Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias

Básicas

ISSN: 0120-4211

revistabistua@unipamplona.edu.co

Universidad de Pamplona

Colombia

Wilches Flórez, Angela María

Estudio genético preliminar de bacterias ácido lácticas productoras de exopolisacáridos (EPS)

Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas, vol. 3, núm. 2, julio, 2005, pp. 12-18

Universidad de Pamplona

Pamplona, Colombia

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RESUMEN

Se realizó el análisis genético preliminar a dos cepas bacterianas productorasde exopolisacáridos (EPS), pertenecientes al grupo de bacterias ácido lácticas(LAB) para determinar si la codificación para la producción de EPS se encuentraa nivel plasmídico o cromosomal. Se encontró que el gen para la producción delexopolisacárido esta codificado a nivel plasmídico para las dos bacterias; esteplásmido se pierde al cultivar las cepas a temperatura de 40º C.

ABSTRACT

Genetic preliminary analysis off two bacterial strains that produces exopolysaccharides(EPS) belonging to lactic acid group (LAB) was done, to determine if codification forexopolysaccharide production is codificate at plasmidic or chromosomal level. Thegen for EPS production is codificate at plasmidic level for both bacteria, this plasmidis lose when the strains are cultivated at temperature of 40º C.

PALABRAS CLAVES

ADN, plásmido, cromosoma, exopolisacárido (EPS), bacterias ácido lácticas(LAB).

KEY WORDS

DNA, plasmid, chromosome, exopolysaccharides (EPS), lactic acid bacteria (LAB)

ESTUDIO GENÉTICO PRELIMINAR DEBACTERIAS ÁCIDO LÁCTICASPRODUCTORAS DE EXOPOLISACÁRIDOS(EPS)

Angela María Wilches Flórez

Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias BásicasDepartamento de Microbiología

e-mail: angelamaw@unipamplona.edu.co

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INTRODUCCIÓN

Las bacterias ácido lácticas (LAB) sonutilizadas en fermentaciones industriales yestán recibiendo gran atención al serempleadas por la industria farmacéutica y dealimentos (de VOS, 2004) principalmente parala producción de ácido láctico, componentessaborizantes, espesantes y bacteriocinas.Estas bacterias se caracterizan por susamplios requerimientos nutricionalesespecialmente con respecto a fuentes denitrógeno, ha sido demostrado que elcrecimiento se ve limitado por ladisponibilidad de nutrientes esenciales, porello el crecimiento se estimulasuplementando el medio de cultivo conextracto de levadura, peptona y aminoácidos.(ARRIETA et al, 1996); sin embargo mientrasque ciertos requerimientos nutricionalesparecen depender de la cepa, elrequerimiento por ciertos aminoácidos esmás generalizado; esta complejidadnutricional conlleva a que el cultivo debacterias LAB frecuentemente empleemedios complejos como por ejemplo MRS yM17 (FLAMBARD et al, 1997). Muchas cepasLAB productoras de exopolisacáridos (EPS)han sido estudiadas ampliamente, porejemplo Lactococcus lactis, aislado de variosproductos lácteos fermentados, Lactobacilluskefiranofaciens aislado de granos de kefir,Lactobacillus delbruecki aislado de yogurth yStreptococcus thermophilus también aisladode yogurth (NOVACK et al, 1997).

Lactococcus lactis es una de las bacteriasLAB mejor estudiadas y muchos avances enel desarrollo de herramientas genéticas sehan realizado con esta bacteria (JAN et al,2005), debido a la importancia de losplásmidos y bacteriófagos los estudiosiniciales en genética se centran en estoselementos extracromosomales(KLEEREBEZEM et al,1997 ). La producciónde exopolisacáridos por bacterias ácidolácticas es inestable (KOJIC et al, 1992), esta

inestabilidad ha sido observada por variosinvestigadores; se ha encontrado que lasbacterias lácticas ganan o pierden lacapacidad de formar polímeros de maneraazarosa (KLAENHAMMER et al, 2005).También se ha visto que los estreptococoslácticos pierden la capacidad de producir EPSdespués de diez a doce transferenciasperiódicas (KOJIC et al, 1992). Algunasinvestigaciones realizadas con L. cremorismuestran variaciones considerables en laproporción de células que producen materialcapsular extracelular (NOVAK et al, 1997). Laasociación de diferentes funcionesmetabólicas en las bacterias lácticas con ADNplasmídico esta bien reconocida (vonWRIGHT et al, 1987); con base en lainestabilidad observada de las característicasde los estreptococos lácticos se ha sugeridoque los plásmidos pueden estar involucradosen la expresión del fenotipo mucoide.(KLEEREBEZEM et al, 1997). La inestabilidades una desventaja para procesosindustriales y por ello se ha trabajado en laestabilización de las propiedades esencialespara los procesos de fermentación como porejemplo utilización de citrato y lactosa,actividad proteinasa, insensibilidad a losbacteriófagos y producción de EPS porintegración de los genes codificados enplásmidos al cromosoma bacteriano. (VEDAMUTHU et al,1986).

Durante los últimos años se han publicadoun gran número de estudios sobre la genéticade Leuconostoc sp (KLEEREBEZEM et al,1997), se conoce que muchas cepas lácticasde Leuconostoc sp poseen plásmidos de ADNy se ha encontrado la transferencia porconjugación de plásmidos ADN deLactococcus lactis a Leuconostoc sp(YOTHER et al, 2002). Los plásmidos usadosen estos estudios codifican propiedadesmarcadas como la fermentación de lactosa,producción de nisina y resistencia aeritromicina y cloranfenicol. (MAGUIN et al,1992). En el presente estudio se realizó el

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análisis genético preliminar a dos cepasbacterianas pertenecientes al grupo de bacteriasácido lácticas productoras de EPS, el estudiogenético se hace con el fin de determinar si lacodificación para la producción de EPS seencuentra localizada a nivel plasmídico ocromosomal.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. MICROORGANISMOS: Los microorganismos objeto de estudio fueroncepas que pertenecen al grupo de bacterias ácidolácticas. Los trabajos se realizaron con dos cepasbacterianas A y B productoras de EPS en mediosacarosa.

2. ANÁLISIS GENÉTICO PRELIMINAR2.1 Extracción de ADN Total: con el fin de realizaruna caracterización genética preliminar de lascepas A y B se realizó la purificación del ADN totalsiguiendo la metodología descrita por Leenhoutset al (LEENHOUTS et al, 1989) modificada en estetrabajo. Las modificaciones realizadas fueron: enla etapa de obtención de células se uso mediosacarosa en lugar del medio de cultivo utilizadoen el protocolo original; durante la lisis celular seeliminó el uso de mutanolisina y en la etapa delimpieza del ADN se reemplazaron lasextracciones con mezcla fenol-cloroformo-alcoholisoamílico por mezcla fenol-cloroformo.

2.2 Perfil Plasmídico: durante el desarrollo deltrabajo se utilizaron las metodologías propuestaspor Kronstad et al (KRONSTAD et al, 1983),Lereclus et al (LERECLUS et al, 1982), Andersonet al (ANDERSON et al, 1983; KLAENHAMMERet al, 1978) para realizar la extracción deplásmidos, con ninguna de ellas se obtuvieronresultados satisfactorios, lo que llevó a realizarmodificaciones a la técnica de Anderson et al(ANDERSON et al, 1983; KLAENHAMMER et al,1978). Las modificaciones consistieron en retirarel polímero de las células cosechadas haciendolavados con agua destilada, también se realizaronmodificaciones en las etapas de lisis celular yprecipitación. Los plásmidos purificados fueron

observados en geles de agarosa al 1% en bufferTBE 1X. Se corrió la electroforesis a 60 voltios porun tiempo de tres horas.

2.3 Curado de plásmidos: el ensayo de curado deplásmidos se realizó siguiendo la metodologíadescrita por Kojic y Vedamuthu (KOJIC et al, 1992;VEDAMUTHU et al, 1986). Las condicionesutilizadas para el cultivo fueron: temperatura de40ºC, tiempo de 24 horas, agitación 200 r.p.m. Sehicieron diluciones para obtener colonias aisladasy así poder observar las característicasmacroscópicas de las colonias resultantes. Serealizaron ensayos de actividad enzimática parala enzima relacionada con la síntesis de EPS alas colonias que presentaron cambios en lamorfología macroscópica.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN3.1 Perfil Plasmídico: los resultados obtenidos conel proceso de extracción de ADN plasmídicomuestran la presencia de cuatro plásmidos en lacepa A y cinco plásmidos en la cepa B cuyospesos moleculares aproximados son 35.8 MDa ytres plásmidos de pesos moleculares ubicadosentre 35.8 y 44 MDa para la cepa A (figura 1 línea2) y 3.4, 3.7, 35.8 MDa y dos plásmidos de pesosmoleculares entre 35.8 y 44 MDa para la cepa B(figura 2 línea 2).

En cuanto al procedimiento para la extracción deADN plasmídico en las cepas estudiadas esimportante mencionar que existen dos aspectosbastante relevantes para obtener una purificaciónde plásmidos eficiente, el primero es realizar laextracción de plásmidos en células que seencuentren en la mitad de la fase logarítmica decrecimiento, de esta manera se garantiza que lascélulas se encuentren en replicación activa yno se presenta una gran producción depolímero; el segundo es la adecuada remocióndel polímero que se alcanza a producir ya quela presencia de este ocasiona interferencias enel proceso de extracción.

3.2 Curado de plásmidos: con los ensayos decurado de plásmidos utilizando el método de

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temperatura se confirma que la ubicación delgen que codifica para el fenotipo mucoide seencuentra a nivel plasmídico como lo reportandiferentes autores (von WRIGHT et al, 1987;KOJIC et al, 1992; VEDAMUTHU et al, 1986).Los resultados obtenidos al realizar laextracción de ADN plasmídico muestran quehay variación en el perfil plasmídico de lascepas silvestres con respecto a las cepascuradas tanto en la cepa A como en la B(figuras 1 y 2 líneas 2 y 4). Los plásmidosque se pierden después del tratamiento contemperatura son los de 35.8 MDa y los depesos moleculares mayores a este. Con lacepa A se obtiene además de la pérdida delos plásmidos un resultado bastanteinteresante, en la cepa curada se visualizala presencia de dos bandas deaproximadamente 12 y 3.9 MDa que no estánpresentes en la cepa silvestre, la presenciade estas bandas puede sugerir inicialmenteque la bacteria sufrió un rearreglo deplásmidos debido a la existencia deplásmidos multiméricos (GRUSS, 1988) quehan sido encontrados en un gran número debacterias Gram positivas, también se puedepensar en la presencia de plásmidostermosensibles que con el tratamiento atemperatura superior a la temperatura óptimade cultivo del microorganismo pierdenfragmentos que se encuentran en suestructura generando las diferencias enmovilidad electroforética. (MAGUIN et al,1996), con este razonamiento se estaríacuestionando la pérdida de los plásmidosmencionada anteriormente, esta situaciónpuede ser aclarada analizando los resultadosobtenidos con los análisis de restricciónrealizados con la cepa silvestre y curada(figuras 1 y 2 líneas 3 y 5) donde seencuentran fragmentos comunes en la cepasilvestre y en la cepa curada y otrosfragmentos son característicos para cadacepa. Esto sugiere que efectivamente existediferencia en cuanto al contenido plasmídicode la cepa silvestre con respecto a la curada.Además la pérdida de los plásmidos se

confirma al evaluar las características demorfología macroscópica y de actividadenzimática en las cepas sometidas atratamiento de curado. Un primer cambiopresentado por las bacterias sometidas atratamiento a temperatura de 40ºC semanifiesta en la variación de lascaracterísticas morfológicas macroscópicascon respecto a las cepas silvestres. Lascolonias resultantes después de los ensayosde curado son colonias pequeñas (2-3 mm),blancas, de aspecto compacto, cremosas,borde definido, que no muestran la formaciónde polímero a su alrededor (Figura 3b y 4b).A nivel microscópico no se presentanvariaciones, se conserva la mismamorfología presentada por las cepassilvestres. Un segundo cambio se verifica alrealizar ensayos de actividad enzimática conlas cepas curadas ya que se registró unapérdida total de actividad enzimática para losdos microorganismos.

Con los resultados presentados y analizadosanteriormente y teniendo en cuenta que unrearreglo de plásmidos no conlleva a cambiosa nivel fenotípico mientras que un curado deplásmidos implica la pérdida de dichaestructura, lo que genera cambios encaracterísticas fenotípicas, se puede afirmarque en las cepas estudiadas si hubo pérdidade plásmidos y que la información para lacaracterística mucoide se encuentra codificadaa nivel plasmídico, lo que no se puededeterminar es cual de los plásmidos que seperdieron con el tratamiento de curado es elque contiene la información para la produccióndel exopolisacárido; se puede pensar que elplásmido relacionado con el fenotipo mucoidees el de peso molecular aproximado de 35.8MDa esto se sugiere con base en los resultadosobtenidos en investigaciones realizadas con L.lactis en donde se encontró que el plásmidoque contiene la información para la produccióndel exopolisacárido tiene un peso aproximadode 30 MDa (von WRIGHT et al, 1987 ).

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FIGURA 1: Perfil Plasmidico cepa A silvestre (s) ycepa A curada (c). Gel de agarosa al 1 %. L1 E.coliV 517. L2 cepa As. L3 cepa A s (Eco RI-Pstl). L4cepa Ac. L5 cepa A c( Eco RI- Pstl). L6 Fago LamdaHind III.

FIGURA 2: Perfil plasmídico cepa B Silvestre (s) ycepa B curada (c). Gel de agarosa al 1%. L1 E.coliV517. L2 cepa B s. L3 cepa Bs (Eco RI-Pst I). L4cepa B c. L5 cepa Bc (Eco RI- Pst I). L6 FagoLamda Hind III

FIGURA 3: características macroscópicas cepa A Silvestre (a). Características macroscópicas cepa Acurada (b)

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CONCLUSIONES

1. La cepa A presenta cuatro plásmidos depesos moleculares entre 35.8 MDa y 44 MDa;la cepa B tiene cinco plásmidos cuyos pesosmoleculares son 3.4, 3.7, 35.8 y dos de pesosmoleculares entre 35.8 y 44 MDa.2. En las dos cepas bacterianas objeto deestudio, el gen responsable de la producción

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FIGURA 4: características macroscópicas cepa B silvestre (a). Características macroscópicas cepaB curada (b).

del EPS se encuentra localizado a nivelplasmídico, estos plásmidos se pierden alcultivar las cepas a temperatura de 40 º C.3. La pérdida del plásmido en las cepasestudiadas conlleva a cambios en la morfologíamacroscópica y en pérdida de la actividad dela enzima que participa en la síntesis del EPS.

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