Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales del daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno a través de

la promoción de la expresión de la oxidasa y la inhibición del estrés del retículo endoplásmico

L. Lu, S. Wang, L. Fu et al.Clinical and Experimental Dermatology 2016; 41: 64–73

Dra. María Gabriela GonzálezResidente de Dermatología y Sifilografía

Introducción Vitiligo enfermedad adquirida caracterizada por Ø progresiva de melanocitos.

Etiología y patogénesis

Estrés oxidativo

Autodestrucción de melanocitos

Factores genéticos

Inicio y progresión de la enfermedad

Desequilibrio REDOX

Peróxido de hidrógeno (H2O2) se acumula en la epidermis y el estrés oxidativo que induce:

Ø del péptido pro-opiomelanocortina Regulación de la señalización colinérgica Apoptosis directamente en los melanocitos

• Estrés en el RE• Promotor de apoptosis en células del epitelio pigmentario de la retina y células HeLa

Autoinmunidad

Introducción

niveles de H2O2 recambio de sustratos sustitutos de la tirosinasa AutoAg

Nuevo Ag Autoinmunidad del melanocito

Fenoles inductores de vitiligo

células dendríticas

producción de IL-6 y IL-8

El extracto de ginkgo biloba

Antioxidante

Detiene la aparición y progresión de vitiligo

Neuroprotector

uno de los principales componentes nonflavone. Trilactone sesquiterpeno con PM 326,3Da

Bilobalide Propiedad de secuestrar radicales libres

Liberación de Hsp 70 de los melanocitos

Investigar si Bilobalide protege a los melanocitos humanos normales

contra el daño oxidativo inducido por H2O2 y explorar los mecanismos

moleculares subyacentes implicados en esta respuesta.

Objetivo

MétodosAislamiento y cultivo de melanocitos

•Se incubaron durante la noche•Bilobalide se preparó como una Sol de

reserva a 100 mmol/L en DMSO•DMSO sin bilobalide se utilizó para las

muestras de control negativo •H2O2 preparado a partir de una Sol

madre de 30% antes de c/experimento

20ng/ml de bFGF 20µg/ml de IBMX 10ng/ml de TC Suero bovino fetal al 10%

Métodos

Viabilidad celular

se incubaron las células con diversas concentraciones de

bilobalide (0-800µmol /L)

72 horas Citotoxicidad

¿Bilobalide protege a los melanocitos del daño celular inducido por H2O2?

pretratados con bilobalide

(0-400µmol/L) 1 hora

se exponen a 1mmol/L de H2O2 durante 16h

solución de MTS a cada pocillo de cultivo y se incubó

durante 1h a 37°C.

Viabilidad celular

La absorbancia se midió a 490nm con un espectrofotómetro de microplacas y la morfología de las células examinadas bajo un microscopio de luz invertida

Métodos

Ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa

evaluar integridad de la MC basada en la cantidad de LDH

citoplásmica liberada en el medio

El sobrenadante de cada pocillo de la placa se transfirió al

correspondiente pocillo de una placa de ensayo enzimático de 9-6 pocillos y se incubaron con

la mezcla de sustrato reconstituida durante 30 min

Tinción de Anexina V-yoduro de propidio

Detectó apoptosis de melanocitos utilizando un kit

comercial

Citómetro de flujo(20.000 eventos)

La medición de liberación de Hsp 70

Se controló usando un kit de inmunoensayo enzimático comercial (EIA).

Medición de ROS intracelulares

Citometría de flujo

Métodos

• Extraído de los melanocitos• Mide niveles de expresión de la

CAT y GPx1• β-actina como control interno

para la normalización

Aislamiento de ARN y el análisis de PCR-TR

en tiempo real

• Postto cel se lavaron una vez con PBS y se lisaron mediante la adición de tampón

• La membrana se incubó con Ac 1° contra CHOP, p-eIF2a, eIF2a y β-actina y con Ac 2° fluorescente marcado con colorante

Inmunotransferencia

Resultados

Bilobalide ejerce un efecto protector contra la citotoxicidad inducida por H2O2 a los melanocitos

(a) (b)

(d) (e)

Análisis estadístico

Prueba de Kolmogorov-Smirnov ANOVA Prueba Dunnett post hoc usando SPSS 17.0

Comparación de grupos múltiples. Cada experimento se realizó por triplicado y repetido 3 veces

Viabilidad celular

Pre-tto x 24h

3,5 veces

ResultadosBilobalide atenúa apoptosis inducida por H2O2 en los melanocitos

ensayo de anexina V-PI

Bilobalide inhibe la secreción de Hsp 70 inducido por H2O2 en los melanocitos

ELISA

12%

62%

36%25%

2,5 veces

Resultados

Bilobalide atenúa la elevación de ROS intracelular inducido por H2O2 mediante la promoción de la expresión de la catalasa y la glutation peroxidasa-1

(b)(a)PCR-TR cuantitativa en tiempo real

2 veces

3 veces

1,2 v

2,7 v

Discusión

Bilobalide protege a los melanocitos contra la apoptosis inducida por H2O2 y la liberación de Hsp70.

CAT

GPx1

Ø H2O2 Co-cultivo de bilobalide + H2O2 fue incapaz de aliviar la citotoxicidad en los melanocitos

Reducen daño oxidativo Expresión de 2 antioxidantes

Hsp

Desencadena respuesta

autoinmune presentación de Ag previamente

oculto

Refuerza respuesta inmune mediante + CD

≠ concentraciones de H2O2

liberación Hsp70 de los melanocitos

Ø tolerancia de cel T hacia Ag propios y mejora reacción

citotóxica de infiltración de LyT

Prevención de la potencial respuesta autoinmune

Inhibición de Ø directa de melanocitos

Conclusión

Bilobalide puede mejorar el estrés RE y apoptosis en los melanocitos humanos inducida por H2O2

Mediante la promoción de la CAT y la síntesis GPx1

Mediante el bloqueo de la inducción CHOP relacionada con la apoptosis

Posiblemente a través de la modulación de la señalización de la UPR.

GRAC

IAS