fundamentos de genética aplicada

ÍNDICE

Tema 1. Introducción. Concepto de ADN recombinante. Aplicaciones.

1

Tema 2. Restricción y modificación del ADN. Enzimas de restricción. Tipos

y utilización.

2

Tema 3.

Otras enzimas utilizadas en la producción de moléculas de ADN

recombinante. Enzimas de degradación. Enzimas de polimerización.

Enzimas de modificación. Marcaje de moléculas de ADN.

Producción de ADN recombinante.

5

Tema 4.

Amplificación enzimática de fragmentos de ADN y ARN.

Reacción en cadena de la polimerasa. Componentes y parámetros de

la reacción. PCR de ARN.

11

Tema 5.

Vectores de clonación en bacterias. Clonación. Tipos y

características de los vectores de clonación. Plásmidos. Vectores

basados en el genoma del fago λ. Cósmidos. BACs. YACs.

16

Tema 6.

Clonación en bacterias. Concepto de genoteca. Construcción de

genotecas de ADN genómico y de ADN copia. Representatividad de

una genoteca.

29

Tema 7.

Rastreo de genotecas. Detección e identificación de clones

individuales. Detección directa por complementación. Detección

indirecta por hibridación de ácidos nucleicos. Vectores de expresión

y detección por métodos inmunoquímicos.

33

Tema 8.

Caracterización estructural de moléculas de ADN recombinante.

Mapas de restricción. Secuenciación de ácidos nucleicos. Hibridación

de ácidos nucleicos en filtro. Localización del fragmento clonado en

el genoma. Determinación del número de copias de una secuencia en

el genoma.

39

Tema 9.

Caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante.

Caracterización funcional in vitro. Caracterización funcional in vivo.

Introducción de genes en células eucariotas: métodos, vectores,

sistemas de selección.

50

Tema 10.

Mutagénesis in vitro. Genética reversa y tipos de mutagénesis.

Mutagénesis aleatoria por deleción, inserción y sustitución.

Mutagénesis dirigida. Inactivación de genes endógenos.

59

Tema 11.

Aplicaciones en genética humana. Aplicaciones al diagnóstico

clínico. Terapia génica. Medicina forense. Proyectos genoma.

69

Tema 12.

Aplicaciones en biología animal y vegetal. Obtención de plantas

transgénicas. Clonación animal. Transgénesis en animales. 80

Fundamentos de Genética Aplicada 1

Introducción

Hasta hace poco tiempo el ADN era una molécula que presentaba amplias dificultades para

su análisis bioquímico. Su gran longitud y monotonía hacían que la secuencia de

nucleótidos pudiese sólo ser estudiada mediante mecanismos indirectos. Para esto se

recurría a la determinación de la secuencia de las proteínas o del ARN. A partir de los años

70 se desarrollaron las herramientas de la ingeniería genética, o lo que se ha denominado

técnicas del ADN recombinante. Hoy en día se pueden separar regiones determinadas del

ADN, obtenerlas en grandes cantidades y determinar su secuencia de nucleótidos. También

es posible alterar un gen y transferirlo a células en cultivo o a la línea germinal de animales,

donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma.

Concepto de ADN recombinante

El ADN recombinante es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de

diferente origen. Generalmente se aplica este nombre a moléculas producidas por la unión

in vitro de ADN proveniente de dos

organismos diferentes que no se encuentran

juntos. Normalmente se trata de ADN

cromosómico que se une a un vector,

comúnmente un plásmido bacteriano.

Al introducirse este ADN recombinante en un

organismo se produce una modificación

genética que permite la adición de un nuevo

ADN al organismo conllevando a la

modificación de rasgos existentes o a la

expresión de nuevos rasgos.

Son necesarias herramientas que

linearicen los vectores y que corten el ADN

cromosómico, es decir, se necesitan enzimas

que tienen como sustrato el ADN. Después de

obtenerse el ADN recombinante debe

multiplicarse, para ello, se introduce en una

bacteria, que se dividirá formando un clon en

el que cada célula tendrá una copia del

plásmido recombinante.

Aplicaciones

Industria farmacéutica y química: se usan bacterias para producir sustancias de

interés para el hombre, como por ejemplo insulina.

Industria alimentaria: se usan bacterias para producir colorantes alimenticios.

Biorremediación: por ejemplo, degradación bacteriana de hidrocarburos.

Agricultura y ganadería: producción de plantas y animales transgénicos.

Medicina: técnicas de diagnostico molecular y terapia génica.

11

2 Alberto Fonte Polo

Restricción y modificación del ADN

En las técnicas de ingeniería genética se necesita fragmentar, modificar y multiplicar las

moléculas de ADN, y para ello se utilizan enzimas de diferentes tipos:

Enzimas nucleasas.

Enzimas de modificación.

Enzimas de polimerización.

Además se utilizan procedimientos químicos y físicos para fragmentar el ADN. Como

método químico cabe destacar la hidrólisis del ADN por pH ácido. Los ultrasonidos y el

cizallamiento son métodos físicos que fragmentan el ADN. Aunque a diferencia de los

métodos enzimáticos, los procedimientos químicos y físicos son inespecíficos.

Enzimas de restricción

Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiéster de la cadena

polinucleotídica de los ácidos nucleicos. Tipos de nucleasas:

Exonucleasas: escinden el último nucleótido del extremo 5' o 3' de un

polinucleótido. Pueden degradar por completo un ácido nucleico lineal.

Endonucleasas: cortan los enlaces fosfodiéster situados en el interior de los

polinucleótidos. Estas enzimas no requieren un extremo libre, por lo que pueden

cortar ácidos nucleicos circulares.

Las nucleasas pueden ser enzimas inespecíficas, es decir, que cortan el ácido nucleico

independientemente del nucleótido que haya. Pero también existen endonucleasas (de

restricción) que sólo cortan cuando reconocen una determinada secuencia nucleotídica.

Las enzimas de restricción (o restrictasas) pueden reconocer una secuencia característica

de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto,

llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la

enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son

reconocidos.

Existen tres tipos de enzimas de restricción (I, II, y III), forman parte de sistemas de

restricción-modificación, estos sistemas hacen la función del sistema inmune en las

bacterias. Cada enzima de restricción reconoce una diana, que también es reconocida por la

enzima de modificación. Las enzimas de modificación son metiltransferasas que añaden

grupos metilo a los nucleótidos de las dianas de restricción. Las restrictasas sólo reconocen

la diana cuando ésta no está metilada.

Cuando el ADN doble metilado en la

diana de restricción se replica, se originan dos

moléculas de ADN hemimetiladas, es decir,

que sólo tienen metilados los nucleótidos de

una cadena. En este caso las metiltransferasas

metilan la cadena de nueva síntesis. En el

caso de que un fago infecte a la bacteria, el

ADN que introducirá no estará metilado, y

por lo tanto será reconocido por las enzimas

de restricción y será degradado. Por otro lado,

22


existen fagos que no poseen dianas de restricción en su material genético, estos virus son

por lo tanto resistentes a la acción de las enzimas de restricción.

Se han descubierto más de 2.500 sistemas de restricción diferentes, y hay aproximadamente

300 enzimas de restricción comercializadas.

El nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen bacteriano de la

misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en:

1. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej.

Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras

letras del nombre se escriben en cursiva.

2. La cepa, si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli).

3. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa

aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción.

De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se debe a:

Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:

E Escherichia Género de la bacteria

co coli Especie de la bacteria

R RY13 Cepa de la bacteria

I La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima

Tipos y utilización

Tipos de enzimas de restricción:

Tipo I: estas restrictasas reconocen dianas largas (de 16 nucleótidos). Al reconocer

la secuencia específica de ADN (no metilado) corta al azar en sitios distintos al sitio

de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. Corta las dos hebras en

puntos cercanos entre sí, poco específicos, a unos 1.000 pares de bases

aproximadamente después de la diana. Deja extremos cohesivos.

Tipo III: el sitio de reconocimiento es más corto. Corta las dos hebras en puntos

distantes entre sí, es por lo tanto un corte desplazado y deja extremos cohesivos. El

punto de corte se sitúa a 24-26 pares de bases de la diana de restricción.

Tipo II: estas son las enzimas de restricción que comúnmente se usan en el

laboratorio. Las enzimas de restricción de tipo II más frecuentes reconocen dianas

de 4-6 pares de bases, pero existen otras menos frecuentes que reconocen dianas de

8, 10 o 12 pb. Cortan las dos hebras en puntos muy específicos, dentro de la

secuencia de reconocimiento.

Las dianas pueden ser secuencias fijas de nucleótidos, o pueden ser flexibles como

por ejemplo:

5'GGNNCC 5'GGPyrPyrCC 5'GGPurPurCC

3'CCNNGG 3'CCPurPurGG 3'CCPyrPyrGG

N representa cualquier base, Pyr representa una base pirimidínica y Pur una base púrica.


En cualquier caso, las dianas son siempre secuencias palindrómicas, esto es,

secuencias de nucleótidos que son idénticas a su cadena complementaria cuando

cada una es leída en la misma dirección química.

5'-GTATAC-3'

||||||

3'-CATATG-5'

Secuencia de reconocimiento palindrómica

El corte puede generar extremos romos o extremos protuberantes, según la enzima.

Extremos romos: la enzima corta las dos hebras en el mismo punto.

5'---CAG CTG---3'

3'---GTC GAC---5'

Extremos protuberantes: cuando el corte ocurre en puntos distintos en cada

hebra. Pueden ser extremos protuberantes 5' o 3', según esté la región simplexa

en el extremo 5' o en el 3' respectivamente.

5'---G AATTC---3' 5'---CTTAA G---3'

3'---CTTAA G---5' 3'---G AATTC---5'

Extremos protuberantes 5’ Extremos protuberantes 3’

Los extremos protuberantes son cohesivos, es decir, pueden volver a ligarse si

se restablecen los puentes de hidrógeno entres las bases nitrogenadas.

Dos sistemas de restricción distintos pueden ser isoesquizómeros cuando ambos

reconocen la misma diana de restricción o dianas muy parecidas, pero producen los

mismos extremos cohesivos.

Cuando se pretende obtener un alto grado de fragmentamiento del ADN se emplean

enzimas de corte frecuente, que son aquellas enzimas que reconocen dianas de

pocos pares de bases. Puesto que, una secuencia corta de nucleótidos aparecerá con

más frecuencia en la molécula de ADN que una secuencia con muchos pares de

bases. Pero las dianas de restricción no están distribuidas uniformemente en el

ADN, sino que puede haber tramos con dianas muy próximas, y otros tramos que

por azar casi no presenten dianas. Por ello, mediante estas técnicas no se puede

obtener fragmentos de ADN del mismo tamaño.


Otras enzimas utilizadas en la producción de moléculas de ADN recombinante

Enzimas de degradación

Las enzimas de degradación que se usan en el laboratorio son nucleasas (exonucleasas y

endonucleasas), son enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster.

Es necesario valorar la enzima para determinar la concentración adecuada de enzima que

hay que utilizar, ya que un exceso podría conllevar la degradación total del ADN que se

esté estudiando.

Las principales enzimas son:

Exo λ: se trata de una enzima sintetizada por Escherichia coli cuando está infectada por el

fago λ. Es una exonucleasa que degrada el ADN en dirección 5'→3', lo que da lugar a

moléculas con extremos protuberantes 3'.

Exo III de E. coli: es una exonucleasa presente en E. coli que degrada en sentido 3'→5',

por lo que produce extremos protuberantes 5'. Actúa sobre moléculas de ADN intactas y

también sobre sustratos mellados, es decir, sobre moléculas de ADN que presentan un

espacio donde falta un enlace covalente, y por lo tanto tienen un extremo 3' sobre el que

puede actuar la enzima.

Exo VII de E. coli: enzima exonucleasa que utiliza moléculas simplexas como sustrato, es

capaz de reconocer ambos extremos. Degrada el ADN simplexo en dirección 3'→5' y

5'→3', por lo tanto produce moléculas progresivamente más cortas. También es capaz de

reconocer ADN semisimplexo, pero en tal caso sólo degradaría la parte simplexa de la

molécula.

Bal 31: es una enzima nucleasa que tiene actividad

exonucleásica 3'→5' y origina extremos

protuberantes 5'. También actúa como endonucleasa

realizando cortes en el interior de la molécula de

ADN. En el laboratorio esta enzima se usa para

mutagenizar el ADN, ya que produce la deleción de

los genes, esto es útil para determinar la parte

codificante de dicho gen. Dependiendo del tiempo

que esté actuando la enzima los fragmentos estarán

más o menos delecionados.

S1: enzima endonucleasa que corta extremos protuberantes en ambos sentidos.

33


ADNasa I de E. coli: esta enzima puede actuar como endonucleasa tanto de cadena simple

como de cadena doble. Si se trabaja con un tampón con Mg2+

la enzima corta solamente

una de las dos cadenas, introduce mellas en la molécula de ADN. Pero ante la presencia de

Mn2+

corta las dos cadenas en el mismo punto. En cualquier caso, siempre actúa sobre

ADN duplexo.

ARNasas: son enzimas endonucleasas que actúan sobre ARN monocatenario. Hay varios

tipos:

ARNasa A: rompe enlaces entre una pirimidina y otra base cualquiera.

ARNasa T: rompe enlaces entre una guanina y otro nucleótido.

ARNasa H: rompe sustratos híbridos ADN-ARN, por lo tanto, origina moléculas de

ADN monocatenarias.

Enzimas de polimerización

Son las ADN polimerasas y las ARN polimerasas. La mayoría de las enzimas de

polimerización necesitan un molde para poder copiar, el molde puede ser una molécula de

ADN o de ARN. Por ejemplo, las ADN polimerasas dependientes de ADN utilizan un

molde de ADN, y las ADN polimerasas dependientes de ARN utilizan un molde de ARN.

Además, estas enzimas también necesitan una cadena que proporcione un extremo 3' OH

libre para formar el enlace fosfodiéster, esta cadena actúa como cebador o primer. También

se requieren los desoxirribonucleótidos trifosfato correspondientes para la síntesis de la

nueva hebra.

ADN polimerasa I de E. coli: participa en la replicación del cromosoma bacteriano

corrigiendo los errores producidos. In vitro esta enzima tiene actividad polimerásica 5'→3',

actividad exonucleásica 3'→5' (actividad correctora de pruebas) y actividad exonucleásica

5'→3'. La actividad correctora de pruebas permite a la enzima eliminar los nucleótidos mal

apareados del extremo 3' de la cadena, y de este modo puede corregir sus propios errores. Y

mediante la actividad polimerasa 5'→3' puede rellenar los huecos con los nucleótidos

correspondientes.

Al tratar la ADN polimerasa I con una proteasa específica se obtienen dos

fragmentos de distinto tamaño. El polipéptido de mayor tamaño mantiene las actividades

polimerásica 5'→3' y exonucleásica 3'→5', se denomina fragmento Klenow. Es útil para la

investigación porque la actividad exonucleasa 5'→3' puede interferir en algunas

aplicaciones experimentales al acortar los extremos 5' de las moléculas de ADN. El gen que

codifica para el fragmento

Klenow ha sido

mutagenizado y se ha podido

obtener un fragmento con

actividad polimerasa 5'→3'

solamente.


ADN polimerasa del fago T7: esta enzima aparece en E. coli cuando está infectada por el

fago T7. En presencia de la enzima de E. coli tiorredoxina se une fuertemente al ADN

molde y no se separa fácilmente, de este modo se pueden sintetizar fragmentos muy largos

de ADN con poca cantidad de enzima. También se han introducido mutaciones en el gen

que codifica para esta ADN polimerasa, y así se ha conseguido la enzima sequenasa que

posee sólo la actividad polimerásica 5'→3'. Ésta ha sido la enzima utilizada hasta hace poco

para la secuenciación del ADN.

Taq polimerasa: es una enzima que resiste altas temperaturas, ha sido asilada de Thermus

aquaticus, una bacteria termófila que vive en las proximidades de las fuentes de agua

caliente. La Taq polimerasa es ampliamente utilizada por sus propiedades de

termorresistencia en las reacciones de PCR. En la reacción en cadena de la polimerasa se

separan las cadenas de la doble hélice del ADN mediante desnaturalización térmica a

temperaturas en torno a los 95°C, por lo que no pueden emplearse las ADN polimerasas

ordinarias. Pero la Taq polimerasa tiene una temperatura óptima de funcionamiento de

72°C, y su termoestabilidad es tal que su vida media a 95°C es de 40 minutos, lo que la

hace idónea para este tipo de procesos. Se trata de una ADN polimerasa que no tiene

actividad exonucleásica 3'→5', por lo que no corrige los errores que comete.

Pfu: es una ADN polimerasa que posee actividad correctora de pruebas, ha sido obtenida

de la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus. Es también usada en las técnicas de PCR.

ADN polimerasa ARN dependiente, también denominada transcriptasa inversa,

transcriptasa reversa o retrotranscriptasa: es una enzima de tipo ADN polimerasa, que

tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN

monocatenario. Esta enzima es específica de los retrovirus, un tipo de virus que presentan

un genoma de ARN monocatenario y se replican de manera inusual a través de una forma

intermedia de ADN bicatenario.

La transcriptasa inversa actúa del siguiente modo: a

partir de la molécula de ARN se sintetiza una cadena de

ADN, ambas moléculas permanecen unidas formando un

híbrido ADN-ARN. Esta enzima, además de poseer la

actividad polimerasa 5'→3', actúa también como

endonucleasa ARNasa H, por lo que puede romper la

molécula de ARN para dar lugar a ADN simplexo. A partir

del cual puede formarse ADN duplexo, denominado ADNc

(copia o complementario).

In vivo la retrotranscriptasa utiliza como cebador el ADN de la célula huésped, pero

in vitro se pueden usar varios tipos de cebadores:

1. El ARNm de las células eucariotas presenta una

cola poli-A en el extremo 3', en este caso se

utilizan cebadores de timina. Para ello se

sintetiza un oligonucleótido de aproximadamente 20 timinas, que actuará como

primer al proporcionar el extremo 3' sobre el que actuará la polimerasa.

2. Si el ARN no posee cola de poliadenilato, se usa un conjunto de cebadores de 4 o 6

nucleótidos con todas las combinaciones posibles. Al menos alguno de los

oligonucleótidos reconocerá alguna secuencia complementaria en el ARN y podrá

actuar como cebador.

3. En el caso de que se conozca la secuencia nucleotídica del ARN se puede sintetizar

un cebador específico.


ARN polimerasas: son un conjunto de enzimas capaces de polimerizar los ribonucleótidos

para sintetizar ARN a partir de una secuencia de ADN que sirve como molde, es decir, las

ARN polimerasas son dependientes de ADN. In vivo estas enzimas realizan la transcripción

del ADN, y para ello deben reconocer unas regiones promotoras situadas al comienzo del

gen. In vitro, hay que incorporar estas regiones promotoras al vector, para que la enzima se

pueda unir a la cadena de ADN. Hay que tener en cuenta que cada enzima reconoce un

promotor específico. Las ARN polimerasas que se suelen utilizar son las de los fagos T7,

T3 y SP6 de E. coli.

Enzimas “polimerasas” que no requieren molde:

Desoxirribonucleotidil transferasa terminal: es una enzima que sintetiza cadenas

de ADN sin la necesidad de un molde, y por lo tanto añade nucleótidos de forma

aleatoria. Requiere extremos 3' OH simplexos para poder polimerizar. Dependiendo

de los dNTPs que se añadan, la enzima creará una secuencia de nucleótidos u otra.

Poli A polimerasa: esta enzima añade nucleótidos de adenina en el extremo 3' de

moléculas de ARN simplexo. No necesita cadena patrón o molde, pues sólo añade

adenina. En condiciones naturales es la enzima de poliadenilación que añade la cola

poli-A en el ARN mensajero de los eucariotas.

Enzimas de modificación

Las enzimas de modificación alteran los extremos de las moléculas, normalmente, de ADN.

Las principales son:

Ligasa: es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5' de una cadena

polinucleotídica y el extremo 3' de otra cadena adyacente. Ésta es probablemente la enzima

más usada en ingeniería genética.

Fosfatasa: enzima que elimina grupos fosfato del extremo 5', y origina por lo tanto

moléculas con grupos –OH en todos los extremos (en los 5' y en los 3'). De este modo se

evita que moléculas fragmentadas puedan unirse de nuevo, ya que la ligasa no reconoce los

extremos 5' OH.

Nucleotidil quinasa: enzima que añade grupos fosfato en los extremos de moléculas

desfosforiladas en el extremo 5'.


Marcaje de moléculas de ADN

Una de las aplicaciones de las enzimas que anteriormente se han estudiado es el marcaje de

las moléculas de ADN. Se realiza incorporando a la molécula de ADN un fluorocromo, es

decir, un componente que hace que la molécula sea fluorescente, un átomo radioactivo

como el 32

P o el 33

P, o un hapteno, que es la parte de un antígeno que por sí sola no dispara

respuesta inmune, pero sí posee especificidad. De este modo se puede realizar el

seguimiento de los procesos en los que está implicada dicha molécula de ADN. Se

distinguen dos tipos principales de marcaje, según quede marcada toda la molécula o sólo

se marquen los extremos:

Marcaje global: se usa para marcar fragmentos de más de 1.000 pares de bases de

longitud, existen dos técnicas diferentes:

Nick translation (traslación de mellas): se emplea

una enzima ADNasa que rompe en el interior de la

molécula de ADN, se hace en presencia de Mg2+

,

en este caso sólo corta una de las dos cadenas en

puntos aleatorios e introduce mellas. A

continuación se usa la ADN polimerasa I de E.

coli, sólo se requieren las actividades polimerasa

5'→3' y exonucleasa 5'→3'. La enzima se

introduce en la mella, y mediante la actividad

exonucleásica 5'→3' elimina los nucleótidos del

extremo 5' y mediante la actividad polimerásica

añade nucleótidos en el extremo 3' libre, es decir,

ocurre un traslado de la mella. Además se

necesitan dNTPs, se añaden nucleótidos fríos, es

decir, sin marcar, y nucleótidos calientes o

marcados, normalmente en una proporción de 1:4.

Así, el ADN de nueva síntesis quedará marcado.

Random priming (cebado al azar): como en

el caso anterior se parte de ADN duplexo,

pero se aumenta la temperatura hasta los

94ºC para generar cadenas simples por

desnaturalización. En este caso la enzima

que se emplea es el fragmento de Klenow

modificado (sólo con actividad polimerasa

5'→3'). Es necesario añadir cebadores que

proporcionen el extremo 3' OH, los

cebadores son secuencias simplexas cortas

de seis nucleótidos (oligonucleótidos

hexámeros). Hay que añadir una mezcla de

cebadores con todas las combinaciones

posibles de seis nucleótidos, alguno de ellos

reconocerá una secuencia complementaria y

se unirá en algún punto de las dos cadenas.

Al igual que en la técnica anterior se añaden

desoxirribonucleótidos trifosfato, algunos

de ellos marcados.


Marcaje en los extremos: se usa para marcar fragmentos de ADN muy pequeños, de entre

100 y 200 pares de bases.

Marcaje del extremo 5': se emplea una fosfatasa para eliminar el grupo fosfato de

los extremos 5'. Después, se añaden nucleótidos, normalmente dATP, que tienen

marcado con 32

P el grupo fosfato en posición γ (el más externo). La enzima

nucleotidil quinasa añadirá el grupo fosfato marcado a los extremos 5' OH.

Marcaje del extremo 3': se usa la enzima exo λ, que con su actividad exonucleásica

5'→3' elimina los nucleótidos de los extremos 5' dejando extremos protuberantes 3'.

Se añaden nucleótidos fríos y calientes (en menor proporción) y la

desoxirribonucleotidil transferasa terminal los incorporará a los extremos 3' de la

molécula de ADN, de este modo se genera una cola marcada.

Producción de ADN recombinante

Para generar ADN recombinante se requiere un vector de clonación, generalmente un

plásmido bacteriano, y un fragmento de ADN. En primer lugar, hay que cortar el plásmido

para obtener una molécula de ADN lineal, para ello se usa una enzima de restricción que

deja extremos romos. En segundo lugar, se tratan ambas moléculas de ADN por separado

con la enzima exo λ. Se generarán moléculas con extremos protuberantes 3'. Después se usa

la desoxirribonucleotidil transferasa terminal para que añada una cola de nucleótidos en los

extremos 3'. En cada preparación se añadirá un tipo de nucleótido diferente pero

complementario, por ejemplo, si a la preparación del plásmido se le añade guanina, al ADN

cromosómico se le añadirá citosina. Posteriormente se reúnen sendas preparaciones y en un

alto porcentaje ambas moléculas de ADN se unirán formando una molécula recombinante.

Por último, se necesita que una ADN polimerasa rellene los huecos que quedan en la

molécula con nucleótidos complementarios, y que una ligasa una los fragmentos para que la

molécula quede sellada.


Amplificación enzimática de fragmentos de ADN y ARN

Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés

(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por

Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN

particular, en teoría, basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN, su utilidad reside en que, tras la

amplificación resulta mucho más fácil estudiar e identificar el ADN.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas que se usaban (fragmento Klenow)

se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas

polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 ºC en las fases de

desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína,

actualmente se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos,

generalmente arqueas, adaptados a vivir a esas temperaturas, por ejemplo: Thermus

aquaticus (polimerasa Taq) y Pyrococcus furiosus (Pfu). Hoy, todo el proceso de la PCR

está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite grandes

cambios de temperatura en pocos segundos.

Para realizar la técnica se necesitan:

ADN polimerasa termorresistente, la más común es la Taq polimerasa.

ADN molde, que contiene la región que se va a amplificar, debe estar

desnaturalizado.

Cebadores (o primers), son cadenas simplexas de oligonucleótidos complementarias

a una región de las dos hebras del ADN. Estas secuencias son reconocidas por la

polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.

Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar un nuevo ADN.

Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la

ADN polimerasa. Se usan tampones de Tris-HCl con un pH en torno a 7,5.

Cationes magnesio (Mg2+

), agregado comúnmente como cloruro de magnesio

(MgCl2), que actúan como cofactores de la polimerasa.

In vivo el origen de replicación marca el inicio de la síntesis de ADN, y la molécula molde

sólo es leída una vez, mientras que in vitro el inicio de la síntesis de ADN está marcado por

los cebadores, y ocurren varias rondas de replicación. In vivo los cebadores son secuencias

de ARN, mientras que in vitro son oligonucleótidos de ADN.

Componentes y parámetros de la reacción

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 35 o 36 cambios repetidos de

temperatura llamados ciclos, este proceso tiene lugar en dos horas aproximadamente. De

este modo, a partir de una sola molécula de ADN se pueden llegar a conseguir 68×109

copias idénticas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de la

enzima y de los cebadores empleados.

44


Las etapas de un ciclo de replicación son las siguientes:

Desnaturalización: el primer paso consiste en desnaturalizar el ADN, es decir, en

separar las dos hebras de las cuales está constituido. In vivo las hebras de ADN se

separan por acción de las enzimas topoisomerasas que rompen los puentes de

hidrógeno. Pero in vitro el ADN se desnaturaliza por calentamiento a 94-95ºC.

Hibridación: el segundo paso de la PCR es la unión del cebador a la región

complementaria de la molécula de ADN molde. Para ello es necesario bajar la

temperatura a 50ºC aproximadamente, permitiendo así la hibridación. Los cebadores

actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Polimerización: fase de alargamiento o de síntesis. La ADN polimerasa sintetiza

una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTPs

complementarios en dirección 5'→3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTPs con

el grupo 3'-OH del cebador. La temperatura para este paso depende de la ADN

polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad

está en 72°C.


Las moléculas de ADN obtenidas tras el tercer ciclo son de dos tipos: producto corto y

producto largo. El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los

extremos 5' de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar.

El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra y cuyos

extremos 3' no están definidos. Con cada nuevo ciclo se incrementa el número de moléculas

de ADN delimitadas por los cebadores.

En la PCR hay una amplificación exponencial:

En la reacción en cadena de la polimerasa se parte, normalmente, de una cantidad de ADN

de 50 ng, pero actualmente se puede amplificar incluso una sola molécula de 3,3 pg. Y

usualmente se trabaja con ADN no deteriorado, pero se ha llegado a amplificar ADN de

herbarios antiguos e incluso de fósiles.

Para llevar a cabo la PCR se añaden dNTPs en exceso y cebadores en exceso. Cuando la

reacción se acaba no es por falta de dNTPs o cebadores, sino porque la ADN polimerasa se

ha soltado de la cadena.


Normalmente la Taq polimerasa usa moldes de 100 pb – 2 kb, por encima de 2 kb la

enzima en muy poco procesiva. La Taq polimerasa tiene actividad polimerásica 5'→3' y

exonucleásica 5'→3', pero no tiene actividad exonucleasa 3'→5', y por ello no puede

corregir sus propios errores, y tiene una alta tasa de error (10–4

, es decir, comete un error

cada 10.000 bases incorporadas). Hay que tener en cuenta que estos errores son

acumulativos. La Pfu polimerasa es más lenta, pero posee actividad correctora de pruebas,

y por lo tanto tiene menor tasa de error.

Los cebadores usados en PCR tienen un tamaño que va desde 15 hasta 30 pares de bases,

aunque lo más normal es que tengan un tamaño de 20-24 pb. Tienen que ser secuencias

totalmente específicas de la secuencia que se quiere amplificar. Normalmente tienen una

composición de guanina-citosina del 50% aproximadamente. La temperatura de hibridación

está determinada por la composición de nucleótidos del primer, si la cantidad de G-C es

elevada la temperatura de hibridación será alta, 50-60ºC (55ºC Tª óptima). Pero si hay más

cantidad de A-T se requerirá menor temperatura de hibridación, y el cebador

complementará regiones inespecíficas del ADN. Al sintetizar los cebadores hay que evitar

que haya tramos que contengan bases (3-4) repetidas, para que no se formen apareamientos

incorrectos. Además, el cebador no debe tener secuencias complementarias, pues se podrían

formar bucles, y tampoco deben existir secuencias complementarias entre un cebador y

otro, para que no se formen dímeros.

Es necesario conocer las secuencias nucleotídicas laterales a la región que se quiere copiar

del ADN molde, para poder sintetizar los cebadores complementarios. Si se desconocen

estas secuencias hay que recurrir a otros métodos:

Si se conoce la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN que

se pretende replicar, se puede predecir la secuencia nucleotídica de dicho ADN.

Pero hay que tener en cuenta que el código genético es degenerado, y que un mismo

aminoácido puede estar codificado por más de un triplete. Por ello, se elabora una

mezcla (oligonucleótido degenerado) de todos los posibles cebadores, según la

secuencia aminoacídica.

Si se conocen secuencias homólogas al ADN que se quiere amplificar se pueden

sintetizar los cebadores específicos. Por ejemplo, conociendo el gen de la insulina

de rata se pueden diseñar cebadores para el gen de la insulina humana, puesto que

son genes homólogos. Normalmente se trabaja con genes de varias especies

distintas, y se buscan las regiones más conservadas como posibles promotores.

También se puede elaborar una mezcla de oligonucleótidos con variaciones en la

tercera base de los codones.

PCR de ARN

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR del inglés

reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de la PCR, en la que una

hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando una enzima

denominada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en un PCR tradicional.

En este proceso se parte de una población de ARNm que se extrae de una preparación de

tejido o de un cultivo celular, la reacción será distinta según se quiera amplificar toda la

población de ARNm, o por el contrario, sólo un tipo concreto de ARNm. En cualquier caso,

la reacción comienza siempre del mismo modo: se añade un oligonucleótido poli-T de 20 o


24 nucleótidos que actuará como cebador, este poli-T complementa con la cola poli-A del

ARNm y proporcionará el extremo 3' OH.

La enzima retrotranscriptasa sintetizará una cadena de ADN a partir de la cadena de ARN,

y posteriormente, usando su actividad endonucleasa H degradará la cadena de ARN. La

transcriptasa inversa actúa a una temperatura de 37ºC. La reacción puede continuar de dos

modo distintos:

En el caso de que se quiera amplificar todas

las moléculas de ARNm sin distinción, se

usará la desoxirribonucleotidil transferasa

terminal, esta enzima sintetiza cadenas de

ADN sin molde. Si se añaden, por ejemplo,

desoxirribonucleótidos trifosfato de guanina

la enzima añadirá una cola poli-G en el

extremo 3' del ADN. A partir de este punto

se procede con una reacción PCR normal. Se

añade la enzima Taq polimerasa, una mezcla

de dNTPs y dos cebadores de 20-25

nucleótidos: un oligonucleótido poli-C y un

oligonucleótido poli-T, que complementarán

con las regiones poli-G y poli-A del ADN.

Si se quiere amplificar sólo un tipo de ARNm producido por un gen concreto, es

necesario conocer la secuencia nucleotídica del ARNm, y en consecuencia la del

ADN, para poder diseñar los cebadores específicos. Se añaden los dNTPs, la Taq

polimerasa y los dos primers específicos para que tenga lugar la reacción en cadena

de la polimerasa estándar.

La reacción RT-PCR es útil para buscar genes concretos, y probar su expresión en ciertos

tejidos.


Vectores de clonación en bacterias

Clonación

Un clon es un conjunto de células genéticamente idénticas, que proceden de un mismo

progenitor por división celular.

El proceso de clonación de genes implica la construcción de moléculas de ADN

recombinante, en estas moléculas se incluye el gen, o fragmento de ADN, a clonar. La

molécula de ADN recombinante es posteriormente introducida en células hospedadoras,

para que se replique usando las enzimas de la célula, de modo que todas las células

descendientes poseerán, al menos, una copia de la molécula recombinante. La obtención de

las moléculas de ADN recombinante es un proceso que se realiza in vitro, pero la

replicación en el interior de la célula hospedadora es un proceso totalmente in vivo.

Las células hospedadoras son normalmente células bacterianas, aunque ocasionalmente

también puede transferirse el ADN recombinante a células eucariotas, esto ocurre, sobre

todo, cuando se quiere estudiar la expresión de genes eucariotas. La bacteria E. coli es la

más usada para este fin. Se trabaja siempre con cepas modificadas genéticamente, a las que

se les ha eliminado el sistema de restricción-modificación, para, de este modo, invalidar los

sistemas que tiene la bacteria para evitar la intromisión de ADN extraño.

Una molécula de ADN recombinante se compone de:

ADN exógeno (o pasajero): es el gen, o fragmento de ADN, que se quiere clonar.

Éste puede tener distintos orígenes:

– Puede proceder de un genoma fragmentado.

– Puede ser un fragmento específico de ADN, amplificado mediante PCR.

– Puede ser ADNc (copia) procedente de ARNm.

– O puede ser ADN simplexo, que deberá pasarse a duplexo para clonarlo.

ADN vector: molécula que porta el fragmento de ADN exógeno. Se clasifican en:

– Vectores de clonación: aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en

la célula hospedadora.

– Vectores de expresión: permiten transcribir y traducir la información

genética dentro de la célula hospedadora.

Tipos y características de los vectores de clonación

Los distintos tipos de vectores de clonación difieren en la especificidad de la célula

huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el

número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen.

Plásmidos: fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son

ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble

cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican

autónomamente dentro de las células bacterianas. Portan fragmentos pequeños de

ADN pasajero, de entre 0,1 y 8 kb (kilobases). Algunos plásmidos usados como

vectores son: pBR322, pUC18, pBluescript…

55


Vectores λ de inserción: son vectores basados en el genoma del fago lambda, que

pueden portar fragmentos de ADN de 0,1–8 kb.

Vectores λ de sustitución o de reemplazamiento: son también vectores basados en

el genoma del fago λ, pero pueden portar fragmento mayores (8–23 kb).

Cósmidos: son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de

plásmidos. Pueden transportar entre 20 y 45 kb de ADN insertado.

BAC (bacterial artificial chromosome): es un cromosoma artificial bacteriano que

puede transportar insertos de 300 kb a 1,5 Mb (megabases).

YAC (yeast artificial chromosome): son cromosomas artificiales de levadura,

permiten clonar grandes trozos de ADN, de 2–3 Mb de tamaño. Al ser fragmentos

tan grandes, muy frecuentemente se producen alteraciones de la molécula de ADN.

Características generales de los vectores de clonación:

El ADN no esencial debe ser mantenido al mínimo. Para que estos vectores se

reproduzcan eficazmente en las bacterias es necesario que tengan el tamaño más

pequeño posible.

Tienen que ser moléculas autorreplicativas, y por lo tanto, deben tener su propio

origen de replicación.

Deben poseer genes marcadores, que sirven para identificar las células que

contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de

resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Deben tener un sitio de clonación, es decir, un sitio que permita introducir el ADN

pasajero. Estos sitios son dianas de restricción, puede haber una sola diana que sea

reconocida por una sola enzima, o varias dianas reconocidas por varias enzimas de

restricción. Pero, cada diana de restricción debe estar presente sólo una vez en el

vector, ya que si no, éste se fragmentaría.

Plásmidos

Características de los plásmidos naturales:

Son moléculas circulares de ADN duplexo de tamaños muy variables, desde 1 kb

hasta 8 kb.

Son moléculas de ADN extracromosómico que portan información adicional, no

esencial, para la bacteria. En muchas ocasiones las bacterias con plásmidos

presentan algún tipo de ventaja respecto de las que no tienen.

Son moléculas autorreplicativas, tienen un origen de replicación (ORI). Se sirven de

las enzimas de la célula bacteriana para replicarse, pero contienen genes

reguladores de la replicación, si éstos son muy estrictos la bacteria sólo tendrá dos

o tres copias del plásmido, pero si los genes reguladores de la transcripción son

relajados puede haber hasta 800 copias del plásmido.

Pueden transferirse por conjugación de

una bacteria a otra, puesto que poseen

genes tra (transferencia) y genes mob

(movilidad). Éstos no están presentes en

los plásmidos usados como vectores,

pues no interesa que se transfieran de

una célula a otra.

Plásmido

ORI

Genes reguladores

de la replicación

mob

tra


En el caso de los plásmidos usados como vectores, sólo es necesario que posean el origen

de replicación. Y tienen genes reguladores relajados, para conseguir el mayor número de

copias posible. Los plásmidos vectores que se usan en el laboratorio son totalmente

artificiales, no existen en la naturaleza. Se les ha incluido genes marcadores procedentes de

genomas bacterianos, y fragmentos de ADN artificiales con dianas de restricción.

Plásmido pBR322: es el primer plásmido utilizado en biotecnología, fue diseñado en 1977

por Bolívar y Rodríguez (de ahí su nombre pBR). A este plásmido se le han añadido dos

genes marcadores: un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la

tetraciclina (tetr); y tres dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI. La inserción de ADN

foráneo puede hacerse en cualquiera de las tres secuencias.

La diana PstI se encuentra inserta en el gen que confiere resistencia a ampicilina, y la diana

BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina. Por ejemplo, si la enzima PstI

reconoce la diana PstI cortará el plásmido por ese punto, e introducirá el ADN exógeno

interrumpiendo e invalidado el gen ampr. Por lo tanto, esta bacteria no podrá crecer en un

medio con el antibiótico ampicilina, pero sí en un medio con tetraciclina. Si el ADN

exógeno se introduce en la diana BamHI la bacteria será sensible a la tetraciclina y

resistente a la ampicilina. Pero si el ADN exógeno se introduce en la diana EcoRI, la

bacteria presentará resistencia a los dos antibióticos. De este modo puede distinguirse entre

bacterias sin plásmido, con plásmido salvaje, o con plásmido recombinante, y además se

puede saber el lugar donde se ha insertado el ADN pasajero.

Plásmidos pUC (plasmid of University of California, plásmido de la Universidad de

California): son un conjunto de plásmidos (por ej. pUC18, pUC19) muy utilizados como

vectores, ya que presentan unas características que son muy beneficiosas:

Son pequeños, de modo que pueden transportar fragmentos de ADN relativamente

grandes (de 8 a 10 kb).

Tienen un origen de replicación y pueden producir hasta 500 copias de los

fragmentos de ADN insertado por célula (tienen control relajado de la replicación).

Se han modificado para que presenten muchas secuencias de reconocimiento para

enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o

sitio de clonación múltiple (MCS: multiple cloning site).


Permiten la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que

contienen un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul.

Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar

a colonias de color blanco.

El plásmido pBluescript es un vector comercializado de la serie pUC. Está formado por una

molécula circular de ADN duplexo, de tamaño inferior a 3 kb, que comprende:

1. Un fragmento lacZ + polylinker + 2 promotores: el fragmento del gen lacZ procede

del operón lactosa de E. coli, y contiene el minigen de la β-galactosidasa (también

contiene el promotor lac). En el extremo 5' terminal de este fragmento lacZ se ha

introducido el polylinker. El polylinker es rico en sitios de restricción únicos, es

importante que las dianas de restricción estén presentes sólo una vez en el plásmido,

pues si no, se fragmentaría la molécula, y lo que se pretende es linealizarla. Los

promotores T3 y T7 también interrumpen el gen lacZ, se sitúan flanqueando el

polylinker. Estas regiones promotoras proceden del fago T3 y T7 respectivamente, y

son reconocidas por las enzimas ARN polimerasas de dichos fagos.

2. Un origen de replicación del fago M13 o F1: estos bacteriófagos son similares al

fago ΦX174 de E. coli, su material genético es una molécula de ADN circular

simplexo, pero cuando infecta a la bacteria se convierte en ADN circular duplexo, y

por medio del mecanismo del circulo rodante se originan moléculas simplexas

nuevamente. Esta región f1 origin se emplea cuando se quiere replicar un ADN en

forma de monohebra. No obstante, la replicación sólo se puede hacer por

coinfección con un virus auxiliar (helper) que aporte los genes que codifican las

enzimas necesarias para la replicación. Este procedimiento ha sido muy utilizado

para secuenciar el ADN, puesto que para esta tarea debe pasarse de ADN duplexo a

ADN simplexo.

3. Un gen de resistencia a la ampicilina: este gen permite, gracias al cultivo en

presencia de ampicilina, seleccionar todas las bacterias que han incorporado

Bluescript, ya sea con o sin el inserto. (La selección de los Bluescripts

recombinantes se realiza según si la β-galactosidasa que se obtiene es, o no,

funcional).

4. Una secuencia origen de replicación (ColE1 ori): esta secuencia permite la

multiplicación del plásmido en E. coli.


El gen lacZ del operón lactosa codifica la

enzima β-galactosidasa, que cataliza la reacción

de hidrólisis de la lactosa en glucosa más

galactosa. Esta enzima debe estar en forma

tetramérica para ser efectiva. Para que se

produzca la tetramerización de la β-

galactosidasa se requiere la información del

minigen (fragmento de la región 5' de lacZ), que codifica los 149 aminoácidos del extremo

N-terminal del péptido. Los restantes aminoácidos constituyen un monómero de β-

galactosidasa.

El plásmido pBluescript contiene el minigen de β-galactosidasa con capacidad de

tetramerizar. Este plásmido se introduce en cepas modificadas de E. coli que contienen un

gen lacZ defectivo que sólo codifica los monómeros de la β-galactosidasa. De este modo,

ocurre una complementación: el péptido que codifica el minigen hace que los cuatro

monómeros se ensamblen para formar la β-galactosidasa funcional.

El gen lacZ está reprimido de forma natural, y sólo se traduce en presencia de un inductor,

el galactósido IPTG. In vivo, la lactosa es la molécula inductora. IPTG induce por

desactivación de la represión la síntesis de la β-galactosidasa.

La presencia de la enzima β-galactosidasa se detecta añadiendo al cultivo celular un

sustrato de ésta, denominado X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido). X-Gal es

un β-galactósido que, al igual que la lactosa, puede ser hidrolizado por la β-galactosidasa.

La ventaja de este sustrato es que su hidrólisis libera, además de galactosa, una sustancia X

(5-bromo-4-cloro-3-hidroxi-indol) coloreada en azul.

5′ 3′

NH2 COOH

minigen β-galactosidasa

LacZ


Pero, cuando se inserta una molécula de ADN pasajero dentro del plásmido no se forma el

tetrámero β-galactosidasa. Y esto es porque el ADN se introduce dentro del minigen, y la

proteína que se genera no tiene la capacidad de tetramerizar. Al no producirse β-

galactosidasa funcional X-Gal no se metaboliza y no cambia a color azul.

En resumen, en presencia de ampicilina sólo sobreviven las bacterias transformadas.

Aquellas colonias de color blanco corresponden a bacterias con plásmido recombinante,

mientras que las colonias de color azul corresponden a bacterias con plásmido pBluescript

salvaje, es decir, sin inserto de ADN foráneo.

Vectores basados en el genoma del fago λ

El bacteriófago lambda es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli. Se trata de un

virus complejo de ADN lineal bicatenario. Los extremos de su material genético son

cohesivos y complementarios (extremos cos) y ello hace que tras la infección su genoma se

circularice, comportándose, en caso de seguir un ciclo lisogénico, como un plásmido y

aprovechando las enzimas

recombinantes de la bacteria para

integrarse en el genoma de ésta. El

fago no tiene por qué integrarse, y

de hecho es más habitual que se

comporte como un virus de ciclo

lítico.

En el ciclo lisogénico, el

virus se inserta en un punto

concreto del genoma de la

bacteria. En este estado, el

virus se replica cuando lo

hace la bacteria, pasando

su genoma a las réplicas de

E. coli.

El ciclo lítico es la forma más habitual de actuación del virus al infectar la célula, y

también es la vía que sigue al final del ciclo lisogénico. En ella se producen

partículas virales que son liberadas al medio una vez que la bacteria hospedadora es

lisada, matando a la célula en el proceso.

El virus replica su genoma circular empezando por un punto de éste, y desenrollando sólo

una de las dos hebras. El resultado es un genoma lineal muy largo, consistente en una gran

cantidad de repeticiones del genoma original de forma seguida, lo que se conoce como

concatámero (o concatémero). La enzima terminasa es una endonucleasa que corta el

concatámero mediante sucesivos cortes en escalera (en las regiones cos). El virus también

sintetiza las proteínas de su cápside, y se ensambla en el citoplasma de la bacteria. Dentro

de la cápside sólo cabe, prácticamente, el genoma de un virus. Finalmente, la célula es

lisada, liberando los viriones al medio.


El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser

utilizado como vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN

foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas.

Antes de introducir el ADN exógeno hay que eliminar partes no útiles del genoma del

virus, para, de este modo, dejar espacio, pues en la cápside sólo hay hueco para 50 kb, y el

genoma del virus tiene 48.502 pb. Las regiones prescindibles corresponden a los genes que

controlan el ciclo lisogénico.

Dependiendo de la cantidad de ADN vírico que se elimine, para insertar el ADN pasajero,

existen dos tipos de vectores: vectores de inserción y vectores de sustitución.

En los vectores de inserción se ha eliminado sólo una parte de los genes que controlan la

lisogenia. Los vectores de inserción sólo presentan un sitio de restricción, donde se

introduce el inserto. Sirven para la clonación de pequeños fragmentos (hasta 8 kb).

Por ejemplo, el vector de inserción λgt10 presenta sólo la diana de restricción EcoRI, que

está situada en el gen cI que codifica el represor λ, éste impide el ciclo lítico. Esto hace que

la inserción de ADN extraño en este sitio inactive el gen cI. El represor no se sintetiza y el

ciclo del virus orienta hacia la vía lítica. En cambio, si el gen cI está activo el fago entra en

ciclo lisogénico. El vector λgt11 utiliza como sistema de selección el gen lacZ del operón

lactosa.

Regiones prescindibles del genoma del fago λ


En los vectores de sustitución (o de reemplazamiento) se sustituye toda la región

prescindible del genoma del fago por el ADN de interés. De este modo se pueden insertar

moléculas exógenas de mayor tamaño (de hasta 20-25 kb). Los vectores de sustitución

tienen dos sitios de restricción que flanquean el segmento de ADN que es sustituido por el

ADN que se va a clonar. Al tratar el genoma del fago con una enzima de restricción se

obtendrán tres fragmentos: brazo izquierdo, brazo derecho y región stuffer (región

prescindible).

En el ADN stuffer se han introducido varias dianas de restricción para poder fragmentarlo

en pequeños trozos que, por centrifugación, pueden separarse fácilmente de los fragmentos

de ADN mayores. El ADN pasajero ocupará el lugar del ADN stuffer, aunque también

pueden ligarse los dos brazos sin incorporar el ADN exógeno. Por eso, es necesario

seleccionar las moléculas recombinantes.

Los vectores λ recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago λ, y

se pasan a un césped bacteriano. Se debe añadir la cantidad adecuada de fagos, para que

cada célula huésped bacteriana sea infectada por uno sólo de estos virus. Dentro de las

bacterias, los vectores se replican y forman múltiples copias del fago infectivo, llevando

todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Cada fago infectará una célula,

se replicará y la lisará. A continuación, la descendencia de viriones infectará y, en

consecuencia, lisará las bacterias adyacentes al lugar de la primera célula infectada, creando

entonces una región clara o calva en el campo bacteriano opaco. Los fagos contenidos en

cada calva, o placa, de lisis pueden recogerse para ser analizados.

Proceso de empaquetamiento in vitro


Para conseguir cápsides víricas vacías se usan cepas mutantes del fago λ. Una cepa formará

colas pero no cápsides, debido a una mutación, otra cepa no produce colas pero sí cápsides.

Cuando se reúnen las colas, las cápsides y el ADN recombinante ocurre el

empaquetamiento in vitro de éste. Los vectores λ tienen extremos cohesivos 5', esto hace

que se forme un concatémero de vectores, algunos de ellos tendrán inserta la región de

ADN exógeno y otros no. Junto al extracto de empaquetamiento (proteínas fágicas) se

añade la enzima terminasa, que corta e individualiza cada molécula. Dentro de la cápside

sólo se introducen moléculas de ADN de 50 kb aproximadamente, por lo tanto, las

moléculas brazo izquierdo–brazo derecho no forman partículas infectivas, pues al tener un

tamaño menor no entran en la cápside. Todos los virus que se formen contienen en la

cápside moléculas del tipo brazo izquierdo–ADN exógeno–brazo derecho porque son las

que tienen el tamaño adecuado. De este modo se ha conseguido seleccionar las moléculas

recombinantes.

Cósmidos

Los cósmidos son vectores de clonación que permiten la introducción de insertos de ADN

de hasta 45 kb. Realmente un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado

unos segmentos del genoma de un bacteriófago como el fago λ, por lo tanto, presenta

características intermedias entre los plásmidos y los vectores λ de reemplazamiento. Un

cósmido contiene:

Del plásmido, el origen de replicación y genes marcadores de resistencia a

antibióticos, esto depende del tipo de plásmido del cual derive y, por tanto, puede

contener más segmentos como por ejemplo el gen lacZ (que permite la selección

blanco/azul de las colonias) u orígenes de replicación para fagos como el M13 (que

permiten la obtención de ADN simplexo, usado para aplicaciones como la

secuenciación del inserto).

Del fago λ, los extremos cos, extremos complementarios del genoma del fago y que

se emplean para la recircularización del mismo.

Estos vectores facilitan el trabajo porque permiten el empaquetamiento in vitro, gracias a

los extremos cos, de los cósmidos en las partículas fágicas λ. Los fagos empaquetados se

usarán para infectar cepas de E. coli, consiguiendo un plásmido en la bacteria, ya que el

cósmido se recirculariza, al entrar a ésta, gracias a los extremos cos.

Uno de los cósmidos más usados es el SuperCos, contiene:

– Dos sitios cos, entre los cuales se sitúa la diana de restricción Xba I.

– Un origen de replicación (ori).

– Un sitio de clonaje múltiple

(MCS), es un polylinker que no

interrumpe ningún gen

marcador, incluye la diana de

restricción BamH I.

– Dos genes marcadores: uno de

resistencia a ampicilina y otro

de resistencia a neomicina.

– SV40 ori: origen de replicación

del virus animal SV40, usado

para replicar el vector cuando se

introduce en células animales.


Para producir cósmidos recombinantes, en primer lugar, se usa la enzima de restricción

BamHI para cortar el vector y linealizarlo. Después, se emplea la enzima fosfatasa alcalina

que hidroliza los grupos P de los extremos 5' y los transforma en extremos 5' OH y, de este

modo, se evita que el plásmido se circularice de nuevo.

Posteriormente se inserta el ADN exógeno, previamente cortado con la restrictasa Sau3AI.

La enzima Sau3AI genera extremos compatibles con la enzima BamHI, es decir, son

enzimas isoesquizómeras. Para ello, se hace una digestión parcial del ADN que se quiere

introducir en el cósmido. En una digestión parcial las condiciones de la reacción impiden

que sean reconocidas todas las dianas, y ocurren menos cortes de los que se esperarían en

condiciones normales. Como resultado se obtienen fragmentos de ADN de un tamaño

mayor. Se usa la enzima Sau3AI en lugar de la enzima BamHI, porque la primera reconoce

una diana de sólo 4 pares de bases, y la segunda tiene una diana de 6 pares de bases. Es

decir, si se cortara el ADN usando una diana de 6 pb los fragmentos que se obtendrían

serían demasiado grandes, ya que esta diana aparece con menos frecuencia que una de 4 pb.

La ADN ligasa une los extremos 3'-OH sólo con los 5'-P, y no con los 5'-OH, por eso queda

una mella entre el ADN exógeno y el ADN del cósmido. Hay que recordar que los

extremos que ha dejado la enzima BamHI en el cósmido tienen grupos –OH en el extremo

3' y en el 5', debido a la acción de la fosfatasa.

En segundo lugar, se digiere el cósmido con la enzima de restricción XbaI, que corta el

vector entre las regiones cos. Los cósmidos linealizados pueden unirse, por los extremos

cos, y formar un concatámero.

Por último, se añaden los extractos de empaquetamiento del fago λ junto con la enzima

terminasa, para empaquetar in vitro el cósmido con el ADN que se quiere clonar. Del

mismo modo que ocurría con los vectores de sustitución, dentro de las cápsides sólo se

empaquetan las moléculas que tienen ADN recombinante, pues son las que tienen el

tamaño adecuado.

Estos fagos no entran en ciclo lítico (tampoco en ciclo lisogénico), puesto que, los únicos

genes que hay en el cósmido procedentes del genoma del fago λ son los extremos cos. Y

por lo tanto, no producen la lisis de las bacterias que infectan, ni se reproducen dentro de

éstas. El fago sólo se utiliza para introducir el cósmido, que se comporta como un plásmido,

en el interior de las bacterias, este proceso se denomina transducción. Las colonias de

bacterias que contienen en su interior ADN recombinante, se seleccionan gracias a que el

cósmido lleva genes de resistencia a antibióticos.


BACs

El cromosoma artificial bacteriano, o BAC (bacterial artificial chromosome), es un vector

usado para clonar fragmentos de ADN de 300 kb de tamaño medio. Se distinguen dos tipos:

Los BACs propiamente dichos, están basados en el plásmido factor-F (factor de

fertilidad) encontrado de modo natural en la bacteria Escherichia coli. Este factor es

un episoma que puede integrarse en el cromosoma bacteriano y es responsable de la

conjugación bacteriana.

Los PACs (P1-derived artificial chromosome), son cromosomas artificiales

bacterianos derivados del fago P1, alojan menos cantidad de ADN pasajero que los

BACs.

Un PAC típico consta de:

– Dos secuencias pac, son secuencias repetidas protuberantes que permiten el

empaquetamiento in vitro.

– Dos secuencias lox que intervienen en la circularización del vector.

– Un origen de replicación (ori).

– Un gen marcador de resistencia a la canamicina (kanr).

– Un gen marcador sac implicado en el metabolismo de la sacarosa, que está

interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS).

De forma natural el bacteriófago P1 sólo presenta un sitio lox, pero en el PAC se han

insertado dos regiones lox. En el interior de E. coli, la enzima recombinasa reconoce los

sitios lox y produce la circularización del ADN situado entre éstos.

Para la selección de las moléculas PAC recombinantes se usan cepas de E. coli sac–, es

decir, cepas que no pueden crecer en presencia de sacarosa. Esto es debido a que en el

metabolismo de la sacarosa se produce un levano, que resulta tóxico para estas bacterias.

Dentro del gen sac se encuentra un polylinker con dianas de restricción. Cuando se

introduce una molécula de ADN recombinante el gen sac queda interrumpido, las bacterias

no sintetizan el levano tóxico y pueden crecer con normalidad. Pero aquellas bacterias que

no poseen vectores recombinantes mueren, puesto que, el gen sac se expresa con

normalidad y se produce el compuesto tóxico.

Para el empaquetamiento in vitro de los PACs se usan extractos de empaquetamiento del

fago P1 y enzima pacasa. La pacasa reconoce los extremos pac y permite el

empaquetamiento del vector en las partículas fágicas. Dentro de la cápside del fago el

vector se encuentra en forma lineal, pero cuando se introduce en la bacteria, ésta sintetiza

recombinasa, y se circulariza la molécula.

Un BAC propiamente dicho incorpora insertos, normalmente, de 300 kb, pero se ha

conseguido clonar fragmentos de hasta 1 Mb. Presenta genes procedentes del plásmido F:

– oriS: origen de replicación.

– rep: control de la replicación del plásmido.

– parA, parB, parC: genes implicados en el mantenimiento de un número bajo de

copias (1 o 2) del plásmido en la bacteria.


Además, tiene otros genes que no proceden del factor-F:

– cmr: gen de resistencia al cloranfenicol.

– Minigen lacZ con un polylinker (MCS) en su

interior. Se usa para el ensayo de alfa-

complementación, del mismo modo que ocurre

en el plásmido pBluescript. A ambos lados del

minigen lacZ hay una diana de restricción de la

enzima NotI, esta restrictasa se usa para

desinsertar el ADN pasajero.

– lox: sitio reconocido por la enzima recombinasa,

permite linealizar el vector.

Procedimiento de clonación: en primer lugar, se corta el

vector con BamHI para linealizarlo, y se añade fosfatasa

alcalina para desfosforilar los extremos 5' del vector, y evitar autoligación. Después, se

hace una digestión parcial del ADN que se quiere clonar con la enzima Sau3A, la cual

genera extremos compatibles a los de la enzima BamHI, y se lleva a cabo la reacción de

ligación de ambas moléculas de ADN. Para la transformación de las bacterias se emplea la

electroporación. Este método consiste en la aplicación de un campo eléctrico que produce

poros transitorios en la membrana citoplasmática de la bacteria, a través de los cuales puede

introducirse el BAC.

La selección de los clones se hace en un medio con cloranfenicol, con IPTG y con X-gal.

Las bacterias que resisten el antibiótico son las que han incorporado el BAC, las colonias

que presentan color azul son aquellas cuyo vector no tiene ADN exógeno, y las colonias

blancas tienen BACs recombinantes.

YACs

El cromosoma artificial de levaduras o YAC (yeast artificial chromosome) es el vector de

clonación de mayor capacidad (hasta 2 Mb). Es un vector que pretende imitar las

características de un cromosoma normal de una levadura, portando un centrómero y

telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras grandes secuencias de ADN, al

comportarse como un cromosoma propio de este microorganismo eucariota. Son utilizados

en construcción de genotecas genómicas, sin embargo, son más inestables que otros

vectores como los BACs, que han acabado imponiéndose. Un problema que presentan los

YACs es que el ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distintas del genoma.

Los YACs contienen características de bacterias:

– Origen de replicación (ori) de tipo plasmídico.

– Gen marcador de resistencia a ampicilina (ampr).

Y características de levaduras:

– Secuencia de replicación de levaduras (SRA).

– Genes marcadores de selección: un gen TRP relacionado con el metabolismo del

triptófano, y un gen URA relacionado con el metabolismo del uracilo.

– Gen marcador de inserción sup, relacionado con el metabolismo de la adenina,

interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS). Este gen identifica las células

de levadura que incorporan el vector, ya que las células huésped que expresan


normalmente el gen sup muestran un color rojizo (sup+), mientras que las que

presentan ADN recombinante adquieren un color blanquecino (sup–).

– Centrómero (CEN), permite la segregación durante la división celular.

– Dos secuencias teloméricas (TEL), procedentes de un ciliado del género

Tetrahymena, pero que funcionan con las levaduras. Entre estas dos secuencias se

sitúa una diana de restricción para la enzima BamHI.

Procedimiento de clonación: se digiere el vector y el ADN que se quiere clonar con la

misma restrictasa, o con restrictasas isoesquizómeras, para que ocurra el ligamiento entre

ambas moléculas. Para que el vector se comporte como un cromosoma más de la levadura

hay que linealizarlo, mediante el uso de la enzima de restricción que reconoce la diana que

se encuentra entre las regiones TEL, dejando, de este modo, funcionales las secuencias

teloméricas. Los YACs se introducen en el interior de levaduras para que ocurra la

clonación del ADN recombinante, pero también se pueden introducir en bacterias, pues

poseen un origen de replicación de procariotas.


Clonación en bacterias

Concepto de genoteca

Una genoteca (genomic library en inglés) es un conjunto de clones en los que está

contenido el genoma de un organismo.

La construcción de una genoteca implica: aislar el genoma completo de la célula (obtención

de ADN genómico), fraccionar el genoma en fragmentos de un tamaño apropiado, clonar

cada fragmento en un vector, e introducir cada molécula recombinante en una célula

hospedadora.

Las genotecas se usan para aislar y estudiar genes, o secuencias genómicas. Cuando se

quiere clonar un fragmento de ADN previamente amplificado mediante PCR no se

construye una genoteca, ya que se parte de una muestra pura.

Existen dos tipos de genotecas según contengan ADN genómico o ADNc:

Genoteca genómica: contiene el genoma de un organismo. Se emplea para aislar un

gen determinado completo (con intrones y exones, en el caso de eucariotas) o para

clonar regiones reguladoras que no se transcriben (por ejemplo, promotores).

Genoteca de ADN copia: está constituida por ADN copia, sintetizado, por acción

de la transcriptasa inversa, a partir de los ARNm expresados en una célula, tejido u

organismo. Esta genoteca es útil cuando se quiere clonar un gen procesado, para ser

expresado directamente a ARN. Cuando se quiere expresar un gen eucariota en

bacterias, éste debe estar procesado, ya que las enzimas procarióticas no reconocen

las regiones intrónicas.

Parámetros de una genoteca:

Tamaño de la genoteca, es decir, el número de clones que constituye una genoteca.

Tamaño medio de los insertos, condiciona el tamaño global de la genoteca.

Representatividad, cuanto mayor sea la probabilidad de encontrar un clon

determinado más representativa será la genoteca.

Hay que tener en cuenta que, la clonación es un proceso aleatorio, puede haber fragmentos

del genoma que, por azar, estén más representados en la genoteca, y otros que no lo estén

en absoluto. Lo importante es que todos los fragmentos estén presente en al menos un

vector, pero existen ciertas regiones del genoma, con secuencias repetitivas, que son

difíciles de clonar, pues presentan gran capacidad para alterarse. Para que una librería

genómica sea representativa, el número de clones debe ser superior al número de

fragmentos generados.

Construcción de genotecas de ADN genómico y de ADN copia

Construcción de genotecas genómicas: el número de clones componentes debe ser, en la

práctica, suficiente para abarcar todo el genoma, incluyendo tanto el ADN codificante

como el no codificante. La preparación del ADN de partida se realiza por escisión del

genoma con enzimas de restricción bajo condiciones de rotura parcial, es decir, que no

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permitan la actuación exhaustiva de la enzima sobre todos los sitios de restricción presentes

en el ADN. La rotura se produce en cada molécula aleatoriamente sobre el conjunto de

sitios de restricción, de forma que aparecen un número menor de fragmentos, y estos son de

mayor tamaño, respecto a lo teóricamente posible, y diferentes de una a otra molécula.

Construcción de genotecas de ADN complementario: a diferencia del caso anterior, las

genotecas de ADNc representan exclusivamente a la parte codificante del genoma. La

clonación del ADN copia está basada en la acción de la transcriptasa inversa, una ADN

polimerasa dependiente de ARN derivada de retrovirus, que puede sintetizar una cadena de

ADNc complementaria de un molde de ARN. La retrotranscriptasa requiere un cebador

para iniciar la síntesis de ADN, tal como un oligonucleótido constituido por timidinas

(oligo-dT); este fragmento se une a la cola poli-A en el extremo 3' de las moléculas de

ARNm y proporciona un cebador que es ampliado por la transcriptasa inversa para la

síntesis de una copia complementaria. Después se elimina el ARNm, y la cadena única de

ADNc se usa como plantilla para la ADN polimerasa, y se origina una molécula de doble

cadena.


A las moléculas de ADNc de doble cadena, se le añaden en ambos extremos unas

moléculas cortas de ADN, denominadas adaptadores (o ligadores). Los adaptadores

presentan en su interior una diana de restricción, y cuando se digiere el ADNc con la

enzima de restricción específica se generan extremos cohesivos. Pero, la diana de los

adaptadores también puede estar presente dentro de la molécula de ADNc original, en este

caso la molécula se fragmentaria al hacer la digestión con la enzima de restricción. Para

evitar esto, hay que metilar el ADNc antes de ligar los adaptadores, ya que cuando una

diana está metilada no es reconocida por la enzima. Por último, las moléculas de ADNc con

los extremos cohesivos se pueden ligar a un vector apropiado para crear una genoteca

representativa de todos los transcritos originales de ARNm que se encuentran en la célula o

en el tejido original.

Representatividad de una genoteca

A partir del tamaño del genoma completo y del tamaño medio de los insertos se puede

calcular el número mínimo de clones necesario para que la genoteca represente al genoma

completo. Sin embargo, el carácter aleatorio de la preparación de fragmentos y del proceso

de clonación hace que, para tener certeza de que una genoteca contiene cualquier región del

genoma, se requiera en la práctica un número de clones muy superior al teórico. Para

calcular el número de clones mínimo para que una genoteca sea representativa se utiliza la

siguiente fórmula:

N = ln 1–P

ln 1– 1n

N: número de clones; P: probabilidad de que un clon en la genoteca tenga una secuencia

determinada; n: número de fragmentos distintos que se pueden generar, depende del tamaño

del genoma y del tamaño medio del inserto.

n = tamaño medio del inserto (pb)

tamaño del genoma (pb)


Por ejemplo: el tamaño del genoma humano es de aproximadamente 3∙109 pb, si se quieren

hacer insertos de alrededor de 20∙103 pb, ¿qué cantidad de clones hay que usar para trabajar

con una probabilidad del 95%, y para una probabilidad del 99%?

Se pueden generar 1,5∙105 fragmentos distintos (3∙10

9 pb 2∙10

4 pb ). Si todos los

fragmentos se clonaran se obtendrían 1,5∙105 clones, pero como el proceso es

aleatorio hay que trabajar con un número de clones mayor:

P = 95% N = ln 1–0,95

ln 1– 11,5∙10

5 = 450.000 clones

P = 99% N = ln 1–0,99

ln 1– 11,5∙10

5 = 690.000 clones


Rastreo de genotecas

Detección e identificación de clones individuales

El rastreo de genotecas incluye una serie de procedimientos que permiten detectar, de

entre los centenares de miles de clones que componen una genoteca, aquel clon que es

portador de la secuencia de interés.

Las estrategias que se pueden llevar a cabo para el rastreo de las genotecas dependerán del

conocimiento previo, que posea el investigador, de la secuencia de interés. Pueden darse

dos situaciones:

Que se conozca la secuencia de nucleótidos que componen el fragmento de ADN

buscado, es decir, que se conozca su estructura.

O que se conozca el producto de expresión (proteína) del fragmento, esto es, que se

conozca su función.

Algunos de los métodos usados para la identificación de clones recombinantes de interés en

una genoteca son: la hibridación de ADN usando alguna sonda marcada, y el rastreo

inmunológico (uso de anticuerpos frente al producto de interés).

Detección directa por complementación

El método más usado, cuando se conoce la estructura del fragmento de interés, es la

hibridación de ácidos nucleicos con una sonda específica.

Su fundamento estriba en la posibilidad de formación de ADN de cadena doble entre

cadenas sencillas del ADN a sondear y cadenas sencillas de ADN marcado (ADN sonda).

Una sonda es un fragmento de ácido nucleico que se usa para el reconocimiento específico

de una molécula determinada de ácido nucleico de cadena sencilla, en un proceso de

hibridación. Existen varios tipos fundamentales de sondas de ácidos nucleicos: ADN

genómico, ADN copia, ARN o un oligonucleótido sintético. La sonda se puede marcar de

varias maneras, mediante nick translation, random priming, o por PCR.

Ahora bien, ¿cuál es la fuente de la sonda? Lógicamente, el usar una sonda de ADN

determinada se justifica porque sepamos o sospechemos que dicho ADN puede tener

parecido con el ADN que estamos buscando en la genoteca. Los principales orígenes de las

sondas moleculares son los siguientes:

Una secuencia de ADN procedente de otro organismo y de la que tenemos indicios

de que puede tener parecido con lo que estamos buscando. A este tipo de sondas se

las suele denominar como sondas heterólogas.

Una sonda sintética elaborada a partir de la información disponible sobre la

secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente al gen que estamos

buscando. Con esta información, y teniendo en cuenta que el código genético es

degenerado, podemos sintetizar todos los posibles oligonucleótidos sinónimos que

codificarían dicha porción de proteína. Marcando esa mezcla de oligonucleótidos,

los podemos usar como sonda para localizar el gen en una genoteca. Pero, de entre

todos los oligonucleótidos, sólo unos pocos serán homólogos a la secuencia de

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interés, y por lo tanto, habrá una señal de hibridación muy débil. Por otro lado, hay

que tener en cuenta que puede haber falsos positivos cuando algunos de los

oligonucleótidos hibriden con regiones del ADN que no son las buscadas.

El procedimiento para el rastreo por hibridación de ADN es el siguiente: las genotecas se

construyen en placas de Petri con medio de cultivo selectivo. Las miles de colonias de una

genoteca se replican a filtros de nylon o de nitrocelulosa, las colonias se fijan a la

membrana de nylon mediante alta temperatura (80ºC) o por luz ultravioleta. Posteriormente

se usa una solución alcalina (NaOH) para lisar las bacterias y desnaturalizar el ADN

recombinante.

El ADN sonda se desnaturaliza también para convertirlo a cadenas sencillas. Y se

mezcla el ADN sonda desnaturalizado y marcado con los filtros que contienen el ADN de

la genoteca (igualmente desnaturalizado), esta reacción se realiza a una temperatura (60-

65ºC) adecuada para que la sonda se una a la región especifica, pero no renaturalicen ambas

cadenas. Si el ADN sonda tiene cierto grado de homología con el ADN de alguno de los

clones, se emparejará con dicho ADN para generar doble hélice. Después, hay que lavar la

muestra a alta temperatura para eliminar el exceso de sonda, y para eliminar las sondas que

se hayan unido en regiones inespecíficas.

Finalmente revelamos el resultado, el procedimiento de detección dependerá del

tipo de marcaje realizado. En la película fotográfica de autorradiografía, encontraremos

unas manchas peculiares correspondientes a las colonias que hayan dado la hibridación con

la sonda. Con esta información vamos a las placas matrices donde están las colonias

originales de células vivas, y recuperamos los clones, que podemos seguir estudiando.

Detección indirecta por hibridación de ácidos nucleicos

Cuando no se dispone de una sonda específica se puede recurrir a la hibridación diferencial

o a la hibridación sustractiva de ácidos nucleicos.

Hibridación diferencial: este método permite la detección de clones que se expresan

abundantemente en un tejido, y muy poco, o nada, en otro tejido diferente. Se extrae el

ARNm de cada uno de los tejidos, y se retrotranscribe a ADNc de doble cadena, mediante

la transcriptasa inversa. Parte del ADNc del tejido 1 se marca y se usa como sonda, y parte


se usa para construir una genoteca; mientras que el ADNc del tejido 2 se marca y se usa

todo como sonda. A continuación, se hacen dos réplicas a membrana de la placa de Petri

que contiene la genoteca.

Cada placa replicada se pone a hibridar con el

ADNc marcado: una placa con el ADNc del tejido

1 y otra con el ADNc del tejido 2. Finalmente, se

obtienen dos placas de autorradiografía que

pueden comparase. Los clones que hibridan sólo

con la sonda 1 y no con la 2 son portadores de

genes que se expresan sólo en el tejido 1, y no se

expresan (o lo hacen muy poco) en el tejido 2. Y

los clones que hibridan en ambas placas son

portadores de genes que se expresan en ambos

tejidos. Teóricamente, en la placa que se ha

añadido el ADNc sonda del tejido 1 debería

observarse hibridación en todos los clones, ya que

ambas moléculas de ADN (de la sonda y de la

genoteca) proceden del mismo tejido. Pero, hay

que tener en cuenta que el ADN copia procede del

ARNm, por lo tanto, dependiendo del nivel de expresión de cada gen en dicho tejido, habrá

más o menos copias de ADNc. Y en las placas de autorradiografía sólo se observa la

hibridación cuando la cantidad de ADNc sonda que ha hibridado es alta.

Hibridación sustractiva: mediante este método se pueden detectar clones que se expresan

poco en un tejido, pero que no se expresan nada en otro. Como en el caso anterior, se

extrae el ARNm de dos tejidos distintos. El ARNm del tejido 1 se retrotranscribe a ADNc

simplexo, y se pone a hibridar con el ARNm del tejido 2. La solución de hibridación

contendrá tres tipos de moléculas distintas:

Moléculas de ARNm del tejido 2 que no hibridan con el ADNc del tejido 1.

Representa los genes que se expresan sólo en el tejido 2.


Moléculas de ADNc del tejido 1 que no han encontrado secuencias homólogas en el

ARNm del tejido 2. Son los genes exclusivos del tejido 1.

Moléculas híbridas de ADN-ARN. Son los genes que se expresan en ambos tejidos.

La mezcla de las tres moléculas se hace pasar por una columna de hidroxiapatito, que

retiene las moléculas duplexas. Se recoge la fracción eluida de la columna, que contiene las

moléculas simplexas (ADNc 1 y ARNm 2), y se pone en presencia de una ADN polimerasa

y de nucleótidos (dNTPs). La enzima ADN polimerasa no usará como sustrato el ARNm,

sólo trabajará con el ADNc del tejido 1, el cual pasará a ser ADNc de doble cadena. Éste

será usado para construir una genoteca enriquecida con clones que se expresan poco en el

tejido 1 y nada en el tejido 2.

Vectores de expresión y detección por métodos inmunoquímicos

Para el rastreo mediante métodos inmunológicos es necesario construir genotecas obtenidas

con vectores de expresión.

Los vectores de expresión son vectores de clonación que permiten la expresión del inserto.

Por lo tanto, tienen que permitir la transcripción y traducción del ADN exógeno. Estos

vectores presentan las siguientes características:

Un origen de replicación (ori).

Un gen marcador.


Un promotor que permita

la transcripción del ADN

insertado. Esta región

promotora está situada

aguas arriba (región 5')

del gen, y es reconocida

por la maquinaria de

replicación. El promotor

tiene que ser fuerte, es

decir, tiene que permitir

una elevada expresión del

gen, el 50% de la proteína

total celular debe ser la

codificada por el inserto;

y también tiene que ser

inducible, es decir, debe

permitir el control del momento de la expresión mediante inductores y/o represores.

Un sitio de unión al ribosoma (RBS) situado a continuación del promotor. Es una

región que se transcribe pero que no se traduce, y permite la traducción eficaz del

fragmento clonado. Las regiones no traducidas de los genes se denominan UTR (del

inglés untranslated region), en este caso se dice que es una región 5'-UTR. Existen

dos tipos:

o Secuencia Shine-Dalgarno: se usa para expresar fragmentos de ADN

procarióticos. Se trata de una secuencia consenso situada unos nucleótidos

antes del codón de inicio de la traducción, que es complementaria a una zona

de la región 3' del ARN ribosomal 16S.

o Secuencia Kozak: se usa cuando se quiere expresar fragmentos eucarióticos.

Permite la unión del mensajero al ribosoma.

Un sitio de inicio de la traducción, en eucariotas el codón de inicio más empleado

es AUG.

Un sitio de clonación múltiple (MCS), o polylinker, con dianas de restricción únicas.

Una señal de terminación que interviene en la finalización de la transcripción, y que

permite la liberación del ARN mensajero.

Antes y después del MCS, se suelen insertar unos genes que codifican para

proteínas de fusión. Las proteínas de fusión aparecen normalmente en la región C- y

N-terminal de la proteína diana, están en fase con ella, y no debe haber codones de

paro entre ambas. Las proteínas de fusión tienen distintas funciones: aumentan la

expresión, mejoran la solubilidad, favorecen la purificación, y ayudan a la

localización de la proteína de interés. Por ejemplo, el gen ompF produce una

proteína de membrana externa en E. coli, y se incluye como proteína de fusión en

algunos vectores. Este gen presenta un promotor propio y una región RBS.

Seguidamente al gen ompF se encuentra el ADN insertado, y a continuación de éste

se encuentra, por ejemplo, el gen lacZ, que permite localizar los clones

recombinantes. Cuando se expresan estos genes se obtiene una proteína trihíbrida,

formada por la proteína ompF, la proteína diana, y la enzima β-galactosidasa. El

producto del gen ompF hace que la proteína trihíbrida se localice en la membrana

citoplasmática de la bacteria hospedadora, y la actividad β-galactosidasa hace que

las colonias portadoras de ADN recombinante aparezcan de color azul si se les

añade X-Gal.


Siempre que se incluyen proteínas de fusión en el vector, se añaden también sitios

de reconocimiento de proteasas entre los genes que codifican para las proteínas de

fusión y el sitio de clonación múltiple. De este modo, es posible aislar de forma

específica la proteína diana de las proteínas de fusión.

Si no disponemos de una sonda de ADN, y si el gen que estamos buscando en la genoteca

se expresa hasta nivel de proteína, podemos recurrir al rastreo inmunoquímico (siempre y

cuando contemos con anticuerpos frente a la proteína en cuestión).

Para buscar en la genoteca aquellos clones portadores de la proteína recombinante,

se procede del siguiente modo: se hacen réplicas de todas las colonias de la genoteca a

membranas de nylon o nitrocelulosa, y se fijan las bacterias a la membrana. Después, las

colonias de réplica se lisan, para dejar expuestas las proteínas producidas por estos clones.

El filtro con las proteínas se trata con un anticuerpo específico que reconoce la proteína que

estamos buscando (anticuerpo primario, que no está marcado). Y se lava la muestra para

quitar los productos en exceso y no unidos. A continuación, se trata el filtro con un segundo

anticuerpo. Este anticuerpo secundario está marcado y reconoce al anticuerpo primario, de

modo que varias moléculas de anticuerpo secundario se unirán a cada molécula de

anticuerpo primario, así se amplifica la señal. El resultado es que en la placa

autorradiográfica aparecerá una señal que se corresponde con aquel clon que ha expresado

la proteína recombinante, proteína que es el producto de expresión del ADN pasajero

insertado en el vector de expresión.


Caracterización estructural de moléculas de ADN recombinante

Mapas de restricción

Un mapa de restricción es un mapa físico que muestra las posiciones relativas de las

dianas, de un conjunto de enzimas de restricción, contenidas en una secuencia de ADN. Las

distancias entre las dianas de corte se indican en pares de bases. Antes de construir el mapa

de restricción hay que estimar el tamaño del fragmento clonado.

Estimación del tamaño del fragmento clonado en la molécula de ADN recombinante:

en primer lugar, mediante la técnica conocida como miniprep, se extrae del cultivo

bacteriano el ADN de naturaleza plasmídica. Una vez aislado el ADN recombinante se

procede a separar el inserto del vector, para lo cual hay dos métodos:

1. Digestión con la enzima de restricción usada en la clonación.

2. Amplificación del inserto por PCR, usando los cebadores adyacentes al sitio de

clonación múltiple (MCS). Por ejemplo, en el plásmido pBluescript se usan los

primers T3 y T7.

En segundo lugar, se realiza una electroforesis en gel de agarosa. A pHs cercanos a la

neutralidad, el ADN está cargado negativamente y migra del cátodo al ánodo con una

movilidad que depende de su tamaño. Normalmente, los fragmentos lineares de ADN

cortos migran a través del gel más rápidamente que los fragmentos largos. La tasa de

migración depende del tamaño de los fragmentos lineares y del gradiente de voltaje que se

establece entre los electrodos. Los productos de la

digestión con la enzima de restricción se cargan en un

pocillo del gel, para separarlos y poderlos visualizarlos.

Se observarán dos bandas, una se corresponde con el

ADN vector y otra con el ADN pasajero. En el caso del

ADN amplificado por PCR se observa una sola banda

(ADN pasajero). Los tamaños de los fragmentos que

han corrido en el gel, se determinan mediante

comparación con los tamaños de fragmentos conocidos

(los patrones) situados en otra calle del gel.

Construcción de un mapa de restricción: para construir el mapa hay que separar el

inserto del vector, para ello, se corta el gel de agarosa con un bisturí y se extrae la banda del

ADN exógeno. Después, el inserto purificado se digiere con diferentes enzimas de

restricción:

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–

+

Patrón E.R. PCR

Vector

Inserto


Digestión con la enzima de restricción A.

Digestión con la enzima de restricción B.

Doble digestión con las enzimas de restricción A y B.

Los distintos fragmentos de ADN generados se separan por electroforesis. Los fragmentos

se organizan en forma de mapa, comparando los tamaños de fragmentos en las calles donde

se cortó con una sola enzima (digestiones simples) con los de las calles donde se cortó con

dos enzimas (digestiones dobles). El tamaño de cada molécula de ADN se estima

comparándolo con las bandas de ADN patrón de tamaño conocido.

Por ejemplo, la digestión de un determinado fragmento de ADN de 3300 pares de bases, da

lugar a los fragmentos que se muestran a continuación:

Enzima de restricción Tamaño de los fragmentos

generados (pb)

A

1500

1000

800

B

1700

900

700

A+B

1500

900

600

200

100

Posteriormente, se extraen del gel de agarosa los fragmentos obtenidos por la digestión con

la enzima A, y se digieren con la enzima B, y viceversa. En este caso es obtienen los

siguientes fragmentos:

1500 pb B 1500 pb 1700 pb

A 1500 pb + 200 pb

1000 pb B 900 pb + 100 pb 900 pb

A 900 pb

800 pb B 600 pb + 200 pb 700 pb

A 600 pb + 100 pb

Patrón Inserto A B A+B


Se observa que, cada fragmento producido por la digestión del fragmento original A con la

enzima B también se encuentra en una de las digestiones dobles en las que el fragmento

original B se ha cortado con la enzima A. Estos datos permiten colocar las dianas de corte y

elaborar un mapa inequívoco. La clave del mapeo de restricción es el uso de fragmentos

solapados.

Los fragmentos que son digeridos sólo por una de las dos enzimas se corresponden con los

extremos de la molécula de ADN exógeno, en este ejemplo serían los fragmentos de 1500

pb y de 900 pb. Estos fragmentos se buscan en la doble digestión y se ordenan. Cuando el

fragmento de 1700 pb se digiere con la enzima A se obtienen dos fragmentos, uno de 200

pb y otro de 1500 pb, el fragmento 1500 se dispone en un extremo y a continuación de éste

está el fragmento 200. Del mismo modo se puede determinar que el fragmento de 100 pb

está contiguo al fragmento de 900 pb. Y por lo tanto el fragmento de 600 pb está entre el

200 pb y el 100 pb. El mapa de restricción resultante sería el siguiente:

Éste es el método usado para hacer mapas de dianas (de 6 nucleótidos) de enzimas de corte

poco frecuente, pero no sirve si se quieren hacer mapas de restricción que muestren las

dianas (de 4 nucleótidos) de enzimas que cortan más frecuentemente el ADN. Por ejemplo,

asumiendo que en un ADN de gran longitud las dianas quedan distribuidas aleatoriamente,

cuanto más corta sea la secuencia del sitio de restricción, más probabilidad habrá de

encontrarla por puro azar, es decir, mayor será la frecuencia de reconocimiento. Esto hará

que se generen fragmentos de ADN más pequeños, y por lo tanto, será muy poco probable

que dentro de éstos haya una diana para una segunda enzima de restricción. En estos casos

hay que recurrir a otras estrategias.

Se usa una enzima fosfatasa para desfosforilar los

extremos 5' P de la molécula de ADN que se pretende

mapear. Se añade ATP marcado, y la enzima nucleotidil

quinasa regenerará los grupos fosfato en los extremos 5',

generándose una molécula de ADN marcada en sus

extremos. A continuación, se corta la molécula con una

enzima de restricción que genere grandes fragmentos, y

mediante electroforesis se aísla el fragmento de mayor

tamaño. Si se usara la enzima B del ejemplo, el fragmento que se seleccionaría sería el de

1700 pb, como es un fragmento de uno de los extremos presenta marcaje en 5' P. Este

fragmento se digiere parcialmente con una enzima de restricción de corte frecuente, bajo

condiciones de rotura parcial que no permiten que la enzima corte todas las dianas

presentes en el ADN. Y se obtiene una colección de fragmentos solapantes de diferentes

tamaños, según la diana que haya sido cortada en cada uno.

A

A+B

B

200

100

1500 800 1000

1700 700 900

1500 600 900

A A

A A

B B

B B


Estos fragmentos se separan mediante electroforesis y se detecta el marcaje

del extremo 5' en una placa de autorradiografía, de este modo se puede

conocer la posición de las dianas en el ADN. Hay que tener en cuenta que

los fragmentos de digestión internos no pueden ser detectados, ya que no

presentan marcaje.

Utilidades de los mapas de restricción:

Se usan para localizar dianas de enzimas de restricción, para un posterior análisis

genómico o una subclonación.

Sirven para ordenar clones solapantes, en la construcción de genotecas genómicas.

Secuenciación de ácidos nucleicos

El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de

nucleótidos. Los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método

enzimático de terminación de cadena de Sanger, también conocido como método didesoxi.

Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger: para

obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por este método, se

necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar

un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese

fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar

en estado de hélice sencilla.

Una enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del

bacteriófago T4. Ésta emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las

reglas de complementariedad de bases va añadiendo nucleótidos a partir de un

cebador.

Un cebador, que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de

longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por

el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria

a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de

nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un

primer con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento

de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al

punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El primer

utilizado suele marcarse radiactivamente.

Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de

marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro

nucleótidos trifosfato en cada reacción.

Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).

Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo

hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden

incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos

ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un

nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción.

Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y


dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi,

por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en

este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN

que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar

donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de

moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo

nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el

extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan

por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida, muy finos y de gran

longitud, que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un sólo

nucleótido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en

cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone

en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en

una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en

ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está

la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción

correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5'→3', si

comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos


aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de

nueva síntesis en la dirección 5'→3'.

Método automático de secuenciación: la principal diferencia entre el método enzimático

de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar,

en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza

fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con un

didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema

permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo las

moléculas de ADN de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La

segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La

detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al

mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor

tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema

aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por

consiguiente, en cada secuenciación.

Hibridación de ácidos nucleicos en filtro

El Southern-blot es un método, desarrollado por el biólogo inglés Edwin Southern, que

permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este

ácido nucleico, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas

específicas.


Para analizar una muestra de ADN genómico, éste debe ser

previamente fragmentado, utilizando enzimas de restricción. Los

fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño,

mediante una electroforesis en gel de agarosa. Cuando se digiere una

molécula de ADN recombinante (menor número de dianas) y se carga

en un gel, se resuelve en bandas discretas, pero en el caso del ADN

genómico (más dianas) no se observan bandas definidas, sino todo un

rastro de fragmentos de ADN de distintos tamaños.

Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de ADN se traspasan a

una membrana de nylon. Para ello, se dispone el gel boca abajo sobre un papel que está en

contacto con una solución desnaturalizante, y por encima del gel se coloca la membrana de

nylon. El líquido asciende por capilaridad, y el ADN es arrastrado desde el gel hasta la

membrana, donde queda retenido.

A continuación, se fija el ADN por medio de luz ultravioleta o mediante calor. El filtro se

incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta

sonda es una secuencia de ácido nucleico que reconocerá a la secuencia de ADN

inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de

ácidos nucleicos. De este modo, en la placa de autorradiografía se detectan aquellos

fragmentos del ADN genómico que son homólogos a la sonda empleada.

Si en lugar de transferir ADN a la membrana se transfiere ARN, la técnica se denomina

Northern blot, se usa en ensayos de expresión de fragmentos. La detección de proteínas, en

una muestra de un tejido homogeneizado o extracto, es denominada Western blot.

Patrón ADNr ADNg


Aplicaciones del Southern:

Obtención de RFLPs desde genomas de especies próximas, para buscar diferencias

estructurales entre genomas próximos que presentan mutaciones en dianas de

enzimas de restricción.

Elaboración de mapas genéticos.

Determinación del número de copias de un fragmento en el genoma.

El término RFLP (del inglés restriction fragment length polymorphism, es decir,

polimorfismo para la longitud de un fragmento de restricción) se refiere a secuencias

específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de

restricción y que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan

usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes

individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos

fragmentos de restricción.

Una forma de detectar dicho polimorfismo es mediante Southern-blot. Para ello, se

digiere el ADN genómico de dos especies con una enzima de restricción y luego se hibrida

la mezcla de fragmentos resultante con una sonda marcada que hibrida en la zona de la

diana que muestra polimorfismo.

La especie 1 muestra en el Southern blot una única banda (el fragmento acotado por dos dianas de

restricción para la enzima empleada), la especie 2 muestra dos bandas, pues la sonda complementa con una

secuencia en ambos fragmentos.

Localización del fragmento clonado en el genoma

Se pretende asignar el fragmento clonado a un locus particular. Los genomas eucariotas

están fragmentados en cromosomas, por lo tanto, hay que asignar el fragmento a un

cromosoma particular.

Un mapa cromosómico representa el orden lineal de los genes en un cromosoma. El

conjunto de mapas cromosómicos constituye el mapa genómico del organismo.

Existen dos variantes fundamentales de mapas:

Los mapas genéticos o de ligamiento, definidos mediante unidades de frecuencia

de recombinación. Para construir los mapas genéticos es necesario analizar la

descendencia de un cruzamiento particular. Se basa en que la probabilidad de

recombinación entre dos genes es menor cuanto menor es la distancia entre ellos.

Los mapas físicos, en los que las distancias entre loci se expresan en pares de bases,

como ocurre, por ejemplo, en los mapas de restricción. Los mapas físicos se

obtienen ordenando fragmentos clonados. El mapa físico más completo es la

secuencia total de nucleótidos que conforman el genoma del organismo.

Especie 2

Especie 1

1 2

Sonda


Los mapas genéticos son la única forma de localizar genes en especies con genomas no

secuenciados. Y son el paso previo a la secuenciación del genoma.

Para hacer un mapa genético es necesario que existan, al menos, dos alelos distintos que

den lugar a un fenotipo distinto. La forma de análisis de los fenotipos depende del

conocimiento del gen y de las herramientas de las que dispongamos.

Ejemplo:

La anemia falciforme es una enfermedad autosómica recesiva con una alta prevalencia en

determinadas regiones geográficas. Los pacientes afectados por esta patología presentan en

homocigosis la sustitución de una glutamina por una valina en el tercer aminoácido de la β-

globina. Dicha mutación se corresponde con el cambio de una adenina por una timina en el

codón 6 de dicho gen, que al mismo tiempo altera la diana de restricción para la enzima

MstII. Esto da lugar a la existencia de RFLPs para el gen de la β-globina, entre individuos

sanos y enfermos.

Aprovechando esta circunstancia se ha diseñado un método muy sencillo para detectar la

mutación. Dicha diana se pierde con la mutación que causa anemia falciforme.

Flanqueando a esta diana existen dos dianas para la misma enzima: una a 1,2 kb y otra a 0,2

kb de distancia. La digestión del ADN genómico de un individuo con la enzima MstII, dará

lugar a miles de fragmentos entre los cuales estarán los correspondientes al locus de la β-

globina. Podemos ahora separar todos los fragmentos según su tamaño en un gel de agarosa

y transferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa por la técnica de Southern. Utilizando

una sonda complementaria al fragmento de 1,2 kb, podremos detectar aquellos fragmentos

de ADN que contengan la secuencia complementaria a la sonda.

Si un individuo es homocigoto para el alelo normal de la β-globina, el único fragmento que

será detectado por la sonda será el de 1,2 kb. Si el individuo es portador del alelo de anemia

falciforme detectaremos dos fragmentos: el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente del

cromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) y el otro proveniente del cromosoma

con la secuencia de la anemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuo

homocigoto para la anemia falciforme sólo detectaremos el fragmento de 1,4 kb.


Determinación del número de copias de una secuencia en el genoma

La mayor parte de los genes son de copia única, pero hay secuencias de más de una copia,

repetidas en tándem o dispersas. La determinación del número de copias de una secuencia

de ADN en el genoma depende de las regiones adyacentes al fragmento insertado.

Si las regiones adyacentes a las diferentes copias, del fragmento clonado, en el genoma son

distintas, se determina el número de copias por RFLPs. Para ello, se digiere el ADN

genómico con una enzima de restricción, se hace una electroforesis en gel de agarosa y se

realiza un Southern Blot. Por ejemplo, si hay dos copias del fragmento clonado en el

genoma, y las regiones adyacentes al inserto son distintas, las dianas para la restrictasa

usada en la digestión estarán en distinta posición en cada una de las copias. Por lo tanto, al

hibridar el fragmento clonado con la membrana de nylon, y después del revelado

autorradiográfico, se observarán dos bandas que corresponden a las dos copias del

fragmento en el genoma.

Si, por el contrario, las regiones adyacentes al fragmento clonado son iguales, se observará

una sola banda en la película de autorradiografía, y no se puede saber el número de copias.

Por lo tanto, hay que recurrir a los ensayos de Dot-Blot.

El dot blot consiste en colocar, sobre una membrana, una serie de diluciones de ADN en

forma de pequeños círculos o puntos, para su posterior hibridación con la sonda. En este

caso, se hacen diluciones del ADN genómico y diluciones del fragmento clonado, y se

hibridan ambos conjuntos de diluciones con el inserto marcado. Se revela el resultado, y se

buscan las diluciones que coincidan en intensidad de señal.

Copia 1 en la región X del genoma

Copia 2 en la región Y del genoma

E.R. A E.R. A

E.R. A E.R. A

Membrana de nylon Autorradiografía Gel de electroforesis

ADN + E.R. A

Sonda

marcada

Membrana de nylon Autorradiografía Gel de electroforesis

ADN + E.R. A

Sonda

marcada Copia 1 en la región X del genoma

Copia 2 en la región Y del genoma

E.R. A E.R. A

E.R. A E.R. A


Sabiendo el tamaño del genoma y el tamaño del inserto, se puede estimar el número de

copias del ADN clonado que hay en el genoma.

Por ejemplo: el tamaño del genoma es de 3,3∙109 pb, y el inserto mide 3∙10

3 pb. Y en el dot

blot se ha visto que, la intensidad de la dilución de 10 µg de ADN genómico coincide con

la dilución de 10 ng del inserto. Sabiendo que en un picogramo de ADN hay 109 pares de

bases, ¿cuántas copias del fragmento clonado hay en el genoma?

Moléculas de inserto en 10 ng:

10 ng = 104 pg = 10

13 pb

1013

/ 3∙103 = 3,3∙10

9 insertos

Número de genomas en 10 µg:

10 µg = 107 pg = 10

16 pb

1016

/ 3, 3∙109 = 3∙10

6 genomas

3,3∙10

9

3∙106 = 1.100 copias del fragmento clonado en el genoma

Diluciones de

ADNg

Diluciones de

ADN clonado


Caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante

Para conocer la función del fragmento de ADN clonado hay que estudiar los productos que

codifica (ARN y proteínas), y saber en qué circunstancias celulares se expresan, es decir, en

que tipo celular y en qué momento del desarrollo.

En la caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante se hacen estudios a dos

niveles:

Análisis funcional in vitro: se trabaja con el fragmento clonado.

Análisis funcional in vivo: hay que introducir el fragmento clonado en células

(bacterias o células eucariotas) o en organismos (transgénicos) para que se exprese.

Las herramientas de estudio serán distintas según se haya clonado un gen o un promotor.

Caracterización funcional in vitro

Si el fragmento clonado es un gen:

Si se ha clonado un gen, o un fragmento génico, éste puede ser usado para saber en qué tipo

celular y en qué estadio celular se está expresando. El Northern-blot y la RT-PCR son las

técnicas usadas para este fin.

El Northern-blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico de

una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN

mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se

extrae el ARN de los distintos tejidos, se digiere con una enzima de restricción, y se

somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su

tamaño. Tras esto, se transfiere por capilaridad el contenido del gel, ya resuelto, a

una membrana en la cual se efectúa la hibridación de una sonda (el fragmento

clonado) marcada radiactiva o químicamente.

La señal de hibridación que se observa por autorradiografía indica el tejido

donde se ha expresado el fragmento de ADN clonado, el momento de expresión, y

la intensidad con la que lo hace.

Membrana de nylon

Sonda

marcada

Gel de electroforesis

Pat

rón

T

ejid

o A

T

ejid

o B

T

ejid

o C

–

+

Película radiográfica

99


La RT-PCR es un procedimiento rápido y cuantitativo para el análisis del nivel de

expresión de genes. Esta técnica utiliza la capacidad de la transcriptasa reversa (RT)

de convertir el ARN en ADNc de una sola hebra y la acopla con la amplificación

por PCR de tipos específicos de moléculas de ADNc presentes en la reacción de

RT. Los ADNc que se producen durante la reacción de la retrotranscriptasa

representan una ventana en el patrón de genes que están siendo expresados en el

momento en que el ARN fue aislado.

El ARN celular total se extrae de tejidos, o de células, y se utiliza como

plantilla para la transcriptasa inversa. Una pequeña alícuota de la reacción de RT se

agrega entonces a una reacción PCR que contiene los primers específicos de las

secuencias que uno desea amplificar, que se han diseñado gracias a que se conoce la

secuencia de bases del fragmento clonado. Los productos del RT-PCR pueden

entonces ser visualizados en un gel de agarosa, de este modo, se demuestra que el

gen clonado se está expresando en el tejido en cuestión.

Si el fragmento clonado es un promotor:

El promotor de un gen es la región de ADN que controla la iniciación de la transcripción

de dicho gen a ARN. El promotor forma parte de la región reguladora del gen, es decir, no

tiene una función codificante y no se transcribe, pero es necesario para el inicio de la

transcripción. Dicha región -el promotor- se encuentra aguas arriba (extremo 5') del gen, y

es el lugar donde se une la ARN polimerasa, y en eucariotas, además, los factores

transcripcionales. Los promotores tienen secuencias de nucleótidos definidas (secuencias

consenso) como, por ejemplo, la caja TATA que aparece en los promotores eucariotas.

Para demostrar que en el fragmento de ADN clonado hay motivos de unión a proteína

(factores transcripcionales), se emplean dos técnicas: la huella de la DNasa y los geles de

retardo.

Geles de retardo: se basan en que la migración de un fragmento de ADN sobre un

gel de electroforesis es más lenta (está “retardada”) si el fragmento está unido a una

proteína.

En una primera etapa, el fragmento de ADN en estudio (marcado) se incuba

con las proteínas (los factores transcripcionales) y después se realiza una

electroforesis. Como en realidad hay muy pocas proteínas reguladoras, sólo un

escaso porcentaje de ADN será retardado. En el caso de que exista interacción

ADN-proteínas, se observa una banda débil encima de la banda de ADN principal.

Es necesario hacer un ensayo control, para

asegurarse de que no se trata de uniones

inespecíficas, realizando una electroforesis

del fragmento de ADN en ausencia de las

proteínas.

Lo más habitual es utilizar un

extracto completo de proteínas nucleares,

entre las cuales se incluyen los factores

transcripcionales. O pueden emplearse

diferentes fracciones proteicas purificadas a

partir del extracto nuclear.

Banda

retardada

–

+

Control

Fragmento clonado

+ extracto nuclear


Huella de la DNasa: esta técnica permite localizar de forma precisa la región de

ADN donde se unen las proteínas. Se basa en la capacidad de la enzima DNasa de

hacer cortes, al azar, en la molécula de ADN. La interacción de una proteína con un

ADN protege a este último de los ataques de la DNasa.

Se realizan dos ensayos en paralelo, en uno se digiere el fragmento clonado

(marcado) con la DNasa, éste servirá de control; y por otro lado, el fragmento

clonado se pone en presencia del extracto nuclear, y seguidamente se realiza la

digestión con la DNasa. Las condiciones de digestión de la DNasa se han adecuado

para que sólo se produzca un corte por molécula. Las roturas se producen al azar y

esto hace que, estadísticamente, aparezcan todas las bases de la secuencia de ADN

en el gel. El ADN incubado con la DNasa en ausencia de proteínas dará lugar, sobre

el gel de electroforesis, a toda una serie de bandas que corresponderán a los

diferentes fragmentos de ADN.

Por el contrario, si en el ADN, después de una incubación con proteínas,

ciertas regiones quedan protegidas del ataque enzimático, aparecerá en el gel una

zona desprovista de bandas. La proteína deja su “huella” sobre el ADN. Es posible

conocer exactamente la localización sobre el ADN de la zona protegida, donde hay,

por tanto, interacción con los factores de transcripción.

Sin embargo, aunque se ha demostrado que el fragmento de ADN tiene regiones de unión a

proteínas, no se sabe si esa región corresponde a un promotor. Es necesario recurrir a la

caracterización funcional in vivo, para lo cual, hay que introducir el fragmento de ADN

clonado en una célula hospedadora.

Caracterización funcional in vivo

El fragmento clonado se expresa en células, que pueden ser bacterias o células eucariotas, o

en organismos transgénicos.


La expresión de genes eucariotas en células bacterianas, normalmente en Escherichia

coli, es útil en experimentación básica:

Para obtener ARN que luego puede ser usado como sonda.

Para obtener proteínas y caracterizarlas funcional y estructuralmente.

Para obtener anticuerpos contra un producto génico específico, y usarlos en ensayos

inmunológicos.

También se utiliza en ensayos biotecnológicos, ya que las bacterias pueden usarse como

“fábricas de proteínas”, es decir, es posible usar el poder reproductivo de las bacterias para

expresar grandes cantidades de proteínas de interés terapéutico o industrial.

Para que el fragmento de ADN se exprese en el interior de las células debe estar

incluido en un vector de expresión, que cuente con los motivos necesarios para que el

inserto se traduzca y se exprese como proteína.

La expresión del fragmento clonado en E. coli conlleva algunos problemas:

Expresar genes eucariotas en células procariotas da problemas de estabilidad, esto

hace que la productividad sea menor.

En ocasiones, las proteínas sintetizadas forman cuerpos de inclusión, y para

romperlos hay que recurrir a tratamientos muy agresivos.

Otras veces, la proteína producida no es funcional, ya que no han ocurrido las

modificaciones postraduccionales (glicosilaciones, metilaciones, formación de

puentes disulfuro…) necesarias para que la proteína adquiera su conformación

nativa, puesto que E. coli carece de las enzimas precisas.

En estos casos, cuando no es posible expresar convenientemente el fragmento clonado en

bacterias, hay que recurrir a la expresión en células eucariotas.

Introducción de genes en células eucariotas: métodos, vectores, sistemas de selección

La introducción de material genético externo en células eucariotas se conoce con el nombre

de transfección. Por el contrario, la introducción de ADN exógeno en células procariotas

se conoce como transformación. El término transformación también se usa para referirse al

paso de una célula normal a una célula cancerígena.

Para la transfección se usan, normalmente, células de levadura. Aunque también es

común el uso de células de mamífero, en este caso se recurre a líneas celulares inmortales

procedentes de células tumorales.

Existen dos tipos de transfección: transitoria y estable.

Para la mayoría de aplicaciones de la transfección, es suficiente que el gen

transfectado se exprese transitoriamente. Como el ADN introducido en la

transfección normalmente no se inserta en el genoma nuclear, el ADN exógeno se

expresa durante 4 o 5 días, pero no se transmite a la descendencia.

Cuando se desea que el gen transfectado permanezca en el genoma de la célula y de

su progenie, se debe efectuar una transfección estable.

Hay varios métodos para introducir ADN en una célula eucariota:

Para la transfección en células de levadura se emplea el método de

permeabilización de la membrana con sales de litio y con polietilenglicol, y

seguidamente, se da un choque térmico.


La coprecipitación con fosfato cálcico se usa en levaduras, células animales y

protoplastos. El ADN se pone en presencia de cloruro de calcio (CaCl2) y ácido

fosfórico (H3PO4). Los iones fosfato cargados negativamente se combinan con los

cationes calcio y, de este modo, se forma un precipitado de ADN y fosfato cálcico

[ADN–Ca3(PO4)2]. Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar,

éstas toman parte del precipitado por endocitosis, y junto con él, el ADN. Con este

método, del 90% de las células transfectadas sólo el 4% integran el fragmento de

ADN en su genoma.

Otro método es la electroporación, consiste en un aumento de la permeabilidad de

la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado

externamente. Cuando el voltaje (2-4 kV) que atraviesa una membrana plasmática

excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del campo eléctrico

aplicado y/o la duración de la exposición al mismo es la adecuada, los poros

formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto periodo de tiempo, durante el

cual la molécula de ADN tiene la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo,

una exposición excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis

y/o necrosis, procesos que provocan la muerte celular. Por este método, sólo

sobreviven el 60-90% de las células, aunque el rendimiento es de 20-30 células

transfectadas de cada 105 supervivientes.

Un método muy eficiente es la inclusión del ADN en liposomas, pequeños cuerpos

formados por una membrana en cierto modo similar a la membrana plasmática de la

célula y que puede fusionarse con la misma, liberando el ADN al interior celular.

Los liposomas se forman por la interacción entre las cargas negativas del ADN, y

las cargas positivas de los lípidos catiónicos que envuelven a éste. La tasa de

transfección de este método es similar a la de la electroporación.

Otra técnica de transfección es el bombardeo con microesferas de metal (bolas de

oro o tungsteno de una micra de diámetro) recubiertas de ADN. Las microesferas

son proyectadas, con una pistola génica, a enorme velocidad sobre las células que

deben modificarse. Estas bolas se retrasarán progresivamente cruzando las distintas

capas celulares. Algunas de las células alcanzadas integrarán espontáneamente los

genes en su genoma.

La microinyección resulta ser una técnica muy efectiva, aunque laboriosa. Consiste

en la introducción mecánica de las moléculas de ADN en el interior de la célula,

utilizando para ello una microaguja. La microinyección es normalmente realizada

bajo un microscopio óptico llamado micromanipulador. Es el método que se emplea

en la introducción del ADN recombinante en las células embrionarias en el proceso

de obtención de animales transgénicos.

Mediante infección viral también se consigue introducir el ADN en el núcleo de la

célula eucariota, usando un virus como vector. En este caso, la técnica es

denominada transducción, y se dice que las células se transducen.

Para seleccionar aquellas células eucariotas que han incluido el gen de interés se usan genes

marcadores. Se entiende por marcadores aquellas secuencias que se incluyen en el vector y

permiten detectar las células que han sido transfectadas. Existen dos tipos de genes

marcadores:

Genes de selección: confieren una ventaja proliferativa a las células transfectadas.

Pueden ser, a su vez, de dos tipos:

o Genes de resistencia a antibióticos: los más usados son los genes puro, neo

e higro, que confieren resistencia a puromicina, neomicina e higromicina,

respectivamente.


o Genes implicados en el metabolismo de las bases nitrogenadas: son genes

que participan en la síntesis de novo de las bases, o bien, genes que permiten

el reciclado de las mismas. Dentro de los genes que permiten el reciclado de

las bases nitrogenadas, caben destacar los siguientes:

tk+: gen de la timidina quinasa, participa en el reciclado de los

nucleótidos de timina, fosforilándolos. Las células eucariotas que van

a ser transfectadas deben ser tk–, en presencia de aminopterina las

células tk– mueren. La aminopterina inhibe la síntesis de novo de

bases nitrogenadas. Sólo aquellas células que han incorporado un

vector con el gen marcador tk+ son capaces de vivir en un medio con

aminopterina, de este modo, se pueden detectar las células

transfectadas.

hprt+: gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa, interviene en el

reciclado de la guanina. Como en el caso anterior, para la selección

de las células transfectadas se usan células que carecen del gen hprt.

Si se las pone en un medio con aminopterina, solamente sobrevivirán

las células recombinantes porque tienen la hipoxantina fosforribosil

transferasa necesaria para el reciclado de las bases.

tkhs+: gen de la timidina quinasa de herpes simple, permite la

selección negativa de las células que lo poseen. Las células que son

transfectadas con el gen tkhs+ mueren en presencia de ganciclovir, un

análogo de la guanina. El ganciclovir es fosforilado por el gen tkhs+,

y se incorpora en el ADN durante la replicación, en lugar de la

guanina, causando la muerte celular.

Genes señal: estos genes marcadores confieren a la célula una característica

distintiva visible, como por ejemplo, un color diferencial.

o Genes señal usados en transfección estable:

GFP: gen de la proteína fluorescente verde, obtenido de la medusa

Aequorea victoria. Es una proteína muy poco tóxica y estable,

absorbe luz azul y emite luz de color verde cuando es iluminada con

luz de 395 nm de longitud de onda.

lacZ: gen que codifica para la enzima β–galactosidasa, que en

presencia de X-Gal, colorea a las células de azul.

o Genes señal usados en transfección transitoria:

Gen de la β–glucuronidasa: en presencia de X-Glu origina un

producto de color azul.

Gen de la luciferasa: la luciferasa es una enzima presente en las

luciérnagas, que cataliza la degradación de la luciferina a un

producto final liberando luz (fotones). Mediante un luminómetro se

puede detectar este fugaz destello de luz amarilla.

CAT: gen de la cloranfenicol acetil transferasa, esta enzima acetila el

cloranfenicol, y el cloranfenicol acetilado migra de forma diferente

en cromatografía.

Vectores de transfección: existen distintos mecanismos vectoriales de transfección celular:

Transfección de ADN lineal con el inserto y otra molécula de ADN con el gen

marcador, que se añade a la célula eucariota diana, y se integra en el genoma de

ésta, al azar, y en un número de copias variable.

Plásmidos mixtos: son construcciones a partir de plásmidos de bacterias, a los que

se les añade los motivos de expresión necesarios para la replicación en el interior de


células eucariotas; tales como un origen de replicación eucariota, un sitio de unión

al ribosoma, un promotor, etc. Estos plásmidos se mantiene en bacterias, y son

posteriormente transfectados a células eucariotas.

Vectores virales: se aprovecha el mecanismo de infección viral para transducir

células eucariotas. Se usan siempre virus defectivos, es decir, carentes de parte del

genoma vírico original, y por lo tanto, no son capaces de replicarse de forma

autónoma.

Mecanismo general de transfección vírica usando virus defectivos:

1. Construcción del vector viral. Se elimina el mayor número posible de genes y

secuencias del genoma viral, para que pueda captar el ADN exógeno.

2. Empaquetamiento del vector viral, mediante células empaquetadoras o mediante

empaquetamiento in vitro, para formar partículas virales infectivas. Las células

empaquetadoras son células eucariotas que poseen los genes que han sido

eliminados del genoma viral, y aportan, por tanto, la composición proteica que

necesitan los virus para su funcionalidad.

3. Infección de las células eucariotas diana.

Algunos vectores virales usados en transfección:

Vectores derivados de SV40: el SV40 es un virus pequeño de ADN circular de

doble cadena, hallado tanto en monos como en humanos, y está implicado en

algunos tipos de cáncer. Parte del genoma de este virus se usa para construir un

vector viral mixto.

Es necesario recurrir al uso de células empaquetadoras, estas células son portadoras

de los genes para los que es defectivo el vector, o en otros casos, estas células son

cotransfectadas con virus auxiliares. De cualquier modo, dentro de las células

empaquetadoras se van a producir partículas recombinantes, con el vector portador

del gen clonado que se pretende expresar en las células diana. Estos virus,

defectivos pero con capacidad infectiva, se usan para transfectar células de una línea

celular de mono africano, con el fin de producir grandes cantidades de la proteína de

interés.

neoR

PBR322

Ori SV40

Promotor temprano

Promotor tardío

MCS

Células empaquetadoras Células diana

Proteína de interés

Partículas virales

Vector viral

Gen foráneo


Vectores derivados de retrovirus: los retrovirus son virus de ARN lineal. Los

vectores retrovirales pueden incluir insertos de hasta 8 Kb, e integran el ADN de

interés en el genoma de la célula diana. Sin embargo, únicamente sirven para

infectar células que se encuentran en división. Además, la tasa de transfección es

pequeña y se obtienen pocas partículas virales. En el proceso de infección el

genoma del retrovirus es retrotranscrito, mediante la transcriptasa inversa, en el

citoplasma a ADNc, que es trasladado al núcleo, donde se integra en el genoma de

la célula hospedadora en forma de provirus. En cada extremo del genoma del

provirus hay dos regiones largas y repetidas LTR (Long Terminal Repeats), que

incluyen secuencias promotoras, de integración y de empaquetamiento. Entre los

dos LTR se sitúan los genes virales gag, pol y env que codifican para proteínas

estructurales del virus: proteínas de la matriz, enzima polimerasa (retrotranscriptasa)

y proteínas de la cubierta del virus, respectivamente.

El vector retroviral se obtiene después de sustituir los genes gag, pol y env, por el

ADN de interés; no obstante, este vector contendrá los LTR virales, además de un

gen de resistencia a antibiótico y un sitio de clonación, donde se inserta el ADN de

interés, con un promotor para que se exprese.

Es necesaria la transfección del vector a células empaquetadoras, éstas tiene

incorporados los genes retrovirales gag, pol y env en el genoma. Sólo cuando entren

en contacto los genes retrovirales de las células empaquetadoras y las regiones LTR,

necesarias para la encapsidación del virus, presentes en el vector, será cuando se

producirán los retrovirus recombinantes que contiene el gen de interés. En el medio

extracelular se acumularán las partículas virales defectivas (carecen de los genes

gag, pol y env), que serán capaces de transducir las células eucariotas diana y

conseguir así que estas células contengan y expresen el gen de interés. En las células

diana no ocurre la complementación, y por lo tanto, en el interior de estas células no

se forman nuevas partículas virales.

Vectores derivados de adenovirus: los adenovirus son virus de ADN duplexo

lineal, son más grandes y complejos que los retrovirus, causan infecciones

respiratorias benignas en humanos. Los vectores adenovirales son defectivos, y es

necesario recurrir a células empaquetadoras. Se pueden llegar a insertar en ellos

hasta 7,5 Kb de ADN exógeno. La gran ventaja de usar un adenovirus como vector

es la alta eficacia de transfección, así como una producción de grandes títulos.

Infecta tanto células en división como quiescentes. Entre los principales

inconvenientes encontramos que el genoma vírico no llega a integrarse en la célula,

de modo que los genes de interés se expresan sólo transitoriamente. Además se ha

visto que, en terapia génica in vivo, los adenovirus producen respuesta inmune

celular e inflamatoria en los organismos tratados con estos vectores.

Promotor

MCS neoR

LTR LTR Vector

retroviral

LTR gag pol env LTR


Vectores derivados de adenoasociados: son parvovirus, contienen ADN simplexo

como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para

multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los

adenovirales. Su capacidad de integrar ADN exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb. Las

principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su ADN en el

genoma de la célula diana. Además, pueden infectar tanto a células en división

como a las que no lo están (muy útil en experimentos in vivo). El riesgo de una

respuesta inmune está minimizado ya que no producen proteínas víricas. La

desventaja de estos vectores es que para producir partículas virales es necesaria la

cotransfección de las células empaquetadoras con un adenovirus o un herpesvirus.

Para separar las partículas virales deseadas de los virus auxiliares que se producen

en las células empaquetadoras, se hace una centrifugación en gradiente de densidad.

Vectores derivados de herpesvirus: los herpesvirus son una familia de virus de

animales poco conocida, cuyo genoma se compone de ADN bicatenario y lineal.

Infectan de forma específica a las neuronas, tanto a células quiescentes como en

división. No se integran en el genoma, por lo tanto, el gen transfectado se expresa

transitoriamente. La gran ventaja de estos vectores es el gran tamaño de su ADN,

que les permite aceptar grandes fragmentos genómicos, incluso genes con sus

propias regiones reguladoras.

En resumen, ¿para qué clonar en células eucariotas?:

1. Análisis de función génica y regulación: para demostrar que el promotor clonado

funciona in vivo en la célula. Se hacen ensayos de expresión transitoria, que

permiten conocer en qué célula se expresa el gen que es regulado por dicho

promotor, y en qué condiciones induce la expresión. Para lo cual, se clona la

secuencia reguladora (posible promotor) junto con un gen señal, por ejemplo el gen

GFP de la proteína fluorescente verde. Luego, se transfecta a células donde se

sospeche que puede expresarse el gen regulado por el supuesto promotor. Si las

células adquieren coloración verde, significa que se expresa el gen GFP junto con el

promotor, ya que en estas células se está expresando el gen regulado por el

promotor clonado. En cambio, si las células no cambian de color quiere decir que no

hay factores que permitan la transcripción del gen, debido a que ese tipo celular no

es el adecuado, o no se ha inducido correctamente.

2. Producción de proteínas de interés a nivel industrial: es un proceso lento y

costoso, y presenta importantes limitaciones. La integración del gen de interés, en el

genoma, es rara y aleatoria. Tampoco se puede controlar el número de copias del

inserto que se integran. La mayor parte del genoma no se expresa, y si el gen se

inserta en una de estas regiones no se expresará, pues no hay promotores. Y si se

integran muchas copias en una misma región del genoma puede haber efectos de

dosis, e inhibirse la expresión del gen.


Mutagénesis in vitro

Genética reversa y tipos de mutagénesis

La genética reversa, o genética inversa, es una disciplina genética que, partiendo del

conocimiento de un fragmento concreto de ADN clonado y/o secuenciado investiga sobre

su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación. El gen mutagenizado in

vitro se introduce en el organismo y se observa el fenotipo que produce, para poder

dilucidar la función de dicho gen.

En cambio, la genética clásica busca situar y clonar un determinado gen de interés

partiendo de individuos cuyo fenotipo es llamativo (generalmente mutantes). Para lo cual,

se producen mutaciones in vivo que conducen a fenotipos mutantes estables y heredables.

Estos fenotipos son analizados para llegar a conocer, como en el caso anterior, la función de

los genes que intervienen en la expresión de dichos caracteres fenotípicos.

En genética se denomina mutagénesis a la producción de mutaciones sobre ADN, clonado

o no. De realizarse in vitro, dicha alteración puede realizarse al azar (mutagénesis

aleatoria), sobre cualquier secuencia, o bien de forma dirigida (mutagénesis dirigida)

sobre una secuencia conocida y en la posición de interés. En el caso de realizarse in vivo,

sobre organismos y no sobre ADN clonado, se realiza a gran escala y sin conocimiento de

secuencia, empleando para ello sustancias denominadas mutágenos.

Para mutagenizar un fragmento de ADN clonado hay que conocer su secuencia, o al

menos tener un mapa de restricción detallado.

Mutagénesis aleatoria por deleción, inserción y sustitución

La mutagénesis aleatoria es una técnica que se utiliza en los laboratorios de investigación

para introducir cambio al azar en una secuencia de ADN. Las mutaciones que se generan

pueden ser por deleción, inserción y sustitución; y se pueden tratar de bases simples o de

agrupaciones de muchos nucleótidos.

Mutagénesis por deleción:

Se emplean dos enzimas de restricción distintas para digerir el fragmento clonado que está

incluido en el vector. El vector con el inserto delecionado se separa del otro fragmento

mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector (con parte del inserto) corresponde a la

banda que menos ha migrado, y el fragmento cortado del gen clonado corresponde a la

banda que más ha corrido en el gel. Se extrae el vector del gel y se pone en presencia de

ADN ligasa para que se circularice de nuevo, generándose un vector que porta un gen

clonado que ha perdido parte de su secuencia. Hay que tener en cuenta que, si las

restrictasas empleadas dejan extremos cohesivos no compatibles hay que usar la polimerasa

T4 en ausencia de dNTPs para que genere extremos romos, después se usará la ADN ligasa

para ligar el vector.

Pero, si en lugar de emplear dos enzimas de restricción sólo se usa una, ésta tendrá

que generar siempre extremos cohesivos. Luego, se usará otra enzima para dejar los

extremos romos, y después la ligasa recircularizará el vector. En este caso se produce la

deleción de un número de bases menor.

1100


Mutagénesis por inserción:

Se digiere el vector con una enzima de restricción que cortará el gen clonado, dejando

extremos cohesivos. Se añade una ADN polimerasa que rellene los huecos, y se generan

extremos romos, después, una ligasa recirculariza el vector. Finalmente, el vector con el

gen mutado se introduce en una bacteria, y se compara la proteína mutante que se produce

con la proteína del gen normal.

Otra opción para obtener mutantes por inserción es digerir el vector de ADN recombinante

con una ADNasa (que corta el ADN al azar), se hace en condiciones restrictivas para que

sólo ocurra un corte por molécula. De modo que, se obtiene una colección de fragmentos de

ADN, dependiendo de donde se haya producido el corte. Después, se añade un

oligonucleótido sintético en los extremos de las moléculas generadas. En presencia de la

enzima ADN ligasa se recircularizan las moléculas de vector. Cada molécula de ADN

recombinante presenta una mutación, por inserción de un oligonucleótido, en una región

distinta. Gracias a que el oligonucleótido sintetizado in vitro incluye una diana de

restricción en su interior, es posible mapear el sitio de restricción y conocer en qué región

se ha introducido la mutación.

E.R.

Vector con el gen

mutado por inserción

C G A A A A G C

G C T T T T C G

C G A A G C

G C T T C G

C G A A

G C

G C

T T C G

C G G C

G C C G

C G A A G C

G C T T C G

C G A A

G C

G C

T T C G

Usando sólo una enzima de restricción se consigue la deleción de un fragmento menor

Gel de agarosa

E.R. 1

E.R. 2

Vector con el

gen delecionado ADN ligasa


Mutagénesis por sustitución en vectores de cadena simple:

Mediante agentes químicos y/o enzimáticos se consigue mutagenizar el ADN clonado,

mediante la sustitución puntual de una base por otra distinta.

Por ejemplo, el bisulfito sódico (NaHSO3) es un agente químico que desamina la

citosina y la transforma en uracilo. Para estos experimentos se utiliza un vector de cadena

simple, habitualmente la serie M13 de vectores de bacteriófagos recombinantes. El

bacteriófago M13 contiene ADN circular de cadena sencilla (forma replicativa) que se

replica a ADN de cadena doble dentro de las células infectadas, por el mecanismo del

círculo rodante. Si se trata el vector M13 monohebra con bisulfito sódico se consigue que

las citosinas se transformen en uracilos. Estos uracilos pueden aparear con un

oligonucleótido adecuado, el cual sirve de cebador para sintetizar la cadena de ADN

complementaria. De este modo, se generan moléculas de vector que incluyen una mutación.

Del mismo modo, pueden usarse análogos de bases como el 5-bromouracilo (5BU), que en

su forma ceto, es análogo a la timina y, por ello, se aparea con la adenina; mientras que en

su forma enol (es decir, en su forma tautomérica), es análogo de la citosina y se aparea con

la guanina.

Cuando el vector M13 de cadena sencilla se replica a ADN duplexo en presencia de

5-bromouracilo, éste se incorpora en el ADN en lugar de la timina. Si el 5-bromouracilo se

tautomeriza a la forma enol, después de dos rondas de replicación, se produce una

transición A–T → G–C.

Mutagénesis por sustitución en vectores de cadena doble:

El vector de doble cadena, se digiere con una enzima de restricción en presencia de

bromuro de etidio (BrEt). El bromuro de etidio es un agente intercalante usado

comúnmente como marcador de ácidos nucleicos para procesos como la electroforesis en

5BU 5BU*

A A A

5BU*

G

T

A

5BU*

G

C

G

T

A

T

A

C U

NH2

AAA

UUU UUU

M13

CCC

NaHSO3

AAA

1 2

4 3

1 2 3 4

2 3 4 1

3 4 1 2

4 1

3 2

1 2

4 3

2 3

1 4


gel de agarosa. Además, en presencia de bromuro de etidio la restrictasa corta sólo en una

de las dos cadenas, es decir, produce mellas en la molécula de ADN. Si después se trata la

preparación con una exonucleasa se consigue extender la mella, por ejemplo con la

exonucleasa III de E. coli que elimina nucleótidos uno por uno desde el extremo 3'–OH.

Seguidamente, se añade un agente mutágeno, como por ejemplo el bisulfito sódico, que

produce mutaciones por sustitución de la citosina por uracilo. Después, una ADN

polimerasa añade nucleótidos en sentido 5'→3', y rellena el hueco. Por último, una ligasa

sellará el vector mutagenizado.

Mutagénesis dirigida

Un enfoque muy empleado en la mutagénesis in vitro es la mutagénesis dirigida.

Utilizando este método, podemos generar mutaciones en cualquier posición de un gen de

secuencia conocida. A partir de la secuencia, se sintetizan químicamente segmentos cortos

de ADN denominados oligonucleótidos, correspondientes a cualquier sitio escogido del

gen, al que pueden unirse mediante la hibridación entre cadenas sencillas de ADN.

Una de las aplicaciones de la mutagénesis dirigida es el estudio de la relación estructura-

función de una proteína. Las mutaciones se introducen en un punto muy concreto del

correspondiente ADN clonado. Se induce la expresión de la proteína y después se

comparan las propiedades de la forma salvaje y de la forma mutante.

Mutagénesis dirigida usando un oligonucleótido mutado y un vector monohebra:

El gen de interés se inserta en un vector de ADN de cadena sencilla, como el fago M13. Se

diseña un oligonucleótido portador de la mutación deseada y se permite que hibride con la

región complementaria del ADN clonado. El oligonucleótido actúa como cebador para la

síntesis in vitro de la cadena complementaria insertada en el vector M13. La mutación que

deseamos generar se programa en la secuencia del cebador sintético. A pesar de que las

bases mutadas están mal emparejadas, la hibridación del oligonucleótido sintético con el

ADN complementario se produce si se realiza a baja temperatura y con concentraciones

elevadas de sal.

CCC UUU

AAA

UUU CCC CCC

3'

NaHSO3

E.R.

BrEt

ADN Pol

Exo III


Una vez que la ADN polimerasa completa la síntesis in vitro, se deja replicar el ADN de

M13 en E. coli, obteniéndose así un gran número de fagos portadores de la mutación

deseada. Para distinguir entre los fagos mutantes y los silvestres es necesario hacer una

selección restrictiva. Por ejemplo, se puede utilizar el oligonucleótido marcado como

sonda. A temperatura baja, la base mal emparejada no impide que el cebador hibride con

ambos tipos de fagos; sin embargo a temperatura elevada, el cebador sólo hibridará con el

fago mutante.

Mutagénesis dirigida por inserción de un cassette:

Otra forma de mutagénesis dirigida es la sustitución de un fragmento de doble cadena por

un oligonucleótido sintético (denominado cassette) que incluya el cambio. Este método

permite introducir más mutaciones que otros métodos como el de PCR.

Se usan dos enzimas de restricción distintas que van a hacer una digestión parcial,

cortando el gen clonado, pero no el vector en el que está incluido. Después de cortar el

vector con las dos enzimas de restricción se obtiene un plásmido abierto, que se separa del

fragmento del gen clonado mediante electroforesis en gel de agarosa. Se extrae el vector del

gel, y se inserta el fragmento de ADN sintetizado in vitro en el vector linearizado. El

oligonucleótido sintético (que lleva incorporada la mutación) tiene extremos

complementarios a los generados en el vector digerido con las dos enzimas de restricción,

de este modo se consigue el ligamiento entre ambas moléculas de ADN.

Mutagénesis dirigida por PCR:

Es posible sintetizar oligonucleótidos con mutaciones, que pueden ser usados como

cebadores en reacciones de amplificación por PCR, lo que permite el enriquecimiento en el

gen mutante por el propio proceso de amplificación. En una primera ronda de PCR, se

utiliza un cebador portador de la mutación deseada. El producto de esta reacción se emplea

como cebador en una segunda ronda de PCR, cuyo

producto es el alelo mutante.

Se puede también añadir secuencias útiles, que

contengan por ejemplo uno o más sitios de restricción,

a los extremos 5' de los fragmentos amplificados. Los

cambios no se pueden introducir en el lado 3' de los

oligonucleótidos elegidos para realizar la PCR, porque

al no hibridar correctamente no produciría el cebado de

la cadena.

Gel de agarosa

E.R. 1

E.R. 2

ADN ligasa

Fragmento de ADN sintético

que contiene el cambio deseado

Plásmido con el

gen mutado

Plásmido de ADN

recombinante

Gen clonado


Inactivación de genes endógenos

La inactivación de genes en el organismo nos da información sobre la función de dichos

genes. Se pueden inactivar genes por recombinación homóloga, o usando moléculas de

ARN o ADN antisentido.

Inactivación de genes por recombinación homóloga:

Cuando se transfecta un cultivo celular con una molécula de ADN determinada, ésta se

integra, al azar, en cualquier punto del genoma por recombinación heteróloga. Pero,

mediante recombinación homóloga se puede obtener una inserción precisa (gene

targeting) y no aleatoria. Es decir, es posible reemplazar una secuencia por una secuencia

homóloga que diferirá de la original porque procede de otra especie o porque presenta una

mutación. La recombinación homóloga es más frecuente en plásmidos y en levaduras

(ocurre en una de cada 106 células transfectadas) que en eucariotas superiores. Pero, puesto

que la recombinación homóloga ocurre muy excepcionalmente, es necesario recurrir a

sistemas para favorecer la selección de las células transfectadas. Se pueden distinguir dos

sistemas de enriquecimiento de células transfectadas por recombinación homóloga:

Sistemas de selección positiva: dentro del gen clonado, se introduce un gen de

resistencia al antibiótico neomicina (neoR) sin promotor. Lo más probable es que el

fragmento de ADN clonado se integre en el genoma en cualquier punto al azar, y

por lo tanto, al no integrarse en una zona con el promotor adecuado no se expresará

el gen neo. Pero, si el fragmento clonado se integra en la región homóloga del

genoma, con el promotor del gen original, el gen neo se podrá expresar. Por lo

tanto, en presencia del antibiótico sólo sobrevivirán las células transfectadas en las

que se ha producido recombinación homóloga.

Sistemas de doble selección positiva-negativa: en este caso, se incluye el gen de

resistencia a neomicina con promotor en el interior del gen clonado, y el gen de la

timidina quinasa viral del herpes simple (tkhs+), también con su promotor, en un

extremo del gen clonado. Gracias a estos dos genes, se puede proceder a una doble

selección:

Positiva: cultivando las células en presencia de neomicina. Las células que

no han incorporado el gen neo, es decir, que no han incorporado el gen

clonado, son destruidas.


Negativa: cultivando las células en presencia de ganciclovir. El ganciclovir

es un análogo de la guanina que puede ser incorporado en un ADN en

proceso de síntesis siempre que sea fosforilado previamente por la proteína

tk del virus del herpes, y después di y trifosforilado por enzimas celulares.

Una vez en forma de trifosfato, bloquea la replicación y produce la muerte

celular. El ganciclovir destruye todas las células en las que se expresa el gen

tkhs, es decir, todas las que han incorporado al azar toda la construcción. Las

células en las que se produce el intercambio del gen normal por el gen

clonado no incorporan el gen tkhs (ya que sólo recombina la región cuyos

extremos son exactamente homólogos) y son, por tanto, resistentes al

ganciclovir.

En resumen, se seleccionan las células que son doblemente resistentes a la

neomicina y al ganciclovir, es decir, las que contienen el gen neo y que no contienen

el gen tk. Son las células en las que se ha producido la recombinación homóloga: el

gen original ha sido reemplazado por el gen exógeno. Las células que no han

integrado el gen exógeno o que lo han integrado al azar en su genoma son

destruidas.

La recombinación homóloga puede emplearse para inactivar un gen. Es una estrategia de

estudio de la función precisa de un gen ya que se pueden conocer y evaluar las

consecuencias anatómicas o fisiológicas debidas a la ausencia de la proteína codificada por

este gen. Esta técnica es particularmente útil en mamíferos para estudiar la función de los

genes de los que no existen mutantes espontáneos. Se usa para obtener ratones knock-out,

son ratones modificados por ingeniería genética para que uno o más de sus genes estén

inactivados mediante una técnica llamada gene knockout. Inactivando el gen y estudiando

las diferencias que presenta el ratón afectado, los investigadores pueden inferir la probable

función de ese gen. El ratón es el organismo modelo más próximo a los seres humanos en el

que esta técnica se puede realizar con facilidad.

Existen algunas variaciones sobre el procedimiento para producir ratones knockout,

siendo el siguiente el ejemplo más habitual:

1. Se aísla el gen que se desea sustituir a partir de una genoteca de ratón.

Posteriormente se diseña una nueva secuencia de ADN muy parecida al gen

original, salvo que está cambiada lo suficiente para hacerla inoperante.

Normalmente también se incluye en la nueva secuencia genes marcadores (p.ej. gen

neoR y gen de la timidina quinasa del herpesvirus), que los ratones normales no


poseen y que les confieren resistencia a ciertos agentes tóxicos. Las oportunidades

de un suceso de recombinación con éxito son relativamente bajas, de modo que la

mayoría de las células alteradas tienen cambiado sólo uno de ambos cromosomas.

se dice que son heterocigotos.

2. A partir de un blastocisto de ratón (un embrión muy temprano que está formado por

una masa esférica de células indiferenciadas rodeada de células extraembrionarias)

se aíslan las células madre; después se cultivan in vitro. Como ejemplo, tomaremos

una célula madre de un ratón blanco.

3. Las células madre del paso 2 se combinan con la nueva secuencia del paso 1. Esto

se realiza mediante electroporación (empleando un pulso eléctrico para transferir

ADN a través de la membrana celular). Algunas de las células madre electroporadas

incorporarán la nueva secuencia en el lugar en el que el gen antiguo estaba en su

cromosoma, es decir, ocurre recombinación homóloga. La razón por la que tiene

lugar este proceso es que ambas secuencias, la vieja y la nueva, son muy similares.

Utilizando los genes marcadores del paso 1, se puede aislar rápidamente las células

que han incorporado la nueva secuencia, mediante el proceso de doble selección

positiva-negativa con neomicina y ganciclovir.

4. Las células madre del paso 3 se insertan en un blastocisto de ratón. En este caso

utilizamos blastocistos de ratón pardo. Estos blastocistos se implantan en el útero de

una madre adoptiva (denominada pseudopreñada, pues fue apareada previamente

con un macho estéril), para llevar a término la gestación. Los blastocistos contienen

dos tipos de células madre: las originales (ratón gris) y las modificadas (ratón

blanco). El ratón neonato será por tanto una quimera genética: parte del cuerpo

provendrá de las células madre originales y parte de las células modificadas. El

pelaje también mostrará zonas blancas sobre pardo.

5. Los ratones neonatos sólo serán útiles si la secuencia ha sido incorporada a la línea

germinal. Estos ratones se cruzan con otros del tipo blanco para obtener una

progenie completamente blanca. Estos ratones aún contienen una copia funcional

del gen y tienen que someterse a cruzamiento endógamo para producir un ratón que

no lleve ninguna copia funcional del gen original (es decir, que sea homocigótico

para ese alelo).


Inactivación de genes por ARN o ADN antisentido:

Moléculas que hibridan con ARN mensajeros específicos pueden inactivar genes

selectivamente. Los oligodesoxinucleótidos antisentido son los instrumentos más utilizados

para alterar la transcripción del ARNm. Éstas son secuencias nucleótidas cortas,

sintetizadas como complementos inversos exactos del ARNm diana, con el cual hibridan.

El dúplex resultante interferirá en la traducción ribosómica y tendrá como diana de

destrucción al ARNm.

Producción de ARN antisentido. Se inserta un gen, o una parte del mismo, en un vector mediante clonación

direccional en el lado 3' de un promotor y con orientación inversa a la normalmente presente en la célula de

origen. La transfección de este ADN recombinante en la célula paterna que lleva el gen normal, da lugar a la

transcripción de ARN a partir del ADN con polaridad inversa (ARN antisentido), junto con un tránscrito de

ARNm de la celular normal (ARN con sentido). Los dos ARN complementarios antiparalelos se pueden

hibridar dentro de la célula bloqueando la expresión (traducción) del tránscrito de ARNm normal.

5' 3'

3' 5'

Promotor T3

ARN polimerasa

del fago T3 5' 3'

ARNm funcional

3' 5'

ARNm antisentido

Transcripción del gen

de la cadena de ADN

complementaria

(cadena antisentido)

El ARN antisentido

hibrida con el ARN con

sentido bloqueando la

traducción del ARNm

Vector de expresión

recombinante

transfectado en la célula

Gen normal


La inhibición de la expresión genética puede obtenerse en el ámbito de la transcripción o en

el de la traducción. La inhibición de la expresión de los genes al nivel de la traducción suele

conllevar interferencia con el ARNm. El mensaje antisentido puede ser ADN o ARN, y

puede ser introducido en la célula diana o expresado in situ desde un vector vírico o un

plásmido transfectado. Mediante complementación inversa, el mensaje antisentido se

hibridará con el ARNm diana y el dúplex resultante convertirá el mensaje ARNm en

ilegible por el complejo ribosómico. Ciertas enfermedades podrían ser tratadas con estas

moléculas, por ejemplo, se ha conseguido en células tumorales revertir el fenotipo tumoral

a célula normal.

También, inyectando oligonucleótidos complementarios adyacentes al inicio de la

traducción (AUG) se consigue bloquear la expresión.


Aplicaciones en genética humana

Aplicaciones al diagnóstico clínico

Las técnicas de ingeniería genética se pueden aplicar en la medicina para determinar el

agente infeccioso, o para localizar el desorden genético, responsable de una enfermedad.

Existen varios tipos de metodologías básicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades:

Basadas en técnicas de hibridación de ácidos nucleicos: en este caso, lo que se

requiere es una copia física del gen, que va a actuar como sonda. En el caso de una

infección, serán secuencias únicas del agente infeccioso y que no sean comunes;

mientras que en el caso de un desorden, es el gen causante del trastorno genético.

Basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): no es preciso la

presencia de sondas, pero si es necesario conocer la secuencia nucleotídica de los

cebadores empleados.

Basadas en técnicas de secuenciación.

Detección de agentes infecciosos por hibridación:

Se emplea la técnica de Dot-Blot. Para este análisis se requieren sondas de regiones

genómicas de los microorganismos infecciosos, y ADN del cultivo de muestra del paciente

infectado.

El ADN del paciente se inmoviliza en forma de puntos (dot) en una membrana.

Luego, se añade la sonda marcada de cada patógeno. Se deja incubar y, tras el revelado, si

da positivo, es que la enfermedad del paciente es causada por el patógeno en cuestión.

También se puede inmovilizar el ADN del patógeno en la membrana e hibridarla

con el ADN muestra del paciente.

Diagnóstico de enfermedades genéticas por hibridación:

Si el gen clonado muestra polimorfismo entre los alelos que determinan fenotipo normal y

fenotipo enfermo, se puede poner de manifiesto la enfermedad por medio de los RFLPs

(polimorfismo para la longitud de fragmentos de restricción).

Por ejemplo, en el caso de la anemia falciforme se emplea el gen de la β–globina para el

análisis de esta enfermedad. En este gen existen dianas para las enzimas de restricción

MstII y DdeI. Mientras que, en el gen mutado (responsable de la patología) estas dianas se

han perdido.

Si se digiere el ADN de la muestra del paciente, con la enzima de restricción MstII,

se realiza un Southern Blot y se hibrida con la sonda del gen de la β–globina, se observan

dos bandas en los pacientes sanos, y una sola banda en los pacientes con anemia falciforme.

1111


Para diagnosticar la anemia falciforme también se puede utilizar un marcador ligado. En

este caso, se estudia el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción HpaI

adyacente al gen de la β–globina.

Diagnóstico de enfermedades infecciosas por PCR:

Se requiere el diseño de oligonucleótidos que amplifiquen regiones específicas del

patógeno.

Se extrae ADN de sangre, vello coriónico o de una gota de saliva del paciente, y se

utiliza en una reacción de PCR con los oligonucleótidos específicos del patógeno (que

servirán de cebadores en la reacción de PCR).

La detección de una infección viral activa (por ejemplo, infección por HIV) requiere

análisis de RT-PCR.

Diagnóstico de enfermedades genéticas por PCR:

Por ejemplo, se estudiará el caso de la hemofilia A. Se trata de una enfermedad hereditaria,

caracterizada por una deficiencia en el factor VIII de coagulación, resultando sangrados

No

rmal

En

ferm

o Diana para DdeI Diana para MstII

----GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAG---- β-globina normal

Se pierden las dianas para las enzimas

----GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG---- β-globina alterada


anormales de los pacientes. La enfermedad está causada por un rasgo recesivo ubicado en el

segmento diferencial del cromosoma X. Debido a que el gen defectuoso está localizado en

el cromosoma X, la enfermedad es mucho más común en los varones.

Localización y organización genómica del gen FVIII

El gen del factor VIII consta de 26 exones. En el intrón 22 hay dos genes (F8A y F8B), y el

primero tiene dos copias altamente homólogas en la región telomérica distal a 400 Kb del

gen FVIII.

Mecanismo de formación de la inversión del intrón 22 del gen FVIII

En la meiosis masculina en ausencia del cromosoma homólogo pueden ocurrir

recombinaciones desiguales entre el gen F8A intrónico y sus homólogos teloméricos, y se

produce una inversión, responsable del déficit de factor VIII. En las personas en las que ha

ocurrido la inversión se observa una banda más pequeña que en las personas sanas.

Estrategia de PCR de fragmentos largos para la detección de la inversión del intrón 22


Diagnóstico genético preimplantatorio (DGP):

El diagnóstico genético preimplantatorio, o preimplantacional, es el estudio del ADN de

embriones humanos para seleccionar los que cumplen determinadas características y/o

eliminar los que portan algún tipo de defecto congénito. Esta técnica nos permite examinar

genéticamente embriones obtenidos a través de fecundación in vitro, para establecer un

diagnóstico de salud genética en el embrión antes de ser transferido al útero materno.

Situaciones susceptibles de DGP:

En la selección de sexo para evitar enfermedades hereditarias ligadas a los

cromosomas sexuales (p. ej. hemofilia).

En casos de enfermedades monogénicas (p. ej. fibrosis quística, distrofia muscular

de Duchenne).

En casos de mujeres de edad avanzada con mayor riesgo de embarazos con

Síndrome de Down.

En casos de parejas con múltiples abortos como consecuencia de alteraciones

cromosómicas de sus embriones.

Cuando los padres presentan alteraciones cromosómicas en sus cariotipos.

La técnica consiste en extraer por aspiración una de las 8 células

del embrión de tres días de desarrollo, cuando estas son

pluripotenciales. Una vez realizada la biopsia, el embrión se

devuelve al incubador del laboratorio y se mantiene en el cultivo

in vitro con las condiciones adecuadas para que siga su normal

desarrollo hasta el momento de la transferencia al útero.

La localización de anormalidades cromosómicas en el

embrión se hace por FISH o por PCR (48 horas). La hibridación

fluorescente in situ (FISH) utiliza moléculas fluorescentes para

localizar genes o fragmentos de ADN.

Al quinto día los embriones diagnosticados como normales son transferidos al útero

de la paciente.

Terapia génica

La caracterización a nivel génico y proteico de un gran número de desórdenes hereditarios

ha abierto la posibilidad de que estos defectos puedan ser corregidos a nivel molecular.

La terapia génica consiste en la inserción de una copia funcional normal de un gen

defectivo, o ausente en el genoma de un individuo, en las células de los tejidos del

individuo con el objetivo de restaurar la función normal del tejido y así eliminar los

síntomas de la enfermedad.

Embrión con trisomía 21. El núcleo se

ha hibridado con sondas para los

cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y

tiene claramente tres señales rojas.


Puede implicar modificaciones genéticas de las células del paciente (terapia génica in vivo)

o la modificación de las células cultivadas que son posteriormente reintroducidas en el

paciente (terapia génica ex vivo).

In vivo: en este caso, al individuo se le hace llegar ADN modificado por varios

métodos, como la suministración en aerosoles para transfectar células respiratorias,

inyecciones o el bombardeo.

Ex vivo: está en fase experimental y consiste en corregir las células para modificar

al individuo enfermo. Para ello, se hace un cultivo in vitro de las células del

paciente y se las modifica por vectores virales del tipo retrovirus que poseen el gen

normal. Con ello, se tienen células enfermas y células sanas, siendo estas últimas las

que se aplican en el paciente para que se vuelva un individuo sano.


La inmunodeficiencia severa combinada fue la primera enfermedad en la que se usó la

terapia génica. Las personas afectadas por el síndrome de la inmunodeficiencia severa

combinada no tienen un sistema inmunitario funcional y normalmente mueren de

infecciones leves. Se debe a un defecto en el gen que codifica la enzima adenosina

desaminasa (ADA). Debido a la ausencia de la enzima adenosina desaminasa se acumulan

adenosina y 2’adenosin trifosfato en la sangre, que destruyen los linfocitos T.

En este caso, la terapia génica comienza con el aislamiento de células T. Estas células, que

forman parte del sistema inmunitario, se mezclan con el vector retrovírico que lleva una

copia del gen ADA normal insertada. Luego, se usa un virus que infecta muchas de las

células T, y una copia normal del gen ADA se inserta en el genoma de algunas de ellas.

Después de mezclar estas células con el vector y de producirse la infección, las células T se

cultivan en el laboratorio y se analizan para asegurar que el gen ADA transferido se está

expresando. El último paso de esta terapia génica es la inyección de millones de estas

células T, genéticamente modificadas, en el torrente sanguíneo del paciente. Algunas de

estas células T emigrarán hasta la médula ósea, y empezarán a dividirse y a producir ADA.

Para desórdenes en los que la mutación provoca una ganancia de función dominante, la

adición de la copia del gen normal no resulta ventajosa. En estos casos la corrección de la

anomalía implica la sustitución del gen endógeno (todavía ineficiente en la práctica). Por

ello, se recurre a métodos que utilizan ácidos nucleicos para inhibir la expresión génica:

ARN antisentido.

Esto tiene importantes aplicaciones en la terapia del cáncer. Utilizando ARN antisentido se

ha conseguido la inhibición de oncogenes. Consiste en bloquear la expresión del oncogén

mediante moléculas de ADN y ARN antisentido, que impiden que el ARN sea traducido a

proteínas, que el ADN sea traducido a ARN o que la expresión del oncogén salga de la

célula.


Para revertir tumores también se usan sistemas asesino-suicidas condicionales. Se

requieren vectores retrovirales con el gen tkhs+ (timidina quinasa viral del herpes simple),

de modo que, las células tumorales transfectadas morirán en presencia de ganciclovir.

Las células T específicas de tumor (de pulmón, en este caso) son recubiertas con vectores retrovirales en su

superficie, además estas células se rodean con glucosaminoglucanos heparán sulfato (HSG), que protegen el

vector del reconocimiento inmunológico. Las células T transformadas se inyectan, en ratones portadores de

tumor, directamente al pulmón. En el tumor pulmonar, las enzimas –producidas por las células tumorales y

por las células T después de la activación por el antígeno tumoral– digieren la cubierta de HSG y el vector es

liberado. El vector transfecta las células tumorales y expresa su transgén (por ejemplo, el gen de la timidina

quinasa viral del herpes simple). La administración de ganciclovir resulta en la destrucción de los tumores

que expresan la timidina quinasa. Iniciando una respuesta inflamatoria que resulta en la activación adicional

de las células T específicas de tumor, causando la muerte de las células tumorales restantes. Estas células T

también dan lugar a células memoria y proporcionan una protección contra la reexposición con las células

tumorales.


Medicina forense

Aunque los individuos de la misma especie comparten el mismo genoma básico, existen

diferencias entre genomas individuales basadas en unas secuencias muy polimórficas

(hipervariables) para las que existen muchos alelos distintos. Estas secuencias pueden ser

de dos tipos, minisatélite y microsatélite.

Las técnicas de DNA fingerprinting (huella genética) ponen de manifiesto estas

diferencias entre individuos.

Análisis de minisatélites:

Los minisatélites son secuencias repetidas en tándem (10-100 kb) que se encuentran en

distintas posiciones en el genoma (multilocus). El número de unidades repetidas por locus

es variable entre individuos.

El análisis consiste en hacer un Southern-blot y usar sondas específicas para detectar

los VNTR (repeticiones en tándem de número variable). En primer lugar el ADN que se va

a analizar debe cortarse en fragmentos de diferentes tamaños usando enzimas de restricción,

los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Y después se añade la

sonda específica marcada. Este proceso termina generando un patrón de bandas de ADN

característico de cada individuo, ya que los VNTRs son únicos para cada persona.

En otras ocasiones la sonda utilizada permite identificar una única región genómica

(unilocus) hipervariable.

Sonda multilocus Sonda unilocus


Análisis de microsatélites:

Los microsatélites son secuencias repetidas menores de 200 pb con unidades de repetición

muy cortas (1-4 pb) que se amplifican desde el ADN de los individuos por la técnica de

PCR.

Al contrario que en el caso anterior, los análisis de microsatélites son técnicas

unilocus, dado que se analiza, cada vez, un único locus. El principio de la variabilidad es el

mismo que el de minisatélites, pero las secuencias flanqueantes son iguales en toda la

población, por lo que se busca manifestar el polimorfismo por amplificación y determinar

su tamaño. Para este cometido, se diseñan oligonucleótidos con las secuencias flanqueantes

(que serán los cebadores de la PCR y estarán marcados con fluorocromos) y se realiza una

PCR. Tras esto, se introducen en un carril de un gel de electroforesis. Al final, se revela o

se tiñe el gel y se observan los resultados.

Las pruebas de paternidad genética se basan en comparar el ADN nuclear entre un niño y

su presunto padre, para aprobar o desaprobar la relación de parentesco. El ser humano al

tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y otro del padre, por lo tanto, un hijo

debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta prueba se realiza

comparando entre 13 y 19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y de la madre, en

regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STR (short tandem repeat).

Proyectos genoma

Los proyectos genoma incluyen toda una serie de iniciativas internacionales apoyadas por

numerosos grupos de investigación que trabajan coordinadamente en la obtención de la

secuencia completa del genoma de una especie.

Diversos consorcios públicos han conseguido hasta la fecha la secuenciación de

numerosos genomas procariotas, mitocondriales y eucariotas.


Especie Tamaño del genoma (Mb) Número de genes

Saccharomyces cerevisiae 12 5.800

Drosophila melanogaster 180 13.700

Caenorhabditis elegans 97 19.000

Arabidopsis thaliana 125 25.500

Homo sapiens 3.000 27.000

Contenido en genes y tamaño del genoma de varios organismos

El Proyecto Genoma Humano (PGH) es un proyecto internacional de investigación

científica con el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases que

componen el ADN e identificar y cartografiar los aproximadamente 25.000 genes del

genoma humano desde un punto de vista físico y funcional. La principal justificación del

PGH fue la promesa de avances importantes en medicina.

El Proyecto constituía el programa de investigación más ambicioso llevado a cabo

nunca en la biología: obtener el mapa de la secuencia genética completa del ser humano.

Tal empresa sería realizada por el llamado Consorcio Público Internacional, una entidad

formada por veinte laboratorios públicos de investigación de Estados Unidos, Reino Unido,

Francia, Alemania, Japón y China.

El Consorcio Público contaba inicialmente para desarrollar el Proyecto Genoma con

3.000 millones de dólares. El consorcio fue liderado inicialmente por el científico James

Watson (codescubridor de la doble hélice). El objetivo principal era determinar la secuencia

completa del ser humano leyendo los 3.000 millones de bases químicas de la cadena de

ADN. La metodología que se utilizaría, la secuenciación clon a clon, era una aproximación

laboriosa pero segura. La estrategia clon a clon de secuenciación consistía en fragmentar el

genoma en pedazos de unos 150.000 pares de bases. A partir de mapas genéticos

elaborados previamente se sitúan los fragmentos en las regiones del genoma. Los

fragmentos se vuelven a cortar, hasta 500 pb, y se superponen. Los fragmentos solapantes

que maximizan la longitud de superposición se secuencian. Por último se ensambla la

secuencia a través de las superposiciones sucesivas obtenidas en la etapa previa.

Ocho años más tarde del inicio del Proyecto, en 1998, apareció en escena una empresa

privada: Celera Genomics y a su cabeza Craig J. Venter. Venter lanzó el reto de obtener la

secuencia del genoma humano en un tiempo récord, antes que el Consorcio Público.

Utilizando para ello la estrategia de secuenciación del perdigonazo, o Shotgun, que está

basada en la fuerza bruta que supone disponer de una gran capacidad de secuenciación y de

cómputo informático. Se fragmenta al azar todo el genoma en pedazos que serán


secuenciados varias veces y posteriormente

ensamblados por potentísimos ordenadores

hasta obtener la secuencia borrador de todo el

genoma.

Al reto de Venter el Consorcio Público

reacciono doblando el presupuesto destinado a

los principales centros de secuenciación.

Paralelamente se iniciaron y terminaron

distintos proyectos de secuenciación de

organismos completos, los denominados

organismos modelos como el genoma de la

bacteria Escherichia coli, o determinados

eucariotas como la levadura Saccaromyces

cerevisiae, el gusano Caenorhabditis elegans, o

la mosca del vinagre Drosophila melanogaster

entre otros.

Debido a la amplia colaboración internacional, a los avances en el campo de la

genómica, así como los avances en la tecnología computacional, un borrador inicial del

genoma fue terminado en el año 2001, finalmente el genoma completo fue presentado en

abril del 2003, dos años antes de lo esperado.

Características principales del genoma humano:

Nuestro genoma contiene un número de genes bastante menor a lo esperado, entre

25.000 y 30.000 genes. Este es un número ligeramente superior al del gusano C.

elegans e incluso menor que el del genoma del arroz. Esta aparente paradoja indica

que son las interacciones entre los productos génicos, más que el número de genes

per se, lo que explicaría la complejidad morfológica y funcional.

El genoma humano tiene más de 3.000 millones de nucleótidos, pero sólo un 3%

codifica proteínas, el resto, la inmensa mayoría, parece no tener función.

El 50% de este ADN no codificante son secuencias repetitivas que derivan de

elementos transponibles.

Los genes no se distribuyen uniformemente por los cromosomas.

El número de intrones en los genes humanos varía desde 0 (en los genes de las

histonas) hasta 234 (el gen de la titina).

Cada persona comparte un 99,9% del mismo código genético con el resto de los

seres humanos.

La principal fuente de variabilidad en el genoma humano se corresponde a 3

millones de bases de la secuencia. Las variaciones entre dos personas en un sólo

nucleótido se conocen como SNPs (single nucleotide polimorphisms), en estas

variaciones se centra la mayor parte de los estudios.

Aplicaciones del conocimiento de la secuencia del genoma humano:

Técnicas de identificación forense.

Técnicas de diagnóstico de enfermedades: incluso mucho antes de que se

manifiesten. Ya hay unos 11.000 genes identificados relacionados con

enfermedades.

Diagnóstico Genético Preimplantacional.

Terapias génicas.

Ensamblaje de las secuencias por ordenador


Aplicaciones en biología animal y vegetal

Un organismo transgénico es aquel que ha sido modificado mediante la adición de genes

exógenos para conferirle nuevas propiedades. Se conoce como transgénesis al proceso de transferir genes en un organismo. La

transgénesis se usa actualmente para hacer plantas y animales transgénicos.

Obtención de plantas transgénicas

La mejora genéticas de las plantas ha sido una tarea lenta y difícil, pero la tecnología del

ADN recombinante promete cambios revolucionarios. Hoy en día es posible utilizar

técnicas genéticas in vitro para modificar un ADN vegetal y, a continuación, transformar

las células vegetales con ADN libre mediante: electroporación, por el método del

disparador de partículas, o utilizando vectores procedentes de Agrobacterium tumefaciens.

Es posible utilizar técnicas de cultivo de tejidos vegetales para seleccionar clones de

células vegetales que hayan sido genéticamente alteradas utilizando técnicas in vitro y, a

continuación, mediante tratamientos adecuados, inducir estos cultivos celulares a que

produzcan plantas complejas que puedan propagarse de forma vegetativa o por semillas.

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La bacteria fitopatógena gram-negativa de dicotiledóneas Agrobacterium tumefaciens

contienen un gran plásmido, plásmido Ti, que es responsable de su virulencia. El plásmido

contiene genes que movilizan el ADN para transferirlo a la planta. El segmento de ADN del

plásmido Ti que se transfiere a la planta recibe el nombre de T-DNA. Las secuencias de los

extremos del T-DNA son esenciales para la transferencia y el ADN que se va a transferir

debe estar entre estos extremos. Se sustituye la región del plásmido que produce el tumor, o

agalla de la corona, por el gen de interés.

Se ha construido un tipo de vector que se utiliza para transferir genes a plantas y se

denomina vector binario. Este vector contiene dos extremos del T-DNA a cada lado del

sitio que utiliza para la clonación, así como algún gen marcador de resistencia a antibióticos

que puede utilizarse en plantas. También contiene un origen de replicación que puede

replicarse tanto en Agrobacterium tumefaciens como en Escherichia coli, así como otro

marcador de resistencia a los antibióticos que se expresa en la bacteria. El ADN que debe

clonarse se inserta en el vector, que a continuación se transforma en Escherichia coli. Acto

seguido se transfiere a Agrobacterium tumefaciens.

Este vector de clonación no contiene los genes necesarios para transferir el T-DNA a una

planta, por lo que la bacteria Agrobacterium tumefaciens en la que se trasfiera debe

contener el otro miembro del sistema del vector binario. Este otro plásmido contiene la

región de virulencia (vir) de un plásmido Ti, pero está “desarmado”.

Aunque puede dirigir la transferencia de ADN en una planta, ya no tiene genes que

provoquen una enfermedad. Este plásmido desarmado, D-Ti, proporcionará todos los genes

necesarios para transferir el T-DNA desde el vector de clonación. El ADN clonado y el


marcador de resistencia a la kanamicina del vector pueden movilizarse mediante el

plásmido D-Ti y transferirse a una célula vegetal. Tras la recombinación con un

cromosoma del hospedador, el ADN foráneo puede expresarse y conferir así nuevas

propiedades a la planta. Muchos genes no se expresan de manera eficaz en las plantas, a

menos que se clonen en un vector de expresión que contenga un promotor vegetal.

El uso de Agrobacterium tumefaciens ha permitido la creación de varias plantas

transgénicas. Bien es verdad que se han obtenido más éxitos con plantas herbáceas

(dicotiledóneas) tales como el tomate, la patata, el tabaco, la soja, la alfalfa y el algodón,

pero Agrobacterium tumefaciens también se ha utilizado con dicotiledóneas leñosas como

pueden ser el nogal o el manzano. Los cultivos de plantas transgénicas de la familia de las

gramíneas (monocotiledóneas) han sido más difíciles de generar utilizando Agrobacterium

tumefaciens, pero parece que puede conseguirse buenos resultados con otros métodos de

introducción del ADN, como es inyección balística del ADN.

Las técnicas de biobalística emplean microesferas de oro o tungsteno, que se recubren del

ADN con el gen deseado, y se disparan a gran velocidad con una pistola, o cañón, de genes.

Las células en la línea directa del proyectil pueden morir, pero a su alrededor muchas

células captan el ADN sin daños.

Después, se induce la regeneración de la planta adulta a partir de los protoplastos o

de las células tratadas. Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema. Sirve

para plantas que son más difíciles de cultivarse sus tejidos (cereales, leguminosas), aunque

tiene el inconveniente de que el ADN puede insertarse en copias, y puede ser inestable. El

bombardeo de microproyectiles presenta el mayor potencial para la transformación de

cereales. Por medio de esta técnica se han obtenido plantas transgénicas en

monocotiledóneas como maíz, arroz, trigo, avena y caña de azúcar.

Aplicaciones de la biotecnología vegetal:

Resistencia a herbicidas: se han desarrollado plantas transgénicas a partir de genes

de bacterias resistentes a herbicida. Así cuando se pulveriza un cultivo con

herbicidas sólo mueren las malas hierbas y no las plantas cultivadas.

Resistencia a plagas y a enfermedades: por ejemplo, se utiliza el gen de la proteína

tóxica de Bacillus thuringiensis. Esta bacteria produce una proteína cristalina,

llamada toxina Bt, que es tóxica para las larvas de las polillas y de las mariposas.

Mejoras de las propiedades nutritivas.

Resistencia a sequía y frío (estrés abiótico).

Otras aplicaciones: producción de variedades coloreadas, plantas transgénicas

productoras de vacunas, etc…

Planta

sensible

Planta

resistente A partir de las células transformadas

se obtienen plantas adultas

Las células que incorporan

el plásmido crecen en un

medio especial o selectivo

Partes de la planta se ponen en contacto

con las bacterias en medio de cultivo


Clonación animal

¿Qué entendemos por clonación animal? La obtención de uno o de varios individuos, bien

sea a partir de una célula (diferenciada o indiferenciada), o simplemente, a partir de un

núcleo. De modo que, los individuos clonados son idénticos o casi idénticos al original.

El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y

por tanto morfológica y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. Se pueden

utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:

Disgregación de células embrionarias: se basa en el mismo principio por el que

nacen gemelos de forma natural. Se pueden separar las células de un embrión en

diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de

mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede

desarrollarse para dar un individuo completo.

Transferencia nuclear: se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula,

obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro, y después se transfieren a ovocitos a

los que se les ha quitado el núcleo.

Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la

célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a

funcionar como un zigoto.

Cuanto más diferenciadas estén las células donantes de material genético, más difícil es

conseguir la reprogramación de dicho material genético para que pueda iniciar la

diferenciación de la célula receptora. Actualmente es posible obtener clones de células

totalmente diferenciadas de un animal adulto que actúan como donantes de su material

genético, como ocurrió en el caso de la famosa oveja Dolly.

La eficiencia de clonación a partir de un animal adulto es muy baja, lo que limita su

aplicación en la industria agropecuaria.


Aplicaciones de la clonación animal:

Mejoramiento genético.

Conservación de especies silvestres en peligro de extinción.

Producción de animales transgénicos:

o Productores de fármacos por sangre, leche u orina (p. ej. factor de

coagulación IX humano).

o Producción de órganos de cerdo para xenotransplantes.

o Producción de animales resistentes a enfermedades.

Transgénesis en animales

Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgén, se introduce en zigotos, y

los embriones que hayan integrado el ADN exógeno en su genoma, previamente a la

primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a

las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos).

La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas:

Transgénesis por microinyección de cigotos: en la primera fase, se aíslan un

número grande de óvulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un

tratamiento hormonal para provocar una superovulación. La fertilización puede

hacerse in vitro o in vivo. En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan

uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, y se introduce una solución que

contiene ADN. En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que

actuarán como nodrizas permitiendo la gestación hasta término. Por último, tras el

destete de los recién nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la

incorporación del transgén.

Transgénesis por manipulación de células embrionarias: una estrategia más

poderosa para la transgénesis implica la introducción de ADN extraño en células

embrionarias totipotentes (células ES) o células embrionarias madres (células EM).

Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio

donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no

se diferencien, y se mantiene su estado embrionario. El ADN extraño se introduce

en las células ES, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas en una

blástula y ésta reimplantada en una hembra.

Con esta técnica los neonatos son quimeras, es decir, tienen células de origen

distinto, parte con el material genético original y parte transfectadas; pero mediante

el cruce de éstas con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su

línea germinal se consiguen animales transgénicos.

fundamentos de genética aplicada

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