Facultad de CienciasDepartamento de Biologa Molecular

Funcin de la DNA polimerasa lambdaen reparacin de DNA y tumorognesis

Gloria Terrados AguadoMadrid, 2010

Memoria presentada por Gloria Terrados Aguado, Licenciada en Bioqumica,para optar al Grado de Doctora en Ciencias por la Universidad Autnoma de

Madrid.

El trabajo recogido en esta memoria ha sido llevado a cabo en elCentro de Biologa Molecular Severo Ochoa (CSIC/UAM),

bajo la direccin del Dr. Luis Blanco Dvila.

Para su realizacin se ha contado con la financiacin del Programa de Formacinde Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Educacin y Ciencia.

Abreviaturas5FU 5-fluorouracilo5FdUMP 5-fluorodeoxiuridinamonofosfato5FdUTP 5-fluorodeoxiuridinatrifosfato5FUMP 5-fluorouridinamonofosfato 5FUTP 5-fluorouridinatrifosfato6mG O6-metilguanina8oxoG 7,8-dihidro-8-oxoguaninaAPE endonucleasa apurnicaAraCTP 1--D-Arabinofuranosilcitosina-5-trifosfatoAraCMP 1--D-Arabinofuranosilcitosina-5-monofosfatoARN cido ribonucleicoARNm cido ribonucleico mensjaeroARNt cido ribonucleico de transferenciaATP adenosina-5-trifosfatoBER reparacin por escisin de baseBSA albmina de suero bovinoBRCT Dominio BRCA1 C-terminalCf Crithidia fasciculatac.p.m. cuentas por minutoC-terminal carboxilo terminaldA deoxiadenosinadAMP deoxiadenosina-5-monofosfatodATP deoxiadenosina-5-trifosfatodC deoxicitidinaDCTD dCMP deaminasadCTP deoxicitidina-5-trifosfatodG deoxiguanosinadGTP deoxiguanosina-5-trifosfatoDK Doble Knock-outDMEM Medio mnimo de Eagle modificado por DulbeccoDNA cido desoxirribonucleicodNMP deoxinucletido-5-monofosfatodNTP deoxinucletido-5-trifosfatodRP deoxiribosa fosfatoDSB roturas de doble cadenadT deoxitimidinaDTT ditiotreitoldTTP deoxitimidina-5-trifosfatodU deoxiuridinadUMP deoxiuridina-5-monofosfatoEDTA etiln diamino tetraacetatoEH enfermedad de HuntingtonFI fraccin insolubleFS fraccin solubleh humanaHGu hidrocloruro de guanidiniohmdUrd hidroximetildeoxiuridinahPol DNA polimerasa humana

ABREVIATURAShPol DNA polimerasa lambda humanahPol DNA polimerasa mu humanaHtt protena HuntingtinaHR recombinacin homlogaIPTG isopropil--D-tiogalactsidoKBrO3 Bromato potsicokDa kilodaltonKO knock-outLi Leishmania infantumLiPol DNA Polimerasa de L. infantumMBD4 protena 4 de unin a metil CpGMEFs fibroblastos embrionarios de ratnMEM Medio de EagleMMR reparacin de desapareamientosMMS metil-metano sulfonatoNER reparacin por escisin de nucletidoNHEJ reunin de extremos no homlogosNi-NTA nquel-cido nitroloacticoNLS secuencia de localizacin nuclearnt nucletidoN-terminal amino terminalOPRT ororato fosforribosil transferasa-P fosfatoPAGE electroforesis en gel de acrilamidapb pares de basesPBS tampn fosfato salinoPCNA antgeno de proliferacin nuclearPCR reaccin en cadena de la polimerasaPHP dominio fosfodiesterasaPM peso molecularPMSF fenilmetilsulfonilfluoruroPNK polinucletido quinasaPol polimerasaPoliQ poliglutaminasRI radiacin ionizanteRPA protena de replicacin Arpm revoluciones por minutoRR ribonucletido reductasaRT-PCR Reaccin de transcripcin inversa seguida de amplificacin por PCRs segundoSB Southern BlotSDS Dodecil Sulfato SdicoSHM hipermutacin somticaSMUG1 uracil DNA glicosilasa monofuncional de cadena sencillaSNC sistema nervioso centralSOD superxido dismutasaTDG DNA glicosilasa de timinaTdT deoxinucleotidil transferasa terminalTLS sntesis a travs de lesionesTP timidn fosforilasa

ABREVIATURASTS timidilato sintasaU uracilou unidadesu.a. unidades arbitrariasUDG urail DNA glicosilasaUK uridn kinasaUNG2 uracil glicosilasa nuclearUP uridn fosforilasaV(D)J recombinacin especfica de genes receptores de antgeno.VPPA Virus de la Peste Porcina Africana

Cdigos de una y tres letras de los aminocidos

Alanina Ala, A Leucina Leu, LArginina Arg, R Lisina Lys, Kcido asprtico Asp, D Metionina Met, MAsparagina Asn, N Fenilalanina Phe, FCistena Cys, C Prolina Pro, Pcido glutmico Glu, E Serina Ser, SGlicina Gly, G Tirosina Tyr, YGlutamina Gln, Q Treonina Thr, THistidina His, H Triptfano Trp, WIsoleucina Ile, I Valina Val, V

ABREVIATURAS

GLOSARIO DE TRMINOS

En esta memoria se ha tratado de evitar el uso de anglicismos. Sin embargo, en algunoscasos se ha preferido mantener el trmino original, bien por no existir unacorrespondencia adecuada en castellano o bien por estar su uso muy generalizado en ellenguaje cientfico.

Downstream: aplicado a un oligonucletido es la cadena de DNA que hibrida con lacadena molde y que contiene el extremo 5 de un gap.

Flap: extremo de cadena sencilla de DNA que se genera por desplazamiento delextremo 5 de un gap o por alineamiento incompleto de cadenas parcialmentecomplementarias.

Gap: hueco de longitud variable en el DNA, que supone una regin de cadena sencillaembebida en un DNA de doble cadena.

Upstream: aplicado a un oligonucletido es la cadena de DNA que hibrida con lacadena molde y que contiene el extremo 3 de un gap.

wild-type: tipo silvestre, sin modificacin gentica.

Odds ratio: Razn de probabilidades definido como el cociente entre la probabilidad deque un evento suceda y la probabilidad de que no suceda

SNP: De las siglas Single Nucleotide Polymorphism en ingles, con traduccin alespaol: polimorfismo de un solo nucletido. Se considera polimorfismo a unavariacin en la secuencia de DNA de un gen que afecta a una sola base y que genera unavariante de la protena representada en al menos un 1% de la poblacin.

SSCP: De las siglas "Single Strand Conformational Polymorphism" en ingls, contraduccin al espaol: polimorfismo conformacional de banda sencilla.

Splicing: Procesamiento del RNA mensajero que produce la omisin de uno o variosexones.

RPA: De las siglas Replication Protein A en ingles, con traduccin al espaol:Protena de replicacin A

RFLP: De las siglas "Restriction Fragment Length Polymorphism" en ingls, contraduccin al espaol: Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin

wobble : tambaleante

hot spot: punto de acumulacin de mutaciones

GLOSARIO DE TRMINOSEST: De las siglas Expresed Sequence Tags en ingles, con traduccin al espaol:marcador de secuencia expresada.

cross-links: entrecruzamientos

INDICE

INDICE

INDICEI- SUMMARY...........................................................................................................II- INTRODUCCIN.................................................................................................

1- Las DNA polimerasas..........................................................................................1.1 -DNA polimerasas replicativas humanas.......................................................

1.1.1 La Familia B....................................................................................1.1.2 La Familia A..................................................................................

1.2 DNA polimerasas humanas implicadas en mecanismos detolerancia al dao....................................................................................1.2.1 La Familia Y..................................................................................

1.3 DNA polimerasas humanas implicadas en reparacin.................................1.3.1 La Familia X..................................................................................

1.3.1.1 La DNA polimerasa ..................................................... Propiedades bioqumicas..................................... Organizacin estructural...................................... Pol en el mecanismo de reparacin por

escisin de base (BER)........................................ Otras funciones.................................................... Homlogos a Pol en otras especies. LiPol...... Variantes polimrficas de Pol humana

asociadas al cncer..............................................1.3.1.2 La TDT............................................................................1.3.1.3 La DNA polimerasa mu..................................................1.3.1.4 La DNA polimerasa lambda............................................

Organizacin estructural..................................... Propiedades bioqumicas..................................... Principales funciones propuestas

para Pol.............................................................. Reparacin de roturas de doble

cadena por el mecanismo de reuninde extremos no homlogos (NHEJ).....................

III- OBJETIVOS.......................................................................................................IV- MATERIALES Y MTODOS...........................................................................

1- MATERIALES................................................................................................1.1 Enzimas.........................................................................................................1.2 Reactivos.......................................................................................................1.3 Nucletidos...................................................................................................

2- MTODOS.......................................................................................................2.1 CULTIVOS CELULARES...........................................................................

2.1.1 Cultivo celular del parsito Leishmania infantum.........................2.1.2 Generacin de lneas celulares que sobreexpresan

distintas construcciones de hPol...............................................2.1.3 Obtencin de fibroblastos embrionarios a partir de embriones

de ratn hermanos de camada (MEFs)........................................2.2 Mantenimiento de las colonias de ratones ...................................................2.3 Derivacin del modelo murino de deficiencia en Pol de fondo

mixto a fondo puro C57Black6...............................................................2.4 Generacin del modelo murino de deficiencia combinada en

Pol y Pol (DK)....................................................................................2.5 Extraccin de DNA genmico de cola de ratn...........................................

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INDICE2.6 Extraccin de DNA genmico de diferentes tejidos ....................................2.7 Genotipado DNA por southern blot..............................................................2.8 Genotipado DNA por PCR...........................................................................2.9 Ensayo de mutagnesis in vivo en clulas de mamfero...............................2.10 Experimentos de citotoxicidad-Ensayo clonognico..................................2.11 Medicin de actividad NHEJ in vivo..........................................................2.12 Anlisis de cariotipos..................................................................................2.13 Anlisis de las distintas fases del ciclo celular de MEFs asincrnicos.......2.14 Ensayo del cometa alcalino.........................................................................2.15 Extractos totales celulares del parsito L. infantum...................................2.16 Preparacin de extractos celulares totales a partir de

tejidos y lneas clulares.........................................................................2.17 Inmunodeteccin de protenas en membrana (Western Blot).....................2.18 Determinacin de repeticiones CAG..........................................................2.19 Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR)- Polimorfismo

conformacional de banda sencilla (SSCP)..............................................2.20 Reaccin en cadena de polimerasa-Polimorfismos de longitud de

fragmentos de restriccin (PCR-RFLP)..................................................2.21 Anlisis estadstico de los resultados de deteccin

del SNP (R/W)438..................................................................................2.22 Retrotranscripcin in vitro (RT-PCR)........................................................2.23 Anlisis comparativo de secuencias...........................................................2.24 Clonaje y Mutagnesis dirigida..................................................................

2.24.1 Clonaje del cDNA de LiPol en el vector pQE32.......................2.24.2 Construccin del vector de expresin en E. coli que

contiene el cDNA de las variantes de splicing hPol6y hPol67 .................................................................................

2.24.3 Mutagnesis dirigida para la obtencin de la construccin dehPolW438-pRSETB..................................................................

2.24.4 Generacin de construcciones para transfecciones enclulas de mamfero....................................................................

2.25 Sobreexpresin y purificacin de protenas................................................2.25.1 DNA Polimerasa beta de Leishmania infantum (LiPol)...........2.25.2 Variante de splicing de la DNA polimerasa

lambda humana (hPol6)..........................................................2.25.3 Variante polimrfica de la DNA polimerasa

lambda humana (hPolW)..........................................................2.26 Sedimentacin en gradientes de glicerol....................................................2.27 Ensayo de relleno del gap de 5 nucletidos. Estudio de

fidelidad de sntesis.................................................................................2.28 Ensayos de DNA polimerizacin................................................................

2.28.1 Anlisis in situ de actividad DNA polimerasa en el ciclo delparsito L. infantum....................................................................

2.28.2 Ensayo de actividad en DNA activado........................................2.28.3 Anlisis de fidelidad en molculas que contienen

un gap de un nucletido con un grupo fosfato en 5...................2.28.4 Anlisis de procesividad de hPol W438.....................................2.28.5 Anlisis de actividad en molculas molde/iniciador,

gap de uno y cinco nucletidos....................................................2.28.6 Ensayos de retraso en gel. Anlisis de la afinidad

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4747

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INDICEde LiPol por DNA.....................................................................

2.29 Ensayos de Reparacin por Escisin de base.............................................2.29.1 Ensayo de actividad deoxirribosafosfato liasa (dRP liasa)..........2.29.2 Ensayo de reduccin con NaBH4 de los

complejos covalentes LiPol/DNA.............................................2.29.3 Reconstitucin in vitro de la va de Reparacin por

Escisin de Base (BER)..............................................................2.29.5 Estudio de la capacidad de insercin frente a

bases modificadas 8oxoG y 6mG y extensin desdepares cuya base molde est modificada.......................................

2.29.6 Estudio de la capacidad de insercin frente abases modificadas 5FU y extensin desde parescuya base molde est modificada................................................

2.29.7 Estudio de la capacidad de insercin de5FdUTP, 5FUTP y AraCTP........................................................

2.29.8 Estudio de capacidad de reparacin deextractos totales de protenas con molde marcado......................

V- RESULTADOS..................................................................................................

1- Caracterizacin Bioqumica de la DNA polimerasa de LeishmaniaInfantum...............................................................................................................

1.1- Actividad DNA Polimerasa asociada a LiPol...........................................1.2- LiPol presenta una preferencia por moldes de tipo gap

con un grupo -P en el extremo 5............................................................1.3- LiPol es capaz de unirse al extremo 5 debido a un

reconocimiento del grupo -P...................................................................1.4- LiPol incorpora preferentemente el nucletido

complementario a la base molde.............................................................1.5- Actividad dRP liasa asociada a LiPol........................................................1.6- Reconstitucin in vitro de la reparacin

por escisin de base por LiPol..............................................................1.7- LiPol presenta un patrn de expresin diferente en

cada etapa del ciclo infectivo de Leishmania infantum..........................

2- Dos Variantes de splicing en la DNA Polimerasa Humana.....................2.1. Identificacin de variantes de splicing

de la protena Pol humana.....................................................................2.2. Construccin de vectores de expresin

que contienen el cDNA de las variantes de splicingde la protena Pol humana.....................................................................

2.3. Sobreexpresin y solubilidad de hPol6 y hPol67en clulas de E. coli.................................................................................

2.3. Purificacin de la variante de splicing hPol6 .........................................2.4. Actividad DNA polimerasa de hPol6......................................................

3- Generacin de modelos murinos carentes de lasDNA polimerasas lambda y mu.........................................................................

3.1 Modelos murinos de deficiencia simple en Pol y Pol..............................

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INDICE3.1.1 Modelo murino de deficiencia en Pol (KO)..............................3.1.2 Implicacin de Pol en la enfermedad de Huntington...................

3.1.2.1 Generacin del modelo murino de estudio.....................3.1.2.3 Fenotipo de comportamiento lnea R6/1-Pol................3.1.2.3 Obtencin de muestras

y anlisis de repeticiones CAG.......................................3.2 Generacin del modelo murino de deficiencia combinada

en Pol y Pol (DK)...............................................................................

4- Pol y Pol en Reparacin y Tolerancia al Dao........................................4.1 Sntesis a travs de lesiones: 5-fluorouracilo (5FU).....................................

4.1.1 Diversidad en comportamiento de insercin frente a5FU de los miembros de la familia X de DNApolimerasas..................................................................................

4.1.2 Diversidad en comportamiento de extensinde pares de bases apareadas a 5FUde los miembros de la familia X de DNA polimerasas..............

4.1.3 Insercin de 5FdUTP en el DNA..................................................4.1.4 Insercin de 5FrUTP en el DNA...................................................

4.2 Actividad DNA polimerizacin en presencia de AraCTP...........................4.3 Reparacin por Escisin de Base (BER).....................................................

4.3.1 Uracilo y 5FU en el DNA.............................................................4.3.1.1 Reconstitucin in vitro de BER ....................................4.3.1.2 Sensibilidad a 5FU de clulas deficientes en

Pol.................................................................................4.3.1.3 Capacidad de reparacin de extractos

de testculo y cerebro del modelo de deficiencia enPol murino frente a la lesin 5FU................................

4.3.2 La familia X y el dao oxidativo..................................................4.3.2.1 Reconstitucin in vitro de la reparacin

por escisin de base de 8oxoG Pol...............................4.3.2.2 Sensibilidad a Bromato potsico (KBrO3)

de clulas deficientes en Pol.........................................4.3.2.3 Capacidad de reparacin de la lesin 8oxoG de extractos

de testculo del modelo de deficiencia en Pol murinofrente a la .......................................................................

4.3.2.4 Implicacin de Pol en BER de pares de bases8oxoG:A ........................................................................

5- Un Polimorfismo Simple en la DNA Polimerasa Humana asociado acncer de recto.................................................................................................5.1 Variantes y polimorfismos en la familia X de DNA polimerasas...............5.2. Identificacin de un SNP en la regin del genoma que codifica

para la DNA polimerasa lambda humana.............................................5.3. hPol W posee actividad DNA polimerasa................................................5.4. hPol W438 presenta un comportamiento distributivo en

sustratos tipo molde/iniciador................................................................5.5. Las variantes de hPol, W438 y R438, presentan una

sntesis procesiva similar en un gap de pequeo tamao.......................

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INDICE5.6. hPol W438 posee actividad dRP liasa.....................................................5.7. Reconstitucin in vitro de la Reparacin por Escisin de Base (BER)......5.8. Fidelidad de insercin de W438.................................................................5.9. Estructura tridimensional de la variante hPol W438................................5.10. Anlisis de mutagensis in vivo ...............................................................5.11. La sobreexpresin de la variante hPol W438 reduce la

actividad celular de NHEJ .....................................................................5.12. La expresin de la variante hPol W438 conduce a la

aparicin de aberraciones cromosmicas...............................................5.13. El fenotipo causado por W438 est asociado a la actividad DNA

polimerasa de la enzima.........................................................................5.14. Sntesis a travs de lesiones......................................................................

5.14.1. Inserccin frente a 8oxoG y 6mG..............................................5.14.2. Extensin de pares de bases con la base molde

modificada 8oxoG y 6mG..........................................................5.14.3. Insercin frente a 5-fluorouracilo (5FU)....................................5.14.4. Extensin de pares de bases 5FU:G y 5FU:A............................5.14.5. Insercin de 5FdUTP.................................................................5.14.6. Insercin de AraCTP..................................................................

5.15. Genotipado de los alelos R/W438 en diferentes poblaciones.Asociacin del alelo W438 al riesgo de padecer cncer de recto..........

VI- DISCUSIN......................................................................................................

1- Evolucin de los miembros de la Familia X de DNA polimerasas.................2- LiPol, DNA polimerasa X tipo Pol, con funcin en BER nuclear y

mitocondrial en el parsito Leishmania infantum.............................................3- Modelos murinos carentes en las DNA polimerasas lambda y mu.................4- hPol, sntesis a travs de lesiones y reparacin.............................................

Pol y el dao oxidativo........................................................................ Pol y el 5FU.........................................................................................

5- Identificacin de isoformas funcionales en el gen POLL que codifica parahPol..................................................................................................................

VII- CONCLUSIONES.............................................................................................VIII- BIBLIOGRAFA...............................................................................................IX- ANEXO.............................................................................................................

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INDICE

SUMMARY

SUMMARY

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SUMMARY

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This Doctoral Thesis reports the purification of Leishmania infantum DNApolymerase beta (LiPol), as well as its characterization as a DNA repair enzyme, witha metal preference for Mn2+ over Mg2+. LiPol prefers gapped-DNA substrates having a5-P end, in agreement with its role in DNA repair reactions. Purified LiPol alsodisplayed a 5-deoxyribose-5-phosphate (dRP) lyase activity, consistent with a -elimination mechanism. The concerted action of dRP lyase and DNA polymerizationactivities of LiPol on a uracil-containing DNA suggests its participation in single-nucleotide base excision repair (BER). Analysis of LiPol DNA polymerizationactivity at different stages of the L. infantum infective cycle supports a role for LiPolin parasite DNA repair, counteracting the oxidative damage occurring inside themacrophage.

DNA polymerase lambda (Pol ), a recently described Family X DNApolymerase, has been also studied in this work regarding its in vivo role in DNA repairand tolerance of oxidative damage. Analysis of the BER activity in tissue extracts fromknock-out lambda mice (KO) indicated that Pol is not essential for the BER of8oxoG:dC pairs. However, Pol has a role in the correction of 8oxoG:dA to 8oxoG:dC,thus minimizing 8oxoG associated mutagenesis. Moreover, Pol does not contribute toBER of either dU:dG or 5FU:dG pairs in adult testis. However, our analysis suggests itsparticipation in the BER of 5FU:dG in brain. In agreement with the participation ofFamily X in translesion DNA synthesis (TLS) of 8oxoG and 6mG and the possible rolein BER of 5FU, we demostrated that hPol, hPol and hPol are able to tolerate 5FU inDNA, mainly inserting dA in front of the lesion. Likewise, these three enzymesproficiently extended the pair 5FU:dA, comparable to normal pairs dT:dA y dU:dA,whereas they were very inefficient to extend the pair 5FU:dG. Moreover, theyincorporated 5FdUTP opposite dA much better than opposite dG in the template.

We have carried out the identification of two hPol splicing variants, that arehighly expressed in different tumors. hPol6 purification and enzymaticcharacterization suggests that the omision of exon 6 results in a poorly active variant,that could act as a dominant negative by sequestering NHEJ factors via interaction withits intact BRCT domain.

We have identified and characterized a single nucleotide polymorphism (SNP),of hPol, having a C/T variation in the first base of codon 438, resulting in the aminoacid change Arg to Trp. In vitro enzyme activity assays of the purified W438 Polvariant revealed that it retained both DNA polymerization and dRP lyase activities, buthad reduced base substitution fidelity. In agreement with this in vitro mutatorphenotype, ectopic expression of the W438 hPolvariant in mammalian cells increasedmutation frequency, affecting the DSB repair NHEJ pathway, and generatingchromosome aberrations. All these phenotypes were dependent upon the catalyticactivity of the W438 hPol . RFLP analysis in normal versus cancer patientsdemonstrated an association of the W438 polymorphism and rectal cancer.

SUMMARY

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INTRODUCCIN

INTRODUCCIN

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INTRODUCCIN

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La informacin gentica de la mayora de los organismos vivos se encuentraalmacenada dentro del genoma en forma de cido desoxirribonucleico (DNA). Estainformacin ha de ser transmitida ntegramente de una generacin a otra. Estatransmisin requiere que se produzca la duplicacin del DNA libre de error, medianteun proceso denominado replicacin. La estabilidad del genoma es mantenida medianteuna maquinaria de reparacin, tolerancia y control del dao generado en el DNA. Entodos estos procesos es necesaria la actuacin de enzimas denominadas DNApolimerasas.

1- Las DNA polimerasas

La principal caracterstica de las DNA polimerasas es su capacidad de sintetizarDNA. El primer ejemplo conocido de esta clase de enzimas fue la DNA polimerasa I deE. coli, descubierta por el grupo de Arthur Kornberg (Lehman y cols., 1958) por lo quefue galardonado con el Premio Nobel de Medicina en 1959. La demostracin de sucapacidad de catalizar la sntesis de DNA de acuerdo a las instrucciones de la cadenamolde fue clave para comprender el modo en que el DNA se sintetiza en el interior de laclula y la base de numerosos estudios posteriores que comenzaron a desvelar elmecanismo de la replicacin. Hasta el momento se han identificado y caracterizadonumerosas enzimas de este tipo presentes en organismos muy diversos que no slointervienen en los procesos de replicacin y reparacin del DNA, sino tambin en otrosmecanismos de tolerancia al dao, recombinacin y mutagnesis.

Las DNA polimerasas poseen una serie de caractersticas bsicas comunes.Llevan a cabo una reaccin qumica consistente en la adicin de un desoxinucletido aun extremo 3 OH de una molcula que acta como iniciador o iniciador y que puedeser DNA, RNA o incluso un aminocido como serina o treonina (Salas, 1991). Lareaccin de polimerizacin implica la participacin de 2 o 3 residuos carboxlicos, queactuando como ligandos de un par de iones metlicos divalentes, estabilizan yposicionan de manera adecuada para la catlisis al residuo OH del extremo 3 deliniciador (metal A) y los tres grupos fosfato del nucletido entrante (metal B), quegeneralmente es seleccionado por complementariedad con cada base de la cadenamolde. Uno de los metales hace disminuir la afinidad del 3 OH por el hidrgeno deforma que se origina un grupo 3 O - que lleva a cabo el ataque nucleoflico sobre elfosfato del nucletido entrante. Una vez realizada la catlisis se libera el pirofosfato yel enzima puede disociarse del DNA, si se trata de una DNA polimerasa distributiva, orealizar un nuevo evento de polimerizacin, si se trata de un enzima procesivo. Estemecanismo general se encuentra conservado en todas las polimerasas estudiadas hasta elmomento (revisado por Steitz, 1999).

Diversos estudios cristalogrficos han revelado que las DNA polimerasas poseenuna organizacin estructural comn (revisado por Beard y Wilson, 2000). Presentan unplegamiento en forma de mano con tres subdominios denominados dedos, palma ypulgar, a excepcin de la DNA polimerasa del virus de la peste porcina africana quecarece de subdominio dedos (Oliveros y cols., 1997; Maciejewski y cols., 2001;Showalter y cols., 2001). Dentro del dominio palma hay residuos implicados en elcontacto con el DNA, y los residuos implicados en la catlisis. En el dominio dedos ypulgar residen contactos con el DNA y el nucletido entrante.

INTRODUCCIN

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A pesar de estas caractersticas comunes, existe una gran diversidad defunciones entre las diferentes familias de DNA polimerasas. La gran complejidad ydiversidad de los mecanismos en los que se hayan implicadas hacen que exista unavariabilidad de caractersticas tanto a nivel estructural como bioqumico. Si bienconservan la organizacin estructural del sitio activo, es frecuente que las DNApolimerasas presenten dominios adicionales que les pueden conferir nuevas actividadesenzimticas suplementarias a la polimerizacin (como la actividad exonucleasa,actividad desoxirribosafosfato liasa, entre otras), o funciones no catalticas (comodominios de interaccin con otros factores proticos o con el DNA). A nivelbioqumico, se pueden diferenciar por el nmero de nucletidos que pueden polimerizarsin disociarse del DNA (distributivas: pocos nucletidos; procesivas: de cientos a milesde nucletidos), en la eficiencia con la que realizan la reaccin de polimerizacin y en lapreferencia por un tipo de sustrato (DNA con amplias cadenas sencillas como molde,DNA con pequeos huecos o gaps, DNA con lesiones, modificaciones...etc).

Por ltimo, una de las diferencias fundamentales es la fidelidad de sntesis decada DNA polimerasa (Kunkel, 2004). Las polimerasas replicativas poseen una granfidelidad de insercin de nucletidos, que va acompaada de la actividad exonucleasa35 correctora de errores lo que redunda en una elevadsima fidelidad de sntesis. Encontraste, existen otras DNA polimerasas que poseen una gran propensin a cometererrores debido a que su funcin en la clula as lo requiere, como es el caso de laspolimerasas implicadas en los fenmenos de generacin de variabilidad en el desarrollodel sistema inmunolgico.

Las distintas DNA polimerasas se han clasificado en familias, basndose en lahomologa de secuencia primaria de aminocidos con las primeras DNA polimerasasidentificadas en E. coli (Ito y Braithwaite, 1991; Braithwaite y Ito, 1993). Las DNApolimerasas homlogas a la PolI de E. coli se han englobado en la familia A, mientrasque las enzimas similares a la subunidad cataltica de la PolII de E. coli forman lafamilia B. La familia C est constituida por las DNA polimerasas homlogas a la PolIIIde E. coli, no habindose encontrado ningn homlogo en eucariotas (Burgers y cols.,2001). La familia D est formada por una serie de DNA polimerasas presentesnicamente en arqueas (Cann y Ishino, 1999). La familia X y la familia Y englobanenzimas presentes tanto en eucariotas como en procariotas y arqueas. La familia Xincluye DNA polimerasas implicadas fundamentalmente en procesos de reparacin ygeneracin de variabilidad. Por ltimo, la familia Y incluye distintas DNA polimerasascapaces de replicar a travs de lesiones en el DNA (Ohmori y cols., 2001; Prakash ycols., 2005). En la tabla 1 se recoge los principales miembros de las diferentes familiasde DNA polimerasas eucariotas.

INTRODUCCIN

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Tabla 1. Familias de DNA polimerasas humanas.Denominacin

griegaDenominacin

HUGO Familia Funcin propuestaPol (gamma) POLG A Replicacin/Reparacin DNA mitocondrialPol (theta) POLQ A Sntesis a travs de lesiones; SHMPolv (nu) POLN A Sntesis a travs de lesiones; TLS

Pol (alpha) POLA B Replicacin nuclear; HRPol (delta) POLD1 B Replicacin nuclear; NER; MMR; HR

Pol (epsilon) POLE B Replicacin nuclear; NER; MMR; HRPol (zeta) POLZ B Sntesis a travs de lesiones

Pol (eta) POLH Y Sntesis a travs de lesionesPol (iota) POLI Y Sntesis a travs de lesiones

Pol (kappa) POLK Y Sntesis a travs de lesionesREV1 Y Sntesis a travs de lesiones

Pol (beta) POLB X BERPol (lambda) POLL X Meiosis; BER; NHEJ; V(D)J

Pol (mu) POLM X SHR; NHEJ; V(D)JTDT X V(D)J

SHM: Hipermutacin somtica; HR: recombinacin homloga; NER: reparacin por escisinde nucletido; MMR: reparacin de desapareamientos; BER: reparacin por escisin de base;NHEJ: reunin de extremos no homlogos; V(D)J: recombinacin especfica de genesreceptores de antgeno.

1.1 -DNA polimerasas replicativas humanas1.1.1 La Familia B

La replicacin del DNA nuclear requiere la participacin de un gran nmero deprotenas entre las que se encuentran las DNA polimerasas de esta familia (revisado porGarg y Burgers, 2005), a excepcin de Pol que est implicada en procesos de sntesis atravs de lesiones en el DNA (Nelson y cols., 1996; revisado por Lawrence, 2004). Unavez que comienza la replicacin con el desenrrollamiento del DNA mediado porMCM2-7 (Johnson y cols., 2005), comienza la replicacin con la actuacin delcomplejo Pol/primasa. La primasa sintetiza pequeos iniciadores de RNA (10nucletidos) en el origen de replicacin de la hebra lder, y a lo largo de la hebraretrasada para dar origen a los fragmentos de Okazaki. Su actividad DNA polimerasa lepermite extender estos iniciadores de RNA para dar lugar a pequeos fragmentos deDNA (20-30 nucletidos) que servirn de iniciadores para las otras dos polimerasasimplicadas en el proceso de replicacin, Pol (cadena retrasada) yPol (cadena adelantada). Ambas polimerasas interaccionan con el antgeno nuclear deproliferacin nuclear (PCNA), mejorando as su unin al DNA, y sintetizan DNA demanera procesiva (revisado por Kelman, 1997). Asimismo, Pol y Pol poseen una altafidelidad de sntesis (Shcherbakova y cols., 2003; Fortune y cols., 2005), gracias a laalta selectividad de nucletido en su centro activo, y a la actividad exonucleasa 35correctora de errores que poseen, lo que les permite llevar a cabo la replicacin delDNA nuclear eficientemente y practicamente libre de errores (revisado por McCullochy Kunkel, 2008).

INTRODUCCIN

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Por otro lado, las DNA polimerasas de esta familia tambin han sido implicadasen diferentes mecanismos de reparacin que requieren la sntesis de fragmentos de DNA(revisado por Hbscher y cols., 2002). Tal es el caso del mecanismo de reparacin porescisin de base (BER) de trecho largo, el mecanismo de reparacin por escisin denucletido (NER), el mecanismo de reparacin de bases desapareadas (MMR) y larecombinacin homloga (HR).

1.1.2 La Familia A

El miembro mejor conocido de esta familia es Pol, compuesto por dossubunidades: la subunidad mayor en la que residen sus actividades enzimticas(polimerasa, exonucleasa 35 y desoxirribosa-fosfato (dRP) liasa), y una subunidadmenor de carcter accesorio que incrementa su afinidad por el DNA, estimula suactividad exonucleasa y aumenta su procesividad de sntesis (Carrodeguas y cols., 2001;Lim y cols., 1999). Pol es la nica polimerasa conocida ubicada en las mitocondrias(revisado por Graziewicz y cols., 2006), por lo que es el enzima encargado de llevar acabo tanto la replicacin del DNA mitocondrial, como la reparacin del mismomediante el mecanismo de reparacin por escisin de base (BER).

Recientemente se han descubierto dos nuevos miembros de esta familia, Pol(Sharief y cols., 1999; Seki y cols., 2003) y Pol (Marini y cols., 2003). Ambos enzimasparecen estar implicados en procesos de sntesis a travs de lesiones (Seki y cols., 2004;Takata y cols., 2006), y Pol tambin parece tener un papel en procesos dehipermutacin somtica (Masuda y cols., 2005; Masuda y cols., 2006), as como dereparacin de DNA (Yoshimura y cols., 2006).

1.2 DNA polimerasas humanas implicadas en mecanismos detolerancia al dao

El DNA celular est sometido a dao endgeno o exgeno, de una formaconstante. Existen un gran nmero de sistemas de reparacin que tratan de solventarestos daos. Pero si alguno de estos sistemas falla se produce un bloqueo en lareplicacin amenazando la viabilidad de la clula que se est replicando. Las lesiones noreparadas modifican la geometra normal de la doble cadena (sitios sin basenitrogenada o absicos, enlaces covalentes entre bases contiguas, etc.) produciendo esteeventual bloqueo de la parada de la horquilla de replicacin. Sin embargo, existenestrategias que mitigan el efecto letal de la parada en replicacin a costa de no eliminarla lesin del DNA. Estos procesos son denominados de tolerancia al dao. La sntesisa travs de lesiones (TLS) es uno de los mtodos de escape de la lesin tolerando eldao. En este proceso intervienen polimerasas con baja fidelidad de sntesis que soncapaces de polimerizar a travs de la lesin. Por tanto, no se trata de enzimas dereparacin, sino de enzimas de tolerancia el dao, ya que permiten la supervivenciacelular en presencia de dao en el DNA, que de otra manera producira la muerte celularpor parada de la maquinaria de replicacin. Estas polimerasas se agrupan en la FamiliaY, a excepcin de Pol que pertenece a la Familia B y que participa tambin en estosprocesos.

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1.2.1 La Familia Y

Los miembros de esta familia poseen una serie de caractersticas comunes: sumodo de sntesis es distributivo, poseen una baja eficiencia cataltica, y poseen una bajafidelidad de insercin de nucletido al sintetizar DNA frente a un molde no daado(revisado por Kunkel, 2004). Su baja fidelidad viene dada por dos motivosfundamentales: la ausencia de actividad exonucleasa 35 y la conformacin de sucentro activo, que les permite tener una baja selectividad por nucletido. Asimismo, elcentro activo de estos enzimas permite acomodar lesiones en la cadena molde debido alreducido tamao de sus subdominios dedos y pulgar, as como a la ausencia delargas cadenas laterales cargadas que permitieran discriminar entre un DNA daado yno daado (revisado por Yang, 2005).

Los miembros de la Familia Y son: Pol, Pol, Pol y REV1 (revisado porPrakash y cols., 2005). Algunas lesiones en el DNA pueden nicamente requerir unapolimerasa que inserte un nucletido frente a la lesin y que adems lleve a cabo lasubsiguiente extensin del par generado. Sin embargo, otras lesiones pueden necesitardos polimerasas diferentes, cada una especializada en uno de los pasos. De igual forma,cada polimerasa parece ser especfica de uno o varios tipos de lesiones concretas, locual vendra dado por especificidades a nivel estructural entre los miembros de estafamilia.

Todos los miembros de la Familia Y interaccionan con PCNA, lo que hagenerado diferentes modelos para explicar el posible trfico de protenas (Pags yFuchs, 2002) y su regulacin a nivel postraduccional mediante ubiquitinacin ysumoilacin (Hoege y cols., 2002; Ulrich, 2004).

1.2 DNA polimerasas humanas implicadas en reparacinEl genoma de las clulas eucariticas est amenazado de forma continua por una

gran variedad de agentes externos e internos que generan un gran nmero de lesiones(Fig. 1) entre las que se encuentran roturas de banda simple, roturas de banda doble,apareamientos incorrectos, modificaciones qumicas de bases y azcares y cross-linksentre la misma o diferente cadena. En respuesta a estos daos generados y para evitar suacumulacin las clulas han desarrollado mltiples sistemas en los que juegan un papelimportante las DNA polimerasas.

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1.3.1 La Familia X

Esta familia posee 4 miembros (Pol, Pol , Pol y TdT) implicados endiferentes procesos de reparacin no asociados a replicacin. Se trata de enzimasmonomricos, de relativo pequeo tamao, carentes de actividad exonucleasa 35 ycuyo modo de sntesis es distributivo, es decir, nicamente son capaces de incorporarunos pocos nucletidos antes de disociarse del DNA.

Los miembros de esta familia se agrupan en torno a un ncleo conservadoestructuralmente (Ruiz y cols., 2001; revisado por Bebenek y Kunkel, 2004) formadopor el dominio de polimerizacin (dedos, palma y pulgar) y el dominio de 8 kDa.Adicionalmente, los miembros de esta familia pueden poseer dominios implicados enprocesos de interaccin protena-protena o protena-DNA (Fig. 2).

Figura 1. Tipos de lesiones causadas en el DNA por diversos agentes y los mecanismosde reparacin y tolerancia al dao.Las abreviaturas incluidas en la figura hacen referencia a los siguientes trminos: BER,reparacin por escisin de base; NER, reparacin por escisin de nucletido; MMR,reparacin de apareamientos errneos; HR, recombinacin homloga; NHEJ, mecanismo deunin de extremos no homlogos; TLS, sntesis a travs de lesiones.

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1.3.1.1 La DNA polimerasa

Pol fue el primer miembro identificado de esta familia. Se trata de un enzimamonomrico de pequeo tamao (39 kDa). La gran cantidad de datos estructurales ybioqumicos acumulados hasta la fecha han permitido implicar a esta polimerasa ennumerosos procesos en los que se requiere una sntesis limitada de DNA (revisado porBeard y Wilson, 2000; revisado por Idriss y cols., 2002).

Propiedades bioqumicas

Pol es una nucleotidil transferasa dependiente de molde que sigue unmecanismo basado en la participacin de dos iones metlicos, que se encuentraconservado en todas las DNA polimerasas (revisado por Steitz, 1999). Pol posee unmodo de sntesis distributivo en molculas tipo molde/iniciador abierto (Abbotts y cols.,1988; Werneburg y cols., 1996) pasando a ser sntesis procesiva en molculas tipo gapde pocos nucletidos en las que haya un grupo fosfato en el extremo 5 del gap (Singhaly Wilson, 1993), siendo ste el sustrato idneo de este enzima ya que su actividad se veincrementada (Chagovetz y cols., 1997; Ahn y cols., 1998). Pol carece de actividad35 exonucleasa correctora de errores por lo que su fidelidad de sntesis se aleja de laque muestran las polimerasas replicativas. En cuanto a errores de sustitucin de basemuestra una frecuencia de 10-3-10-4 (Kunkel, 1985; Ahn y cols., 1997; Osheroff y cols.,1999a). Por otro lado, su modo de accin distributiva favorece la propensin a cometererrores de delecin mediados por deslizamiento (Kunkel, 1985; Werneburg y cols,1996b; Osheroff y cols., 1999b), efecto que aumenta si la base molde posee algn tipode lesin (Efrati y cols., 1997; Hashim y cols., 1997). En su sustrato idneo, molculastipo gap, la fidelidad de sntesis de Pol alcanza su nivel ptimo (Chagovetz y cols.,1997; Osheroff y cols., 1999b). Asimismo, la fidelidad de Pol in vivo podra aumentargracias a protenas accesorias con actividad 35 exonucleasa que corrigiesen loseventuales errores cometidos por Pol (Shevelev y Hubscher, 2002).

Figura 2. Organizacin estructural de los miembros humanos de la Familia X de DNApolimerasas.Sobre la estructura bsica comn de Pol (dominio de 8 kDa y dominio de polimerizacin de31 kDa formado por los subdominios dedos, palma y pulgar) se muestran loselementos estructurales adicionales presentes en cada caso (dominio rico en aminocidosserina y prolina, secuencia de localizacin nuclear NLS, dominio de interaccin protena-protena y protena-DNA BRCT). Asimismo, se indica la longitud total de la secuenciaaminoacdica de cada DNA polimerasa.

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Organizacin estructural

Estructuralmente Pol est compuesta por dos dominios diferentes. El dominiode polimerizacin (31 kDa) en su extremo C-terminal, formado a su vez por lossubdominios dedos, palma y pulgar, en donde reside su actividad polimerasa. Enel extremo N-terminal se encuentra el dominio de 8 kDa, en donde reside la actividaddesoxirribosa-fosfato (dRP) liasa, actividad enzimtica fundamental para el mecanismode reparacin por escisin de base (BER). Ambos dominios se encuentran conectadospor una regin sensible a proteasas (Prasad y cols., 1998a).

La resolucin de la estructura cristalogrfica de Pol como apoenzima (Sawayay cols., 1994; Davies y cols., 1994) y formando un complejo con diferentes sustratos deDNA y nucletido entrante (Pelletier y cols., 1994; Pelletier y Sawaya, 1996; Pelletier ycols., 1996a; Sawaya y cols., 1997) ha permitido dilucidar los detalles del mecanismode polimerizacin de Pol.

En ausencia de DNA o en presencia de un DNA tipo molde/iniciador, Pol seencuentra en una conformacin en la que el dominio de 8 kDa se sita alejado deldominio de polimerizacin y no interacciona con el DNA (Fig. 3A; Sawaya y cols.,1994; Pelletier y cols., 1994). En presencia de un DNA tipo gap de un nucletido, eldominio de 8 kDa se pliega uniendo la zona final del gap, concretamente el grupofosfato en posicin 5 del gap (Fig. 3B; Sawaya y cols., 1997; Beard y Wilson, 1998).De esta forma se produce una interaccin entre el extremo C-terminal del dominio de 8kDa y el subdominio pulgar del dominio de polimerizacin, afianzando la unin alDNA.

La formacin del complejo ternario por la unin del nucletido provoca que elsubdominio pulgar sufra un cambio conformacional encaminado a establecer lasinteracciones necesarias para la catlisis enzimtica, dando lugar a un complejocerrado (Fig. 3C; Sawaya y cols., 1997), que influye adems decisivamente en elnivel de fidelidad de la reaccin (revisado por Beard y Wilson, 2000; revisado porKunkel y Bebenek, 2000; revisado por Kunkel, 2004). Adems, el subdominio dedosa travs de un motivo hlice-horquilla-hlice (HhH, Doherty y cols., 1996)interacciona con el iniciador contribuyendo al cierre del sitio de unin del nucletido(Fig. 3C). Tras el evento de catlisis, el subdominio pulgar vuelve a su posicininicial (complejo abierto) facilitando la difusin del pirofosfato (Pelletier y cols.,1996a) y la traslocacin o disociacin del DNA segn el caso.

Por timo, Pol presenta un dominio llamado de 8 kDa. Este dominio situado enel extremo N-terminal de la protena posee asociadas diversas actividades y funciones.En primer lugar, en l se sita el centro activo de la actividad dRPliasa, encargada deeliminar el residuo dRP generado durante la ruta de reparacin por escisin de base(BER) (Matsumoto y Kim, 1995). Esta actividad se produce gracias a un mecanismo deeliminacin a travs de un intermediario en forma de base de Schiff y de maneraindependiente de metal (Prasad y cols., 1998a), a diferencia de la mayora de lasnucleasas, que utilizan un mecanismo asistido por metal. Se ha postulado que en estedominio reside otra actividad endonucleoltica denominada AP-liasa que produce laincisin de la cadena de DNA en el flanco 3 del sitio absico. Cabe resear que estaactividad es 200 veces menos eficiente que la actividad dRP-liasa (Prasad y cols.,1998a).

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Por otro lado, el dominio de 8 kDa tambin posee una funcin de unin a DNA.Presenta una superficie de unin a DNA de cadena sencilla (Kumar y cols., 1990) atravs de un motivohlice-horquilla-hlice (HhH, Doherty y cols., 1996) y un sitio deunin para grupos fosfato situados en posicin 5 de un gap de DNA (Prasad y cols.,1994). Ambas propiedades son cruciales para que Pol lleve a cabo sus funciones invivo.

El dominio de 8 kDa tambin ha sido objeto de estudio desde el punto de vistade la regulacin de su actividad mediante modificacin postraduccional. Se hademostrado la acetilacin de residuos de este dominio a travs de la interaccinespecfica entre Pol y el coactivador transcripcional p300, lo que provoca la reduccinde la actividad dRP-liasa, mientras que las actividades polimerasa y AP-liasa no se venafectadas (Hasan y cols., 2002).

Figura 3. Estructura tridimensional de Pol.La disponibilidad de diferentes cristales de Pol ha permitido comprender la dinmica de lareaccin de polimerizacin. (A) Apoenzima. En ausencia de DNA el dominio de 8 kDa(azul) se dispone alejado del dominio de polimerizacin, formado por los subdominiosdedos (amarillo), palma (naranja) y pulgar (verde). (B) Complejo binario. La unin deun DNA tipo gap provoca el cierre del dominio de 8 kDa, que lleva a cabo la unin de lazona final del gap, concretamente el grupo fosfato en 5. (C) Complejo ternario. La unindel nucletido entrante (rojo) provoca cambios conformacionales en los subdominiospulgar y dedos, dando lugar a un complejo cerrado necesario para la catlisisenzimtica. Los iones magnesio necesarios para coordinar la entrada del nucletido y para lacatlisis se representan en magenta. La figura se ha realizado empleando el programa SwissPDB Viewer (Guex y cols., 1997; http://www.expasy.com/spdbv/). Las coordenadascristalogrficas empleadas corresponden a los archivos 1BPD (A), 1BPX (B) y 1BPY (C),de la base de datos de estructura de protenas (PDB; http://www.pdb.org).

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Pol en el mecanismo de reparacin por escisin de base (BER)

Una de las principales funciones asociadas a Pol es la participacin en elmecanismo de reparacin por escisin de base. Este mecanismo es el encargado dereparar la prdida de bases en el DNA, la presencia de bases modificadas porfenmenos de alquilacin, oxidacin o desaminacin, o la insercin de basesmodificadas (dUTP, 8-oxo-dGTP) (revisado por Fortini y cols., 2003).

La ruta comienza con una DNA glicosilasa especfica que reconoce y retira labase modificada, dejando un sitio absico. A continuacin una endonucleasa de sitiosabsicos (AP endonucleasa) realiza un corte en posicin 5 respecto al sitio absico paragenerar un nick que deje un residuo 3OH y un residuo desoxirribosa fosfato (dRP) enposicin 5. Este residuo en 5 se eliminar gracias a la actividad dRP-liasa presente enel dominio de 8 kDa de Pol, generndose un gap de 1 nucletido que ser rellenadopor la propia polimerasa (Fig. 4, parte derecha). Si la glicosilasa, u otro enzima, poseetambin actividad AP-liasa puede generarse una situacin diferente: tras la retirada de labase se realiza un corte en posicin 3 respecto al sitio absico por la actividad AP-liasay la AP-endonucleasa corta en posicin 5 provocando la formacin de un gap de 1nucletido. El enzima polinucletido quinasa (PNK), gracias a sus actividades 5 DNAquinasa y 3 DNA fosfatasa, repondra el grupo OH en posicin 3 y el fosfato en 5 sifuera necesario, siendo posteriormente rellenado el gap por la polimerasa (Fig.4, parteizquierda). Por ltimo, en ambos casos se necesita la accin de una DNA ligasa parasellar la unin (DNA ligasa I o el complejo formado por XRCC1/DNA Ligasa III),completndose de esta forma la reparacin por escisin de base de trecho corto (Fig.4A). Si el residuo dRP est modificado (oxidado o reducido) y no puede ser eliminadopor la actividad dRP-liasa (mecanismo de -eliminacin), se puede producir una sntesis(2 a 13 nucletidos) asociada a desplazamiento de banda, generando un DNA de cadenasencilla de longitud equivalente que ser cortado por la endonucleasa FEN1, generandoun sustrato para la DNA ligasa. De esta forma se completara la reparacin por escisinde base de trecho largo (Fig. 4B).

La implicacin de Pol en el mecanismo de BER de trecho corto ha sidodemostrada tanto in vitro (Kubota y cols., 1996) como in vivo (Sobol y cols., 1996).Asimismo, se ha demostrado la interaccin especfica de Pol con las protenasimplicadas en esta ruta de reparacin, como la AP-endonucleasa (Bennett y cols., 1997),la DNA ligasa I (Prasad y cols. 1996; Dimitriadis y cols., 1998), as como elheterodmero XRCC1/ADN Ligasa III (Caldecott y cols., 1996; Kubota y cols., 1996).Estas interacciones especficas puede que faciliten la coordinacin secuencial entre lossucesivos pasos enzimticos de este proceso (Wilson y Kunkel, 2000; Mol y cols.,2000).

Por ltimo, Pol posee tambin un papel significativo en el mecanismo dereparacin por escisin de base de trecho largo (Dianov y cols, 1999; Horton y cols,.2000; Podlutsky y cols., 2001b; Prasad y cols, 2001), en el que est encargada de iniciarla sntesis de DNA y el desplazamiento de banda, como paso previo al acceso de lasDNA polimerasas replicativas Pol y Pol que continuaran la polimerizacin.

La regulacin entre ambas rutas, trecho corto y trecho largo, podra estar dirigidapor el grado de acetilacin que sufriese el dominio de 8 kDa de Pol, ya que si ste seacetilase se forzara la ruta de trecho largo, dada la imposibilidad de eliminar el residuodRP por la inactivacin de la actividad dRP-liasa (Hasan y cols., 2002).

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Otras funciones

Aparte de su papel principal en el mecanismo de BER, Pol ha sido tambinimplicada en el mecanismo de reparacin por escisin de nucletido (Horton y cols.,1995; Oda y cols., 1996; Canitrot y cols., 2000), en replicacin (Jenkins y cols., 1992;Sweasy y Loeb, 1992; Sweasy y cols., 1995), en recombinacin (Nowak y cols., 1990),en meiosis (Plug y cols., 1997) y en fenmenos de neurognesis, ya que los ratonescarentes de Pol mueren al poco tiempo de nacer y muestran altos niveles de muertecelular por apoptosis en neuronas postmitticas del sistema nervioso central y perifricoen desarrollo (Sugo y cols., 2000).

Homlogos a Pol en otras especies. LiPol

Analizando la presencia de DNA polimerasas de la familia X, se han encontradorepresentantes de la misma en todos los taxones filogenticos: Eukaria, Bacteria yArchea e incluso en virus DNA (Oliveros y cols., 1997). Si bien en mamferos existenvarios miembros de esta familia, en virus, procariotas, parsitos, levaduras y plantas seha identificado un solo miembro. Incluso existen especies en las que no se ha descrito lapresencia de protenas de esta familia, como los organismos modelo Caenorhabditiselegans y Drosophila melanogaster (Burgers y cols., 2001). Sin embargo, la Pol,como miembro central de esta familia, se encuentra representada en un gran nmero de

Figura 4. Mecanismo de reparacin por escisin de base (BER).(A ) BER de trecho corto. (B ) BER de trecho largo iniciado por una DNA glicosilasamonofuncional o bifuncional. En verde se seala el DNA de nueva sntesis. Figuramodificada de Fortini y cols., (2003).

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especies desde mamferos hasta hongos pasando por parsitos como Crithidiafasciculata, Trypanosoma brucei y Leishmania infantum. En C. fasciculata existe unanica Pol de localizacin mitocondrial (Torri y cols., 1995) cuya expresin seencuentra regulada en las diferentes fases del ciclo del parsito (Li y Englund, 1997;Johnson y cols., 1998). Sin embargo, T. brucei , presenta dos polimerasas tipo Pol conlocalizacin mitocondrial al igual que su homlogo en Crithidia (Saxowsky y cols.,2003). Por ltimo, en nuestro laboratorio se describi la presencia de una nicapolimerasa tipo Pol en L. infantum denominada LiPol y regulada en el ciclo delparsito pero de localizacin nuclear (Taladriz y cols., 2001), cuya caracterizacin esobjeto de estudio en un captulo de esta Tesis Doctoral.

Variantes polimrficas de Pol humana asociadas al cncer.

En el desarrollo del cncer se han de dar alteraciones genticas que conduzcan ala transformacin de la clula normal sana (Hananan y Weinberg, 2000). Se ha descritola relacin entre numerosos genes implicados en reparacin de DNA y el cncer(Sweasy y cols., 2005; Kunkel, 2003; Ponamarev y cols., 2002). Entre los genes deDNA polimerasas se encuentra Pol (Bergoglio y cols., 2002). La Pol humana a su vezpresenta variantes polimrficas, algunas de ellas asociadas a procesos tumorales(Sweasy y cols., 2005; Lang y cols., 2004 y Dalal y cols., 2005). Se ha descrito queestas variantes de Pol estn presentes junto a la variante normal, en un 30% de lostumores analizados, sin embargo, no se encuentran en el tejido normal de los mismospacientes. En concreto, las variantes I260M y K289M tiene una relacin con laetiologa del cncer de colon y prstata respectivamente. La expresin de estas variantesen fibroblastos de ratn independientemente de la expresin de la Pol endgenaprovoca una transformacin celular (Sweasy y cols., 2005; Lang y cols., 2004 y Dalal ycols., 2005). Estos autores demuestran que I260M y K289M presentan un defecto en elproceso de reparacin por escisin de base (BER) por falta de discriminacin entre elnucletido correcto que ha de ser insertado tras la escisin de la base daada (Dalal ycols., 2005 y Lang y cols., 2004).

1.3.1.2 La TdT

La desoxinucleotidil Transferasa Terminal o TdT, identificada en 1960, es unmiembro muy especial de la Familia X, ya que su actividad polimerasa es llevada a caboexclusivamente sobre extremos 3OH de molculas de DNA de cadena sencilla enausencia de hebra molde que dirija la sntesis (Bollum, 1960; Kato y cols., 1967).

Mediante un alineamiento de secuencia de aminocidos se observa que TdT yPol posee un 22% de identidad a nivel del dominio cataltico. Aparte del ncleocataltico tipo Pol, TdT posee en su parte N-terminal un dominio BRCT de interacciny una secuencia de localizacin nuclear (Fig. 2).

Su modo de sntesis es estrictamente independiente de molde, destacando lacapacidad de incorporacin tanto de dNTPs (2H) como rNTPs (2OH) in vitro(Roychoudhury y cols., 1972; Boule y cols., 2001), as como la de una gran cantidad denuclesidos trifosfato no naturales (Semizarov y cols., 1997; Krayevsky y cols., 2000).

La expresin de TdT se encuentra prcticamente restringida a rganos linfoidesprimarios (timo y mdula sea) en los que se produce el reordenamiento de los genes de

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las inmunoglobulinas (clulas B) y del receptor TCR (clulas T) mediante el proceso derecombinacin V(D)J. El papel de TdT en este proceso es el de llevar a cabo lasadiciones N entre los segmentos V, D y J, durante el proceso de reordenamiento, decara a generar una variabilidad antignica en el repertorio de receptores. El papel deTdT en este proceso fue demostrado in vivo gracias al empleo de ratones deficientes enTdT (Komori y cols, 1993; revisado por Gilfillan y cols., 1995), en los que las regionesvariables de los receptores son ms cortas y muestran un menor grado de diversidad queen los individuos silvestres.

1.3.1.3 La DNA polimerasa

Identificada junto a Pol en nuestro laboratorio (Dominguez y cols., 2000), Poles otro de los miembros de la Familia X. Tanto a nivel de secuencia de aminocidos(42% de identidad) como estructuralmente, Pol presenta un gran parecido con TDT.Ambas polimerasas presentan, adems del core cataltico tipo Pol, un dominio BRCT yuna secuencia de localizacin nuclear en su extremo N-terminal (Fig. 2).

Entre sus caractersticas principales est la de ser una DNA polimerasadependiente de molde pero que a su vez presenta actividad transferasa terminal(Dominguez y cols., 2000; Ruiz y cols., 2001). Pol presenta una fidelidad de sntesisbaja debido a su capacidad de dislocacin, es decir, es capaz de realizar sntesis de DNAdirigida por posiciones adyacentes alejadas del extremo iniciador (Zhang y cols., 2001;Ruiz y cols., 2004). Asimismo, Pol posee una baja discriminacin a nivel del azcar,insertando en el DNA tanto dNTPs como rNTPs (Ruiz y cols., 2003; Nick-McElhinny yRamsden, 2003), lo que podra tener repercusin en momentos del ciclo celular en losque los niveles de dNTPs sean bajos (Nick-McElhinny y Ramsden, 2004), ya que losniveles de rNTPs se mantienen altos en todo momento (Bjursell y Skoog, 1980;McCormick y cols., 1983; Traut, 1994).

Pol presenta una expresin ubicua, aunque es preferencial en centrosgerminales de los rganos linfoides secundarios (Dominguez y cols., 2000), lo queapoya un papel de esta polimerasa en la diversificacin del sistema inmune (Ruiz ycols., 2001). As, se ha descrito la participacin de Pol en la recombinacin de losgenes V y J de la cadena ligera k de las inmunoglobulinas durante el proceso demaduracin de las clulas B en la mdula osea (Bertocci y cols., 2003).

A su vez, el patrn de expresin y el fenotipo mutador asociado a Pol, junto ala sobrexpresin de Pol in vivo despus de una inmunizacin, hizo pensar en un papelde esta DNA polimerasa en el proceso de hipermutacin somtica (Domnguez y cols,2000; Ruiz y cols., 2001; Lucas y cols., 2005), mediante el que se introducenmutaciones en los genes V de las inmunoglobulinas para mejorar el nivel de afinidadpor el antgeno. Estudios de sobreexpresin de Pol en clulas Ramos, en las que lahipermutacin somtica es constitutiva, apoyaron la hiptesis inicial, ya que se observun aumento en las mutaciones somticas de los genes V (Ruiz y cols., 2004). Sinembargo, estudios in vivo con ratones deficientes en Pol revelaron que lahipermutacin somtica se segua produciendo, por lo que Pol no es imprescindiblepara este proceso (Bertocci y cols., 2002).

Estos resultados parecen apoyar la hiptesis de que en este proceso intervienenvarias DNA polimerasas (revisado por Gearhart y Wood, 2001; revisado por Daz y

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Casali, 2002), como ha sido evidenciado por diferentes estudios que implican en esteproceso a Pol (Faili y cols, 2002), Pol (Rogozin y cols, 2001; Zeng y cols., 2001) yPol (Zan y cols, 2001; Daz y cols., 2001).

Por otra parte, la ubicuidad de Pol en todas las clulas del organismo sugiri unpapel general de esta polimerasa. En primer lugar, se asoci su funcin a la reparacinde roturas de doble cadena, concretamente mediante el mecanismo de reunin deextremos no homlogos (NHEJ), proceso que comparte factores proteicos con elproceso de recombinacin V(D)J y donde recientemente se ha demostrado que la Poles esencial para el desarrollo embrionario del sistema inmune participando en lareparacin de roturas de doble cadena que se producen en este proceso y comoconsecuencia contribuyendo a la preservacin de la estabilidad genmica de losprecursores linfohematopoyticos durante el desarrollo (Gozalbo-Lpez y cols., 2009).

La similitud existente entre Pol y TdT, que es reclutada a los extremos de unarotura a travs de la interaccin con el heterodmero Ku mediante su dominio BRCT(Mahajan y cols., 1999), hizo pensar en un papel de Pol en NHEJ en tejidos nolinfoides (Ruiz y cols., 2001). Esta hiptesis se apoya tambin en propiedades de Pol,como la capacidad de relleno de pequeos gaps, la capacidad de dislocacin de la hebramolde y su actividad transferasa terminal controlada que define el balance entre laprecisin y la eficiencia en procesos de NHEJ (Andrade y cols., 2009), que seran muytiles a la hora de reparar este tipo de roturas.

1.3.1.4 La DNA polimerasa

Pol es el miembro de la familia X de DNA polimerasas que guarda mayorsimilitud con Pol, presentando un 32% de identidad con la secuencia aminoacdica delcore tipo Pol (Garca-Daz y cols., 2000; Aoufouchi y cols., 2000; Nagasawa y cols.,2000).

Organizacin estructural

Con una organizacin estructural similar a Pol, Pol posee un dominio depolimerizacin de 31 kDa (formado por tres subdominios: dedos, palma y pulgar)y un dominio de 8 kDa. Adicionalmente, en su extremo N-terminal muestra un dominioBRCT, dispensable para la catlisis (Nagasawa y cols., 2000), que fue identificado porprimera vez en la protena BRCA1 y que est implicado en procesos de interaccinentre protenas y de protenas con el DNA (Callebaut y Mornon, 1997; Bork y cols.,1997). A su vez, entre el dominio BRCT y el ncleo conservado tipo Pol hay unaregin rica en aminocidos serina, treonina y prolina, que podra constituir un dominiodiana de modificaciones postraduccionales como fosforilaciones y glicosilaciones, quepudieran regular la actividad de Pol (Garca-Daz y cols., 2000) (Fig. 2).

Propiedades bioqumicas

Pol es una DNA polimerasa dependiente de molde, que carece de actividad35 exonucleasa y cuyo modo de sntesis es distributivo en molculas tipomolde/iniciador, es decir, slo es capaz de sintetizar unos pocos nucletidos antes dedisociarse del DNA (Garca-Daz y cols., 2002). Sin embargo, al evaluar su capacidadde polimerizacin en molculas con pequeos gaps se observ que su modo de sntesis

INTRODUCCIN

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pasaba a ser procesivo, siendo capaz de rellenar todo el gap sin disociarse del DNA,siempre que en el extremo 5 del gap hubiese un grupo fosfato (Garca-Daz y cols.,2002).

El metal divalente utilizado como cofactor por las DNA polimerasas influye demanera determinante en aspectos como la fidelidad de sntesis o la eficiencia cataltica,como ha sido descrito para Pol (Pelletier y cols., 1996b) y Pol (Domnguez y cols.,2000). De igual forma, el uso de Mn2+ como metal activador de Pol provoca unincremento en la capacidad de desplazamiento de banda (Garca-Daz y cols., 2002).

Desde el punto de vista del nucletido existen diferentes aspectos a destacar.Pol posee una gran afinidad por nucletido (baja Km), lo que le permite llevar a cabola catlisis enzimtica incluso cuando la concentracin de dNTPs es muy baja (Garca-Daz y cols., 2002). Por otro lado, Pol es capaz de insertar tanto dNTPs (3OH) comoddNTPs (3H) debido a la baja discriminacin a nivel de la posicin 3 del azcar queposee (Garca-Daz y cols., 2002). Sin embargo, Pol s que es capaz de discriminarentre dNTPs y rNTPs, al contrario de lo que le sucede a Pol (Ruiz y cols., 2003; Nick-McElhinny y Ramsden, 2003).

Las DNA polimerasas de la Familia X, por carecer de actividad exonucleasa35 correctora de errores, no se caracterizan por una elevada fidelidad de sntesis(Domnguez y cols., 2000). Pol y Pol cometen errores de sustitucin de base con unafrecuencia similar, sin embargo, Pol posee una tendencia exacerbada a cometer erroresde delecin, convirtindose en el enzima con mayor tasa de error de este tipo de losestudiados hasta el momento, incluyendo a los miembros de la Familia Y, consideradascomo polimerasas mutagnicas (Bebenek y cols., 2003).

El dominio de 8 kDa de Pol es crucial para entender las peculiaridadesfuncionales de este enzima. Al igual que sucede con Pol, el dominio de 8 kDa esresponsable de mltiples caractersticas bsicas de Pol . En primer lugar, se ha podidodemostrar la existencia de una actividad dRP-liasa asociada a este dominio (Garca-Dazy cols., 2001). Sin embargo, Pol carece de actividad AP-liasa, a pesar del alto gradode similitud con el dominio de 8 kDa de Pol, lo que sugiere que quiz esta actividadresida en el dominio de polimerizacin de Pol (Garca-Daz y cols., 2001).

Al igual que sucede con los residuos implicados en la actividad dRP-liasa, Polconserva los residuos del dominio de 8 kDa que han sido relacionados con la capacidadde unin al grupo fosfato en 5 en su homloga Pol (Fig. 5), lo que explicara elcambio de patrn de polimerizacin observado en molculas tipo gap con grupo fosfatoen 5 (Garca-Daz y cols., 2002).

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Principales funciones propuestas para Pol

Debido a la expresin predominante de Pol en testculo se propuso un papelpara Pol en procesos de reparacin asociados a procesos de meiosis durante laespermatognesis. Asimismo, la expresin se ve regulada en el tiempo y en el espacio,siendo la presencia de Pol mxima en los espermatocitos en fase Paquitene tarda,momento en que se produce la recombinacin meitica (Garca-Daz y cols., 2000).

Gracias a la presencia de la actividad dRP-liasa asociada al dominio de 8 kDa dePol y a la capacidad de llevar a cabo la reaccin de reparacin por escisin de base(BER) in vitro con protenas purificadas, se puede pensar que Pol puede participar enesta ruta de reparacin in vivo (Garca-Daz y cols., 2001). Adems, la presencia deldominio BRCT y la expresin tan abundante de Pol en testculo, donde han sidodescritos altos niveles de reparacin por BER (Intano y cols., 2001; Olsen y cols.,2001), aval la hiptesis de que Pol podra estar asociada a eventos de reparacinespecficos no accesibles a Pol (Garca-Daz y cols., 2001). Asimismo, gracias a sucapacidad de desplazamiento de banda en presencia de iones Mn2+, Pol podra tener unpapel relevante en la ruta de reparacin BER de trecho largo (Garca-Daz y cols., 2002;Parlanti y cols., 2003).

Por otro lado, Pol podra ser la protena implicada en diferentes eventos desntesis de DNA asociados a procesos de reparacin cuando en la clula los niveles dedNTPs fueran bajos, gracias a la gran afinidad que muestra por este sustrato (37 vecesmayor que Pol), lo que sera muy beneficioso para la clula en ciertas fases del ciclocelular, as como para las clulas que no se encuentran en proliferacin (Garca-Daz ycols., 2002).

La caracterizacin de su baja fidelidad de sntesis hizo pensar en un posiblepapel de Pol en el proceso de hipermutacin somtica, ya que existe una opiningeneralizada segn la cual este proceso ha de involucrar DNA polimerasas propensas acometer errores (revisado por Gearhart y Woods, 2001). Sin embargo, al obtener el

Figura 5: Alineamiento de secuencia aminoacdica de los dominios de 8 kDa de lasdiferentes DNA polimerasas humanas de la Familia X.Los aminocidos de Pol idnticos a los de otras DNA polimerasas se muestran en blancosobre fondo negro. Los residuos de Pol conservados en otras DNA polimerasas se muestranen negrita. La numeracin de los residuos se realiza tomando como origen la metionina delextremo N-terminal.Los residuos relevantes para la actividad dRP liasa se indican con unpunto. El residuo responsable de la actividad dRP-liasa de Pol (K312) y Pol (K72) estsealado con un asterisco. Este alineamiento fue realizado con el programa Multalin(www.toulouse.inra.fr/multalin.html), y el resultado fue ajustado manualmente en base a losdatos de las estructuras cristalinas disponibles de TdT (Delarue y cols., 2002) y Pol(Pelletier y cols., 1994; Pelletier y Sawaya, 1996; Pelletier y cols., 1996a; Sawaya y cols.,1997).

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modelo murino deficiente en Pol se observ un patrn de mutaciones normal desde elpunto de vista cuantitativo (nmero de mutaciones), cualitativo (tipo de mutaciones) yde distribucin a lo largo del gen estudiado (Bertocci y cols., 2002). De este trabajo sepuede concluir que Pol no es indispensable para este proceso, probablemente debido auna situacin de redundancia entre distintas DNA polimerasas.

Por otro lado, la interaccin especfica entre Pol y el antgeno nuclear deproliferacin celular (PCNA, Maga y cols., 2002; Shimakazi y cols., 2002), implicaba aPol en nuevos procesos de reparacin y de tolerancia al dao. Se ha descrito que enpresencia de PCNA Pol es capaz de sintetizar DNA teniendo como molde un sitioabsico (Maga y cols., 2002) gracias a un mecanismo de dislocacin de la hebra moldeque hace que la sntesis vaya dirigida por el siguiente nucletido de la cadena (Blanca ycols., 2004). Pol es capaz de tolerar la presencia de 8oxoG en el DNA (Picher yBlanco, 2007), siendo su comportamiento ms fiel en presencia de PCNA y la protenareplicativa A (RPA) (Maga y cols., 2008). Recientemente se ha descrito la participacinde Pol en procesos de reparacin de pares de bases daadas en los que participa laglicosilasa MutY (van Loon y Hbscher, 2009).

Los primeros estudios sobre la DNA polimerasa IV de Saccharomycescerevisiae en un principio aportaban pistas para un posible papel de Pol en la ruta dereparacin NHEJ ya que PolIV muestra un alto grado de identidad estructural y desecuencia aminoacdica con Pol. Comparten el ncleo tipo Pol y tambin losdominios situados en la zona N-terminal, el dominio BRCT y el dominio Ser/Pro(Garca-Daz y cols., 2000). PolIV ha sido implicada en la reparacin por NHEJ(Wilson y Lieber, 1999), y se ha descrito su interaccin con los componentes de la ruta(Tseng y Tomkinson, 2002). Otras razones por las que se le ha asignado a Pol un papelen la reparacin por NHEJ son su elevada propensin a cometer errores de delecin quepodra reflejar una capacidad intrnseca de esta polimerasa para utilizar sustratos deDNA que tuviesen apareamientos imperfectos, como los que probablemente se generendurante la reparacin de roturas de doble cadena mediante el mecanismo NHEJ(Bebenek y cols., 2003). La presencia del dominio BRCT podra ser beneficiosa para laregulacin de la participacin de Pol en este mecanismo, ya que podra regular elacceso de Pol a la sinapsis de los extremos slo cuando se produzcan cierto tipo desustratos que requieran de su accin. Ms recientemente se ha descrito de una formams directa, la participacin de Pol en procesos de reparacin por NHEJ gracias a lasinteracciones protena-protena mediadas por su dominio BRCT (Ma y cols., 2004; Leey cols., 2004; Nick-McElhinny y cols., 2005; Capp y cols., 2006; Lieber y cols., 2010).

Reparacin de roturas de doble cadena por el mecanismo de reunin deextremos no homlogos (NHEJ).

Las roturas de doble cadena (DSB) representan un tipo de dao extremadamentepeligroso para la clula. Estas roturas pueden surgir como consecuencia de agentesqumicos exgenos o por la exposicin a radiacin ionizante (Morgan y cols., 1996;Ward, 2000) as como consecuencia del metabolismo propio de la clula (Karanjawala ycols., 2002) que podran introducir modificaciones qumicas en el DNA, incluidomodificaciones de las bases y el azcar, aductos entre el DNA y protenas y sitiosabsicos. De igual manera las clulas eucariticas producen DSB de una formaprogramada mediante la expresin controlada de endonucleasas especficas par supropio beneficio, tal y como ocurre en levaduras durante el cruce (Paques y cols., 1999),

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el reordenamiento y posterior segregacin correcta de los cromosomas durante lameiosis en todos los organismos eucariotas (Keeney y cols., 2006) as como encontextos V(D)J en clulas de vertebrados (Soulas-Sprauel y cols., 2007).

La reparacin de estas roturas es esencial para mantener la estabilidad genmica.La reparacin de roturas en los cromosomas de una clula en divisin es esencial para elreparto en igual proporcin del material gentico a las clulas hijas. Alteraciones oprdidas de fragmentos de cromosomas pueden conducir por un lado, a una muerteprogramada de la clula por apoptosis, o por otro a procesos tumorales mediados por laactivacin de oncogenes o la inactivacin de genes supresores de tumores. Por estarazn los organismos eucariticos han desarrollado dos sistemas eficientes dereparacin de roturas de doble cadena: la recombinacin homloga (HR) y la reunin deextremos no homlogos (NHEJ).

La recombinacin homloga se basa en la existencia de una segunda copia de laregin a reparar, que sirve de molde para la sntesis de DNA, lo que permite restaurar laintegridad del DNA daado de manera fiel (revisado por West, 2003). Sin embargo,debido a la organizacin cromosmica y a la composicin genmica, con gran cantidadde DNA repetido ( 40%), la bsqueda de complementariedad para reparar una roturaproducida en una zona de DNA repetido sera un proceso lento y peligroso para laclula, ya que podra encontrarse complementariedad de secuencia en regiones de DNArepetido de cualquier cromosoma, pudiendo dar lugar a reordenamientos cromosmicoscomo translocaciones. Slo durante las fases S tarda, G2 y M, la recombinacinhomloga est activa ya que el posicionamiento adyacente de las cromtidas hermanaspermite llevar a cabo el proceso sin riesgo para la clula. Durante las fases G0, G1 y Stemprana, la recombinacin homloga se encuentra inactiva (Takata y cols., 1998).

Por su parte, el mecanismo de NHEJ reconoce los extremos de una rotura dedoble cadena y, basndose en secuencias complementarias de pocos nucletidos (1-4 nt,o incluso en ausencia total de complementariedad), restaura la integridad del DNA conescasas modificaciones en la secuencia. Esas modificaciones son producto delprocesamiento necesario de los extremos por parte de la maquinaria de NHEJ parapoder unir y sellar los extremos (Hefferin y Tomkinson, 2005; Ma y cols., 2005; Lieber,2008) ms econmico desde el punto de vista mecanstico, sobretodo considerando lasnecesarias remodelaciones de la cromatina. El primer paso de la ruta NHEJ es lasinapsis de los extremos de la rotura de doble cadena. El heterodmero Ku70/Ku86reconoce los extremos de la rotura, y gracias a su estructura toroidal acomoda el dplexde DNA en su interior, previniendo la posible degradacin nucleoltica (Walker y cols.,2001). A continuacin, la quinasa DNAPK se recluta (Dvir y cols., 1992; Gottlieb yJackson, 1993), desplazando ligeramente al heterodmero Ku (Dynan y Yoo, 1998), ypermitiendo que ambos extremos se acerquen gracias a interacciones protena-protenaespecficas (Yaneva y cols., 1997; Chen y cols., 2000; DeFazio y cols., 2002). Elcomplejo DNA-PK formado recluta a su vez a las protenas necesarias para un posibleprocesamiento y posterior ligacin de los extremos. Artemis, una exonucleasa 35 decadena sencilla, se activa mediante fosforilacin por DNA-PK mostrando tambinactividad endonucleasa en extremos tanto 3 como 5 protuberantes (Ma y cols., 2002).La polinucletido quinasa PNK, que posee actividad 5 DNA quinasa y 3 DNAfosfatasa (Karimi-Busheri y cols., 1999), se encarga de procesar los extremos (Chappelly cols., 2002). Tras el procesamiento y alineamiento de las cadenas de DNA, es factiblela aparicin de huecos de pocos nucletidos que tendrn que ser rellenados como paso

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previo a la ligacin. En este proceso se ha implicado tanto a Pol como a Pol enfuncin del grado de complementariedad existente entre los extremos (Mahajan y cols.,2002; Nick-McElhinny y cols., 2003; Ma y cols., 2004). Asimismo, Pol podrarealizar una polimerizacin independiente de molde para promover la aparicin desecuencias complementarias necesarias para el alineamiento (Ma y cols., 2004; Jurez ycols., 2006). Por ltimo, el complejo formado por XRCC4/DNA ligasa IV sella la uninentre los extremos de la rotura (Grawunder y cols., 1997; Chen y cols., 2000) (Fig. 6).

Recientemente, se ha identificado en mamferos un factor similar a la protenaXRCC4 denominado XLF (XRCC4-like factor) o Cernunnos, el cual interacciona con elcomplejo XRCC4/DNA ligasa IV promoviendo la ligacin de los extremos (Ahnesorg ycols., 2006; Hentges y cols., 2006). En S. cerevisiae, el proceso de NHEJ requiere lasprotenas Ku70/Ku80, el complejo MRX (Mre11-Rad50-Xrs2), la DNA ligasa 4 (Dnl4),XRCC4 (Lif1), Nej1 (homlogo de XLF) y ScPolIV. Curiosamente no se hanidentificado homlogos de DNA-PK y Artemis (Daley y cols., 2005). En S. pombe esteproceso nicamente requiere las protenas Ku70/Ku80, Xlf1, DNA ligasa 4 yprobablemente SpPolIV (Gonzlez-Barrera y cols., 2005). Sorprendentemente, S. pombeno presenta homlogos de XRCC4, ni de DNA-PK y Artemis (Manolis y cols., 2001;Prudden y cols., 2003; Hentges y cols., 2006; Cavero y cols., 2007). Estos datossugieren que el ncleo fundamental de protenas para el mecanismo de NHEJ en todoslos organismos es Ku70/Ku80 y la DNA ligasa IV, mientras que hay organismos querequieren de otros factores adicionales como la DNA-PK, Artemis, XRCC4/Lif1 y elcomplejo MRN/MRX.

Figura 6. Mecanismo de reparacin porunin de extremos no homlogos (NHEJ).Este sistema de reparacin se encarga de repararroturas de doble cadena que se generan en elDNA como consecuencia de un dao. (A) Elheterodmero Ku70/Ku86 reconoce y se une alos extremos de la rotura. (B) A continuacin seune la quinasa dependiente de DNA DNA-PK.(C ) que recluta y activa por fosforilacin a lanucleasa Artemis y a PNK (D), los cuales seencargan de procesar los extremos.Posteriormente se alinean los extremos, serellenan los huecos generados (E ) y se sella larotura (F), proceso en el que intervienen DNApolimerasas de la familia X, XRCC4 y DNAligasa IV.

INTRODUCCIN

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MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES Y MTODOS

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MATERIALES Y MTODOS

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1 MATERIALES

1.1 EnzimasLa polinucletido quinasa de T4 (T4 PNK), uracil DNA glicosilasa (UDG) ,

glicosilasa 8 oxo guanina humana (hOGG1), glicosilasa de cadena sencillamonofuncional humana (SMUG1) y DNA ligasa de T4 se adquirieron en New EnglandBiolabs; la glicosilasa MutY de Trevigen; Pfu DNA polimerasa se obtuvieron dePromega; las endonucleasas de restriccin, fosfatasa alcalina de gamba, Klenow y TaqExpand High Fidelity fueron adquiridas en Roche; la hAPE fue cedida por el Dr S. H.Wilson (NIEHS, Research Triangle Park, NC). Las Pol y Pol humanas purificadas seobtuvieron como se describi anteriormente (Domnguez et al., 2000; Garca-Daz etal., 2002). El cocktel de inhibidores de proteasas fueron suministrados por Roche.

1.2 ReactivosLas sales inorgnicas, cidos, bases y compuestos orgnicos, fueron

suministrados por Merck, Sigma y Fluka.

1.3 NucletidosSe utilizaron desoxinucletidos y ribonucletidos ultrapuros no marcados

adquiridos en Amershan Biosciences y los ncleotidos marcados radioactivamente; [-32P]ATP, [-32P]dATP, [-32P]dCTP [-32P]dGTP, [-32P]dTTP (3000Ci/mmol)adquiridos en Amershan Biosciences y Perkin Elmer. Los oligonucletidos sintticosfueron obtenidos de Invitrogen e Isogen.

2 MTODOS

2.1 CULTIVOS CELULARES2.1.1 Cultivo celular del parsito Leishmania infantum

Los cultivos celulares se realizaron en colaboracin con la Dra. Ana Alonso(CIB, Madrid). La cepa del parsito (MHOM/FR/80/LEM75) fue amablemente cedidapor el Servicio de Parasitologa, Majadahonda, Madrid. Los promastigotes, o formaextracelular, de L. infantum se crecieron a 26C en RPMI-1640 (Gibco BRL, Scotland,UK) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco BRL, Scotland, UK),penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 g/ml). El cultivo se inicia partiendo de 106clulas y los Promastigotes se separan en sus fases logartmica y estacionaria en funcinde su morfologa y concentracin celular como se define en (Zarley y cols., 1991). LosPromastigotes pasan de su estado no infectivo durante el crecimiento logartmico aestado infectivo en su fase estacionaria. (Da Silva y cols., 1987).

La otra forma celular del parsito o amastigote (MCAN/ES/89/IPZ229/1/89), fueamablemente cedida por la Dra. M. Colmenares Centro de Investigaciones Biolgicas(CSIC, Madrid). Para obtener estos amastigotes se requiere cultivar los promastigotes

MATERIALES Y MTODOS

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dando entre cuatro y seis pases a bajas diluciones (1:101:25) para adaptarlos alcrecimiento en medio cido. Una vez establecidos se valora su capacidad de crecimientoen el medio a 37C (Armson y cols., 1999).

2.1.2 Generacin de lneas celulares que sobreexpresan distintas construccines dehPol

Los vectores hPolR438-pIRES y hPolW438-pIRES, construidos como sedetalla ms adelante, se transfectaron, mediante jetPEI (Qbiogen), clulas de ovario dehmster chino (CHO-DRA10), MRC5 y XRCC4KD para generar clones estables porseleccin con puromicina (5 g/ml) (Invivogen). Estas clulas se generaron encolaboracin con el grupo del Dr. Jean-Sebastien Hoffmann (Toulouse, Francia).

Las clulas CHO-DRA10 se cultivaron en medio Eagle (MEM) , 10% de suerofetal bobino (GIBCO BRL) y penicilina/estreptomicina (Sigma) . Los clones DRA10-R2, DRA10-R15 y DRA10-W14, DRA10-W15 se obtubieron por transfeccin establede los vectores que contenan los cDNAs de R438 y W438 respectivamente. Paraobtener el clon DRA10-WD14 con la Pol inactiva, se realiz transfectando hPolWD-pIRES con jet-PEI de igual manera que para las construcciones anteriores.

De igual manera se obtuvieron clones en las clulas MRC5 y clulasXRCC4KD Estas clulas fueron cultivadas en medio Eagle modificado por Dulbecco(DMEM) (Dulbecco y Freeman, 1959), 10% suero fetal bobino (GIBCO BRL),penicilina/estreptomicina (Sigma) y aminocidos no esenciales (Sigma).

2.1.3 Obtencin de fibroblastos embrionarios a partir de embriones de ratnhermanos de camada (MEFs)

El protocolo se realiza a partir de embriones de 14,5 das procedentes de uncruce entre ratones heterocigotos. Se sacrifica a la hembra por dislocacin cervical y seinterviene al animal en una cmara de flujo para mantener las condiciones deesterilidad. Se extrae el tero y se trasvasa a una placa p100 para lavarlo con PBS. Serealizan varios lavados en PBS. A continuacin se extraen los embriones del tero conunas pinzas de diseccin, desechando las placentas. Los embriones se trasvasan a unaplaca p100 con medio de crecimiento sin suero de MEFs atemperado. Se eliminan lascabezas y las vsceras de cada embrin. Se lava el resto del embrin en medio frescopara MEFs sin suero y atemperado. Se transfiere cada embrin a un tubo con 1 ml de0,05% tripsina, 0,02% EDTA. Se incuba en agitacin suave 4 h a 4C. Pasado esetiempo se incuba a 37C hasta obtener una mezcla homognea, ayudando a ladisgregacin con la pipeta si fuera necesario. Posteriormente se diluye la mezcla conmedio para fibroblastos hasta alcanzar los 5 ml por embrin. La mezcla se filtra 3 vecesen gasas estriles para desechar los restos de vsceras. A continuacin, se centrifuga lamezcla 1000 rpm 5 min a temperatura ambiente y el sobrenadante de siembra en placap100. Se mantiene el cultivo a 37C. Cuando la placa llega a confluencia se divide paramantener en cultivo, congelar MEFs y extraer DNA genmico para realizar elgenotipado.

MATERIALES Y MTODOS

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2.2 Mantenimiento de las colonias de ratonesLos ratones utilizados en los experimentos fueron mantenidos en el animalario del

Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa. Se agruparon en un mximo de 5animales por jaula con agua y comida (Harlan Iberica) ad libitum y se mantuvieron encondiciones de temperatura controlada y con ciclos de luz-oscuridad de 12 h conencendido de luz a las 07:00 h. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con lasnormas aprobadas por el comit tico del CSIC.

2.3 Derivacin del modelo murino de deficiencia en Pol de fondomixto a fondo puro C57Black6.

En el laboratorio poseemos dos modelos murinos de deficiencia en cada una delas DNA polimerasas que son objeto de estudio de nuestra investigacin, Pol y Pol.El modelo murino de deficiencia en Pol se gener en colaboracin con el laboratoriode Klaus Rajevski (Colonia, Alemania) El modelo de deficiencia en Pol fue generadoen colaboracin con el grupo del Dr. Antonio Bernad (CNIC, Madrid). Ambos modelospresentaban un fondo gentico mixto debido a la procedencia de los progenitores. Parapoder unificar el fondo gentico decidimos derivar a un fondo puro C57Black6 ambascolonias de ratones. La derivacin del modelo de deficiencia en Pol (knock out ,KO) se realiz por el grupo del Dr. Antonio Bernad (CNIC, Madrid). En nuestrolaboratorio llevamos a acabo la derivacin del modelo murino de deficiencia en Pol(knock-out , KO). Para ello se realiza un primer cruce del ratn entre un ratn KO yun ratn silvestre C57Black6. De la 1 generacin (F1) resultan animales heterocigotospara Pol. A continuacin se cruza un ratn de F1 por un raton silvestre por un ratnsilvestre C57Black6. La generacin 2 se genotipa para escoger un ratn heterocigoto ycruzarlo nuevamente por un ratn silvestre C57Black