GENETICA BACTERIANATaller No. 4Dr. Francisco ArochaMedico Infectologo

GENETICA BACTERIANAGenoma procariota:Cromosoma bacteriano:Caractersticas generales:Carece de membrana nuclearLongitud: 1,3 mmPosee mltiples sitios de iniciacin de la replicacinPosee gyrasasEs linealTiempo de replicacin 18 minutos.

EL ADN

Semiconservativo Conservativo Dispersivo

GENETICA BACTERIANAGenoma procariota:Elementos Genticos:Plsmidos:Son elementos genticos extracromosomicos circulares capaces de autoreplicarse (replicn)Trasmiten informacin como:Resistencia a los antibiticosProduccin de toxinasProduccin de enzimas para el metabolismoProduccin de bacteriocinaPilis y adhesinasSideroforosEnzimas catalticas

GENETICA BACTERIANAGenoma procariota:Elementos Genticos:Transposones:Son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posicin a otra del genoma o desde el ADN cromosmico a un plsmido o viceversa

GENETICA BACTERIANAGenoma procariota:Elementos Genticos:Secuencias de insercin:Son los transposones ms simples. Su longitud oscila entre 150 y 1.500 pares de base y poseen nicamente los genes codificadores de las enzimas necesarias para promover su propia transposicin, adems tienen secuencias distintivas de nucletidos en sus extremosSon los responsables de las mutaciones por insercin.

GENETICA BACTERIANAGenoma procariota:Elementos Genticos:Bacterifagos: son virus que infectan a las bacterias:

LticosLisogenicos o temperados

Replicacin del Bacterifago T4

Esquema del Ciclo de Replicacin de un Bacterifago T4

GENETICA BACTERIANAMecanismos de regulacin de la expresin gentica:Operones:

GENETICA BACTERIANAMecanismos de regulacin de la expresin gentica:Operones:

InduciblesReprensibles

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Mutaciones:Cualquier cambio en la secuencia de base del ADN y que se trasmiten de la clula madre a la hija

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Mutaciones:Tipos:SilentesReemplazoSupresinInsercinInversinSentido errneoSin sentido

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Mutaciones:EspontneaInducidas:CalorLuz ultravioletaRadiacin ionizanteQumicos (5-bromouracilo, bromuro de etidio)

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Transformacin:Es el paso del material gentico de una bacteria muerta o lisada a una bacteria viva

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Transformacin: Experimento de Griffith

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:ConjugacinEs el paso de material gentico generalmente extracromosomico de una bacteria a otra a travs de un pili sexualEl plsmido que induce la formacin del pili sexual se denomina F+ o factor de fertilidad.Cuando el gen F+ se integra al cromosoma se denomina factor de fertilidad integrado Hfr.

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Transduccin.Es la transferencia gentica mediante bacterifagos

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Transduccin.El genoma de un fago puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario.El ciclo vital puede ser ltico o lisogenico

GENETICA BACTERIANAMecanismos de Variabilidad gentica:Transduccin.En la infeccin lisogenica el acido nucleico del fago se integra a la bacteria pero en lugar de trasformar la clula en una fabrica de fagos, el ADN del bacterifago se replica como una parte integral del cromosoma y agrega caractersticas fenotipicas a la bacteria como ejemplo el fago Beta del Corinebacterium diphteriae

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:Ingeniera gentica: es la aplicacin de la ciencia basada en la gentica bacteriana para el diagnostico de las enfermedades infecciosas y su posible tratamiento.

GENETICA BACTERIANARECOMBINACION GENETICA:Es el proceso de intercambio del material gentico entre el ADN exgeno y el endgeno que da como resultado un cromosoma hibrido

GENETICA BACTERIANARECOMBINACION GENETICA:tipos:HomologaEspecifica para el sitioilegitima

GENETICA BACTERIANARECOMBINACION GENETICA:Precombinacin homologa:Ocurre por un fenmeno de entrecruzamiento el cual es controlado por una protena RecA para lo cual los dos segmentos debe poseer cierto grado de homologia.

GENETICA BACTERIANARECOMBINACION GENETICA:Recombinacin especifica para el sitio:Ocurre por un grupo de varios mecanismos independientes de RecA estas enzimas no parten de la homologia de los segmentos de ADN sino del reconocimientos de las secuencias nicas de ADN que forman los bordes de los sitios especficos.

GENETICA BACTERIANARECOMBINACION GENETICA:RESISTENCIA A LOS ANTIBIOTICOSLos plsmidos pueden ser nicos o mltiples y poseen genes tra que le permiten pasar de una bacteria a otra por conjugacin.plsmidos R: Son plsmidos que incluyen genes capaces de conferir resistencia a los antimicrobianos (factor R), estos genes codifican enzimas que inactivan los antibiticos o reducen la permeabilidad de la clula a ellos. Por lo general trasmiten resistencia a mltiples antibiticos y producen presin selectiva sobre las bacterias.Las bacterias no patgenas sirven de reservorio a estos plsmidos.Factor de transferencia de resistencia o determinante r, aumenta la capacidad de replicacin del plsmido.Muchos factores R tienen secuencias de insercin y transposones.Los plsmidos se pueden detectar por electroforesis en gel de agarosa o microscopia electrnica

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:Tcnicas de Hibridacin: La especificidad de los nucletidos y las enzimas de restriccin permiten que los fragmentos que contengan genes especficos puedan ser detectados por tcnicas de radioinmunoenzayo o inmunolgicas (anticuerpos monoclonales). La tcnica mediante la cual se fragmenta una seccin de ADN y se aparea con un segmento conocido de ADN se conoce como HIBRIDACION.

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:Sondas de Hibridacin: Son segmentos de ADN marcados y especficos y permiten reconocer a una parte del ADN.Enzimas de restriccin: son enzimas que cortan el ADN en sitios especficos por lo general formados por 6 pares de bases.Electroforesis en Gel: permite que los fragmentos de ADN sea separados en base a su tamao y son identificados por bromuro de etidio (agregado fluorescente)

Sondas de hibridacin

Sondas de hibridacin

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:CLONACION:Cuando se fracciona un ADN pude originar mltiples fragmentos y algunos pueden contener extremos adhesivos y se pueden unir a un plsmido convirtindolo en un plsmido recombinante, estos plsmidos pueden ser introducidos en una clula mediante transformacin o electroporacin.Esta clula manipulada genticamente se denomina clon.

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:CLONACION:SECUENCIACIN: es el anlisis de la estructura del ADN mediante enzimas de restriccin y sondasVECTORES DE CLONACIN: permiten la insercin de ADN extrao en una clula:plsmidos: pBR 322Bacterifago: fago Cosmidos

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:ADN recombinante: Es la unin de un vector con un fragmento de ADN

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:Es una tcnica enzimtico que nos permite fabricar In vitro un numero tericamente ilimitado de copias de una secuencia especifica de ADN conocida, gracias a la replicacin cclica de tres pasos o reacciones simples, en las cuales slo varia la temperatura de incubacin.Fue concebida por Mullis en 1983 y desarrollada 10 aos mas tarde

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:Aplicaciones en Medicina:Estudiar alteraciones en un gen.Diagnostico de enfermedades genticas como hemofilia, anemia falciforme o corea.Diagnostico de agentes infecciosos como virus de la hepatitis, HIV, VPH, Herpes y Tuberculosis.Estudio de los Oncogenes.Estudio de los sistemas HLA.Medicina forense.Estudios de paternidad

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:TECNICA:Extraccin del ADN:La proteinasa K permite la obtencin de ADN de alto peso molecular desprovisto de protenas y otros inhibidores enzimticos.La calidad y concentracin de ADN se realiza por electroforesis en agarosa.Preparacin de los Primers:Los primers son secuencias especificas y conocidas de ADN que previamente han sido marcados

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:TECNICA:Componentes de la mezcla para Amplificacin:

Dos primers complementarios.Oligonucleotidod (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)DNA palimerasa y buffer de reaccin (Thermus aquaticus).Cloruro de Magnesio

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:TECNICA:

Ciclos:Desnaturalizacin del ADN a 94-98 C por 30 a 60 segundosRenaturalizacion o alineamiento o unin a los primers a las secuencias complementarias por descenso de la temperatura 55-65 C durante 30 a 60 segundosPolimeracin, sntesis o extensin, en el la temperatura se eleva a 72-76 C por 120 segundos, permite copiar la hebra de ADN molde mediante la adicin al primers de los distintos desoxinucleotidos segn la regla de la complementariedad

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:TECNICA:

Ciclos:Estos pasos se repiten cclicamente, de tal manera que despus de cada ciclo habr un crecimiento exponencial de las copias de ADN, igual a 2n.El nmero de ciclos puede variar de 20 a 40 obtenindose millones de copias de ADN.

GENETICA BACTERIANAAPLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS:REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA:TECNICA:

VERIFICACION:Tincin y ReveladoLa muestra amplificada luego se debe colocar en un gel agarosa y correr electroforeticamente para detectar las bandas a travs del bromuro de etidio a fin de determinar si la secuencia amplificada es la que estamos buscando.