fragmentación del adn espermático: su dinámica en el tiempo y la importancia de … ·...

asistida (FIV o ICSI), ya que la calidad del esper-matozoide que se utiliza requiere un control mu-cho más delicado.

La transferencia de la molécula de ADN (ínte-gra e intacta) del espermatozoide al ovocito escrucial para conseguir una fecundación con cier-tas perspectivas de éxito. Como postuló el DrJuan Álvarez (La Coruña, España): “Si nos pre-guntamos cuál es la función principal del esperma-tozoide, creo que todos estaríamos de acuerdo en quees la de introducir el ADN intacto dentro del ovo-cito. El ADN espermático es el manual de instruc-ciones del genoma paterno; una vez que se fusionacon el del ovocito dará lugar al genoma o manualde instrucciones del embrión, responsable de poneren marcha el desarrollo embrionario y fetal”. Sinembargo, no existe una tecnología rápida paraanalizar la calidad del ADN de los espermatozoi-des que se pueda utilizar con la misma facilidadcon que la que se procede para estudiar, por ejem-plo, la motilidad. En este sentido, se sabe que lapresencia de defectos en el material genético, ta-les como anomalías en la condensación de la cro-matina, la integridad de la molécula de ADNasociada con la presencia de roturas tanto de do-ble como de simple cadena o la presencia de ano-malías cromosómicas, se asocian estrechamentecon la infertilidad.8

En cuanto al origen del daño en el ADN del es-permatozoide, se sabe que tiene una naturalezamultifactorial. Por ejemplo, la generación de ra-dicales libres de oxígeno (ROS) 2,4 en casos de leu-cocitospermia, tabaquismo, varicocele, edadavanzada y circunstancias ambientales como ex-posición a altas temperaturas o pesticidas, pueden

Actualización •

Como es de universal conocimiento, para el es-tudio de la infertilidad masculina se han estable-cido una serie de parámetros que se deben anali-zar de forma rutinaria en un laboratorio básico deandrología.1 Estos son, el volumen del eyaculado,el pH, la concentración de espermatozoides, lamotilidad y la morfología. Los parámetros semi-nales alterados y las roturas en el ADN nuclearestán en estrecha asociación en humanos y su es-tudio ha merecido la atención en los últimosaños. Se sabe, por ejemplo, que la fragmentacióndel material genético del espermatozoide es ma-yor en pacientes diagnosticados de oligoteratoas-tenozoospermia.2-5 Gandini y col,6 estudiando larelación entre apoptosis y parámetros seminales,también demostraron que un incremento de lafragmentación estaba relacionado con una dismi-nución de la concentración espermática y motili-dad. Esta correlación se observó también con lamorfología. Los gametos que mostraban roturasen su ADN presentaban cabezas pequeñas yamorfas.

Sin embargo, se estima que aproximadamenteun 15% de los varones estériles presentan un es-permograma normal.7 Es decir, existe una pobla-ción de hombres con problemas reproductivosque muestran características de concentración,movilidad y morfología normales. Cabe pensarentonces que muchas veces los parámetros semi-nales no son del todo indicativos de la calidad delespermatozoide. La situación es mucho más críti-ca cuando se utilizan técnicas de reproducción

Fragmentación del ADN espermático: su dinámica en el tiempo y la importancia deir más allá de lo evidente M Agustina González Torres,1 Vanesa Rawe 1,2

1 REPROTEC, Buenos Aires, Argentina. 2 CREA, Medicina de la Reproducción, Valencia, España. Reproducción 2010;25:185-191

Correspondencia: Vanesa RaweE-mail: [email protected]

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res de las señales de apoptosis que dan lugar a lamuerte celular programada. Hasta la fecha se hanidentificado más de 14 tipos de caspasas que sehan dividido en dos familias. Las caspasas -2,-3,-6,-7,-8,-9 y -10 median señales de apoptosis y lascaspasas -1,-4,-5,-11 y -12 regulan citokinas du-rante procesos inflamatorios. Aunque la mayoríade ellas se sitúan en el citoplasma, algunos miem-bros pueden ser encontrados en asociación conlas mitocondrias (-2,-3,-9) y en el aparato de Gol-gi (-12). La caspasa 3 es la más importante de lasefectoras ya que su activación marca un punto deno retorno en la señalización de la apoptosis. Lapresencia de caspasa 3 activa en muestras de se-men (Figura 1) puede ser medida por epifluores-cencia y su presencia está relacionada con altosniveles de inmadurez espermática (especialmenteen muestras de pacientes infértiles), disrupcióndel potencial de membrana mitocondrial (espe-cialmente presente en las muestras descongela-das) y bajos niveles de penetración ovocitaria ydescondensación del núcleo espermático.

producir daño irreversible en el ADN del game-to.9-13 Cabe agregar que la apoptosis (muerte celu-lar programada) también culmina en la fragmen-tación del ADN y tiene lugar durante el procesonormal de maduración espermática testicular.14

Se ha sugerido que el daño provocado en la mo-lécula de ADN del espermatozoide por razonesde distinta naturaleza, puede afectar la salud delembrión, la del feto e incluso la de la descenden-cia global.15,16

Existen diferentes estrategias para estudiar lafragmentación del ADN espermático. Por un la-do, se encuentran las metodologías encaminadasa marcar las roturas, tanto de cadena sencilla co-mo de cadena doble (totales), que se registran deforma natural o fortuita en la molécula de ADN;dentro de este grupo, podríamos incluir, porejemplo, el ensayo de TUNEL (Terminal dUTPNick-End Labeling).17 Por otro lado, una segundaestrategia de estudio de la fragmentación se basaen medir la distinta capacidad de la cromatina yen particular del ADN para desnaturalizarse fren-te a determinados tratamientos. Aquí podríamosnombrar técnicas tales como el SCSA (Sperm Ch-romatin Structure Assay),18 el ensayo del Cometabajo condiciones desnaturalizantes y el SCD(Sperm Chromatin Dispersion).19

El ensayo de TUNEL permite visualizar la in-corporación de nucleótidos marcados a los extre-mos que quedan libres a causa de las roturas en elADN, bien sean de cadena simple o doble. Lareacción se cataliza in situ mediante la acción deuna tranferasa terminal. Esta enzima incorporadeoxiuridina, modificada con biotina o digoxige-nina, en el extremo 3’-OH de la cadena afectada.El nucleótido incorporado está directamente mar-cado con un fluorocromo. Teóricamente, la señalde marcado obtenida por cada espermatozoide seincrementaría de acuerdo con el número de rotu-ras que presente la cadena de ADN.17,20 Esta técni-ca ha tenido muy buena aceptación dado que esversátil, está comercialmente disponible y los re-sultados pueden ser interpretados fácilmente.

En nuestras manos, la determinación se realizacon fluorescencia y la marca observada es muyclara a la hora de obtener un valor numérico(VN<20%). Acompañando a este ensayo incor-poramos la marcación de caspasa 3 activa. Lascaspasas son los principales trasductores y efecto-

Fragmentación del ADN espermático M Agustina González Torres y col

Figura 1. Ensayos de TUNEL y caspasa. Fragmenta-ción del ADN espermático (verde, TUNEL) y caspasa-3 activa (rojo) en espermatozoides obtenidos post-swim up y vistos al microscopio de epifluorescencia.Fuente: REPROTEC, Buenos Aires, Argentina.

En el estudio de SCSA o Sperm ChromatinStructure Assay, desarrollado por Evenson ycol,18 se desnaturaliza la molécula de ADN me-diante una solución ácida o mediante un trata-

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miento con calor, y una vez desnaturalizada se ti-ñe con naranja de acridina. Este fluorocromo tie-ne la capacidad de intercalarse entre las dos cade-nas de ADN como un monómero y al ser excita-do emite una longitud de onda de 530nm y se vi-sualiza de color verde, mientras que al intercalar-se en el ADN de cadena sencilla (desnaturaliza-do) emite una longitud de onda de 640nm (colorrojo). Las células se separan por citometría de flu-jo. El ADN fragmentado es más susceptible deser desnaturalizado y, por tanto, se visualizará encolor rojo.21

El ensayo de cometa o electroforesis en gel decélulas individuales es un método sensible, rápi-do y relativamente de bajo costo para cuantificardaño en el ADN de células individuales.22,23 Pue-de ser realizado bajo condiciones neutras, detec-tando rupturas de doble cadena del ADN, o bajocondiciones alcalinas, detectando rupturas desimple cadena del ADN. En esta técnica las célu-las son embebidas en un gel de agarosa en un por-taobjetos, sometidas a lisis mediante un agentereductor de grupos sulfidrilo de las protaminas y


luego corridas por electroforesis durante un cortotiempo. Luego el microgel es teñido con sustan-cias fluorescentes. Las células con mayor daño delADN muestran una migración aumentada desdeel núcleo hacia el ánodo,22,23 generando una ima-gen similar a la cola de un cometa. Los esperma-tozoides que no presentan fragmentación no ge-neran esta imagen (Figura 2). La importancia deeste ensayo radica en la posibilidad de poder de-tectar fragmentación de simple o doble cadenadel ADN espermático ya que cada una de ellastiene diferente impacto luego de la fecundación.Se sugiere que la fragmentación de doble cadenaes aquella “no reparable” por el ovocito, mientrasque la simple podría llegar a ser reparada por unovocito sano y joven.

El ADN del espermatozoide se encuentra unasseis veces más compactado que el del cromosomamitótico. Este ADN se encuentra organizado enbucles que se compactan por acción de las prota-minas intercaladas, las que estabilizan rígidamen-te la estructura a través de la formación de puen-tes disulfuro entre ellas. La técnica de SCD o

Figura 2. Fragmentación del ADN espermático estudiada por el ensayo de cometa dedos dimensiones. En una primera electroforesis neutral y horizontal se logran detectarfragmentación del ADN de doble cadena. En una segunda electroforesis alcalina se de-tectan rupturas de cadena simple. Los resultados de ambas rupturas son observados almicroscopio de epifluorescencia a través de la coloración del ADN con Gel Red. Fuente:Enciso y col, RBM on-line (2009).


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Sperm Chromatin Dispersion consiste en produ-cir una descondensación diferencial de la croma-tina mediante la ruptura de los puentes disulfuroen aquellos espermatozoides que tienen su ADNfragmentado respecto de aquellos que no lo tie-nen. Este efecto se consigue mediante un trata-miento ácido seguido de una desproteinización,donde los bucles de ADN se relajan constituyen-do grandes halos alrededor de la estructura nu-clear central. Por el contrario, los espermatozoi-des con fragmentación no liberan bucles de ADNy no generan el halo de dispersión de la cromati-na o éstos son de muy reducido tamaño.19 Sim-plemente valorando el tamaño de los halos dedispersión mediante microscopía tanto de campoclaro como de fluorescencia es posible reconocerla presencia de fragmentación de ADN en los es-permatozoides humanos.24 Los patrones a obser-var son los siguientes (Figura 3): las cabezas de es-permatozoides donde se observan halos grandes omedianos no presentarían daño en el ADN esper-mático, mientras que aquellos con halos peque-ños o sin ellos sugieren un daño en el ADN.Dentro de este grupo se encuentran tambiénaquellos espermatozoides que presentan el núcleodegradado (Figura 3).

Ensayos de fragmentación dinámicaLa fragmentación dinámica del ADN espermá-

tico, es decir, la fragmentación del mismo duran-te determinadas horas de incubación, puede serevaluada por SCD. La preparación de la muestrade semen para técnicas de reproducción asistidapuede incrementar la tasa basal de daño en el

ADN especialmente en muestras “suceptibles”,25-

27 con una subsecuente reducción de la tasa defertilidad.28 Desafortunadamente, los mecanis-mos involucrados en la fragmentación del ADNen un eyaculado fresco o en una muestra procesa-da no son aún claros.29,30 En varias especies de ma-míferos se sabe que la tasa de fragmentación delADN espermático se incrementa cuando las célu-las están expuestas a variaciones de temperatu-ra.27,31,32 Por lo tanto, la tasa de fragmentacióntiende a incrementarse luego de un periodo de in-cubación (usualmente horas) a 37°C y en una at-mósfera con una baja concentración de CO2.

33

También se sabe que la centrifugación de mues-tras de semen con gran proporción de espermato-zoides inmaduros (que producen altos niveles deROS) puede resultar en un incremento del dañoal resto de las células espermáticas.34,35 Los proce-sos de congelación-descongelación no parecenafectar el nivel de fragmentación de ADN de losindividuos fértiles. Sin embargo, esto puede noser así con los espermatozoides de los individuosinfértiles.36

Con lo anteriormente expuesto, podemos decirque una muestra puede aparentar ser normal (conbajos valores de fragmentación en un tiempo de-terminado) cuando es analizada inmediatamentedespués de ser obtenida, pero que quizás no man-tenga estos valores luego de ser procesada para técni-cas de reproducción asistida. Es sabido que trans-curren varias horas entre la obtención de la mues-tra y su utilización. Por ejemplo, en FIV e ICSI,la inseminación/inyección de los ovocitos se rea-liza entre las 3 y 6 horas posteriores a la captaciónovocitaria. Durante un FIV o ICSI deben trans-


Figura 3. Ensayos de susceptibilidad cromatínica con fluorescencia. A) de manera panorámica y con contraste defase se pueden observar diferentes tamaños de halos en la población espermática a estudiar. B) Halo grande, señalde cromatina intacta. C) Halo mediano. D) Halo chico, señal de cromatina dañada. Fuente: REPROTEC, Bue-nos Aires, Argentina.


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currir entre 16-19 hs post-inseminación/inyec-ción para observar y valorar si la fecundación delos ovocitos se ha producido correctamente. Contodo lo antedicho, ¿hasta qué punto un solo va-lor inicial de fragmentación del ADN espermáti-co nos da una idea de la “performance” que eseespermatozoide tendrá al fecundar al ovocito? Enotras palabras, ¿qué tipo de comportamiento ten-drá una población de espermatozoides a 37°C?,¿incrementará sus niveles de fragmentación deADN de manera logarítmica afectando incluso ala fecundación o será de manera exponencial?Distintas dinámicas parecerían tener diferenteimpacto en los resultados de FIV-ICSI.

En los últimos años algunos autores creen ne-cesario estudiar la fragmentación del ADN esper-mático en el tiempo. El análisis de la fragmenta-ción dinámica 24 se realiza a 0 hs, 4 hs y 24 hsluego de que la muestra es procesada, pudiendoser un punto a incluir las 8 hs post-eyaculado. Es-ta técnica nos brindará mayor información acer-ca de cómo proceder en el manejo de una mues-tra de semen que será utilizada en una técnica dereproducción asistida. Dada su sencillez se hapropuesto que la técnica de fragmentación diná-mica puede ser potencialmente utilizada comoprueba de rutina en el estudio de la fragmenta-ción de ADN espermático en los laboratorios bá-sicos de andrología.

Significado ClínicoEs sabido que la calidad seminal, la capacidad

de fertilización, la calidad del embrión y el desa-rrollo hasta blastocisto se ven influenciados por elporcentaje de espermatozoides con ADN frag-mentado presentes en la muestra.37

Como mencionamos anteriormente, la frag-mentación del ADN espermático no parece teneruna correlación plena con ninguno de los pará-metros clásicos de calidad seminal que se analizanpara estimar la capacidad fertilizante del indivi-duo. Las nuevas tendencias en la andrología mo-derna marcan “ir más allá de lo evidente” ycompletar el análisis del factor masculino conmétodos que hablen de las características fun-cionales en las muestras espermáticas.

En nuestra experiencia (resultados no publica-dos) entre un 10-15% de los pacientes con pará-

metros seminales normales tienen altos niveles defragmentación del ADN espermático por lo quese aconseja su estudio con el fin de tener una vi-sión más completa de la calidad seminal. El índi-ce de fragmentación del ADN, evaluado median-te la técnica de SCSA, presenta una débil o mo-derada correlación con los criterios clásicos de ca-lidad espermática.38,39 Sin embargo, mediante laprueba de TUNEL y ensayo de cometa se ha de-mostrado una correlación inversa entre el porcen-taje de espermatozoides con ADN fragmentado yla motilidad, concentración y los parámetrosmorfológicos relacionados con formas normales.3

El daño en el ADN evaluado mediante SCDmuestra un incremento significativo en pacientescon OAT (47,1%±17,3) y en pacientes normo-zoospérmicos (27,3%±11,7), frente a individuosfértiles (16,3%±6,0).24 Sin embargo, el estableci-miento de una correlación entre un alto grado defragmentación en el ADN espermático y ausenciade embarazo, no se ha llegado a establecer de for-ma absoluta.40 Obviamente, la capacidad que pre-senta el ovocito para reparar el ADN dañadotambién debe ser considerada. Cuando ocurre lafertilización con un espermatozoide que presentadaño en su ADN, la habilidad del ovocito pararepararlo depende de la severidad de dicho daño.41 Por lo tanto, el desarrollo embrionario puedefallar en cualquier etapa o llegar a término conciertas anomalías. Se ha demostrado que la pro-porción de espermatozoides con ADN fragmen-tado es significativamente más alta en varones deparejas con abortos recurrentes (38,0%±4,2)comparado con la de la población general(22,0%±2,0) o con la de donantes fértiles(11,9%±1,0).42 A pesar de estos trabajos, los da-tos sobre la posible relación entre la fragmenta-ción del ADN de los espermatozoides y el desa-rrollo de abortos espontáneos, tanto aislados co-mo de repetición, son escasos y por lo tanto no sepueden considerar que sean concluyentes.2,43,44,45

Podemos entonces afirmar que la evidencia enla literatura demuestra que el daño en el ADN enlos espermatozoides afecta el resultado de la ferti-lidad de tal forma que una muestra de semen quepresente una alta proporción de espermatozoidescon ADN fragmentado tendría mayor dificultadpara producir un embarazo que un semen conbajo nivel.



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Cabe destacar que no existe un consenso cla-ro sobre la técnica que se debe utilizar para medirel daño en el ADN de los espermatozoides de pa-cientes considerados como sub-fértiles, pero sepropone a la técnica de TUNEL como de mayorproyección y fácil aplicación a la clínica rutinariay la FRAGMENTACIÓN DINÁMICA como lapróxima estrategia en el estudio del factor mascu-lino funcional.

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