Fecundación in vitro

La fecundación in vitro (FIV o IVF por sus siglas en inglés) es una técnica por la cual la fecundación de los ovocitos por los espermatozoides se realiza fuera del cuerpo de la madre. La FIV es el principal tratamiento para la esterilidad cuando otros métodos de reproducción asistida no han tenido éxito. El proceso implica el control hormonal del proceso ovulatorio, extrayendo uno o variosovocitos de los ovarios maternos, para permitir que sean fecundados por espermatozoides en un medio líquido. El ovocito fecundado (que algunos denominan como preembrión) puede entonces ser transferido al útero de la mujer, en vistas a que anide en el útero y continúe su desarrollo hasta el parto.

Indicaciones

Inicialmente la FIV se desarrolló para superar situaciones de infertilidad debidos a problemas en las trompas de Falopio, pero posteriormente se observó que la técnica tenía éxito también en otros casos de infertilidad. La introducción de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) soluciona en gran medida los problemas de infertilidad masculina.

Para que un tratamiento de FIV tenga éxito, es necesario disponer de ovocitos sanos, espermatozoides que puedan fecundarlos y unútero que pueda mantener un embarazo. Aunque en algunos países los tratamientos de FIV están cubiertos por los servicios sanitarios sociales, normalmente se recurre a esta técnica cuando otras opciones han fallado, debido a que la FIV conlleva costos elevados.

La FIV puede utilizarse también en mujeres menopáusicas, utilizando ovocitos procedentes de una donante. Asimismo es una técnica que puede

considerarse en pacientes que han sufrido una pérdida total o parcial de fecundidad debido a un tratamiento agresivo frente a una patología grave (como el cáncer).

Método

Estimulación ovárica

Generalmente la fecundación in vitro es iniciada en el tercer día de la menstruación y consiste de un régimen de medicación para estimular el desarrollo de folículos múltiples en los ovarios. En la mayoría de las pacientes se emplean inyecciones de gonadotropinas(generalmente análogos de la FSH), realizando controles frecuentes de los niveles de estradiol, y del crecimiento folicular mediante ultrasonografía ginecológica. Normalmente se necesitan 10 días de inyecciones. La ovulación espontánea durante el ciclo se previene por el uso de agonistas GnRH (aGnRH) o antagonistas GnRH (agGnRH), que bloquean el surgimiento natural de la hormona luteinizante (LH). Ambas generan, en otras palabras, lo que se conoce como un hipogonadismo hipogonadotrofo reversible. Sin embargo, los agonistas de la GnRH se diferencian de los antagonistas principalmente porque su efecto no es inmediato, sino que desencadenan en primera instancia un pico de FSH y LH (efecto flare-up), produciéndose un bloqueo posterior en la liberación de gonadotropinas por el desacople de los receptores de GnRH de la cascada de activación. Sin embargo, existen diferentes protocolos de estimulación que varían en el día de inicio, medicamentos empleados y métodos para prevenir e inducir el pico de la hormona luteinizante (LH).

Básicamente, si en el laboratorio el equipo se decanta por un tratamiento con aGnRH, se pueden escoger entre un protocolo corto y uno largo:

- Protocolo largo: los agonistas de la GnRH se suministran a la paciente varios días antes del nuevo ciclo y durante la administración de las gonadotropinas exógenas. Entre sus múltiples ventajas destaca que, con él, se asegura la no liberación prematura de LH, lo que garantiza la invalidación de toda ovulación precoz. A su vez, este hecho permite al embriólogo planificar sin margen de error la fecha de la captación folicular. Por otra parte, se asegura que el desarrollo de los folículos se sincronice. Desgraciadamente, con la aplicación de este protocolo, la probabilidad de que se produzca un síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) se multiplica, y se requiere un soporte de fase lútea (administración de progesterona), así como una mayor cantidad de gonadotropinas.

- Protocolo corto: los agonistas de la GnRH comienzan a suministrarse en los primeros días del ciclo, casi al mismo tiempo que las gonadotropinas exógenas. La principal virtud de este procedimiento es que consigue mejores resultados en mujeres con baja respuesta, aunque este hecho aún no ha sido completamente demostrado. Por contra, la aplicación de este protocolo multiplica el riesgo de que se produzcan picos de LH (induciendo entonces una ovulación precoz) y no posibilita un desarrollo sincrónico de los folículos. En definitiva, se establece control sobre el desarrollo folicular mucho menor.

Por otra parte, cuando se emplean antagonistas de la GnRH, sólo se establece un protocolo, en el cual se administra la sustancia bloqueante varios días después del inicio del ciclo, al mismo tiempo que se suministran gonadotropinas recombinantes o purificadas de la orina.

Los protocolos de estimulación ovárica se han convertido en complejos y costosos. Por esto, parece haber una tendencia a nivel mundial dirigida a reducir la cantidad y la dosis de los medicamentos empleados durante la estimulación con el fin de reducir los riesgos y costos asociados a estos tratamientos [7]. Ejemplo de estos esfuerzos son los tratamientos FIV con Ciclos Naturales, además de los protocolos FIV con mínima estimulación desarrollados por los doctores John Zhang en NY [8], el Dr. O. Kato en Tokyo [9], y el Dr. Chávez-Badiola en México [10].

Extracción de ovocitos

Cuando se considera que la maduración de los folículos es adecuada, se administra a la paciente gonadotropina coriónica humana ( -hCG) o βalgún agonista de la GnRH. La primera actúa como un análogo de la hormona luteinizante (LH); mientras que la segunda induce un disparo de la propia hormona luteinizante (LH). En cualquiera de los casos, el medicamento provocará la ovulación alrededor de 36 horas después de la inyección, pero el procedimiento de extracción tiene lugar justo antes de que esto ocurra.

La extracción de los ovocitos se programa unas 36 horas después de la inducción de la ovulación y se realiza por vía transvaginal, utilizando una aguja guiada por ultrasonido, que pincha la pared vaginal para alcanzar los ovarios. Un médico aspira los folículos ayudado por un ecógrafo y recoge el líquido folicular en unos tubos que serán introducidos a un termobloque hasta que pasen al laboratorio. El líquido folicular es un fluido amarillento y seroso que contiene linfocitos y células de la granulosa aisladas o formando cúmulos con o sin ovocitos. A medida que se punciona el ovario el líquido folicular se vuelve de color rojo (hemático) debido a la hemorragia provocada por la punción. La sangre

es tóxica para el ovocito pues contiene muchos anticuerpos, por lo que una vez que se termine la punción habrá que eliminarla. Este paso se realiza en el laboratorio, donde se procesa el líquido de la punción con el objetivo de recuperar los ovocitos contenidos en el líquido; de esta manera se obtendrán los ovocitos, se hará un lavado de los mismos y se clasificarán según su morfología. Estos tres pasos se tienen que realizar en el menor tiempo posible para evitar el efecto de la temperatura, a la que los ovocitos son muy sensibles, y el daño producido por el líquido hemático.

Temperatura: el ovocito es el elemento más sensible a la temperatura de todo el laboratorio. Si ésta bajo de 34 °C el huso meiótico despolimerizará, y cuando se vuelva a forma puede crear anomalías cromosómicas, de forma que el ovocito será fecundable pero no dará lugar a un embrión normal.

Se deben aislar los complejos cúmulo-corona-ovocitos que se llegan a observar a simple vista (varios mm de diámetro).

Medios: durante este proceso se emplean diferentes medios de cultivo con diferente composición:

En los tubos: 0,1ml de medio tamponado (HEPES) con heparina para evitar la formación de coágulos.

El medio HEPES (que debe estar desde el día anterior a ser utilizado en una estufa a 37 °C) acumulará temporalmente los cúmulos mientras se realiza la punción. Además será empleado para lavar y reducir el tamaño de los cúmulos antes de pasar al incubador.

Placas de cultivo: con un medio simple rico en glucosa (por ejemplo HTF + HSA 10 mg/ml) para mantenerlos en el incubador al 5% dióxido de

carbono. El medio debe estar desde el día anterior a ser utilizado en el incubador a 37 °C y 5% de dióxido de corbono.

Las punciones se programan normalmente cada 30 minutos aunque la búsqueda de los ovocitos no suele durar más de 15 minutos. En estos procesos se utiliza anestesia local, general o parcial para evitar el dolor producido por la punción.

Existen 3 estadios de maduración en los cúmulos que se extraen por punción folicular, a saber:

- Grado I (Maduración nuclear MII): El cúmulo y la corona del ovocito presentan un aspecto expandido. Es el estado en el cual el ovocito presenta una mayor maduración y sólo los de este tipo son los que se utilizan en técnicas de reproducción asistida más refinadas, como el ICSI.

- Grado III (Maduración nuclear VG): El ovocito destaca por la gran compactación del cúmulo, el cual cuenta con pocas células, muy fijadas a la zona pelúcida (ZP).

- Grado II (Maduración nuclear MI): El ovocito presenta un aspecto intermedio entre los dos estadios anteriores.

Esta clasificación trata de describir el ovocito y su estado de maduranción nuclear estando rodeado de células del cúmulo y la corona.

Morfología: para observar bien el ovocito habría que colocarlo en muy poca cantidad de medio para esparcir las células de granulosa. De forma que la ventaja de saber el estado madurativo no parta ningún beneficio frente a la manipulación que representa el poder conocerlo.

Es por ello que actualmente esta clasificación no tiene gran relevancia y no debe dársele mayor importancia, salvo para indicar características que

se salgan especialmente de lo considerado como normalidad: cúmulos o coronas de aspecto apoptótico o postmaduro, presencia de sangre...

Fecundación

Una vez en el laboratorio, los complejos cúmulo corona ovocito extraídos se lavan en medio HEPES para mantener el pH, recortando las células de la granulosa que los rodean y preparándolos para la fecundación. Los ovocitos deben permanecer al menos 4 horas en el incubador (medio simple rico en glucosa) hasta su inseminación, es decir, aproximadamente 40 horas tras la inducción de la ovulación que sería el momento de la ovulación espontánea.

Al mismo tiempo, el semen se prepara para la fecundación, eliminando las células inactivas, el fluido seminal y se realiza su capacitado. Los parámetros adecuados de semen capacitado para realizar FIV son: 5-10 millones de espermatozoides por mililitro, más de 75% de espermatozoides móviles progresivos y más de 1% de formas normales. Si la muestra seminal posee valores inferiores a los anteriores, se recurre a ICSI en lugar de FIV. Si el semen proviene de un donante, probablemente habrá sido preparado antes de ser congelado y puesto en cuarentena, y cuando sea descongelado estará listo para usar.

Existen distintos protocolos de FIV pero todos se basan en el mismo principio: el esperma y el ovocito se incuban juntos (en un ratio de aproximadamente 75.000:1) en un medio de cultivo simple con glucosa durante unas 18 horas. Concentraciones superiores de espermatozoides pueden producir fecundaciones anómalas (poliespermia) y una menor concentración de espermatozoides puede producir fallos de fecundación.

Trascurrido 16-18 horas se comprueba la fecundación, que ya debería haber ocurrido. Como los ovocitos se fecundan en los primeros 20 minutos de exposición. Hay autores que a la media hora lavan los ovocitos para evitar la exposición a ROS, que pude formarse por la presencia de espermatozoides muertos.

El cigoto humano de 15 a 20 horas tras la concepción permanece en el estadio de pronúcleos (PN). Se considera que la fecundación es correcta cuando el cigoto presenta dos PN y dos corpúsculos (CP). A veces es difícil interpretar los CP y se valoran como correctamente fecundado cualquier embrión con dos PN. Cualquier otra combinación se considera anormal y se descarta. La mayoría de las veces aparece primero el PN paterno en la posición central y el materno se acerca más tarde. Para poder valorar correctamente la fecundación, es necesario decumular previamente el cigoto. Es importante que en FIV no se decumule el ovocito antes de la fecundación, ya que conlleva alta probabilidad de polispermia.

El óvulo fecundado se pasa a un medio de cultivo simple (como HTF/HSA) o secuencial (G1 de Vitrolife) y se mantiene durante alrededor de 48h hasta que alcanza el estadio de 6-8 células.

Embrión de 8 células listo para ser transferido.

Hay estudios realizados que demuestran que la liofilización del esperma de ratón permite el desarrollo de embriones normales tras la inyección de ovocitos.