

PROTOCOLO DE TRABAJO:

Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica correspondiente. 51



PRACTICA Nº 21

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

CORYNEBACTERIUM

INTRODUCCION El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se incluyen especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo. Las características comunes del género son:

1) Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas 2) Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en

“letras chinas”, 3) Aerobios o anaerobios facultativos,

4) Catalasa positivos, 5) Citocromo oxidasa negativo.

La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda, contagiosa y febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe, además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina difterica). Es propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias superiores. El género se divide en tres grupos: Grupo I : Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales; Grupo II : Corinebacterias fitopatógenas, y; Grupo III : Corinebacterias no patógenas.

Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son: C.diphtheriae, C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y C.hoffmannii (pseudodiphthericum). La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.

MATERIAL

Cepa de Corynebacterium diphtheriae en caldo

enriquecido

Placa con Agar sangre

Placa con Agar chocolate telurito de potasio

Tubo de 13x100 con medio Pai en plano inclinado

Set de colorante de Gram

Set de colorante de Albert

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Tubos con Agar Urea Christensen en plano

inclinado

Caldo Rojo de fenol + Glucosa

Caldo Rojo de fenol + Maltosa

Asas de siembra



Microscopio

PROCEDIMIENTO 1. Tomar el inóculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el método de

dispersión agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por estrías. Incubar por 48 horas a 37°C.

2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.

3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert. 4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el

caldo Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.

COLORACION DE ALBERT

Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.

PROCEDIMIENTO 1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave. 2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético,

alcohol etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos. 3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis. 4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por

1 minuto. 5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X

LECTURA

En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados

ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o dispuestos paralelamente, o en forma de “letras chinas”.

En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro

En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos) observar los tres tipos de bacilos diftéricos:

a) Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.

b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras. c) Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.

En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con bordes enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta hemolisis.

BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae

Hemolisis: Beta (sólo el Tipo mitis) Gelatina : Negativo

Catalasa : Positivo Sacarosa : Negativo

Movilidad: Negativa Glucosa : Negativo

Urea* : Negativa Maltosa : Positivo

Nitrato : Positivo Lactosa : Negativo

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PRACTICA Nº 22

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO PSEUDOMONAS

INTRODUCCION

La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes para su desarrollo “In Vitro”.

Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana, principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales, esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con riesgo de vida fatales.

La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P. aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y desarrollan bien a 42°C.

MATERIAL Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150

Agar nutritivo en Placa Petri

Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150

Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100

Medio TSI

Reactivo de Oxidasa

Frasco con cloroformo

Set de colorantes Gram


PROCEDIMIENTO

1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de

Gram. 2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas

conocidas. 3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas. 54

RESULTADOS

COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos. CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de

color verdoso y un olor característico.

AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa. MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio de oxidación- fermentación (OF)]. AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el

Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.

CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la

piocianina.

PROTOCOLO

CARACTERÍSTICAS MICROORGANISMOS

Pseudomona aeruginosa

Crecimiento en Mac Conkey

Reacciones en TSI

Difusión de Pigmento en Agar nutritivo

Prueba de Citocromo- oxidasa

Solubilidad Cloroformo- piocianina

Crecimiento Agar nutritivo

Agar semisólido

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PRACTICA Nº 23

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

BRUCELLA HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA

INTRODUCCION

Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas. Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo menos 2 minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram. La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus. Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar Brucella o Caldo tripticasa soya. Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de

H2S, hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002

% y requerimiento de CO2.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o biopsias de ganglios linfáticos e hígado.

I: HEMOCULTIVO

Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La

incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen entre el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado como negativo.

II: SEROLOGIA Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de: 1. Aglutinación rápida en placa

2. Aglutinación lenta en tubo (Wright) 3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)

4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina) 5. ELISA 56

MATERIAL Tubo con cepa de Brucella

Frascos con medio de Ruiz- Castañeda

Muestra de sangre total de paciente

Agar fucsina en placa

Agar Thionina en placa

Suero positivo y suero control negativo

Antígeno estandarizado de Brucella

Láminas excavadas

Pipetas de 0.2 ml

Palito mondadientes



PROCEDIMIENTO

I: HEMOCULTIVO

Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.

COLORACION Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram, siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.

II: SEROLOGIA

1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da.

Línea de la lámina excavada. 2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero

positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente. 3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml. 4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por

el suero negativo y la dilución más alta 1:400 5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en

reposo por 4 minutos más. 6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una

reacción positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.

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INTERPRETACION

SUERO ANTIGENO DILUCION / TITULO

0.08 + 0.03 25 ó +

0.04 + 0.03 50 ó ++

0.02 + 0.03 100 ó +++

0.01 + 0.03 200 ó ++++

0.005 + 0.03 400 ó +++++

DIFERENCIACION BIOQUIMICA

ESPECIES

DE PRUEBAS DE DIFERENCIACION

BRUCELLA

Crecimiento en Huésped Necesidad Producción Hidrólisis

Preferido CO2 (5%) de H2S de Urea Fucsina Thionina 0.002 % 0.002 %

B.abortus Bovino + ++ Débil + -

B.melitensis Cabra, oveja - - Débil + +

B.suis Cerdos - + Fuerte - +

B.canis Perros - - Fuerte - + 58



PRACTICA Nº 24

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO

INTRODUCCION

En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de los cuales son patógenos para el Hombre y causantes de enfermedades. El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el aislamiento del agente patógeno bacteriano. La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de alimentos contaminados con heces humanas.

Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.

Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e infección y son productoras de endotoxinas.

Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la Salmonella paratyhi A, B ó C.

El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.

El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.

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MATERIALES Muestra de heces.

Placas Petri con Agar Mac Conkey

Placas Petri con Agar SS

Placas con Agar Manitol

Tubos con Agar Sabouraud

Tubos con medio TSI, LIA

Tubos con caldo peptonado

Tubos con Citrato de Simmons

Tubos con caldo MR-VP

Frasco con Lugol

Reactivo para Citocromo-oxidasa

Reactivo de Kovacks (prueba de indol)

Reactivo para Rojo de metilo

Láminas portaobjeto y cubreobjeto

Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)

Juego de colorantes para Gram

Material básico para laboratorio

PROCEDIMIENTO

1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.) 2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram. 3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:

a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de solución salina.

b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey, Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.

c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.

LECTURA

EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa. EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en las colonias que son SH2. EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las características. EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro. EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y

producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador púrpura de bromocresol] 60

EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el reactivo de Kovac tornándose rojo grosella. EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul), negativo (color verde). EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color amarillo). EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se

le añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo),

negativo (color amarillo). PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del

reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son

productoras de la enzima en caso contrario no habrá ningún cambio de color COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos. CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos

DIFERENCIACION BIOQUÍMICA

TSI LIA Cp Ct

(glucosa, sacarosa

Especies MR-VP Oxidasa

lactosa,SH2 )

Lisina Indol Citrat

Ac. Ac.

Ga SH2 o

Sup Fon s

+ + + - V + - + - -

Escherichia coli

+ + + - - V + - + -

Klebsiella

- + - + + - + + - -

Salmonella typhi

- + - - - V - - - -

Shigella

- + - V - - V + - -

Proteus

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PRACTICA Nº 25

ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE

INTRODUCCION

Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus, causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos blandos. Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo. La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa. Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.

MATERIAL

Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus Tubos con TSI Tubos con LIA

Tubo con Caldo peptonado Tubo con MR-VP

Tubo con Citrato de Simmons Desoxicolato de sodio al 0.5 % Láminas portaobjetos

Set de coloración de Gram Microscopios Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO Y LECTURA

1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.

cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares, de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a partir de la utilización de la sacarosa) En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto

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verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva) 2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la

sacarosa, no produce H2 S. 3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol 4. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.

5. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol 6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio

7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram 8. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de

Desoxicolato sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una cuerda larga” que se torna mas pegajosa después de 60 segundos mas.

9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados. PROTOCOLO

MEDIOS Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus

TSI Acidez en superficie y profundidad Acidez superficie y

profundidad

LIA Positiva por descarboxilación de la Positiva

Lisina

VP 10- 50% cepas es positivo Negativo

MR Negativo Negativo

Indol Positivo Positivo

Citrato Negativo Negativo

Urea Negativo Negativo

Oxidasa Positiva Positivo

Catalasa Positiva Positiva

Prueba de la cuerda Positiva Negativo

RESULTADOS

1. Realizar esquemas de lo observado en la práctica 2. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.

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PRACTICA Nº 26

ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA INTRODUCCION

Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas, muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).

El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales; comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi, L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de restricción o la composición de su DNA.

La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.

Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas. Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10 días, en condiciones de aerobiosis.

Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:

1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido

cefalorraquídeo, orina) en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo. 2. Evidencia sexológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de

diagnóstico inicial de 1:100

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MATERIAL

Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado

Lamina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de Congo.

Microscopio. LECTURA

En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en

todo el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio En la coloración de Kiktenko las Leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta en fondo

incoloro, presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con

los extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas. En la observación al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un

“collar de perlas” son muy móviles, realizan movimientos de translación, rotación y al

rededor de su eje. RESULTADOS

1. Características del cultivo observado. 2. Realiza esquema de la observación en las láminas coloreadas

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UNIVERSIDADPRIVADA SAN JUAN BAUTISTA



PRACTICA Nº 27

ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA

INTRODUCCIÓN

La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un insecto alado hematófago conocido como Lutzomya.

Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su tamaño varía entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de diámetro, presenta flagelos unipolares en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta) Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).

Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma, durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento por lo general semanas, enturbia el medio con sedimento y a veces se observa películas o témpanos en la superficie de la parte líquida del medio.

Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis. En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por Infección de los hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del movimiento de los hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella

MATERIAL

Frotices coloreados por Leishman, Wrigth ó Giemsa procedentes de cultivo. Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina

PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN

Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella. En las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada. En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de películas o témpanos Realizar esquemas de las observaciones realizadas.

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PRACTICA Nº 28

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL ó RPR

INTRODUCCIÓN Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares móviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres géneros de microorganismos patógenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sífilis, T. pertenue, produce el pián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis. La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y 5 a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de anilina y es difícil su cultivo en medios artificiales.

PRUEBAS DE DIAGNOSTICO 1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden

observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles características.

2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina 3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no

treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey) 4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene

0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que las partículas del antígeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en enfermos se combina con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos contra algunos antígenos).

MATERIALES

Suero problema Laminas excavadas

Antígeno VDRL Pipetasgraduadas

PROCEDIMIENTO

Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lamina excavada

Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de floculos cuando la reacción es positiva.

RESULTADOS N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos RD (Reactivo débil) ........................ Floculos pequeños R (Reactivo) ....................... Floculos medianos y grandes

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PRACTICA Nº 29

CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO INTRODUCCION

El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patógenos causantes de una infección urinaria. Para la obtención de muestras debe considerarse:

La recolección debe ser con un mínimo de contaminación

Establecer el momento óptimo para la recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad de recuperar microorganismos causales.

Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo necesarias. Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.

Normalmente la orina es estéril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminación por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:

1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la

muestra negativa. 2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infección urinaria. 3. Si el número de gérmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será

necesario repetir el cultivo.

La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recolección para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el Antibiograma correspondiente.

MATERIAL

Muestra de orina patológica Sedimento de orina

Agar Mac Conkey, Medio hipertónico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C

Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de Christensen.

Tubos con 9.9 ml de Suero fisiológico 0.85% Pipetas de 1 ml. estériles Placas Petri, vacías estériles

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Bocal con desinfectante Microscopio Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen Serie de colorantes de Gram Láminas portaobjetos y laminillas

PROCEDIMIENTO

PRIMER DIA:

A. Estudio de las características macroscópicas Describir el aspecto de la orina:

Color (amarillo, oscuro, castaño o incoloro) Señalar si la orina es clara o turbia.

B. Estudio de las características microscópicas

1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al

microscopio con objetivos de 10X y 40X 2. Realizar un frotis y colorear por el método de Gram y Ziehl- Neelsen

C. Siembra de la muestra de orina:

1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersión agotamiento en las

placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud 2. Método de dilución: Preparar una dilución de la orina de la siguiente manera.

a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con suero fisiológico 0.85% estéril. Mezclar bien.

b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacías estériles.

c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla homogénea.

d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37°C por 18- 24 horas.

LECTURA

1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales

anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales, cilindros. 2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y

Gram negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes(en caso de infección por Mycobacterium).

SEGUNDO DIA:

1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el

crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de 69

colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de levaduras.

2. En la siembra por dilución, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número de colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.

3. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioquímica respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de Christensen. Incubar a 37°C por 18-24 horas.

Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara una suspensión en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del antibiótico alcanzado en el suero o en foco de infección. El método de disco-difusión estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el laboratorio, para dicha determinación (MIC).

REPORTE FINAL Diseñar el protocolo correspondiente, señalando: 1. La observación macroscópica y microscópica de la muestra clínica. 2. Las características del desarrollo bacteriano, y los principios bioquímicos en cada uno de los

medios selectivos empleados. 3. Los resultados del comportamiento bioquímico. 4. La determinación del agente patógeno causante de la infección urinaria.

5. Determinación cuantitativo número de UFC por ml.

Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)

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PRACTICA Nº 30

AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES

LACTANTES.

OBSERVACION DE LÁMINAS COLOREADAS INTRODUCCION

Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos). En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano; debido a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y multiplicación deben necesariamente utilizar los sistemas de las célula que parasitan y por ello se denominan parásitos intracelulares obligados. En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las infecciones virales así como drogas antivirales específicas para muchos virus.

Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican en el interior de las células vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de métodos especiales en el laboratorio de virología, tales como:

a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayoría de los virus pueden multiplicarse en cultivo de células apropiadas.

b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad alantoidea y saco vitelino).

c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hámsters, monos)

d) Serología o demostración de anticuerpos frente al virus. e) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigación médica y epidemiología y constituye un método muy extendido para el diagnóstico de la infección. Por lo tanto estas prácticas nos orientan a conocer los diversos métodos de aislamiento directo o indirecto para demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como se deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.

METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO: 71

A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.

Muchos de los virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos embrionados de gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces están siendo ampliamente usadas. Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser inoculado.

MATERIALES Huevos embrionados de 7-9 días.

Huevos embrionados de 10-12 días.

Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.

Colorante Fucsina al 1% con agua destilada

Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada

Frascos con Alcohol yodado

Algodón

Ovoscopio

Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados

Equipo de disección (Pinzas, tijeras curvas, guantes)

INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA

a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 días. b) Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevos embrionados. c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de

45° e inocular 0.2 ml. de colorante. d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por

2-4 días, luego cosechar y observar.

INOCULACION POR VIA AMNIOTICA a) Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días. b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del

embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón. c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no

vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente. d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana

amniótica, formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de metileno o del inoculo problema.

e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen. f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-

35°C por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)

INOCULACION DEL SACO VITELINO

a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo

embrionado de 6-7 días. b) Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire. c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la 72

aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de

profundidad. d) Sellar la abertura

COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGÚN LAS CAVIDADES INOCULADAS)

a) Comprobar que el embrión este vivo. Enfriar a 4°C los huevos embrionados por algunas

horas (2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones. b) Cortar la cáscara que cubre la cámara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes. c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localización del

Azul de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculación (Membrana alantoidea, amniótica, corioalantoidea y saco vitelino).

d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amniótico y realizar las pruebas de diagnóstico correspondientes según la investigación solicitada

D. INOCULACIÓN EN RATONES LACTANTES: Se utilizaran ratones lactantes y las vías de inoculación serán: Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutánea y Nasal.

E. OBSERVACIÓN DE LAMINAS COLOREADAS:

Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión (Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su localización es específica de la enfermedad viral. Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto citopatico) como conglomerados de virus asociados a productos de reacción de la célula infectada.

OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:

1. Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado

el citoplasma.

2. Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusiones eosinofilas

intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.

3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración

celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el borde de la célula.

4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las

inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.

5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en

“ojos de lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).

6. Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las

inclusiones basófilas intranucleares.

PROTOCOLO Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.

73



PRACTICA Nº 31

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES

INTRODUCCION

Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a expensas de la materia inerte existente, la mayoría se encuentra como saprofito, otros pueden ser causantes de inducir hipersensibilidad así como también ser responsables de infecciones. Entre los hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula

MATERIALES Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,

Rhodotorula y Helmintosporium.

Láminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Microscopios

PROCEDIMIENTO

1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio aéreo, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia. 2. Observar al microscópico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las características

microscópicas de cada uno de los hongos preparados en las láminas con azul de lactofenol.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES

Aspergillus Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado, marrón o negro. Microscópicamente presenta hifas tabicadas que forman conidióforos no tabicados que se ensanchan en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde salen las conidias en cadena.

Penicillium Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante. Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en cuyo extremo se hallan los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.

Fusarium Colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado ó violeta en la superficie. 75

Microscópicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidióforos, macroconidias septadas y alargadas, fusiformes.

Rhizopus Colonias de micelio aéreo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisáceo. Microscópicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se encuentran las esporas.

Cephalosporium Colonias de micelio aéreo de color blanco- rosado o blanco- amarillento. Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias hialinas agrupadas.

Helmintosporium Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada de color gris. Microscópicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre conidióforos cortos y nudosos

Rhodotorula Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.

PROTOCOLO Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica. 76



PRACTICA Nº 32

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS

INTRODUCCION

Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más comunes en los humanos. Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso de los cabellos, barba y bigote.

Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).

MATERIALES

Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E. floccosum.

Lámina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Láminas preparadas de M. furfur en hidróxido de potasio al 20%.

Láminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.

Material básico de laboratorio(xilol, algodón, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.

PROCEDIMIENTO

1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia , producción de pigmento y consistencia de la colonia. 2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos preparados en láminas.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.

Trichophyton rubrum Colonias de micelio aéreo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento de color púrpura. Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a veces puede observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares. 78

Trichophyton mentagrophytes Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento amarillo- pardusco. Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esféricas agrupadas, pueden presentar hifas en espiral y macroconidias.

Trichophyton tonsurans Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con pigmentación amarillo- castaño al reverso. Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas septadas, pueden observarse macroconidios.

Microsporum gypseum Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela. Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en número de 4-6, rara vez se observan microconidias.

Microsporum canis Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la colonia. Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse microconidias y clamidosporas.

Epidermophyton floccosum Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la colonia. Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.

Malassezia furfur (Pityrosporum) Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnóstico se da por el examen directo de la muestra

Piedraia hortai Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que envuelven completamente el tallo piloso.

PROTOCOLO Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica 79



PRACTICA Nº 33

ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.

INTRODUCCION: Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutáneos. Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o mucosas, aparato genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre la infección primaria es casi siempre pulmonar.

MATERIALES Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.

Láminas de Candida albicans en Agar harina de maíz.

Láminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.

Cortes histológicos con C. albicans y Cr. neoformans.

Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.

PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y

consistencia de la colonia. 2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el

Agar harina de maíz, tinta china y en los cortes histológicos.

CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES

Candida albicans Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.

En el Agar- almidón- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican a Candida albicans.

En los cortes histopatológicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.

Cryptococcus neoformans Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto mucoide

viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.

En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.

En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.

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PRACTICA Nº 34

ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.

INTRODUCCION Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en el hombre y algunos animales.

Paracoccidioides brasiliensis En su fase inicial esporógena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su fase de levadura en tejidos infectados. Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infección crónica, granulomatosa de la piel, mucosa, ganglios y vísceras. Es más frecuente entre los trabajadores rurales.

Histoplasma capsulatum En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporógena, que se desarrolla principalmente sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de murciélagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado. Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.

Sporothrix schenckii Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios linfáticos

MATERIALES Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.

Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol

Cortes histológicos infectados por estos hongos.

PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia. 2. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS Paracoccidioides brasiliensis En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes. En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con microconidias esféricas o piriformes. 83

En Agar Infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro. Microscópicamente se observan células esféricas.

Histoplasma capsulatum

En frotices o cortes histológicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeñas, redondas u ovaladas de 1-3 micras de diámetro. En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscópicamente se observan hifas tabicadas con escasa producción de microconidias y gran cantidad de macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa “Clamidospora tuberculada”. En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón claro. Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.

Sporothrix schenckii En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeñas, blanquecinas presentando posteriormente un aspecto húmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a negro. Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo se encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita. En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en gemación ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.

PROTOCOLO Esquematice o dibuje lo observado en la práctica. 84


ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA


SEMINARIO-I

GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENÉTICA

(Organización de los genes. Transferencia del DNA. Mutación. Expresión génica e Ingeniería genética)

TEMA 1 : ORGANIZACIÓN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO)

TEMA 2 : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIÓN

GENETICA BACTERIANA.

TEMA 3 : MUTACIÓN Y SUS CONSECUENCIAS

TEMA 4 : EXPRESIÓN GÉNICA E INGENIERIA GENÉTICA Y SUS

APLICACIONES EN LA MEDICINA.

OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA:

PRESENTACIÓN EN POWER- POINT Y TRÍPTICO EXPOSICIÓN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS LUGAR: AULA DE CLASES TEÓRICAS HORA: EN HORAS DE PRÁCTICAS PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIÓN

Profesor Responsable del Curso

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SEMINARIO – II

VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIÓN

(Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)

TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE

LA VACUNACIÓN. TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIÓN Y REQUISITOS DE UNA

BUENA VACUNA.

TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIÓN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL

TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE LA VACUNACIÓN

TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIÓN


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SEMINARIO - III

ANTIBIÓTICOS Y QUIMIOTERÁPICOS

(Mecanismos básicos de actividad y resistencia a los antibióticos)

TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS

1.1: Inhibidores de la Síntesis de la pared celular 1.2: Inhibidores de la Síntesis de proteínas 1.3: Inhibidores de la Síntesis de ácidos nucleicos

1.4. Inhibidores de la función de la membrana citoplasmática

TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS

2.1: Genética de la resistencia 2.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTÁTICOS

3.1. Mecanismos básicos de actividad

3.2. Mecanismos de resistencia

TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES

4.1: Mecanismos básicos de actividad 4.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICÓTICOS

5.1: Mecanismos básicos de actividad 5.2: Mecanismos de resistencia

Profesor Responsable del Curso 88




SEMINARIO - IV

ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL:

(ETS) Y SIDA

1. SÍFILIS CONGÉNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO.

2. PAPILOMAVIRUS

3. VIRUS DE LA HEPATITIS B

4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH):

A) ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH

B) ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIÓN POR VIH

C) EPIDEMIOLOGÍA. TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN


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SEMINARIO - V

ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA

TEMA 1: FIEBRE AMARILLA

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

TEMA 2: FIEBRE AMARILLA a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA

b) PREVENCIÓN Y CONTROL

TEMA 3: DENGUE

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

TEMA 4: DENGUE

a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA b) PREVENCIÓN Y CONTROL

Profesor Responsable del Curso 90

g.p._microbiologia_3.pdf

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