7/21/2019 Ficha Fabiana Ortega - Apagar El Gen de Endotelina 1 Derivada de Endoelio Atena La Fibrosis Cutnea Pero Acelera La Cura de Heridas en Piel

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Knockout of Endothelial Cell-Derived EndotAttenuates Skin Fibrosis but AcceleratesCutaneous Wound Healing

Katsunari Makino1, Masatoshi Jinnin1, Jun Aoi1, Ikko Kajihara1, Takamitsu Mak

Fukushima1, Keisuke Sakai1, Kazuhiko Nakayama2, Noriaki Emoto2, MasashiYanagisawa3,4, Hironobu Ihn1

DRA. FABIANA ORTEGA

Mayo 2014

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Introduccin

Pptido vasoconstrictor ms potente por accin sobre el musculo liso vapuede estimular la proliferacin del msculo liso.

Induce la expresin de protooncogees como Myc

En cultivo induce la expresin de colgeno en fibroblastos de corazn, p

In vitro e in vivo: efecto profibrtico (mecanismo detallado desconocido

Liberado principalmente por clulas endoteliales

Acciones biolgicas mediadas por dos receptores ETA y ETB

Supresin de ET-1 en ratones produce muerte postnatal por anormalidadcraneofaciales

Endotelina 1:

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Mtodos y materiales

Protocolos animales aprobados por el Comit para la investigacinanimales en Universidad de Kumamoto

8 semanas

Heterocigotos ET-1 ; Tie -2.Cre (+), control ET-1 Tie -2-Cratones salvajes (WT)

Mantenidos en aislamiento libre de patgenos, temperatura, dieta y luz/oscuridad controlados y agua libre.

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Mtodos y materiales

Bleomicina: diluido en solucin salina buffer (PBS)concentracin: 1 mg/ml, esterilizado por filtracin

Inyectado ID en la espalda, afeitada, de los ratones por 4semanas.

La piel de la espalda se removi luego de la ltima inyeccinde bleomicina.

Bajo anestesia local, punch de 8mm, luego enjauladosindividualmente.

Tejido de la herida y el rea alrededor fue recolectada a los0,3,7,12 das

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Mtodos y materiales

Tincin: Hematosilina-eosina o tricromo de Masson

Inmunotincin: anticuerpos para ET-1, myeloperoxidasa, CD3, F4/80 teihematoxilina de Mayer

Inmunofluorescencia: anticuerpos policlonales de conejo anti ET-1 e isol

Medida del contenido de colgeno en los tejidos: kit microensayo cua

midi con espectofotmetro la absorbancia. Aislamiento de ARN y PCR rt

Analisis estadstico: Mann-Whitney U para comparacin de medias. P

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Resultados

Expresin de ET-1 en piel de ET1f/f; Tie-2-Cre (+):

Ratones ET-1 completos, murieron al nacer

Tie-2-Cre (+) se compararon con WT:caractersticas macroscpicas ymicroscpicas similares

Se confirma expresin de ET-1 por inmunohistoqumica

en Wt ms no en ET1f/f; Tie-2-Cre (+)

Inmunoflorescencia: expresin de c

e Isolectina IB4 ( marcador de clula

WT

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Resultados

Bleomicina induciendo fibrosis cutnea en ET1f/f; Tie-2-Cre (+):

PBS

BLEOMICINA

Nodiferenciaen grosor

WT KO

Fibrosis yengrosamiento

drmico

HE

Tricrmica de Mansson

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Resultados

Infiltrado inflamatorio y expresin de genes relacionados con MECen ratones ET1f/f; Tie-2-Cre (+):

No hubo diferencia en neutrfilos mieloperoxidasa +, macrfagos F4/80 + o por inmunohistoqumica

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Resultados Cierre de herida, formacin de tejido de granulacin y

reepitelizacin en ET1f/f; Tie-2-Cre (+):

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Resultados

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Resultados

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Discusin

Primer estudio en reportar el rol de endotelina-1 en fibrosis cutnea y re

de heridas, regulando la expresin de citoquinas y MEC La induccin de fibrosis cutnea por bleomicina es conocida por estud

para esclerosis sistmica.

El desarrollo de fibrosis cutnea inducida por bleomicina(FCIB), se acomevidencia de aumento de TGF- , pero se demostr que el desarrollo deinhibe en ratones sin endotelina-1 de clulas endoteliales.

Los niveles de ARNm de TGF y colgeno 2 disminuyen en piel, con bde ratones KO, sin haber diferencia en el numero de clulas inflamatoriala disminucin de la fibrosis resulta en ratones KO, por niveles menores dsubsecuente menor expresin de colgeno

A pesar de estudios previos donde la expresin de ET-1 era regulada por TGnuestro estudia demuestra que in vivo puede ocurrir lo contrario

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Discusin

La cicatrizacin de heridas en ratones ET-1 KO fue ms acelerada que

La reduccin ms temprana del tejido de granulacin y reepitelizacifue vista en ratones KO, sin embargo no se observ diferencia en cuaninflamatorias

RNA_m de TNF-, citocina proinflamatoria, se observ significativamereducido en la herida de los ratones KO que en los WT. Se sabe que endeficientes del receptor de TNF-se acelera la cicatrizacin por dismininfiltracin leucocitaria, por lo tanto este podra ser uno de los mecanis

que se acelera la cicatrizacin

Los niveles de ARN_m de TGF- asi como colgeno 2 y CTGF se encreducidos en en la herida de los ratones KO. A pesar que segn estudiTGF- induce fibrosis va sntesis de colgenos y CTGF, puede causar eadversos en la curacin de las heridas. Por tanto este puede ser otro mpara la curacin de heridas, ms acelerada, en ratones KO

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Conclusines

La endotelina 1 es un potencial blanco teraputico en fibrosis ycuracin de heridas.

Futuras investigaciones sobre los mecanismos reguladores de escondiciones patolgicas, pueden proporcionar una aproximacteraputica

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Gracia