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Jornada sobre Posibilidades de la

Espectrometría de Masas

en Laboratorios de Investigación.

“El poder” del análisis comparativo de

muestras en Alimentación,

Proteómica y Metabolómica.

Organizado por: Miguel Angel Martínez

e Inmaculada Álvarez

ICTAN-CSIC

Madrid,

5 de Julio del 2012 10:30-11:15

PCiTAL - UDL

Isidro Masana

Especialista Productos LC/MS

Agilent Technologies

Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.

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Programa:

1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y

Validación de Biomarcadores en Metabolómica.

2.-Estrategias en el Descubrimiento de

Biomarcadores en Proteómica.

3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis

Multi-ómicos.

4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros

para la identificación de Metabolitos.

5.- Conclusiones


Metabolómica: es el estudio sistemático de las pequeñas

moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico

DNA

RNA

CH2OH

Metabolitos

Proteinas

GENÓMICA

TRANSCRIPTÓMICA

PROTEÓMICA

La Importancia del Metaboloma

Metaboloma ~ Expresión final de las “-omicas”

METABOLÓMICA

Página 3

El estudio de cambios en rutas metabólicas generados por agentes internos/externos permite:

• Conocer mejor la biología del organismo

• Prevenir futuras enfermedades.

• Prever efectos indeseados /deseados de fármacos, dietas,…

• Mejorar la salud.

•…..

Genoma

Proteoma

La Importancia del

Metaboloma y la

Alimentación

Página 4

Página 5

2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos

Comparación de Perfiles Genéricos del

Metaboloma (metabolitos conocidos

+ desconocidos)

Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo

espectral con masa exacta

Típico para Descubrimiento de

Nuevos Biomarcadores

Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)

Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en

modo selectivo

Típico para Validación de Biomarcadores y

diagnóstico

Evaluar cambios en ciclos concretos del

metabolismo

LC/MS-QTOF

GC/MS-QTOF

LC/MS-QqQ

GC/MS-QqQ

5-40m

Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de

Perfilado Genérico (Descubrimiento/ “Un-Targeted Metabolomics”)

Extraer automáticamente la información para cuantificar

relativamente MILES de compuestos desconocidos

Soft. Deconvolución: MFE

PCA

El mismo flujo de trabajo puede aplicarse a Proteómica

(excepto GC/MS y soft. Identificación)

GC-QTOF

MS m/z exacta

GC-MSD

Aplicaciones no “-ómicas” de las estrategias de

análisis metabolómico

04 de julio de 2012

La Clave para una Buena Comparación de la

Composición de las Muestras

Se debe asegurar la comparación de respuestas de los mismos compuestos entre las diversas

poblaciones comparadas

Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativa

de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da

Clenbuterol S/N = 14

Rango extracción típico Cuadrupolo

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm

S/N = 102

LC/MS-TOF Agilent 6210

Exactitud

Masa (ppm)

Nº posibles

fórmulas

empíricas

Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP

10ppm 13

5 ppm 7

2 ppm 2 TOF /Q-TOF

Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

Página 8

¿Qué masas extraer en un análisis NO dirigido?

Deconvolución Cromatográfica (3-D) con AMDIS (GC/MS) y

Mass Hunter “Molecular Feature Extractor”(LC/MS)

TIC (suma de los 3)

Componente 1

Componente 2

Componente 3

“Deconvolución”

Picos deconvolucionados y espectros

Componente 1

Componente 2

Componente 3

TIC & Espectro

En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios

compuestos no resueltos y algunos del propio fondo

[M+H]+

[M+Na]+

[M+H]+

[M+Na]+ [2M+H]+

[M+H]+

E.C.C.: Suma de intensidades de sus

iones específicos

10-35m

Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass Hunter

Molecular Feature Extractor” para obtener por la Masa Exacta

de ”todos” los Compuestos Ionizados en la Muestra

Espectros Deconvolucionados

TIC ECC’s 0

Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF

Para cada analito exporta MPP:

m/z, Tr, Intensidad


Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)

Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales

PCA

• Normalizar datos.

• ANOVA

GC-QTOF

MS m/z exacta

Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras

Análisis

Estadístico

Admite Experimentos:

• Estudios simples (A vs. B)

• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….

• Clasificación (/ Autentificación) de muestras,…

Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)

• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)

• Análisis de Componentes Principales (PCA)

• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),

• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)

• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)

• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……

• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…),…..

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• Con MS Agilent facilita reaprovechar la información obtenida (gran cantidad de datos) para mejorar la calidad de los resultados, p.e.:

• Flujos de trabajo recursivos para reinterrogar muestras con la información obtenida de otras (análisis NO dirigido Dirigido). • Exportar la programación en el tiempo de los MS/MS de los compuestos relevantes para facilitar su identificación con Q-TOF’s de Agilent. • …..

“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación

de Análisis de PCA con ANOVA

Proporciona una mucha mejor diferenciación

de clases

3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico 1

2

3-INF

4

5

6-RES

7-INF

3-INF

7-INF 6-RES

5

2

3-INF 7-INF

6-RES

5

2

mod. genet.

“bacteria salvaje”

“control”

“sin tratar”

+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN

LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta

ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables

Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra

16-29m

Flujo de Trabajo RECURSIVO de Agilent en Estudios

Comparativos Perfilado Genérico Específico

Identificación metabolitos relevantes

PCA

Interpretación

Resultados

GC-QTOF

MS m/z exacta

Flujo

Trabajo

RECURSIVO “Untarget” “Target”

Flujo Trab.

RECUR- SIVO

Ver sección 4

0

500

1000

1500

2000

2500

L-ornithine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

L-arginine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

citrulline

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw0

500

1000

1500

2000

2500

L-ornithine

[IRBC_pH9] avg :Raw

[NRBC_pH9] avg :Raw

Arginine Ornithine Citrulline

Pathway Analysis Showing Differential Abundances For Three Metabolites In The Arginase Pathway In Malaria

Infected Erythrocytes

Células sangre

Infectada

No infectados

L-Arg

Citrul.

Ornit.

Ver en que rutas

metabolicas están

involucrados los

metabolitos

relevantes del

estudio diferencial

Ciclo de la Urea

Nota de Aplicación An LC/MS Metabolomics Discovery Workfl ow for Malaria-

Infected Red Blood Cells Using MPP & LC/QqQ MRM Confirmation 5990-6790EN

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2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos

Comparación de Perfiles Genéricos del

Metaboloma (metabolitos conocidos

+ desconocidos)

Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo

espectral con masa exacta

Típico para Descubrimiento de

Nuevos Biomarcadores

Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)

Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en

modo selectivo

Típico para Validación de Biomarcadores y

diagnóstico

Evaluar cambios en ciclos concretos del

metabolismo

LC/MS-QTOF

GC/MS-QTOF

LC/MS-QqQ

GC/MS-QqQ


Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)

GC-QqQ

LC-QqQ

“Pathway to Database Tool”

Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS):

• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés.

• Elimina metabolitos redundantes.

• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:

• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura

Página 19

Seguimiento de Cambios de Expresión en Rutas

Metabólicas en Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)

Cambios de concentración entre las 2 poblaciones comparadas

Sin cambios de concentración

Página 20

Programa:






Multi-ómico.



5.- Conclusiones


25-20 23-22m

Sano

Enfermo

Estrategia “Metabolómica” para el Descubrimiento de

Biomarcadores en Proteómica

Off-Gel Electroforesis

Fraccionar por pI

HPLC MS:QTOF

Análisis por LC/MS con masa exacta

Deconvolución cromatográfica de los datos

masas

Análisis Estadístico Multivariante / PCA

entre las diversas poblaciones de muestras

Digestión Tríptica

Identificación Proteínas

Relevantes con Bases de

datos + motor de

Búsqueda

Péptidos Relevantes

HPLC MS:QTOF

Target LC-MS/MS con masa exacta

Huella Dactilar del Mapa Proteico

Sano

Enfermo

1. Digestión Tríptica “in-gel”

2. MALDI-TOF: mapa masas péptidos

Identificación Proteínas

mediante Bases de datos + motor de

Búsqueda.

Estrategia “Clásica” para Descubrir Biomarcadores:

Proteómica Comparativa Geles-2D + MALDI TOF (TOF/TOF) :

Opción

2D-DIGE: permitirá en 1 Gel combinar varias muestras etiquetadas con distinto colorante fluorescente.

Se analizan las manchas (spots) que muestran

diferencias entre los 2 geles

Gel 2D Separan Proteínas Intactas

por Peso Molecular y pI

Espectro MS -TOF: huella péptídica de

1 mancha (/proteína)

La estructura semejante de los péptidos permite etiquetar

X muestras con distintas etiquetas isotópicas para poder

analizarlas conjuntamente y cuantificarlas relativamente con

1 solo análisis (multiplexado).

Técnicas de cuantificación relativa:

• Por metabolización SILAC (MS),

• Etiquetado antes digestión: ICAT (C13, D) (MS) (ver ejemplo en aptdo. 3)

• Después de la digestión: iTRAQ (MS/MS), O 16/18 (MS),…..

* Agilent Spectrum Mill software. Permite cuantificar relativamente con cualquier tipo de etiquetado

HPLC-Chip/QTOF

Cuantificación Relativa Multiplexada de Proteínas

mediante LC/MS con Etiquetado Isotópico

Pep-NH2

184

121

30

5

Pep-NH2

186

119

Pep-NH2

187

118

Pep-NH2

188

117

Mta 1 Mta 2 Mta 3 Mta 4 Pep-NH2

192

113

Mta 8

Reporter Ion

Balance masa

ITRAQ –plex8:

MS/MS plex 4

Página 24

Programa:






Multi-ómico.



5.- Conclusiones


30-15m

Razones y Aportaciones

de la Biología Integrada

• Extrema complejidad y variabilidad de los procesos biológicos.

• La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la activación de

otras vías alternativas.

• Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones

postraduccionales,…..

• La Integración de datos experimentales de las diferentes

–ómicas permitirá validar los resultados experimentales a través de

una coherente interpretación biológica de los cambios de expresión

observados entre distintas las distintas poblaciones de individuos/

tratamientos/ enfermedades/…. comparadas en el estudio.

• Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores requiere

efectuarla con unos miles de individuos de cada población.

Proyectos

Experimentos de MS: datos de abundancia de compuestos medidas por MS (LC/MS, GC/MS, CE/MS, ICP/MS),…

Microarray-based, Q-PCR, NSG,… Datos Genómica

Rutas Metabólicas “Pathways”: el nexo de union entre experimentos: transcriptómica /

proteómica/ metabolómica

Mass Profiler Profesional 12: Muy potente Integración de Datos de Múltiples Plataformas para su Análisis Estadístico: Genómica, Proteómica y Metabolómica (LC-GC-CE/MS, ICP/MS),….. Incluyendo plataformas No Agilent.

Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico

Integrado de Rutas Metabólicas mediante Mass Profiler

Professional (o GeneSpring GX).

1. Análisis NO Dirigidos de:

1. Transcriptoma (p.e. mediante µ-arrays mRNA)

2. Metaboloma (mediante LC-GC/MS mayoritarios y minoritarios– RMN sólo mayoritarios)

2. Reextraer los datos de TODOS los metabolitos involucrados en las

rutas metabólicas involucradas.

3. Identificar las proteínas involucradas y realizar los ensayos dirigidos (típico

LC/QQQ) para analizar estadísticamente los cambios cuantitativos del

proteoma.

MPP (o GeneSpring)

Análisis NO dirigidos Correlacionar metaboloma

con transcriptoma

Análisis DIRIGIDO

del proteoma

Nuevo MPP 12 permite integrar datos de transcriptómica, metabolómica y proteómica

Enrichment Analysis on curated pathways (Wikipaths, KEGG,….) and computationally –

derived networks

Gene Product Data Overlay

Metabolite Data Overlay

Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB:

Cambios expresión representados en las propias rutas

Página 29

Programa:






Multi-ómico.



5.- Conclusiones


36-9m

GC/MS

• Se realiza por búsquedas en bibliotecas universales de espectros de MS

obtenidos por “Impacto Electrónico” (EI: técnica de ionización).

– Genéricas: Wiley (+800.000 espectros/+600.000 compuestos), NIST (+200.000 espectros y compuestos)

– Especificas de Metabolitos: Fiehn Metabolomics GC/MS RTL Library que incluye los espectros y

Tiempos de Retención (+1.000 metabolitos volátiles –algunos previa derivatización: aminoácidos, azúcares, ácidos

orgánicos,....). Utiliza unas condiciones analíticas concretas.

LC/MS

• No existen bibliotecas universales de espectros de

MS o MS/MS.

• Se realiza por búsquedas en bases de datos de

masa exacta/fórmulas empíricas; algunas contienen

Tiempos de Retención de algunos metabolitos (para

unas condiciones analíticas concretas).

– METLIN DB: incluye +25.000 metabolitos endógenos

(unos 8.000 lípidos). Incluye ~700RT’s

• METLIN DL: incluye DB + biblioteca de 9,000 espectros de MS/MS de ~2.300 metabolitos. (en

unas determinadas condiciones de fragmentación con Agilent QTOF).

Identificación de Metabolitos

Ejemplo Resultados de Búsqueda en Biblioteca

Universal de Espectros de GC/MS* *ionización por Impacto electrónico (EI)

LC/MS: Base de Datos METLIN Batch Search: La importancia

del Tiempo de Retención

Load file for batch search

Active mass

Active metabolite structure

Active mass search results

Algunos metabolitos tienen la misma fórmula empírica se requiere su Tiempo de retención o espectros de MS/MS para poder diferenciar entre ellos.

MS/MS y Tiempo de Retención: Una Valiosa

Herramienta para la Identificación de Metabolitos

RT= 3.299

RT= 2.593

No identificados: Asignación Estructuras Moleculares

“Mass Structural Correlation” (MSC)

1.-Iones Espectro MS/MS

Requiere la rotura de más enlaces

mayor penalización

1.- MSC busca en internet posibles estructuras asociadas a la fórmula molecular. (p.e. Chemspider ≈ 30millones estructuras) 2.- MSC clasificará las estructuras según el nº de enlaces que hay que romper de la estructura del ión precursor, para encajar con la fórmula de cada uno de los iones producto. La probabilidad será mayor cuanto: • menor sea el nº de enlaces a

romper. • menor nº de dobles enlaces a

romper. • …

3-Representación de la parte de la estructura propuesta

que corresponde al ión remarcado

2.-Propuesta Estructuras

Página 35

Programa:






Multi-ómico.



5.- Conclusiones


Página 36

Conclusiones • El estudio de cambios en el metaboloma permite evaluar el impacto sobre un organismo, tanto de factores internos (genoma/ proteoma/

enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio ambiente/…).

• El metaboloma/proteoma es una excelente fuente de biomarcadores para diagnóstico, seguimiento de enfermedades, clasificación de pacientes, y estudios de impacto nutricional.

• La espectrometria de masas acoplada a cromatografía (LC/MS y GC/MS) y combinada con Bioinformática constituyen hoy en día la herramienta analítica más potente para proporcionar: PERFILES MASIVOS DE CIENTOS/MILES DE METABOLITOS/PEPTIDOS y correlacionarlos con diversas poblaciones de individuos/ pacientes

• Ya están disponibles comercialmente en el mercado:

– Cromatógrafos, Espectrómetros de Masas y Software para pasar: de IONES a RUTAS METABOLICAS

– Instrumentos y Software bioinformático con una visión multi-omica para abordar un enfoque de Biología Integrada (/Biologia de Sistemas).

Página 37

37

www.metabolomics-lab.com

Página 38

Mass Spec/tacular

Isidre Masana

Especialista de Productos LC//MS

AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90

[email protected]

www.metabolomics-lab.com

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Estamos a su disposición en:

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¿Preguntas?

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