fibrosis hepática congénita en el caballo franches-montagnes es asociada con el riñon...

PLOS UN | el www.plosone.org 1 Octubre 2014 | el Volumen 9 | el Asunto 10 | e110125

Fibrosis Heptica Congnita en el Caballo Franches-

Montagnes es Asociada con el Rin Poliqustico y la

Enfermedad Heptica 1 (PKHD1) Gen Michaela Dro gemu ller1,2, Vidhya Jagannathan1,2, Monika M. Welle3, Claudia Graubner4, Reto Straub4,

Vinzenz Gerber4, Dominik Burger4, Heidi Signer Hasler2,5, Pierre-Andre Poncet6,

Stephane Klopfenstein7, Ruedi Von Niederha Usern2,8, Jens Tetens9, Georg Thaller9, Stefan Rieder2,8,

Cord Dro Gemu Ller1,2, Tosso Leeb1,2 * 1 Instituto de Gentica, Universidad de Berna, Berna, Suiza, 2 Instituto Suizo de Competencia de Animal Proliferando y Genetics, Universidad de Berna, Bern

University de Applied Sciences HAFL y Agroscope, Berna, Suiza, 3 el Instituto de Patologa Animal, Universidad de Berna, Berna, Suiza, 4 el Instituto Suizo de

Medicina Equina, Universidad de Berna y Agroscope, Berna, Suiza, 5 Berna Universidad de Sciences Aplicado HAFL, Zollikofen, Suiza, 6 HIPPOP, Lignerolle,

Suiza, 7 Asociacin que Prolifera Franches-Montagnes Suizo, Avenches, Suiza, 8 Agroscope, Semental del Nacional Swiss Labra la Tierra, Avenches, Suiza, 9

el Instituto de Animal Proliferando y la Conservacin, Christian-Albrechts-Albrechts-University, Kiel, Alemania

Resumen

La fibrosis heptica congnita ha estado descrita como una enfermedad letal con herencia recesiva autosmica monogenetica en

la raza del caballo Swiss Franches Montagnes. Realizamos un estudio societario ancho en el genoma con 5 casos y 12 controles

y se detect una asociacin en el cromosoma 20. El mapeo de homocigosis posterior define un intervalo crtico de 952 kb que

albergan 10 genes y un loci anotado incluyendo el rin poliqustico y la enfermedad 1 (autosmica recesiva) gnica heptica

(PKHD1). El PKHD1 representa un candidato funcional excelente como variantes en este gen fueron identificados en pacientes

humanos con herencia autosmica recesiva del rin poliqustico y la enfermedad heptica (ARPKD), as como varios mutantes

de ratn y rata. Mientras que las variantes del PKHD1 ms patgenas conducen a los defectos polienquistados en rin e hgado,

un subconjunto pequeo de los pacientes humanos ARPKD tienen slo sntomas ms vivos, parecido a nuestros caballos con

fibrosis heptica congnita. El gen PKHD1 es uno de los genes ms grandes del genoma con mltiples transcripciones

alternativas que an no han sido completamente caracterizados. Hemos secuenciado los genomas de un potro afectado y 46

caballos de control para establecer una lista exhaustiva de las variantes en el intervalo crtico. Se identificaron dos variantes sin

sentido en el gen PKHD1 que eran fuertemente, pero no perfectamente asociados con fibrosis heptica congnita. Especulamos

que la penetrancia reducida y / o potenciales interacciones epistticas con genes modificadores hipotticas pueden explicar la

asociacin imperfecta de las variantes PKHD1 detectados. As, nuestros datos indican que los caballos con fibrosis heptica

congnita representan un modelo animal de gran inters para el subtipo restringido en el hgado de ARPKD humana.

Cita: Drogemuller M, Jagannathan V, Welle MM, Graubner C, Straub R, et al. (2014) Fibrosis heptica congnita en el caballo Franches-Montagnes se asocia con el rin poliqustico y la enfermedad heptica 1 (PKHD1) Gen. PLoS ONE 9 (10): e110125. doi: 10.1371 / journal.pone.0110125 Editor: William Barendse, CSIRO, Australia Recibido 11 de junio 2014; Aceptado 15 de septiembre 2014; Publicado 08 de octubre 2014 Copyright: 2014 Drogemuller et al. Este es un artculo de acceso abierto distribuido bajo los trminos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Disponibilidad de datos: Los autores confirman que todos los datos que se basan las conclusiones son totalmente disponibles sin restricciones. Los archivos FASTQ primas para la RNA-Seq experimento hgado han sido archivados en EBI archivo de lectura corta y se puede acceder con el nmero de acceso PRJEB6068. La secuencia del genoma entero de la caballo afectado ha sido depositado bajo el nmero de acceso PRJEB5942. Financiacin: Este estudio fue financiado en parte por las contribuciones de la Oficina Federal Suiza para la Agricultura, el suizo Federal de Seguridad Alimentaria y la Oficina Veterinaria, y la Asociacin de Cra suizo Franches-Montagnes. Sin financiacin externa adicional se recibi para este estudio. Los financiadores no tenan papel en el diseo del estudio, la recogida y anlisis de datos, decisin a publicar, o la preparacin del manuscrito. Conflicto de intereses: Despus de su retiro como director de la National Stud suizo en Avenches, Pierre-Andre' Poncet es Presidente de la Junta de Suiza y Observatorio de la Industria Equina (Conseil et Suisse Observatoire de la Filie`re du Cheval (COFICHEV)). Esto no altera la adherencia de los autores a la revista PLoS One polticas sobre datos y materiales de uso compartido. * Email: [email protected]

Introduccin La enfermedad poliqustica autosmica recesiva del rin (ARPKD) tiene

una incidencia de aproximadamente 1: 20.000 en los seres humanos [1].

Es causada por variantes en el rin poliqustico y la enfermedad 1

(autosmico recesivo) gen heptica (PKHD1). Ms de 500 variantes

potencialmente patgenos diferentes en el gen PKHD1 humana se han

descrito, y hay una considerable variacin en el fenotipo clnico y la edad

de inicio ([1,2], http://www.humgen.rwth-aachen.de/ index.php). Pa-

pacientes que llevan dos mutaciones PKHD1 truncar suelen morir en el

perodo perinatal, mientras que los pacientes con funcin PKHD1 residual

tpicamente tienen una enfermedad menos grave, que afecta

principalmente a los riones y el hgado.

Un pequeo subgrupo de pacientes con mutaciones PKHD1 slo muestra

enfermedad heptica [2,3].

La protena PKHD1 probablemente tiene un papel esencial en los cilios primarios de clulas epiteliales tubulares, que son necesarios como

mecanosensoress y regulan Ca2 + afluencia. PKHD1 interacta

probablemente directamente con policistina 2 (PKD2), pero su funcin exacta y el papel de sus muchas isoformas diferentes son desconocidos

[4]. El gen PKHD1 es muy complejo y abarca unos 500 kb con mltiples

transcripciones alternativas. La transcripcin PKHD1 humana mejor estudiado comprende 67 exones, tiene un marco de lectura abierto de

12.222 nucletidos, y codifica una protena de 4074 aminocidos, que

tambin se ha denominado fibrocistina o poliductina [5,6].

Equine Liver Fibrosis Associated to PKHD1 Variants


Varios modelos roedores de ARPKD han estado descritos. La rata polienquistada (PCK) conlleva una mutacin espontnea del sitio del

empalme en el gene Pkhd1 y es caracterizada por la formacin del

quiste en rin y hgado. Hay tambin varios mutantes a los que se

apunt de los ratones disponibles incluyendo uno que exclusivamente

muestra disgenesias biliares enquistados sin alteraciones renales 710. La ocurrencia de enfermedades similares afectando

exclusivamente el hgado ha sido reportada en mono 11, y los casos

espordicos diferentes en las especies animales domsticas les gustan

15 12,13 vacuno, de gato 14, de perro, y el caballo 16,17.

Previamente identificamos a 30 potros con lesiones ms vivas

compatibles con fibrosis heptica congnita en un estudio

retrospectivo 17,18. Los datos de la Anamnesis revelaron signos

clnicos de lesin ms viva severa en la mayora de animales

afectados 16,17. El estudio anatomopatolgico mostr gravemente

hgado agrandado y firme con quistes de pared delgada.

Histolgicamente, los hgados mostraron difusa porto-portal fibrosis

en puente con muchos conductos biliares pequeos, de forma

irregular y en ocasiones qustica [18]. Todos los potros pertenecieron

para el Swiss Franches Montagnes prolifera. El anlisis de raza dej

que se sepa que los animales afectados podran ser llegados a ubicar a

un garan 18 . Estos resultados fuertemente sugieren que la fibrosis

heptica congnita en caballos Swiss Franches Montagnes sea un

defecto gentico ancestral recesivo automico. Durante los ltimos seis aos siete potros innatos nacieron con

fibrosis ms viva congnita y se sometieron para investigaciones

genticas. La meta del estudio presente fue identificar la causa

gentica asumida para la condicin usando un acercamiento

posicional y una siguiente ordenacin en secuencia de generacin

para desarrollar una prueba gentica para impedir ms all en los

apareamientos de riesgo.

Resultados Fibrosis Hpatica Congnita en Caballos Franches-Montagnes

Entre los aos 2008es y 2013, reclutamos un total de 7 potros de

Franches-Montagnes, 5 varones y 2 hembras, semanas 3 envejecidas para

12 meses, con signos clnicos de lesin ms viva severa (la Figura 1). Los

padres de todos los casos fueron clnicamente poco notorios. En 5 fuera de

estos 7 potros la calidad de tejido fino o las pruebas de sangre y el cido

desoxirribonucleico extrado fueron suficientes para los genotipos con

patatas fritas SNP. Los padres de estos 5 potros podran ser rastreados,

ambos en lo maternal y las lneas paternales sobre 3 para 7 generaciones,

para un solo antepasado comn y masculino (Elu) nacido en 1964 (la

Figura 2). Por lo tanto, llegamos a la conclusin de que una mutacin

hereditaria recesiva era lo ms probable, de acuerdo con nuestros estudios

anteriores [18]. Las pruebas incrustadas en parafina arregladas en

formalina del hgado del anterior estudio estaban disponibles y

exitosamente extrajimos cido desoxirribonucleico de 13 de estos potros

afectados.

Dos de los casos recientes fueron cedidos al caballo clnico de la

Universidad de Berna para examen clnico de fondo (la Figura 1).

Estaban en una forma reducida del cuerpo y demostraron

comportamiento deprimido. Sus abdmenes fueron ampliados y las

heces fueron amarillentas y de una consistencia aceitosa. La ecografa

trans-abdominal revel un aumento del tamao del hgado con

lesiones hipoecoicas qusticas distintas. Hematologa mostr una

leucocitosis grave debido a una neutrofilia grave. La qumica de

laboratorio mostr cidos biliares del hgado extremadamente alta.

Ambos pacientes fueron sacrificados y sometidos a una necropsia.

El examen Histopatolgico de todos los potros afectados revelados

que la fibrosis que tiende un puente sobre ms vivo porto-portal

mostrado y difuso con muchos conductos biliares pequeos, (la

Figura 1C) irregularmente formados y algunas veces enquistados

parecido a la anterior serie de 30 reportados casos de fibrosis ms

viva congnita en el 18 de raza de Franches-Montagnes Asignacin a una regin de la CEPA 20 que contiene PKHD1 como gen candidato funcional. Determinamos el genotipo 65,157 SNPs en 5 potros afectados y 12

caballos no afectadas Franches-Montagnes. Despus de la eliminacin de

los marcadores no informativos (MAF, 0,1) y marcadores con tarifas de

llamadas por debajo del 90%, retuvimos 38.394 SNPs para un estudio de

todo el genoma allica asociacin (GWAS). El factor de inflacin genmico en este anlisis fue de 1,33, lo que indica la estratificacin

debido al uso de animales estrechamente relacionados (Figura 2). El

anlisis revel un nico SNP asociados, BIEC2-564517, en la posicin 49643575 en el cromosoma 20. El p-valor bruto de la asociacin fue

5,561029. Esto supera el umbral de correccin de Bonferroni significacin

(pBonf = 0,00021) y tambin un umbral de significacin emprica determinada despus de 100.000 permutaciones de los fenotipos de tipo

(pgenome = 0,00011, figura 3).

Con base en los registros de pedigr la hiptesis de que los potros

afectados fueron ms probables endogmica y relacionado con un

solo animal fundador (Figura 2). Bajo este escenario se esperaba que

las personas afectadas sean idnticos por descendencia de la mutacin

causante y flanqueando segmentos cromosmicos. Eso, hemos

analizado los casos la presencia de una regin de la homocigosis con

alelo simultnea compartir cerca de la SNP asociados en el

cromosoma 20. En esta regin los 5 casos de hecho eran

homocigotos, y compartimos alelos idnticos ms de 31 marcadores

SNP consecutivos. Este segmento delinea un intervalo crtico de 952

kb entre los marcadores heterocigotos ms cercanos a cada lado del

bloque de homocigotos compartido (Chr20: 49,164,218-50,115,936;

Figura 3C). Segn el comunicado de anotacin NCBI 101 de la asamblea

EquCab2 el intervalo crtico contiene 6 anotado genes de

codificacin de protenas (PKHD1, IL17A, IL17F, Mcm3,

PAQR8, EFHC1), 2 genes de microARN (MIR206-2, MIR133B)

y 2 loci no caracterizado (LOC102148758 , LOC102148781).

Una inspeccin cuidadosa de estos genes y las bsquedas de bases

de datos de su presunta funcin revel el rin poliqustico y

heptica enfermedad 1 gen (PKHD1) como un excelente

candidato gen funcional para la fibrosis heptica congnita en los

caballos. Las mutaciones en este gen causan autosmica recesiva

del rin poliqustico (ARPKD) la enfermedad en los seres

humanos, tambin conocido como poliquistosis renal y la

enfermedad heptica 1 (OMIM # 263200).

Todo el genoma de re-secuenciacin no revela ninguna variante de ADN perfectamente asociado

Optamos por secuenciar el genoma completo de un potro afectada

y un toro portador heterocigoto obligado de otro caso de generar una

lista completa de variantes con respecto a la referencia del genoma

equino de un caballo pura sangre no afectado. Debido a la herencia recesiva y el efecto letal de la mutacin, que

inicialmente la hiptesis de que muy probablemente una prdida de

funcin de la mutacin que afecta a la secuencia de codificacin de

PKHD1 sera responsable del fenotipo de la fibrosis heptica

congnita. Dentro del intervalo asignado 952 kb, hemos identificado

16 variantes no sinnimas (Tabla 1; Figura S1). Dos de ellos son muy

probablemente debido a errores marco de la jornada en la secuencia

de referencia del genoma como la RefSeq transcripcin ordenador

predicho (XM_001498967.4) contiene dos nucletidos adicionales en

comparacin con la referencia del genoma. Los restantes 14 no

sinnimo variantes eran todas las variantes de sentido errneo en el

gen PKHD1. Las 14 variantes no sinnimas eran homocigotos en el

caso secuenciado y heterocigotos en el portador obligado

secuenciado. Por ltimo, comparamos los datos de secuencia del potro

afectado a todo el genoma secuencias de 28 Franches-Montagnes no afectadas caballos y 18 caballos de otras razas diferentes (Tabla S1). Todas las 14 variantes no sinnimas tambin ocurrieron en caballos de control de otras razas, 12 de ellos an en estado homocigoto. Dos de las 14 variantes no sinnimas slo se encontraron en estado heterocigoto en los caballos de control.

Continuacin, se centr en estas dos variantes, PKHD1: c.6112C.T y PKHD1: c.6845T.A, predijimos que causa la p.H2038Y cambios no conservadores y p.I2282N en el nivel de



Figura 1. Fibrosis heptica congnita en caballos Franches-Montagnes. (A) se vea, 2 meses de edad potro. El potro era pequeo para su edad y se muestra una barriga. (B) de hgado de color ampliada y gris del potro afectada con quistes macroscpicamente visibles. (C) Imgenes histolgicas de tejido heptico de un potro con fibrosis heptica congnita. Nota del porto-portal fibrosis en puente marcado y las abundantes conductillos biliares dilatados rodeados de algunas clulas inflamatorias en el tejido fibrtico (H & E, 400x). (D) Imagen histolgica de tejido heptico de un potro no afectado. Tenga en cuenta los pequeos conductos biliares en las reas del portal y la ausencia de fibrosis (H & E 400x).doi: 10.1371 / journal.pone.0110125.g001

protenas (Figura S2). Validamos las variantes mediante secuenciacin Sanger. Posteriormente se confirm que los cinco

potros afectados fueron homocigotos, mientras que sus padres fueron

heterocigotos en comparacin con la secuencia de referencia.

Determinamos los genotipos cohortes ms grandes para estas

variantes y notamos perfecto desequilibrio de unin entre las dos

variantes en ms de 300 caballos investigados. No fue posible

determinar el genotipo de forma fiable la variante c.6112C.T de

nuestras muestras fijadas con formalina y otra de ADN de baja

calidad y embebidas en parafina. Por lo tanto, a continuacin,

genotipo slo c.6845T.A en una gran cohorte de ms de 2.300

caballos. Se observ una asociacin perfecta fuerte, pero no entre

la variante c.6845T.A y el fenotipo heptica fibrosis congnita.

Hemos tenido 1 caso histopatolgicamente confirmado que llev

a la variante slo en estado heterocigoto y tenamos 3 caballos

Franches-Montagnes que eran homocigotos para la variante, pero

no mostr ningn sntoma clnico de hasta al

Figura 2. Pedigree de cinco caballos Franches-Montagnes con fibrosis heptica congnita. Los hombres estn representados por los cuadrados, las hembras de los crculos. Los animales afectados se muestran con smbolos negros llenos, el ao de nacimiento se muestra para todos los animales, y los nmeros de laboratorio FM se dan para animales de los que se dispona de ADN. El defecto gentico causante fue probablemente transmite principalmente a la poblacin por el semental Elu naci en 1964. Todos los potros afectados son endogmicos a este semental y le tanto como paterna y ancestro materno tener. doi: 10.1371 / journal.pone.0110125.g002



Figura 3. Asignacin de la fibrosis heptica congnita en el cromosoma 20, con 5 casos y 12 controles. (A) de Manhattan trama del estudio de asociacin allica de todo el genoma (GWAS). (B) Detalle de la regin asociada. Un nico SNP en la posicin 49643575 super el umbral de significacin de todo el genoma. (C) la cartografa Homocigtica. Las barras azules representan regiones homocigotos con alelos compartidos en los 5 potros afectados. El comn idntica por segmento de descenso entre los 5 animales afectados delinea un intervalo crtico desde Chr20: 49,164,218-50,115,936. doi: 10.1371 / journal.pone.0110125.g003

Tabla de variantes 1. No sinnimo en el intervalo crtico con respecto al conjunto de referencia EquCab 2 de un caballo Franches-Montagnes afectado.

Position on chr. Reference

20 allele Variant allele Gene Variant (cDNA) Variant (protein)

49,398,500 C T PKHD1 c.10796G.A p.R3599H

49,398,692 A C PKHD1 c.10604T.G p.L3535R

49,597,760 A T PKHD1 c.6845T.A p.I2282N 49,630,834 G A PKHD1 c.6112C.T p.H2038Y

49,630,951 T C PKHD1 c.5995A.G p.K1999E

49,709,730 C A PKHD1 c.4462T.G p.A1488S

49,709,928 C T PKHD1 c.4264G.A p.D1422N

49,710,356 G C PKHD1 c.3836C.G p.A1279G

49,710,359 C T PKHD1 c.3833G.A p.R1278Q

49,710,363 A G PKHD1 c.3829T.C p.S1277P

49,710,468 C T PKHD1 c.3724G.A p.E1242K

49,740,355 C T PKHD1 c.1811G.A p.R604Q

49,741,254 C T PKHD1 c.1670G.A p.R557Q

49,766,468 T C PKHD1 c.317A.G p.E106G

50,077,556 G GC EFHC1 Probable error in the reference assembly

50,077,559 G GC EFHC1 Probable error in the reference assembly

doi:10.1371/journal.pone.0110125.t001



menos una edad de 6 aos (Cuadro 2). Basado en el desequilibrio de ligamiento observado perfecta entre c.6112C.T y c.6845T.A, se especula que la variante c.6112C.T mostrara el mismo o un resultado asociacin altamente similares (Tabla S2). Tambin nos encontramos con un nuevo potro del bosque que se homocigotos para ambas variantes y no comunicados a mostrar signos de enfermedad heptica. Como no se encontr ninguna variante no sinnimo de asociacin

perfecta entonces tambin investig todas las dems variantes en el

intervalo crtico. El potro afectado secuenciado lleva a un total de

2.048 homocigotos variantes de secuencia en comparacin con el

genoma de referencia (incluyendo las 16 variantes no sinnimas de la

Tabla 1). El portador obligado secuenciado era heterocigoto para 471

de ellos. Excluyendo variantes que eran homocigticos en cualquiera

de los genomas de control 46 reducen an ms la lista a 64 variantes

(Tabla S2). Slo una de estas 64 variantes era exclusivamente

presentes en caballos Franches-Montagnes. Esta variante, una nica

transicin de base, se encuentra en el medio de un intrn de PKHD1

ms de 4 kb de distancia desde el siguiente lmite de exn. El

genotipo de esta variante en una gran cohorte de caballos y

encontramos 3 casos, que no eran homocigotos para esta variante en

comparacin con slo 1 de las dos variantes PKHD1 no sinnimos

(Tabla 2).

Como la secuencia de referencia del genoma del caballo contiene

tres lagunas en el gen PKHD1 amplificado estas regiones mediante

PCR y se analizaron los productos obtenidos por secuenciacin de

Sanger. La comparacin de los datos de los caballos afectados y no

afectados no revel ninguna indicacin de variantes adicionales

situadas en estas regiones. RNA-seq y la transcripcin de RT-PCR anlisis en el hgado

A continuacin, hemos probado si una variante no codificante o

una variante en un exn del gen desconocido PKHD1 pueden ser

responsables de la enfermedad. Por lo tanto, se realiz un

experimento RNA-seq utilizando ARN de hgado de un afectado y un

caballo de control. Hemos mapeado las lecturas para el genoma de

referencia y produjo una anotacin de genes del gen PKHD1 equina

(Tabla S3). Para la numeracin de los exones en el genoma del

caballo se utiliz la transcripcin humano isoforma PKHD1 1 como

referencia, que se deriva de 67 exones en el genoma humano. Todos

menos uno de los 67 exones humanos tambin estuvieron presentes

en el caballo. El exn 42 humano estaba ausente en los datos de

RNA-seq hgado equino y podra tambin no ser amplificado por RT-

PCR. Estamos, adems, identificaron los empalmados lecturas indicando la

presencia de 9 exones previamente desconocidas en el caballo (Tabla

S3). No enfermedad asociada variante de la secuencia se encuentra

dentro de estos exones PKHD1 recientemente identificados. Todos

los exones PKHD1 especficos 75 caballos fueron transcritas en tanto,

el afectado y el control de los animales. No nos asignamos los exones

identificados recientemente a diferentes transcripciones PKHD1

como el gen PKHD1 obviamente codifica una variedad de variantes

de corte y empalme alternativos [5]. Tambin amplificado

aproximadamente 90% de la secuencia de codificacin de PKHD1

como la superposicin de los productos de RT-PCR a partir de ARN

de hgado de la caja y el control. La posterior secuenciacin de

Sanger de estos productos de RT-PCR confirm los resultados

obtenidos por la RNA-seq y no indica ningn defecto estructural en la

transcripcin PKHD1 del caballo afectado. La cuatificacin y transcripcin especfica del alelo en una portadora obligada Ya que no pudimos identificar un perfectamente asociado variante no

sinnimo que investig si las transcripciones PKHD1 del alelo

asociado a la enfermedad y el alelo de tipo salvaje estaban presentes

en cantidades iguales en una portadora obligada. Se obtuvo una

biopsia de hgado a partir de un portador obligado y se compararon

las proporciones entre los dos alelos de ADN genmico y de cDNA

obtenido por RT-PCR a partir de ARN de hgado. Este experimento

confirm la presencia de cantidades aproximadamente iguales

demandante transcripciones de ambos alelos (Figura 4).

TT

17 a 19

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1

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17

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Figura 4. cuantificacin alelo-especfica de las transcripciones PKHD1. Hemos secuenciado un producto de PCR derivados de ADN genmico y un producto de RT-PCR derivado de ARN de hgado de un semental heterocigticos, que ya haba engendrado un potro afectado y era, por tanto, considera una portadora obligada de la enfermedad causante de la variante. Los electroferogramas muestran proporciones comparables de ambos alelos en el ADN genmico y cDNA. Esto indica que ambos alelos se transcriben en niveles similares y que no hay descomposicin mediada por el antisentido de la transcripcin derivada de la A-alelo asociado a la enfermedad. doi: 10.1371 / journal.pone.0110125.g004 Discusin.

A pesar del mapeo exitoso del lugar geomtrico para fibrosis

heptica congnita en caballos de Franches-Montagnes para una

regin del contenido genmico un gene funcional plausible del

candidato no podramos identificar una variante de secuencia

perfectamente asociada.

Si el fenotipo en estos caballos es de hecho causado por un defecto

en el gen PKHD1, podra ser o bien una variante no sinnimo de

afectar directamente a la funcin de la protena o una variante

reguladora de la expresin de genes que afecta no codificante. Hemos

sistemticamente-ATED evala todas las variantes no sinnimas y

encontraron dos variantes fuertemente asociados, pero para estas dos

variantes encontramos raros caballos no afectados que tambin eran

homocigotos para estas variantes. Debido a la fuerte asociacin de la

variante c.6845T.A se utiliza actualmente en la seleccin asistida por

marcadores para las decisiones de cra. Aprox-madamente el 14% de

la poblacin actual Franches-Montagnes son heterocigotos para esta

variante y apareamientos entre animales heterocigotos estn

actualmente prohibidos. Tiene que ser advertido que no se conocen

todos los exones del gen PKHD1, pero evalu regiones por lo menos

todas transcritas que podramos identificar despus de un experimento

RNA-seq a partir de ARN de hgado.

Tambin tratamos de investigar sistemticamente todas las variantes

no codificantes en el intervalo crtico, que por supuesto es difcil

debido al tamao de la regin investigada y una imperfecta genoma

de referencia equina. Nuestros datos sostienen con mucha fuerza

contra una variante causal reguladora por dos razones: Por un lado, no

encontramos las variantes que eran ms fuertes asociados de las dos

variantes no sinnimas. Slo se encontr una variante intrnica con

fuerte asociacin, que tambin fue privado de la raza Franches-

Montagnes. Sin embargo, esta variante era heterocigota en 2 de

nuestros casos, que eran homocigotos para tanto de las variantes no

sinnimas. Esto sugiere que esta variante intrnica se origin muy

recientemente por un evento de mutacin de la enfermedad haplotipo

asociado despus de que adquiri la mutacin causante de la

enfermedad. Por otro lado el anlisis cuantitativo de las

transcripciones de PKD1 especficos de alelo de un animal portador

heterocigoto no mostr grandes diferencias en la cantidad de PKHD1

mRNA, ya sea del tipo salvaje o el alelo asociado a la enfermedad,

que tambin sostiene firmemente contra un regulador de la

transcripcin variante que afecta. Estos resultados ponen de relieve que la fibrosis heptica congnita

en los caballos Franches-Montagnes probablemente no hereda de

modo autosmico recesivo estrictamente monognica con penetrancia

completa. Posiblemente una o ambas de las variantes de la secuencia

sin sentido asociadas son patgenas, pero no totalmente penetrante,

por ejemplo, debido a las interacciones epistticas desconocidos en el

genoma.

Entre los ms de 2.300 caballos probados slo encontramos 5

caballos, que llevan a las variantes potencialmente patgenas en

estado homocigoto y no estaban claramente afectados. Uno de estos

caballos era un potro Franches-Montagnes en una cohorte

prospectiva. Se examin cuidadosamente y repetidamente por

especialistas clnicos hasta la edad de 6 meses sin ningn signo de

enfermedad. Un ultrasonido del hgado a la edad de 6 meses fue

completamente normal. Se pidi a los propietarios a reportar

cualquier cambio en el estado de salud a nosotros inmediatamente.

Sin embargo, cuando queramos volver a examinar este potro a los 12

meses de edad, los propietarios nos dijeron que tenan que masacr en

el nterin. Sospechamos que este caballo fue afectado con una

aparicin muy tarda de la enfermedad o que la enfermedad fue

suprimida por el gen modificador hipottica (s). Los cuatro caballos

discrepantes restantes eran 3 adultos caballos Franches-Montagnes y

un adulto nuevo potro del bosque, donde los propietarios no

informaron signos clnicos manifiestos. Especulamos que la

enfermedad heptica en estos caballos de nuevo ha sido suprimida por

el gen modificador hipottico (s).

Finalmente, tuvimos una potro Franches-Montagnes que tena los sntomas clnicos tpicos de la fibrosis heptica congnita, pero lleva slo una copia del haplotipo enfermedad asociada. Creemos que este caballo podra haber adquirido una segunda mutacin patognica independiente en el otro alelo PKHD1. Sin embargo, por desgracia, el ADN de este animal era de calidad

insuficiente para todo un experimento de secuenciacin del genoma y, por tanto, no hemos podido confirmar esta hiptesis.

En conclusin, este estudio proporciona un modelo animal

grande de origen natural para el subtipo restringido el hgado de

ARPKD humana. El fenotipo caballo est fuertemente asociado con variantes en el gen PKHD1. Este estudio pone de manifiesto

que la identificacin de mutaciones causantes de rasgos

mendelianos sigue siendo una tarea difcil, si las variantes

subyacentes se encuentran en los genes no codificantes regiones o

mal anotados. La imperfecta correlacin genotipo-fenotipo

posiblemente sugiere la presencia de genes modificadores

adicionales. El conocimiento de la enfermedad vinculada SNPs

permite la seleccin indirecta hacia la erradicacin de la enfermedad de la raza de caballos Franches-Montagnes. Materiales y Mtodos. Declaracin de tica

Todo animal de trabajo se ha realizado de acuerdo con las

directrices nacionales para el bienestar animal. La coleccin de la

biopsia del hgado de un caballo no afectado fue aprobado por el

cantn de Berna (nmero de permiso BE114 / 12). La recoleccin de

muestras de sangre de los caballos afectados no fue aprobado por el

cantn de Vaud (permitir no. 2227). Muestras de sangre de los

caballos CLF afectados fueron tomadas con fines de diagnstico. Las

muestras de hgado de caballos CLF afectados fueron tomadas post

mortem. As, la recogida de muestras de los caballos afectados CLF

no constitua un experimento con animales y no necesitarn

autorizacin adicional. Todas las muestras fueron tomadas con el

consentimiento de los propietarios o se presentaron voluntariamente

por los propietarios con fines de diagnstico. Caballos afectados CLF

fueron masacrados o bien (matadero Thun), sacrificados por razones



humanitarias, o murieron a consecuencia de su enfermedad. Ningn

animal fue sacrificado para este estudio.

El protocolo para la eutanasia de CLF afectados potros

involucrados sedacin de la yegua por inyeccin intravenosa de 1 mg

/ kg de xilazina, si el potro era todava con la yegua. Posteriormente,

un catter intravenoso se situ en la vena yugular del potro con

anestesia de lidocana en el sitio de colocacin. A continuacin, el

potro fue sedado mediante inyeccin de 1 mg / kg de xilazina en el

catter. Aproximadamente 5 minutos despus de la inyeccin de la

sedacin, la yegua se separ de la potro y el potro afectado CLF fue

sometido a eutanasia por inyeccin de 90 mg / kg de pentobarbital en

el catter. Seleccin Animal

Un total de 2,123 caballos Franches-Montagnes fueron investigados

en este estudio. Estos incluyeron un total de 25 casos afectados con

fibrosis heptica congnita y al menos algo de ADN para el anlisis

gentico disponible. Las muestras de los casos se recogieron en un

perodo de 30 aos (1984-2013), e incluyen por ejemplo, en parafina

hgado muestras de tejidos animales fijado en formol de los anlisis

histopatolgicos de casos antiguos.

Nuestra cohorte incluy a 2.098 caballos Franches-Montagnes que

consideramos como caballos de control no afectados. stos

incluyeron 173 Franches-Montagnes sanos mayores de 5 aos con

ningn reporte de la enfermedad heptica, hasta el punto de muestreo

de tiempo. El otro 1925 Franches-Montagnes eran o menor de 5 aos,

o ninguna informacin sobre el estado de su edad o salud estaba

disponible.

Utilizamos adicionalmente 234 caballos no afectados de los

genticamente diversas razas de caballos (Tabla S1, el cuadro S2).

Aislamiento del ADN y genotipado de SNP

Se aisl el ADN genmico de EDTA muestras de sangre y tejidos con

el kit Nucleon Bacc2 (GE Healthcare). El aislamiento de ADN

genmico de muestras de tejido embebidas en parafina se llev a cabo

usando el kit de DNeasyBlood y Tissue (QIAGEN) combinar el

protocolo para el tratamiento previo de tejido embebido en parafina y

el protocolo de spin-columna para la purificacin de ADN total a

partir de tejido animal como se recomienda por el fabricante. El ADN

de 5 casos recientes con buena calidad del ADN y 12 controles se

genotipo por GeneSeek con el EquineSNP70 Genotipado BeadChip

(iluminacin), incluyendo 65.157 SNPs distribuidos uniformemente.

Asociacin de todo el genoma y la cartografa homocigtica Utilizamos v1.07 PLINK [19] para realizar anlisis-Asociacin

de todo el genoma completo (GWAS). Los 5 casos y 12 controles que se utilizan para el anlisis tenan llamar tasas 0,90%. Hemos eliminado los marcadores con tarifas de llamadas, 90% y con menor frecuencia alelo (MAF), 5%. Todos los marcadores restantes se encontraban en equilibrio de Hardy-Weinberg (p.1025). El ltimo conjunto de datos constaba de 17 caballos y 38 394 SNPs. Se realiz un estudio de asociacin allica y determinamos un umbral de significacin emprica mediante la realizacin de 100.000 permutaciones del conjunto de datos con fenotipos asignados arbitrariamente.

Se analizaron las regiones de la homocigosis compartida entre los 5 casos en el cromosoma 20 mediante inspeccin visual de los genotipos en un archivo-Excel. Tambin se realiz una bsqueda homocigosis con PLINK v1.07 utilizando los siguientes

parmetros: -homocigotos grupo de homocigotos -homocigotos kb 500 -homocigotos-SNP 25 -homocigotos-partido 0.95 - homocigotos-het 1. La regin homocigotos en el cromosoma 20 fue la nica regin en la totalidad del genoma que cumplieron con los criterios de bsqueda usando estos parmetros.

Todo el genoma re-secuenciacin

Preparamos las bibliotecas de fragmentos con un tamao de

inserto de 200 pb-300 pb y recogimos un carril de Illumina

HiSeq2000 extremo emparejado

lee (26100 bp) por genoma. Archivos FASTQ fueron creados

usando Casava 1.8. Se obtuvieron un total de 234 536 171

(caballo afectado) y 568567625 (portador) de extremo

emparejado lee que despus se correlaciona con el genoma de

referencia caballo Amplio / equCab2.0 y alineado usando

Burrows-Wheeler alineador (BWA), versin 0.5.9-R16 [20] con

la configuracin predeterminada. El mapeo mostraron

204.062.157 y 517.388.289 lee tenido posiciones cartogrficas

nicas que revelan ms o menos una cobertura de 7.55x y 19.1x,

respectivamente. El archivo SAM generada por BWA luego se

convirti en BAM y la lee ordenadas segn cromosomas

utilizando samtools (http: //. Samtools sourceforge.net/).

Duplicados de PCR fueron marcados usando herramientas Picard

(http://sourceforge.net/projects/picard/). Se utiliz el Kit de

Herramientas de Anlisis Genmico (GATK versin 2.4.9, [21])

para realizar reajuste local y para producir archivos BAM

limpiadas. Llamadas Variante Despus se hicieron con el mdulo

genotipo unificada de GATK. Tambin se realiz una inspeccin

visual de la alineacin lee en la genmica espectador integradora

(IGV, [22]) para buscar grandes variantes estructurales. Sin

embargo, este anlisis no indic ninguna variacin estructural

dentro del intervalo crtico. Los datos de variantes para cada muestra se obtuvo en formato

variante llamada (versin 4.0) como las llamadas primas para todas las muestras y sitios recompensadas con el mdulo variante filtracin de GATK. Filtracin Variante se realiz siguiendo mejor documentacin prctica de GATK versin 4. El software snpEFF [23], junto con la amplia / equCab2.0 anotacin Ensembl versin 2.69 se utiliz para predecir los efectos funcionales de variantes detectadas. Secuencia de RNA

Se aislaron ARN total de hgado de un afectado y un caballo no

afectado y preparamos dos bibliotecas de fragmentos con 350 pb

tamao de inserto siguientes de Illumina TruSeq ARNm Muestra

Gua de preparacin y medio recogido de un carril de Illumina

HiSeq2000 extremo emparejado lecturas (26100 pb) por biblioteca

obtencin 152265046 (caballo afectado) y 121 033 908 etiquetas

(caballo no afectado). Hemos trazado las lecturas a la referencia del

genoma del caballo (Broad / equCab2.0) utilizando el programa

TopHat2 empalmados alineacin con los parmetros por defecto [24].

Se realiz Leer conteo y la expresin diferencial de genes anlisis

utilizando software Gemelos 2.0 [25]. RT-PCR

Utilizando las mismas muestras de ARN de hgado descritos

anteriormente tambin amplifica el ADNc PKHD1 desde la posicin

252 a 10.706 como una serie de 9 superposicin de los productos de

RT-PCR usando SuperscriptII (Life Technologies) y

AmpliTaqGold360 Mastermix (Life Tech-tecnologas) segn las

recomendaciones del fabricante. Una transcripcin que contiene la

secuencia completa de codificacin PKHD1 equina se ensambla a

partir de los datos de RNA-seq y secuencias de Sanger derivados de

los productos de RT-PCR (Figura S3). Secuencia de Sanger Las variantes asociadas se genotipo por la re-secuenciacin de los

productos de PCR especficos utilizando tecnologa de

secuenciacin de Sanger. Los productos de PCR fueron

amplificados utilizando AmpliTaqGold360 Mastermix (Life

Technologies) y los productos fueron secuenciados directamente

en un ABI 3730 secuenciador capilar (Life Technologies) despus

del tratamiento con exonucleasa I y fosfatasa alcalina de gamba.

Secuencia de los datos se analizaron con Sequencher 5,1

(GeneCodes). Informacin de apoyo

Figure S1 Alignment of the human PKHD1 protein (NP_619639.3) to

the equine PKHD1 protein derived from a non-affected horse

(translated from the sequence given in Figure S3).



(DOCX) Figura S2 Conservacin del residuo histidina en la posicin 2038 y el

residuo isoleucina en la posicin 2282 en la protena PKHD1. (DOCX) Figura S3 Secuencia de una transcripcin PKD1 equina predicho, que

fue montado a partir de productos de RT-PCR secuenciado Sanger y

datos de RNA-seq. Esta secuencia de mRNA ensamblado se deriva de

diferentes caballos y no se parece necesariamente un haplotipo

contigua. (TXT) Tabla S1 Caballos utilizados para la secuenciacin del genoma. (DOCX) Tabla S2 genotipos de 64 variantes en el intervalo crtico, que eran

homocigotos variante en el genoma se-extingui de un potro afectado

Franches-Montagnes y, o bien de tipo salvaje homocigotos o

heterocigotos en las secuencias del genoma de 29-lun-tagnes

Franches no afectadas caballos y 18 caballos no afectado de otras

razas. (DOCX) Referencias

1. Harris PC, Torres VE (2009) Polycystic kidney disease. Annu Rev Med 60: 321 337.

2. Adeva M, El-Youssef M, Rossetti S, Kamath PS, Kubly V, et al. (2006) Clinical and molecular characterization defines a broadened spectrum of autosomal recessive

polycystic kidney disease (ARPKD). Medicine (Baltimore) 85: 121. 3. Gunay-Aygun M (2009) Liver and kidney disease in ciliopathies. Am J Med

Genet C Semin Med Genet 151C: 296306. 4. Zhang MZ, Mai W, Li C, Cho SY, Hao C, et al. (2004) PKHD1 protein

encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 23112316.

5. Onuchic LF, Furu L, Nagasawa Y, Hou X, Eggermann T, et al. (2002) PKHD1, the polycystic kidney and hepatic disease 1 gene, encodes a novel large protein containing multiple immunoglobulin-like plexin-transcription-factor domains and parallel beta-helix 1 repeats. Am J Hum Genet 70: 13051317.

6. Ward CJ, Hogan MC, Rossetti S, Walker D, Sneddon T, et al. (2002) The gene mutated in autosomal recessive polycystic kidney disease encodes a large, receptor-like protein. Nat Genet 30: 259269.

7. Nagao S, Kugita M, Yoshihara D, Yamaguchi T (2012) Animal models for human polycystic kidney disease. Exp Anim 61: 477488.

8. Sanzen T, Harada K, Yasoshima M, Kawamura Y, Ishibashi M, Nakanuma Y (2001) Polycystic kidney rat is a novel animal model of Carolis disease associated with congenital hepatic fibrosis. Am J Pathol 158: 16051612.

9. Moser M, Matthiesen S, Kirfel J, Schorle H, Bergmann C, et al. (2005) A mouse model for cystic biliary dysgenesis in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD). Hepatology 41: 11131121.

10. Gallagher AR, Esquivel EL, Briere TS, Tian X, Mitobe M, et al. (2008) Biliary and pancreatic dysgenesis in mice harboring a mutation in Pkhd1. Am J Pathol 172: 417429.

11. Wallace S, Blanchard T, Rabin L, Dick E, Allan J, et al. (2009) Ductal plate malformation in a nonhuman primate. Vet Pathol 46: 8487.

12. Bourque AC, Fuentealba IC, Bildfell R, Daoust PY, Hanna P (2001) Congenital hepatic fibrosis in calves. Can Vet J 42: 145146.

13. Yoshikawa H, Fukuda T, Oyamada T, Yoshikawa T (2002) Congenital hepatic fibrosis in a newborn calf. Vet Pathol 39: 143145.

Tabla S3 Equina PKHD1 anotacin. (XLSX) Agradecimientos Los autores desean agradecer a Miche`le Ackermann, Brigitta Colomb, y Muriel Fragnie`re por su excelente asistencia tcnica. Los estudiantes de

pregrado Nathalie Albrecht, Sarah Gerber, y Arle`ne Marchand son

reconocidos por ayuda con la adquisicin de muestras y genotipado. Estamos muy agradecidos a Nadina Ortiz Bruchle para discusiones

crticas y comentarios tiles. La plataforma de secuenciacin de prxima

generacin de la Universidad de Berna es reconocido por la realizacin de experimentos de secuenciacin de Illumina y la TI-Vital centro de

computacin de alto rendimiento del Instituto Suizo de Bioinformtica

para realizar tareas computacionalmente intensivas (http: // www.vital-it.ch /). Contribuciones de los autores Concebido y diseado los experimentos: VG SR CD TL. Realizado los experimentos: MD VJ MMW CG. Analizados los datos: MD VJ MMW CG CD TL. Aportados reactivos / materiales / herramientas de anlisis: RS DB HS-H P-AP SK RVN JT GT. Contribuy a la redaccin del manuscrito: MD VJ CG TL.

14. Zandvliet MM, Szatmari V, van den Ingh T, Rothuizen J (2005) Acquired

portosystemic shunting in 2 cats secondary to congenital hepatic fibrosis. J Vet Intern Med 19: 765767.

15. Brown DL, Van Winkle T, Cecere T, Rushton S, Brachelente C, et al. (2010) Congenital hepatic fibrosis in 5 dogs. Vet Pathol 47: 102107.

16. Stocker H, Kaser-Hotz B, Lischer C, Zahn I, Ehrensperger F (1996) Congenital bile duct cysts and liver fibrosis in a foal. Tierarztl Prax 24: 4447.

17. Straub R, Herholz C, Tschudi P. Gerber V, von Tscharner C, et al. (2003) Intrahepatische Gallengangszysten (Caroli-Erkrankung) und Leberfibrose beim Freiberger Fohlen. Tierarztl Prax 31: 162165.

18. Haechler S, Van den Ingh TS, Rogivue C, Ehrensperger F, Welle M (2000) Congenital hepatic fibrosis and cystic bile duct formation in Swiss Freiberger horses. Vet Pathol 37: 669671.

19. Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MAR, et al. (2007) PLINK: a toolset for whole-genome association and population-based linkage analysis. Am J Hum Genet 81: 559575.

20. Li H, Durbin R (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25: 17541760. doi:10.1093/bioinformatics/ btp324.

21. McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, et al. (2010) The genome analysis toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res 20: 12971303.

22. Thorvaldsdottir H, Robinson JT, Mesirov JP (2013) Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform 14: 178192.

23. Cingolani P, Platts A, Coon M, Nguyen T, Wang L, et al. (2012) A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly 6: 8092.

24. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, et al. (2013) TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol 14: R36.

25. Trapnell C, Roberts A, Goff L, Pertea G, Kim D, et al. (2012) Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc 7: 562578.

fibrosis hepática congénita en el caballo franches-montagnes es asociada con el riñon...

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