GUÍA DE TRABAJO Ingeniería Biomédica

Código FDE 048

Versión 03

Fecha 2009-06-09

1. IDENTIFICACIÓN Nombre guía: Extracción de ADN mediante el uso de kits comerciales.

Asignatura Bioquímica Médica II Guía No. 8

Área Ciencias Básicas de la

Ingeniería Nivel 4

Código BMO42 Pensum 3

Correquisito(s) AYO4 Prerrequisito(s) CDO24, BMO32

Créditos 2 TPS 4 TIS 2 TPT 64 TIT 32

TRABAJO INDEPENDIENTE TRABAJO PRESENCIAL

Trabajo Teórico

Trabajo Práctico

Trabajo Teórico

Trabajo Práctico

4h

COMPETENCIAS CONTENIDO TEMÁTICO INDICADOR DE LOGRO

Uso de herramientas computacionales y de laboratorio para el análisis de ácidos nucleicos.

Técnicas de Biología Molecular. Extracción de ácidos nucleicos a partir de kit comercialmente disponibles.

Comprende y utiliza las metodologías disponibles para el estudio de los ácidos nucleicos.

2. RECURSOS REQUERIDOS

2.1 Instalaciones

Laboratorio de Ingeniería Biomédica H-105, Campus Robledo

2.2 Equipos

Centrífuga para microtubos (1,5 ml – 2 ml), con capacidad de hasta 10,000 x g

Baño serológico o placa de calentamiento 37ºC - 55ºC

Vortex 2.2.1 Indicaciones sobre el manejo del equipo

Microcentrífuga: Será manejada únicamente por el personal del laboratorio o el docente

1. Encender y oprimir para abrir la cubierta. 2. Ubicar los tubos para microcentrífuga en el rotor asegurando que cada brazo del

rotor contenga la misma cantidad de volumen al frente (en caso de no tener muestras pares, llenar con agua un tubo del mismo tamaño con el mismo volumen de la muestra).

3. Programar la centrifuga a más de 10000 x g durante el tiempo requerido.

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4. Al finalizar el centrifugado no abrir la cubierta hasta que el rotor deje de girar totalmente.

Baño Serológico: 1. Llenar con agua destilada estéril hasta el nivel indicado. 2. Encender y programar a 37ºC o 55ºC por el tiempo requerido. 3. Cuando termine la práctica completa, apagar el equipo.

2.3 Herramientas

(1) Micropipeta de volumen variable 100 μl - 1000 μl

(1) Micropipeta de volumen variable 0,5 μl - 20 μl 2.4 Reactivos

Desinfectante (Etanol al 70% o Alcohol Yodado)

Etanol 96% - 100%

Buffer de Lisis/Adsorción (Genomic Lysis/Binding Buffer)

Buffer de Digestión (Genomic Digestion Buffer)

Buffer de lavado 1 (Genomic Wash Buffer 1)

Buffer de lavado 2 (Genomic Wash Buffer 2)

Proteinasa K (20mg/ml)

RNasa A diluida en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, EDTA 10 mM

Buffer Genómico de elución (10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.1 mM EDTA) (Genomic Elution Buffer)

Agua estéril con pH 7,0 – 8,5 2.5 Materiales

Guantes

Bata

Gafas de laboratorio

Guardianes para desecho de corto-punzantes

Canecas de bolsa roja para el desecho de químicos y biológicos

Aguja sistema vacutainer

Camisa sistema vacutainer

Tubo vacutainer tapa lila

Torundas de Algodón

Torniquete

Toallas absorbentes

Tubos de 1,5 ml (microtubos) para Microcentrifuga, estériles y libres de DNasa

Puntas nuevas y estériles con capacidad para tomar micro-volúmenes entre 1 μl y 1000 μl

Columna en tubos de recolección PureLink

Tubos de recolección PureLink

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Fecha 2009-06-09 2.6 Obtención de la muestra La muestra de trabajo corresponderá a sangre total, obtenida en sistema vacutainer con EDTA (tapa lila), mediante venopunción del antebrazo. Para esto, personal especializado en el área de bienestar universitario del ITM – Campus Robledo se encargará de tomar la muestra, siguiendo las guías internacionales de asepsia y bioseguridad. La toma de muestra, será precedida por un consentimiento informado, el cual será proporcionado por el personal del laboratorio y almacenado en el mismo. Una vez tomada la muestra, esta será marcada con un código interno que no identifique el donante. El tubo vacutainer se transportará hasta el laboratorio H-105 envuelto en papel absorbente, usando un doble recipiente con tapa hermética, debidamente identificado con los símbolos de bioseguridad. Una vez en el laboratorio H-105, la muestra será manipulada por el docente o los coordinadores de laboratorio hasta el inicio del procedimiento de extracción de material genético. 3. PROCEDIMIENTO 3.1 Fundamento del Método

Actualmente se cuenta con una gran variedad de métodos para la extracción de ácidos nucleicos. Estos pueden cambiar dependiendo del tipo de muestra (Células en cultivo, sangre, tejido, órganos o microorganismos), la calidad y la cantidad de material a extraer, y si se trata de ADN (Nuclear, mitocondríal) o ARN (ARN total, ARN ribosomal, ARN mensajero o ARN de transferencia). Sin embargo, los pasos generales siguen un mismo algoritmo:

1. Obtención y almacenamiento de la muestra 2. Rompimiento de las estructuras que contienen el material genético 3. Separación del material genético de los componentes homogenizados 4. Precipitación de los ácidos nucleicos 5. Purificación 6. Elusión 7. Preservación del material

Aunque todos los pasos de este procedimiento general son cruciales para el aislamiento de material genético, la obtención de la muestra, su identificación y preservación son vitales para la realización ulterior de análisis sobre el ADN o el ARN. Por regla general, el material obtenido deberá será transportado y almacenado a la menor temperatura posible (Desde 4 hasta -86°C), evitando procesos de descongelación y congelaciones sucesivas. Una vez en el laboratorio el procedimiento tendrá los siguientes propósitos: 3.1.1 Rompimiento de las estructuras que contiene el material genético. Consiste en la liberación de los ácidos nucleicos de las células animales o vegetales, microorganismos o virus presentes en una muestra de interés. Para esto se utilizan soluciones de lisis que generalmente contienen proteasas o sustancias caotrópicas que

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Fecha 2009-06-09 degradan las estructuras protectoras, y emulsificantes de los lípidos presentes en membrana externas y endomembranas. 3.1.2 Separación del material de los componentes homogenizados. Consiste en extraer los restos de las estructuras que contenían a los ácidos nucleicos (principalmente lípidos y peptidos). Se pueden utilizar solventes orgánicos de diferente densidad (fenol, cloroformo) que actúan generando fases diferenciales, permitiendo la separación de los ácidos nucleicos hacia la fase acuosa (superior), y de las proteínas y lípidos hacia la fase orgánica (fase intermedia e inferior). 3.1.3 Precipitación de Ácidos Nucleicos. Se basa en la neutralización de las cargas y la deshidratación de los ácidos nucleicos, utilizando soluciones salinas (NaCl; EDTA; Tris) y alcoholes (etanol, isopropanol), lo que hace que los ácidos nucleicos se precipiten reversiblemente (formación del “pellet”), mediante el uso de centrifugación de alta velocidad. 3.1.4 Purificación. En esta etapa se remueven las sales y alcoholes del sobrenadante, y se lava el “pellet” con etanol al 75%. Este paso puede repetirse varias veces con el fin de obtenerse un extracto de ácidos nucleicos de alta pureza. 3.1.5 Elusión. Sirve para rehidratar los ácidos nucleicos purificados en el “pellet”. Para esta fase se utiliza agua de alta pureza (Grado biología molecular), libre de DNasas o RNasas. Una vez solubilizado el material, este se deberá alicuotar (dividir en pequeñas porciones a otros microtubos) para evitar que los procesos de descongelaciones sucesivas ocasionen el deterioro del material genético. Así mismo, se deberá procurar almacenar el material a la menor temperatura posible. Los Kits comerciales permiten la purificación rápida de ácidos nucleicos a partir de órganos, tejidos y células provenientes de Animales, vegetales, microorganismos y virus. En el caso del presente laboratorio se utilizara un kit estándar (DNA Genómico PureLink) el cual permite la purificación de ADN en muestras de sangre, a través de un método de columna en Silica-Gel. Una vez purificado el ADN, este podrá ser amplificado mediante PCR, digerido por enzimas de restricción, y/o sometido a las diferentes técnicas de ADN recombinante utilizadas en clonación y expresión génica. Específicamente, el Kit DNA Genómico PureLink se basa en el anclaje del DNA a una membrana de silíca-gel, en presencia de sales caotrópicas. La muestra de sangre será digerida con Proteinasa K a 55ºC con la ayuda de una solución estabilizante (Buffer de digestión). Cualquier resto de ARN será destruido (digerido) mediante la digestión con RNasa A la cual ataca específicamente los fosfatos unidos a nucleótidos de pirimidinas (T o C) en presencia de iones monovalentes. El homogenizado es mezclado con etanol y el buffer genómico de adsorción, permitiendo la adherencia del ADN a la membrana de silica en la columna (Ver figura 1). Una vez

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Fecha 2009-06-09 adherido el ADN las impurezas (Lípidos y proteínas) se remueven mediante lavados sucesivos con buffers. Al final del proceso, el DNA genómico podrá ser solubilizado con el Buffer de Elución.

Figura 1. Esquema de la columna de Silica-Gel, permitiendo la adherencia del ADN

3.2 Procedimiento de laboratorio Antes de iniciar el procedimiento tenga en cuenta lo siguiente:

a. Identifique los guardianes o recipientes con bolsa roja que utilizará para desechar el material de plástico contaminado, y los frascos de vidrio debidamente marcados para descartar los reactivos del kit

b. Utilice bata, guantes, gafas de laboratorio y tapabocas para manipular los reactivos del kit y el ADN (Este ácido nucleico es sensible a DNasas presentes en la saliva, la piel y las superficies).

c. Encienda el baño serológico o el bloque seco y póngalo a 55°C d. Limpie la superficie de trabajo con hipoclorito y alcohol antiséptico (70%) e. Coloque papel absorbente debajo de la gradilla donde va a trabajar f. Marque claramente los microtubos en los que se hará el procedimiento,

indicando la fecha, su grupo de trabajo y el curso. Una vez la muestra esté disponible en el laboratorio, realice los siguientes pasos: 3.2.1 Rompimiento de estructuras (Homogenizado)

1. Adicione 20 microlitros (20ul) de proteinasa K en el microtubo estéril de 1,5ml previamente marcado (Deseche la punta de la micropipeta en bolsa roja)

2. Adicione 200ul de la muestra de sangre. Una vez deposite la muestra mezcle 10 veces la solución. Una vez termine de homogenizar, descarte la punta de la micropipeta en el guardián designado.

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3. Adicione 20 ul de RNasa A.

4. Mezcle la solución de manera vigorosa, colocando el microtubo en el Vortex durante 10 segundos.

5. Incube la solución a temperatura ambiente durante 2 minutos

6. Cumplido el tiempo, adicione 200ul del reactivo Lysis/binding buffer y

mezcle con el Vortex durante 10 segundos, hasta obtener una solución homogénea.

7. Incube la solución durante a 55°C durante 10 minutos para promover la

digestión

8. Una vez terminado el tiempo de incubación, adicione 200ul de etanol puro (96-100%), y utilice el Vortex durante 5 segundos para mezclar.

9. Incubar a 55 °C y aplicar vortex ocasionalmente hasta que se complete el

lisado (1-4 h). Para grandes pedazos de tejidos, se puede llevar a cabo el proceso de digestión durante toda la noche.

3.2.2 Separación de los componentes celulares no deseados y purificación del

ADN

10. Tome un tubo de recolección con la columna incluida del Kit PureLink y adicione todo la solución que contiene el ADN (Deposite toda la solución que usted generó en el microtubo estéril al realizar los pasos 1 a 9).

11. Centrifugue la columna a 10,000 x g durante un minuto a temperatura ambiente.

12. Descarte el tubo de recolección PureLink y ponga otro tubo limpio de recolección suministrado por el Kit.

13. Adicione 500μl de Buffer de lavado 1 (Washing buffer 1) a la columna.

14. Centrifuge la columna a una temperatura ambiente a 10,000 x g durante un

minuto.

Los Buffers Genómicos de Lisis/Adsorción y de Lavado 1 Contienen guanidina hidroclorada. Usar siempre bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos cuando se manipulen estos Buffers. No adicionar hipoclorito de sodio o soluciones acidas directamente a las soluciones, preparado de muestras o desechos que contienen guanidina hidroclorada debido a que estos forman reactivos compuestos y generan gases tóxicos cuando se mezclan con hipoclorito o ácidos.

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15. Descarte el tubo de recolección y coloque la columna en otro tubo suministrado por el Kit.

16. Adicione 500 μl de Buffer de Lavado 2 (washing buffer 2) a la columna.

17. Centrifuge la columna con la velocidad máxima durante 3 minutos, a

temperatura ambiente.

18. Descarter el tubo de recolección y ahora vuelva a colocar la columna pero sobre un nuevo microtubo de 1,5 ml estéril (No suministrado por el kit).

19. Adicione 100 μl de Buffer Genómico de Elución PureLink a la columna.

20. Incube a una temperatura ambiente durante un minuto. Centrifuge la

columna a una velocidad máxima durante un minuto a temperatura ambiente. Nota: Aquí, el tubo contiene el ADN genómico purificado.

21. Remover y descartar la columna.

22. Alicuotar y almacenar el ADN purificado a -20ºC, o usar el ADN para una aplicación inmediata.

3.3 Resultados Esperados

3.3.1 Análisis de concentración y calidad del ADN:

Cantidad de ADN Una vez finalizada la purificación de ADN Genómico con el Kit, la concentración de ADN purificado puede ser estimada por Absorbancia a 260 nm; para esto realice el siguiente procedimiento:

– Medir la A260 de la solución en un espectrofotómetro contra un blanco de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 – 8,5.

– Calcular la cantidad de ADN usando la siguiente formula:

– Para ADN la equivalencia es A260= 1 por un 50μg de ADN /ml

Calidad de ADN

Generalmente el ADN que se obtiene por aislamiento con el Kit tiene una relación de A260/A280>1.80, cuando las muestras son diluidas en Tris-HCl (pH 7.5), lo que indica que el ADN es razonablemente limpio de proteínas que

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pueden interferir en estudios posteriores con ADN aislado; para esto, por favor mida la Absorbancia del ADN obtenido a 280nm y realice la operación para determinar la calidad del material obtenido, un valor mayor a 1,80 indica alta pureza.

4. PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME 4.1 Describir que acción tiene cada uno de los componentes del Buffer de Digestión

durante la fase de homogenización.

4.2 ¿Por qué es necesario adicionar RNasa durante el paso de lisado de la muestra?

4.3 Describir que acción tiene cada uno de los componentes del Buffer de Lisis y el Buffer de Adsorción (en inglés Lysis Buffer- Binding Buffer).

4.4 Dibuje como interactúa o cambia el ADN con cada solución utilizada en el procedimiento.

4.5 ¿Qué función cumple el etanol al final del proceso del lisado de la muestra?

4.6 Enuncie las ventajas que tiene el método de separación de ADN por adsorción en matriz de silíca o columna de filtración (en inglés: Spin Column) frente a métodos convencionales de extracción de ácidos nucleicos como Trizol, fenol-cloroformo y salting out. De una breve fundamentación de estos métodos convencionales.

4.7 Dentro de los resultados esperados se presentan diferentes formas para calcular la producción de ADN y longitud de ADN. Sin embargo conociendo la longitud de la muestra de ADN por medio de electroforesis en gel de agarosa es posible conocer el peso, explique el factor de conversión para pasar de pares de bases [pb] a microgramos [µg] de ADN.

4.8 ¿Cómo se puede asegurar que el producto final de extracción es Acido desoxirribonucleico (ADN) y no Ácido ribonucleico (ARN)?

4.9 Cuál es el componente del ADN que absorbe a la longitud de 260nm?

4.10 Que sustancias absorben a 280nm?

4.11 Como se puede utilizar el número de abogador y la relación de absorbancia para determinar la concentración un plásmido con 2000 nucleótidos de longitud y 0.8 de Absorbancia a 260nm?

5. BIBLIOGRAFÍA Invitrogen. 2007. PureLink™ Genomic DNA Kits, for purification of genomic DNA, Catalog nos. K1820-01. Version A, 5-1012.

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Fecha 2009-06-09 Instituto Tecnológico Metropolitano. Manual de Bioseguridad, generalidades de bioseguridad en el laboratorio nivel II de biología celular y molecular. Laboratorio de Ingeniería Biomédica, ITM. Gerald Karp. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. Editorial Mcgraw Hill. Geofrey M Cooper. The Cell a molecular approach. Editorial Sinauer Associates.

Elaborado por: Fabian Mauricio Cortés Mancera

Versión: 3

Fecha: 2012/03/16

Aprobado por: Alfonso Restrepo Jurado