facultad de medicina centro universitario de ...digeset.ucol.mx/tesis_posgrado/pdf/ricardo antonio...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD DE COLIMAFACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD EN FISIOLOGIA
PRESENTA
RICARDO ANTONIO NAVARRO POLANCO
DIRECTOR DE TESIS: Dr. JOSE ANTONIO SANCHEZ CHAPULACo DIRECTOR DE TESIS: Dr. ALEJANDRO MANUEL ELIZALDE LOZANO
ENERO DE 1993
I N D I C E
PAGINA
INTRODUCCION GENERAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
El potencial de acción en las célulascardiacas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Mecanismos ionices involucrados en elpotencial de acción cardiaco. . . . . . . . . . . . 9
Las corrientes repolarizantes en elpotencial de acción. . . . . . . . . . . . . . . . 12
- El rectificador anómalo (IK1). . . . . . . . . . 12
- El rectificador tardío (Q). . . . . . . . . . . 15
- La corriente transitoria de salida (Ita). . . . . 16
OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
M E T O D O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 0
Preparación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Preparación multicelular. . . . . . . . . . . . . . ,20
- Estimulación eléctrica y registro delpotencial de acción. . . . . . . . . . . . . . . 21
Preparación de miocitos. . . . . . . . . . . . . . 23
- Registros electrofisiológicos. . . . . . . . . . 24
Protocolos experimentales . . . . . . . . . . . . . 24
Micropipetas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
RESULTADOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28.
La forma y duración del potencial de accióny la respuesta al cambio de frecuencia. . . . . . . 28
Respuesta de los potenciales de accióna la 4-amimopiridina (4-AP). . . . . . . . . . . . 30
Respuesta de los potenciales de acciánal sotalol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Identificación de las corrientes repolarizantesen los miocitos aislados. . . . . . . . . . . . . . 35
- La corriente de rectificación tardia (IK). . . . 42
- Bloqueo de IK por el sotalol. . . . . . . . . . . 43
- Bloqueo de la Itol por la 4-AP. . . . . . . . . . 43
- La corriente transitoria dependientede calcio (Ito2). . . . . . . . . . . . . . . . . 46
DISCUSION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
CONCLUSIONES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. . . . . . . . . . . . . . . 59
2
demostrado que cada célula está unida a otras por medio de
uniones especializadas llamadas discos intercalares. De esta
manera, cada célula se une con dos o mas células para formar
una malla tridimensional formándose asi láminas, haces o
fascPculos en los que las células cardIacas están
estrechamente unidas entre si. Estas unidades a su vez están
rodeadas de tejido conectivo y de vasos sanguíneos.
En el miocardio se distinguen básicamente tres
tipos de células musculares con estructura diferente: i)
las células de los nodos senoauricular (SA) Y
auriculoventricular (AV), que generan la actividad marcapaso
Y la conducen entre aurlcula y ventriculo respectivamente;
ii) las fibras de Purkinje, encargadas de la transmisión del
impulso desde el haz de Hiss a las células ventriculares;
iii) las células de las aurículas y los ventrículos
especializadas en la contracción son llamadas células de
trabajo (Sommer y Johnson, 1979).
Las células de las auriculas tienen ligeras
diferencias con las de los ventriculos (McNutt y Fawcett,
1974). Son de menor tamaño que las ventriculares y poseen un
escaso porcentaje de túbulos transversos (tubulos T).
Las células de los nodos son más pequeñas que las
células de trabajo del miocardio y forman una especie de red
rodeada de un tejido conectivo denso (James y Sherf, 1968).
Las células del tejido de conducción tienen una
estructura similar al tejido de trabajo. La diferencia más
importante radica en que poseen una distinta proporción de
3
los organelos intracelulares, lo que indica una diferente
especializacibn. En las fibras de Purkinje solo el
10% de su volumen es ocupado por mitocondrias, mientras que
las miofibrillas ocupan el 30% del volumen total; 20% menos
que en las células de trabajo. Esto explica la menor tensión
que desarrolla este tipo de células, comparadas con las de
trabajo.
El sarcolema en las células cardiacas no es una
envoltura completamente lisa sino que presenta varios tipos
de invaginaciones 0 irregularidades. El tipo de
invaginaciones más notable es el sistema de túbulos T. Estos
se encuentran en las células ventriculares de los mamiferos;
su presencia en las aurículas es poco frecuente. En general
no se encuentran tubos T en el sistema de conducción.
El retículo sarcoplásmico (RS) es un organelo
fundamental en la regulacibn de la concentración del calcio
intracelular. En las células cardiacas una parte del RS se
relaciona con el sarcolema, ya sea con el periférico
(superficial) o el de los tubos T. La otra, forma una red
estrechamente relacionada con el material contrScti1. En
esta red, los tubos forman una malla en forma de panal que
se extiende en segmentos planos con un ordenamiento respecto
a la sarcómera menos organizado o regular al que tiene el
retículo sarcoplásmico del mGscul0 esquelético. Estos
segmentos del RS están más desarrollados a nivel de la banda
M y de la línea 2. Ambas porciones del RS están
interconectadas.
4
El material contráctil ocupa aproximadamente el
50% del volúmen de una célula cardiaca de trabajo. Al igual
que en el músculo esquelético la actina y la miosina son las
principales proteinas que forman los miofilamentos que se
alternan y superponen entre SS, formando haces paralelos.
Las células cardíacas son capaces de conducir
impulsos eléctricos y de contraerse. Estos dos fenómenos; el
eléctrico y el mecánico estdn estrechamente relacionados. El
primero de estos, representado por el potencial de acción,
desencadena una serie de eventos que producen la contracción
muscular. A esta relación estimulo respuesta se le conoce
como acople excitacion-contraccion.
La conducción del potencial de acción a través de
regiones extensas del músculo cardiaco es posible debido a
la existencia de uniones comunicantes (nexus) entre las
células individuales. Estas regiones de contacto entre las
células cardiacas (Discos intercalares) son sitios de baja
resistencia eléctrica (de 1 a 3 5/cm2), aproximadamente 1000
veces menor que la resistencia de la membrana plasmática,
por lo cual la corriente puede fluír fácilmente de célula a
célula (Weidmann, 1970).
5
EL POTENCIAL DE ACCION EN LAS CELULAS CARDIACAS.
Los potenciales de acción de las células cardiacas
son más prolongados que los registrados en el nervio y el
mdsculo esquelético y presentan una meseta prominente . En
las fibras de Purkinje el potencial de acción dura
aproximadamente 300 ms y pueden ser definidas
morfológicamente cinco fases. La fase 0 se caracteriza por
una rápida despolarización e inversión del potencial de
membrana y la velocidad máxima de la despolarización (V,,,)
es de aproximadamente 500 V/s. La siguiente fase (fase 1)
consiste en una repolarización inicial de corta duración,
que es seguida por una meseta 0 fase 2, la cual es
principalmente responsable de la prolongada duración del
potencial de acción cardíaco. Durante la fase 3 el potencial
de membrana es llevado hacia su potencial de reposo
(repolarización). En estas células la fase 4 corresponde a
la despolarización diastólica espontánea.
Los potenciales de acción cardiacos varian en
forma y duración dependiendo del tejido donde sean
registrados (Hoffman y Cranefield, 1960). Las células de los
nodos SA y AV tienen una fase 0 de ascenso muy lento (l-3
V/s) y las fases 1, 2 y 3 no pueden distinguirse claramente.
Durante la fase 4 presentan característicamente el fenómeno
de despolarización diastólica espontánea (fis. 1).
5
EL POTENCIAL DE ACCION EN LAS CELULAS CARDIACAS.
Los potenciales de acción de las células cardiacas
son mas prolongados que los registrados en el nervio y el
musculo esquelético y presentan una meseta prominente . En
las fibras de Purkinje el potencial de acción dura
aproximadamente 300 ms y pueden ser definidas
morfológicamente cinco fases. La fase 0 se caracteriza por
una rápida despolarización e inversión del potencial de
membrana y la velocidad máxima de la despolarización (V,,,)
es de aproximadamente 500 V/s. La siguiente fase (fase 1)
consiste en una repolarización inicial de corta duración,
que es seguida por una meseta 0 fase 2, la cual es
principalmente responsable de la prolongada duración del
potencial de accibn cardiaco. Durante la fase 3 el potencial
de membrana es llevado hacia su potencial de reposo
(repolarización). En estas células la fase 4 corresponde a
la despolarización diastólica espontánea.
Los potenciales de acción cardiacos varian en
forma y duración dependiendo del tejido donde sean
registrados (Hoffman y Cranefield, 1960). Las células de los
nodos SA y AV tienen una fase 0 de ascenso muy lento (l-3
V/s) y las fases 1, 2 y 3 no pueden distinguirse claramente.
Durante la fase 4 presentan característicamente el fenómeno
de despolarización diastólica espontánea (fis. 1).
6
NSA
A
NAV
MSS
FP
V
Figura l.- Reg is t ros tipicos d e los potencia les d e accibn u nd i f e r e n t e s t e j i d o s c a r d i a c o s d e l corazbn d e p e r r o . NSFS ( N o d os e n o - a u r i c u l a r ) , A (Auricula), NAV ( N o d o auriculo-v e n t r i c u l a r ) , HISS ( H a z d e His), F P ( F i b r a s d e Purkinje) y V( M ú s c u l o vent r icu la r ) . T o m a d a d e H o f f m a n 6 C r a n e f i e l d(1960).
7
En las fibras auriculares y ventriculares de
trabajo la 'max es de aproximadamente 200 V/s y el
potencial de membrana durante la fase 4 permanece constante
( Ver: Sánchez-Chapula, 1987).
La amplitud y la duración del potencial de acción
cardiaco son variables fisiológicas importantes; modulan la
fuerza de la contracción así como la duración del periodo
refractario y los patrones de conducción en el corazón
(Giles W. R. e Imaizumi Y., 1988). Se han registrado una
variedad de formas y tamaños de potenciales de acción en
preparaciones musculares cardiacas aisladas. Algunas de
estas diferencias dependen de la especie. Se sabe también
que la forma del potencial de acción cambia notablemente
cuyo se varia la frecuencia de estimulación (Boyett y
Jewell, 1980).
La explicación biofísica para estas diferencias
requiere conocer detalladamente cada una de las corrientes
iónicas que generan las fases de meseta y repolarización del
potencial de acción. El método de fijación de voltaje ha
permitido conocer mejor estos mecanismos electrofisiológicos
en las células cardiacas (Mc Allister et al. 1975).
El objetivo de las técnicas de fijación de voltaje
(FV) es el de medir la corriente necesaria para mantener el
potencial en áreas determinadas de membrana celular en un
valor conocido y que sea uniforme con respecto a la
distancia y el tiempo.
Los métodos más utilizados de FV en preparaciones
multicelulares cardiacas son, entre otros, la brecha ánica
de sacarosa, la brecha doble de sacarosa y el método de 3
microelectrodos modificado para músculo cardiaco (Beeler y
McGuigen, 1978). Sin embargo la complicada geometrxa de las
preparaciones cardIacas multicelulares ha impuesto severas
limitaciones para el logro de una adecuada fijación de
voltaje, ya que es un sincicio tridimensional y existe
comunicación entre las células por las uniones de baja
resistencia tanto en la dirección longitudinal como radial,
lo que dificulta obtener la uniformidad en el voltaje.
El uso de preparaciones cardiacas unicelulares
(miocitos dispersados mediante métodos enzimáticos), han
eliminado muchos de los problemas metodolbgicos que
presentan las preparaciones multicelulares cardiacas. Los.
miocitos aislados pueden ser perfundidos internamente, de
manera que se puede controlar la composición iónica a los
dos lados de la membrana (Brown et al. 1981a). Además
disminuyen en forma muy importante los problemas que imponen
los estrechos espacios intercelulares: la resistencia en
serie con la membrana y los fenómenos de acumulación y
depleción de iones. .
9
MECANISMOS IONICOS INVOLUCRADOS EN EL POTENCIAL DE ACCION
CARDIACO.
Las diferentes fases del potencial de acción (PA)
cardiaco pueden ser explicadas en base a las
caracteristicas propias de las corrientes ionicas de entrada
y se salida y la relación que guardan entre SS, en el rango
de voltajes en el que se desarrolla el PA.
Un incremento rápido en la conductancia a Na+ por
la activación de un cierto tipo de canales sensibles a
voltaje, produce la despolarización rápida durante la fase
inicial del PA; esta corriente es la base de la
excitabilidad en la mayoria de las células musculares y
nerviosas. En el corazón, la corriente de sodio (IEa) es
responsable de la fase excitatoria (fase 0) del PA en las
células auriculares, ventriculares y de conducción (Haz de
His y fibras de Purkinje)(Fozzard, H. y Hanck, D. 1992).
En células auriculares aisladas del gato y a una
temperatura de 14OC, la 'Na producida por pulsos
despolarizantes a varios niveles desde un potencial de
mantenimiento de -100 mV, tiene un umbral entre -65 y -60 mV
y el mdximo de corriente se alcanza a los -20 mV (Follmer
et.al. 1986). En la mayoría de los mamsferos estudiados
hasta ahora, el potencial de inversión de INa utilizando
diferentes concentraciones de sodio externo, coincide con el
potencial predicho por la ecuación de Nernst para el Na+
(Brown et al. 1981b).
10
La conductancia de sodio (GNa) calculada a partir
de la conductancia de cuerda muestra una dependencia
sigmoidal del voltaje, con un potencial umbral de
aproximadamente -50 mV, una activación máxima a -10 mV y el
potencial al cual la activación es el 50% de la maxima es deI
aproximadamente -35 mV. La constante de tiempo de
reactivación (Tr) de la corriente de sodio es también
función del potencial de membrana y su valor es de
aproximadamente 20 ms a -100 mV y aumenta a 35 ms a -70 mV.
Esta reactivación lenta de la 1Na podr1a explicar el largo
periodo refractario de los tejidos cardiacos.
Estudios recientes han demostrado la presencia de
un componente de la corriente de sodio que inactiva
lentamente y que participa en la meseta y en la fase final
de la repolarización del PA (Carmeliet, 1987). Estos canales
lentos de Na+ son similares a los canales de inactivación
rápida de sodio en su dependencia al voltaje, conductancia
unitaria, sensibilidad a TTX (tetrodotoxina) y conductancia
a Li+ (Liu et.al. 1992).w
La célula permanece despolarizada durante la
meseta del PA por el movimento hacia adentro de Ca++ a
través de canales de Ca++ sensibles a voltaje. El movimiento
de cargas positivas hacia el interior celular despolariza la
membrana y contribuye además a la actividad marcapaso
(Hagiwara et.al. 1988) y a la conducción de los potenciales
de acción.
ll
En distintas preparaciones cardiacas se ha
demostrado claramente la coexistencia de dos tipos de
canales de calcio; el canal de calcio tipo L y el tipo T
(ICaLI %aT)*
Las corrientes generadas por la apertura de estos
dos tipks de canales pueden separarse con relativa facilidad
puesto que tienen diferente sensibilidad a voltaje y a
fármacos bloqueadores de canales de Ca++ (Pelzer D. et al.
1992). El umbral de activación para ICaL e ICaT en miOCitOS
cardiacos es alrededor de -40 mV y entre -65 a -50 mV
respectivamente, utilizando una concentracibn de 2 mM de Ca
en la solución externa. La inactivación en estado estable de
los canales T inicia a -90 mV y es completa a -50 mV. La
curva de inactivación de los canales L se encuentra entre -
40 y 0 mV, a este último potencial la inactivación es
completa (Bean, 1985).
El PA concluye con la activacibn de canales de K+
sensibles a voltaje que producen un movimiento de iones K+ a
favor de su gradiente electroquímico que repoiariza la
célula. Los canales de K+ sensibles a voltaje también
participan en la generación del potencial de reposo de la
célula y modulan la frecuencia y el umbral del PA'. Las.corrientes generadas por la apertura de estos 'canales
selectivos a K+ son responsables en gran medida de la forma
y duración del PA.
12
LAS CORRIENTES REPOLARIZANTES EN EL POTENCIAL DE ACCION
CARDIACO.
Los canales de K+ descritos hasta ahora en las
preparaciones cardiacas pueden ser divididos en dos grupos
tomando en cuenta el estímulo por el cual estos pueden ser
activados: a) los activados primariamente por voltaje y b)
los activados principalmente por agonistas. Sin embargo,
debe señalarse que los agonistas pueden modificar el
funcionamiento de los canales operados por voltaje y que el
voltaje a su vez afecta a los canales operados por agonistas
(Carmeliet, 1989).
Entre las corrientes de potasio más comunmente
descritas en las céluas cardiacas están: la corriente
transitoria de salida (Ita) responsable de la primera fase
de repolarización (fase l), la corriente del rectificador
tardPo (Ix) importante para la repolarización final (fase
3) y la corriente del rectificador anómalo (Ixi) que se sabe
contribuye al potencial de reposo de las células cardiacas
(Tabla 1).
EL RECTIFICADOR ANOMALO (Ika)
Investigaciones recientes realizadas en miocitos.
ventriculares y de fibras de Purkinje demostraron qué Ikl se
activa con pulsos hiperpolarizantes (Tourneur et al. 1987).
La activación de esta corriente es muy rápida (20 ms a
lOOC), en contraste, el proceso de inactivación tiene un
curso temporal del orden de cientos de milisegundos (Harvey
y Ten Eick, 1988).
13
CORRIENTE DE RECTIFICACION ANOMALAABREVIATURA TEJIDO ESPECIE
Humano%l Cone jo
AURICULA CobayoRanaGato 3
REFERENCIA
Shibata et al. (1989)1) Oiles y Imaisumi (1988)
Noma et al. (1984)Giles y Shibata (1985)
conejoVENTRICULO Cobayo
Gato
1Irisawa (1984)Barvey y Ten Eiak (1988)
NODO S-A Conejo
CORRIENTE DE RECTIFICACION TARDIAConejo
IK AURICULA CobayoRanaGato 3
Yanagihara y Irisawa (1980)
12) Hume y Giles (1983)
Hume et al. (1986)
ConejoCobayo
VENTRICULO PerroGatoCarneroCarnero
12
3) Tseng et al. (1987)MaDonalU y Trautwein (1978b)Noble y Tsien (1972)
4) Josephson y Sanahes-Chapula(1984)
NODO S-A Conejo
CORRIENTE TRANSITORIA DE SALIDARumano
Ita AURICULA ConejoGato 3
Noma et al. (1984)
Escande et al. (1987)1
VENTRICULO
Conejo 1Perro 3Gato Furukawa et al. (1990)(epicardio)Rata 4Raton Benndorf y Nilius (1988)
F. PURKINJE Perro Nakayama y Fo&sard,:(1988)
NODO A-V Conejo Nakayama y Irisawa (1984)--------------------------------------------------------------------
Cuadro 1. Tejidos cardiacos y especies donde se hanregistrado las corrientes IK1, IK e *to*
14
La curva de activación depende de la concentración
externa de K+ ([K+J,) y el potencial en el cual la
activación es el 50% de la máxima es aproximadamente 5 mV
negativos con respecto al potencial de equilibrio para el
potasio (EK) (Cohen et al. 1989). Una característica notable
de Ikl"es la rectificación que presenta a potenciales mas
positivos que EK donde la corriente pasa con mayor facilidad
hacia el interior de la célula. Esta rectificacion es d,ebida
en parte a las caracteristicas de apertura y cierre de la
compuerta del canal y en parte a un rápido bloqueo producido
por el Mg++ intracelular que obstruye el canal cuyo la
corriente empieza a salir. Esto hace suponer que la
dependencia de tiempo de Ikl se debe tanto al bloqueo por
Mg++, como a las caracterkticas intrinsecas de activación e
inactivación del canal (Gintant, G. A. et. al 1992).
En estudios previos se ha demostrado que existen
diferencias significativas en el tipo y amplitud relativa de
la Ikl en varias regiones anatómicas del corazón de algunos
mamiferos y anfibios. Por ejemplo en el corazón dk la rana
toro en aurícula y ventrículo Ikl es grande, pero está
virtualmente ausente en las células del marcapaso (Shibata y
Giles, 1985). En la auricula de cobayo y de conejó el
potencial de reposo es debido a una muy pequeña corriente de
fondo (Ikl). En contraste, Ikl es relativamente grye en
miocitos ventriculares de ambas especies (Giles, W. y
Imaizumi Y. 1988).
15
El Bac12 aplicado en la solución extracelular en
concentraciones micromolares (10M4 M) es un inhibidor
selectivo de Ik1 en los tejidos cardiacos (Irisawa, 1984).
EL RECTIFICADOR TARDIO IR.i’
Esta corriente es activada durante la meseta del
PA y es conocida como corriente de la rectificación tardia
(IK) ya que es dependiente de tiempo. Su activación es lenta
en el rango de cientos de milisegundos y es activada a
potenciales positivos a -50 mV. En preparaciones
multicelulares esta corriente ha sido dividida en dos (Noble
y Tsien, 1968) y hasta tres componentes con cinética
diferente. La totalidad de los canales son activados en
estado estable a +20 mV. Sin embargo, algunos de los
estudios en m i o c i t o s aislados de fibras de Purkinje
concuerdan con una conductancia única cuyo canal presenta
mdltiples estados cerrados (Gintant et al. 1985). Por otro
lado los trabajos de Sanguinetti y Jurkiewicz (1990) en
ventriculo de cobayo han mostrado evidencia consistente
respecto a la presencia de dos tipos de corrientes de
rectificación tardia (IKs e IKr).
Las discrepancias entre ambas preparaciones.
(miocitos aislados y multicelulares) posiblemente se deben a
la acumulación de potasio, durante los pulsos
despolarizantes de larga duración utilizados para estudiar
la corriente en preparaciones multicelulares (Beeler y
McGuigan, 1978). En estudios con fijación de voltaje se han
16
identificado algunas diferencias significativas en los tipos
y tamaños relativos de IK presentes en varias regiones
anatómicas del corazán en distintas especies. Por ejemplo en
miocitos de rana y cobayo se a reportado una IR gran
amplitud (Hume, et al. 1986), esta corriente es
relativamente pequeña en aurllcula y ventriculo de rata
(Josephson, Sánchez-Chapula y Brown, 1984), conejo (Imaizumi
y Giles, 1987), perro (Tseng, et al. 1987) y humano
(Shibata, et al. 1986; Escye, et.al. 1987).
Una de las características mas importantes de
esta corriente es la capacidad que tiene para modificar la
forma y duración del PA en respuesta a variaciones en la
frecuencia de estímulo (sobre todo a frecuencias altas,
mayores de 0.5 Hz). A este fenómeno se le conoce como
acumulación activa del rectificador tardío y se explica en
base a la desactivación lenta (6= 200 ms, en Purkinje) de la
corriente IR (Gintant, et al. 1992). La IR es bloqueada por
el tetraetilamonio (TEA). Estudios recientes han demostrado
que el sota101 un agonista B-adrenérgico y agente
antiarrítmico clase III, bloquea selectivamente a esta
corriente (Varró et al. 1991).
.
CORRIENTE TRANSITORIA DE SALIDA (Ita)
La fase 1 del potencial de accibn en la mayoría de
los tejidos cardiacos ha sido atribuída a la presencia de
una corriente transitoria de salida de gran amplitud (Ita).
Esta corriente en fibras de Purkinje es activada con pulsos
17
despolarizantes positivos a -30 mV (Deck y Trautwein, 1964).
La Ita se ha encontrado en varias preparaciones cardiacas de
distintas especies y en algunas de estas especies puede
variar con la edad, la localización anatómica y
fisiopatologias (Gintant et al. 1992).
Estudios recientes han demostrado que esta
corriente consta de dos componentes: a) una corriente de K+
activada por voltaje ( 1tal) que es bloqueada selectivamente
por 4-Aminopiridina (4-AP) b) un segundo componente (Ito2)
activado por Ca++ (liberado por el retSculo sarcoplSsmico),
sensible a cafeina, rianodina y cationes divalentes (Co++,
Sr++) (Kenyon y Sutko, 1987). En trabajos recientes se ha
demostrado que en miocitos ventriculares de conejo (Zyqmunt
y Gibbons, 1991) y de gato (Sánchez-Chapula, 1992) la
corriente transitoria de salida activada por Ca++ (Itoa) es
acarreada por el cloro.
En preparaciones multicelulares de ventriculo de
perro los PA del epicardio presentan una fase 1 de mayor
amplitud que los PA del endocardio. Estas diferencias entre
ambos tejidos se atribuyen a una Itol de mayor tamaño en
epicardio que en endocardio (Litovsky y Antzelevitch, 1988).
Estudios posteriores con miocitos aislados de
ventrículo de gato (Furukawa et al. 1990), y preparaciones
multicelulares de auricula de cobayo (Wang et al. 1991) han
aportado mayor información respecto al importante papel que
juega Itol en la repolarización del PA.
18
En miocitos auriculares de humano se han
registrado ambos componentes de la corriente transitoria de
salida (Itol e Ito2) (Escande et al. 1987). Además en
condiciones de fijación de corriente la respuesta del PA a
la 4-AP (Shibata et al. 1989) es diferente a lo reportado
para otras especies de mamiferos, como la rata, el conejo y
el cobayo (Giles e Imaisumi 1988; Gintant et al. 1992).
Especies que han sido utilizadas como modelo para el estudio
de la acción de fármacos, principalmente antiarrítmicos.
La aurícula de gato ha sido poco estudiada desde
el punto de vista electrofisiológico, y prácticamente nada
en lo que respecta a las corrientes repolarizantes (punto
principal en el que se centra el presente trabajo).
Estudios preliminares hechos en nuestro
laboratorio mostraron que la respuesta de los PA a varios
fármacos fue parecida a lo reportado para el humano. Lo que
nos hizo suponer que la aurícula de gato podía ser un mejor
modelo fisiológico que los anteriormente señalados.
En base ha estos planteamientos hemos formulado
nuestros objetivos y los resultados del presente trabajo han
permitido contestar algunas preguntas como son: a) Que tipo
de corrientes repolarizantes están presentes en este tejido?
b) Cual es la contribución relativa de estas corrientes en
la repolarización del PA? c) Existen o no diferencias entre
los PA y las corrientes repolarizantes de epicardio y
endocardio?.
19
Los objetivos del presente trabajo son los siguientes:
1) Caracterizar la morfología de los potenciales de
acción de las regiones epicárdica y endocárdica de la
aurícula izquierda de gato.
2) Identificar las corrientes de potasio y cloro que
participan en la repolarización de los potenciales de acción
en miocitos aislados de la auricula de gato.
20
PREPARACION
El trabajo experimental se dividió en dos partes:
En la primera se utilizó el método convencional de registro
de potenciales de acción con microelectrodos intracelulares
en pequeñas porciones de tejido (preparación multicelular)
obtenidos de la auricula izquierda del gato (epicardio y
endocardio). En la segunda, se uso el método de fijación de
voltaje para el registro de las corrientes iónicas en
miocitos aislados de la auricula.
En ambos casos se utilizaron gatos adultos machos
y hembras con pesos entre 1.5 a 2.5 Kg. Se les aplicó por
vía intraperitoneal heparina sódica (aproximadamente 30
minutos antes de sacrificarlos) y pentobarbital sódico a
dósis de 1000 u.1. y 30 mg por kilogramo de peso
respectivamente. Los corazones fueron rápidamente extraidos .
y depositados en una solución oxigenada de Tyrode normal.
PREPARACION MULTICELULAR
La auricula izquierda fue disecada y fragmentada
en pequeños trocitos de aproximadamente 1 cm2. La
preparación se fijó al fondo de una cámara de lucita
(capacidad 2.5 ml) recubierto con resina transparente
Wlg=-d) I utilizando alfileres entomológicos para exponer
hacia arriba las superficies epicárdica o endocárdica (Fig.
2) lLa cámara se perfundió con las soluciones control y de
prueba a 5 ml/min. Las soluciones de perfusión se
21
burbujearon con una mezcla de 95% 02 y 5% COZ. La
temperatura se mantuvo entre 35 y 36 OC con la ayuda de un
termostato de circulación de agua (HAAKE D3).
<Estimulación eléc rica
Un electrodo bipolar de plata recubierto con
Teflón (excepto en las puntas) fue usado para estimular la
preparación mediante pulsos supraumbrales con duración de 2
ms. El electrodo de estimulo se conecto a una unidad
aisladora (GRASS SIU5) acoplada con un estimulador (GRASS
S88).
Para el registro de los potenciales de acción los
microelectrodos se acoplaron a la entrada de un
amplificador de alta impedancia (DAGAN 8500), por medio de
una hemicelda de Ag-AgCl. La solución del baño se puso a
tierra por medio de un electrodo de plata clorurada (Figura
2) ' Las señales fueron desplegadas en un osciloscopio
(Tektronix 5115), de cuya pantalla se fotografiaban con una
cámara quimográfica (GRASS, modelo C4R). Los registros
también fueron grabados con una videograbadora digital
modificada (VETTER PCM, modelo 200T). Posteriormente se
digitalizaron utilizando un convertidor analógico digitalf
(Labmaster, 125 KHz, SCIENTIFIC SOLUTIONS) y se almácenaron
en una microcomputadora (IBM-AT).
.
m n 0
I f
h
Figura 2.0 Esquema de la 'cámara de perfusión utilizada parael registro de potenciales de acción en preparacionesmulticelulares. Cámara de lucita (a), fondo de Sylgard (b),tejido (c), electrodo bipolar de estimulación (d), perfusiónW I electrodo de tierra (f), succión (g), estimulador (h),microelectrodo de registro (i), microelectrodo indiferenteW I amplificador diferencial (k) t osciloscopio (1) rvideograbadora (m), convertidor analógico digital (n),microcomputadora (0).
23
PREPARACION DE MIOCITOS
Las células auriculares del corazón de gato fueron
aisladas de acuerdo con el procedimiento experimental
descrito previamente (Sánchez-Chapula, 1988). Una vez
obtenidos los corazones, se perfundieron por el sistema
coronario retrogradamente através de la aorta, mediante un
sistema de perfusión tipo Langendorff. Los corazones fueron
perfundidos inicialmente con una solución de Tyrode ,normal
hasta lavarlos totalmente de sangre. Posteriormente se
perfundib durante 5 a 10 minutos con una solución de Tyrode
sin Ca++ y enseguida con una solución sin Ca++ que contenla
0.26 mg/ml de colagenasa (Sigma, Tipo 1) y 0.03 mg/ml de
proteasa (Sigma, Tipo XIV) . Finalmente las encimas fueron
lavadas perfundiendo el corazõn con la solución Kraft-Bruhe
(KB) (ver soluciones) durante 5 minutos. La obtención de las
células se hizo por agitación mecanica con una pipeta
Pasteur y posteriormente se almacenaron en la solucion KB a
4 Oc.
La cámara experimental (volumen 0.3 ml) fue
montada sobre la platina de un microscopio invertido (Nikon
Diaphot TMD). Las células fueron depositadas en el interior
de esta cámara y se perfundieron con un flujo de. 2 a 3
ml/min. Estos experimentos fueron hechos a una temieratura
de 34-35 OC f 0.5 utilizando para precalentar la solución de
prueba un calentador de platina (Biowarmer MT-l).
24
Reaistros electrofisioloaicos:
Los registros de las corrientes transmembranales
en miocitos aislados se realizó con la técnica de fijación
de voltaje en células completas (Whole-ce11 patch-clamp)
orignalmente descrita por Hamill et al. (1981). Para lo cual
se utilizó un amplificador Axopatch-1C (Axon Instruments
Co.). Los protocolos de fijación de voltaje, la adquisición
de datos y el análisis de los mismos se hicieron con una
microcomputadora (IBM-AT) via un convertidor analogico-
digital (Axon Instruments Co.) utilizando el programa de
adquisición y análisis pClamp (Axon Instruments Co.).
PROTOCOLOS EXPERIMENTALES
1) Preparaciones multicelulares: El estudio de la respuesta
de los diferentes tejidos a cambios en la frecuencia de
estimulación se obtuvo midiendo la amplitud (Amax) y la
duración del potencial de acción al 30 Y 90% de la
repolarizacion (DPA30 Y DPA90 respectivamente). Se
utilizaron cuatro frecuencias de estimulo (0.5, 1, 2 y 3
Hz.) y se dejo un periodo de estabilización de 2 a 3 min con
cada una de las frecuencias antes de grabar la señal. Una
vez empalada la célula este procedimiento se repitio en.condiciones control (Tyrode normal) y utilizando soluciones
de prueba que contenian 4-Aminopiridina (3mM) o Sota101 (100
PM) .
25
2) Preparacion de Miocitos: Los protocolos para el registro
de corrientes serán explicados en los pies de figura de la
seccion de resultados.
MICROPIPETAS
Preparacion multicelular: Los microelectrodos se
construyeron con capilares de vidrio de 1.2 mm y 0.68 mm de
diámetro externo e interno respectivamente ( A-M Systems,
Inc.) con filamento interior, utilizando un estirador de
microelectrodos vertical (KOPF, modelo 700 D). Los
microelectrodos se llenaron con una solución KCl 3M. La
resistencia de los microelectrodos utilizados fue de lo-20
-> M8r.a h fi -g_
Preparacion de miocitos: Las micropipetas para los
experimentos de fijacibn de voltaje se construyeron con
tubos capilares de boro-silicato con un diámetro externo de
1.5 mm (WPI, Inc.). Las pipetas fueron llenadas con solución
interna normal o solución interna con 300 pg/ml de nistatina
(Horn & Marty 1988). El valor de la resistencia de las
-> pipetas fue de 3 a 4 Mé-. -f2-
2 6
SOLUCIONES
Tabla No. 1. Soluciones de Perfusión (Tyrodp bioarbonato)
(mMy*T.4AP T.Sot(W 4 . (m)
NaCl-----> 125 125 125
KCl --B-W> 4 4 4
CaCl ---> 1.8 1.8 1.8
MgCl ---> 1.05 1.05 1.05
NaHC03 --> 24 24 24
NaH2P04 -> 0.42 0.42 0.42
Dextrosa-> ll 11 l l
4-AP ----> 3
Sot. ----> 0 . 1
T.N = Tyrode Normal4-AP = 4- aminopiridinaSot . = Sota101
Tabla No. 2.Solucih interna normal.KCl -------.m----> 50 nO4
---------> 10 InM
---------> 3lnMHEPES-K --------> 5 m MAspartato de KW-> 80 mMEGTA-K ----e--a-> 10 mM
Soluci6n interna conKCl ------------->
---------->
---------->HEPES-K --------->Aspartato de K -->Nistatina ------->
nistatina5 0 mM10 mM1mM3 m M5 m M
80 mM300,Clglml
27
Tabla No. 3. Soluciones Externas.*
SEN SE. Caco. SE.QAP SE.Sot SE .Rian(n-w (ti) (mw (l-m (ti)
NaCl----->
KCl --W-W>
CaC --->
MgC --->
HEPES-Na->
Dextrosa->
coc --->
4-AP ---->
Sot. ---->
Rian. --->
136
5.4
1.8
1.0
10
ll
136
4
1.0
1 . 0
10
1 1
3
136
4
1.0
1.0
10
ll
3
3
136 136
4 4
1.0 1.0
1.0 1.0
10 10
ll ll
3 3
0.1
0.01
SEN = Solución Externa NormalSE.4AP = Solución Externa + 4- aminopiridinaSE.Sot. = Solución Externa + Sota101SE.Rian.= Solución Externa + Rianodina
* Estas soluciones se ajustaban a un PH de 7.4 utilizando .NaOH.
Tabla No. 4. SOLUCION DE INCUBACION (KRAFT-BRUHE)**
Glutamato de KI ----------Ac. Succinico ----------Taurina ----------------Creatina ----------------Dextrosa ----------------
KCîKH PO4 ----------------
----------------EPES-K ----------------EGTA-K ----------------
70 mM5mM
10 mM0.5 mM10 mM10 mM20 mM10 mM
0.2 mM
** Esta solucion se ajusto a un PH de 7.4 utilizando KOH.
2 8
PREPARACIONES MULTICELULARES
La forma y duración de los potenciales de acción (PA) y la
respuesta al cambio de frecuencia:
Antes de iniciar los protocolos experimentales las
preparaciones fueron estimuladas a una frecuencia basal de
0.5 Hz durante un periodo de estabilización de
aproximadamente 2 Hrs. Durante este periodo se perfundieron
con la solución de Tyrode normal (ver soluciones). Los
potenciales de acción (PA) se registraron con cuatro
frecuencias de estimulo distintas (0.5, 1, 2 y 3 Hz) y se
hicieron tanto de la región endocardica como epicárdica en
la aurícula izquierda de gato. Los valores del potencial de
reposo medidos de estas células se encuentran entre -75 a
-80 mV.
En los potenciales superpuestos de la figura 3 se
muestran los PA registrados a una frecuencia de estímulo de
0.5 y 3 Hz. En esta figura se puede observar que existe una
relación inversa entre la duración de los PA y la frecuencia
de estímulo. Los PA registrados con 3 Hz en todos los casos
(epicardio y endocardio) corresponden a los trazos de menor
duración.
Este aumento en la duración ~610 fué evidente en
la fase final de la repolarización (DPAgO), contrastando con
el DPA30 que no se modifico de manera significativa con
ninguna de las frecuencias exploradas (Fig. 3 y 4).
1. -.-1 1 _ -1
E N D O C A R D I O
C D
Figura 3.0 Respuesta de los potenciales de acción de doscélulas de epicardio (A y B) y dos células de endocardio (Cy D) al cambio de frecuencia de estloaulo; 0.5 Hz (0) y 3 Hzfn\ - Nátese la similitud en la forma y duración entre los
3 0
Nuestros resultados muestran que entre los PA
registrados en epicardio y endocardio no existen diferencias
significativas ni en su configuración morfologica, ni en la
duración de los mismos (Fig. 3 y 4). Sin embargo, tanto en
la región endocárdica como epicárdica se observó un rango de
variación en la morfología de los PA. En la figura 3 se
pueden observar registros de PA que corresponden a las
formas extremas, tanto de epicardio como de endocardio. Las
diferencias morfológicas fueron evidentes a nivel de las
fases 1 y 2 de los PA. Algunos PA presentaron una fase 1
prolongada y prácticamente carecian de meseta (fig. 3B y
3C). Por lo contrario, otros PA registrados en la misma
región anatómica presentaban una meseta claramente
distinguible y una fase 1 menos prolongada (Fig. 3A y 3B).
Respuesta a la r-aminopiridina (40AP): Se tiene evidencia de
que la 4-AP bloquea selectivamente a la corriente
transitoria de salida (Itol) por lo que este fármaco se ha
utilizado como una herramienta titil para destacar la
presencia y contribución relativa de Itol en los PA en
preparaciones multicelulares (ver introducción).
3 1
150
130
110
52E 90
2 70c3
50
30
10
0 Epicardio APDSD A Epicardio APDso
l Endocardio APDSD A Endocardio APDgD
xI A
3 ã
4
a a Q 0
I0I
0.5I I m
1 2
Frecuencia (Hz)
t l3
Figura 4.- Efecto de la frecuencia de estimulacibn sobre laDPQ en los potenciales de accicjn del epicardio (n=l9) y delendocardio (n=15) cada punto representa el promedio 2 elerror estandar. La diferencia significativa con respecto a.control es de P < 0.4 en todos los casos.
.
32
En la aurkula de gato se tomaron registros de PA
en las condiciones testigo y después de la aplicación de 3
mM de 4-AP en la solución de perfusión. Los trazos control
se obtuvieron después de un periodo de estabilización del
tejido de aproximadamente 2 Hrs. Los registros de PA con el
efecto de la 4-AP se obtuvieron después de 30 minutos de
perfusión con el fármaco. Este tiempo corresponde al periodo
en el cual observamos se alcanza el efecto máximo de la 4-AP
sobre los PA. La 4-AP produce cambios importantes en el PA.
Estos cambios son principalmente: a) un aumento en la
amplitud, b) levantamiento de la meseta hacia potenciales
más positivos c) alargamiento en el DPA30 y d) disminución
en el DPA90 (Fig.S-A). Estos PA registrados en la aurícula
de gato tienen una gran simulitud con los reportados por
Shibata et.al. (1989) en células auriculares del humano
(Fig. 5-B). Ademas la respuesta a la 4-AP es parecida en
ambas regiones estudiadas (epicardio y endocardio) (Fig. 6).
Respuesta al Sotalol: El sota101 es un antiarritmico de
clase III que bloquea selectivamente a la corriente de
rectificación tardia (IE) (Carmeliet, 1985; Komeichi, 1990).
Esta droga fue utilizada como herramienta farmacológica para
destacar la posible participación de IE en la repolarización
de los PA. En la figura 7 se muestran registros de PA
obtenidos en condiciones control (perfusión con Tyrode
normal) y con 100 PM de sotalol.
A
33
B. 1
100 ms
I Shibata et al.'Am. J. Physiol. 26:H1773. 198f
Figura 5.. Potenciales de acción representativos de laaurIcula de gato (A) y de la aurlcula de humano W t encondiciones control (0) y después de 30 minutos de perfusióncon 3 mM de 4-AP (0). Nótese la similitud de la respuesta alfármaco en ambas preparaciones.
ENDOCARDIO EPICARDIO
120
ñ‘ 1007.3
-L”3 80
60
50
\nz; 40
2.T 30‘3
20
1 0
1l O
10
90
10
9
175
1 I , 1 50
t 1 8 100 0.5 1 2 3
Frecuencia (Hz)
*P(O.Ol **pto.025
L
OCONTROL1 0 3mY4-AP
l O
l * 81
4� 0 1
0 l * 0
ll
c 9. 1-.
l i l i i? ? 0
0 0.5 1 2 3Frecuencia (Hz)
l P ( 0.025 +* P ( 0.05
’ .
Figura 6.0 Efecto de la 4-AP (3 mM) sobre la DPA3s
Y laDPAgO de los potenciales de accibn del endocardio (n= ) y elepicardio (n=6). Antes (0) y después (0) de la aplicación dela 4-AP. Valores promedio 2 el error estandar (*, **diferencias significativas).
35
El registro con sota101 se obtuvo a los 20 min de
perfusion con el fármaco, tiempo en el cual observamos se
presenta el efecto máximo de esta droga. El sota101 produjo
un alargamiento en el DAPgO sin modificar significativamente
el DPA3 o t este efecto se observó tanto en la región
epicárdica como endocardica.
IDENTIFICACION DE LAS CORRIENTES REPOLARIZANTES EN MIOCITOS
AURICULARES DE GATO.
Registro de corrientes en miocitos de epicardio y
endocardio.
A partir de un potencial de mantenimiento de -60
mV se aplicaron pulsos despolarizantes cada 10 segundos con
una duración de 500 ms y con incrementos consecutivos de 10
mV a partir de -100 mV hasta +50 mV.
La solución interna contenía 10 mM de EGTA y como
solución de perfusión se utilizó la solución de calcio-
cobalto (ver soluciones). Bajo éstas condiciones
experimentales en miocitos endocárdicos se obtuvieron dos
componentes claramente distinguibles en la corriente
saliente para los potenciales entre -30 y +50 mV. Un
componente transitorio que se activa aproximadamente a los.
-20 mV y que inactiva espontáneamente antes de los 15 'ms. El
segundo componente no presenta inactivación apreciable y si
un pequeño aumento con el tiempo (Fig. 8-A).
36
>E
0Lo
:
1 0 0 m sFigura 7.- E f e c t o d e l s o t a l o l (100 ~IM) s o b r e l o s p o t e n c i a l e sd e acci9n d e l e n d o c a r d i o d e a u r í c u l a d e g a t o . L o s r e g i s t r o ss o b r e p u e s t o s s e o b t u v i e r o n an tes ( c o n t r o l 1 y despues(sotalol) d e 20 m i n u t o s d e p e r f u s i ó n c o n s o t a l o l .
37
A
ENDOCARDIO
B. :
C (PA) T 7oo
A Corriente al picoA
0 Corriente (500 ms) -- 500 /
A ’A
--300 A/
/
(mV)jA
t 1 1 - md.-.-.-. I-100/- - 5 0 ---lOO 50
/l - 1 - 3 0 0
Figura 8.- R e g i s t r o d e c o r r i e n t e s e n miocitos d e l e n d o c a r d i od e l a auricula d e g a t o e n r e s p u e s t a a p u l s o s d e v o l t a j e ( e lp r o t o c o l o d e p u l s o s s e m u e s t r a e n e l i n s e r t o ) . L o s r e g i s t r o sc o r r e s p o n d e n a - 3 0 , 1 0 ,- 6 0 y - 4 0 m V e n (8).
30 y 50 mV en (A) y de -100, -80,P o t e n c i a l d e m a n t e n i m i e n t o - 6 0 m V . E n C
s e m u e s t r a u n a c u r v a c o r r i e n t e - v o l t a j e ( 1 - E m ) h e c h a c o n l o sv a l o r e s d e c o r r i e n t e a l pico Ca> y c o n l a c o r r i e n t e m e d i d a61 f i n a l d e l p u l s o (0).
30
Para potenciales entre -30 y -80 mV se presento un
aumento en la resistencia de la membrana y los cambio en las
corrientes fueron poco apreciables.
A potenciales m6s negativos que -80 mV se observó
una clara rectificación hacia adentro de la corriente (Fig.
8-B). En la figura 8-C se muestran las magnitudes de la
corriente medida al pico y la corriente medida al final del
pulso en función del potencial de membrana., Bajo las mismas
condiciones experimentales los resultados obtenidos en
miocitos epicárdicos fueron similares (Fig. 9).
Comparando las corrientes obtenidas de las células
epicárdicas y endocárdicas no se encontraron diferencias
significativas.
En las figuras 10 y ll se muestran las curvas
corriente-voltaje para un promedio de n=3 células de
epicardio y endocardio de la corriente medida al pico y la
corriente medida al final del pulso (500 ms)
respectivamente. A potenciales entre -30 y +50 mV para la
corriente medida al pico y de -100 a +50 mV en el caso de la
corriente medida al final del pulso. En estas relaciones I-
Em la corriente obtenida en los registros se dividió. entre
la capacitancia de la membrana celular para obtener la
densidad de corriente.
3 9
EPICARDIOA B.
\ :
C
0 Corriente al pico
0 Corriente (500 ms)
(PA)- 5 0 0 0
/0
;/
-- 3 0 0 /O .
/O/O
@/OH0,@
(mV1
iI -0I l
*-.-Q=@-8
/-0’
I 1I 4- 1 0 0
l 0’
/@-e--@-25 50
- - -100
.L -200 :
Figura 9.-epicardio
R e g i s t r o d e corriente$ en m ioc i tos au r i cu la res ded e g a t o e n r e s p u e s t a a
r e g i s t r o s c o r r e s p o n d e n a pu 1 sos d e v o l t a j e . Lo5
d e- 1 0 0 , - 8 0 ,
-30, 10, 30 y 50 mV en (B):ambos ;% lin-4o mV en (” ’manten im ien to de - 60 mV . p o t e n c i a l d e
hechaEn C se mues t ra una cu rva 1 -Em
c o n l o s v a l o r e s d e c o r r i e n t e a lc o r r i e n t e m e d i d a a l f i na l de l pu l so (0).
pico (0) y con la
40
(PWPF)
- 1 3
0 Endocardioa
0 Epicardio -- 9 /J
,V
l /O0
( m 9.-bd 1 I1 I 4
-30 - 1 0 -4 30 3
F i g u r a lo.- Comparacibn d e l a s c o r r i e n t e s d e e p i c a r d i o yendocard io . E n l a grhfica s e m u e s t r a l a c u r v a 1 - E m d e l ac o r r i e n t e m e d i d a a l p i c o e n e p i c a r d i o (0) y e n e n d o c a r d i o(0) * L o s p u n t o s r e p r e s e n t a n e l v a l o r p r o m e d i o d e n=3. L a s1 Yneas c o n t i n u a s f u e r o n aJustadas a o j o . L a s b a r r a sr e p r e s e n t a n e l e r r o r e s t a n d a r d e l a m e d i a .
41
0 Endocardio
l EP icardio
F i g u r a l l . - R e l a c i ó n I-Em d e l a c o r r i e n t e m e d i d a a l finald e l pulso e n epicardio (@) y e n e n d o c a r d i o (0). L o s p u n t o srepresentan e 1 v a l o r promedlo d e nr3. L a s l’ineas c o n t i n u a sfueron a j u s t a d a s a o j o . L a s b a r r a s r e p r e s e n t a n e l e r r o re s t a n d a r d e l a m e d i a . N b t e s e l a rectificacibn h a c i a d e n t r od e la corriente p a r a potenclnles m e n o r e s a lOS -80 mV.
La corriente de rectificación tardia IK.
La corriente de rectificación tardía (IE) ha sido
encontrada en muchos de los tejidos cardiacos estudiados de
distintas especies (Gintant etx al. 1992). Esta corriente es &-
activada por voltaje, dependiente de tiempo y aparentemente
no presenta inactivación.
El componente sostenido al que nos hemos referido
en la sección anterior cumple con todas las características
de un rectificador tardio. Aunque es difícil mostrar con
claridad sus caracteristicas con pulsos de voltaje de corta
duración.
Utilizando pulsos de mayor duración, como en los
trazos de la figura 12-A, se pueden observar con mayor
claridad las características de IE. Estos registros de
corriente se obtuvieron en respuesta a pulsos de voltaje
entre -30 y +70 mV, con una duración de 5 segundos y
partiendo de un potencial de mantenimiento de -60 mV.
Graficando la amplitud de las corrientes de cola en función
del potencial de membrana se obtuvo la curva de activación
para IE (Fig. 12-B). El valor umbral para IE fue de -20 mV
aproximadamente y el valor máximo de la corriente se alcanzó
a los 60 mV. Los valores de amplitud de las corrientes de
cola se ajustaron a una distribución de Boltzmann de la
forma: h = {l+exp[(Vh-V)/k J)-l (1)
donde Vh es el voltaje al cual se obtiene el 50% de la
corriente mdxima.
K = zF/RT y z representa la valencia de la
compuerta de activación de IK, F la constante de Faraday, R
la constante de los gases y T la temperatura absoluta. A
partir del ajuste se obtuvieron los siguientes valores:
Vh = 9.80 mV, K = 11.07 mV-l y z = 0.29.
El sota101 bloquea a la IK:
El sota101 es un bloqueador beta-adrenérgico y
se ha demostrado que bloquea de forma selectiva a la IK
(Carmeliet, 1985; Varo etyalol991). En la figura 13-A y B se+---
muestra cómo la aplicación de 50 PM de sota101 disminuye en
más de 50% la corriente de rectificación tardía. En las
curvas de activación de la figura 13-C se puede observar
como aun cuando el sota101 disminuye las corrientes de cola
prácticamente a todos los valores de voltaje explorados; Vh,
K y z no se modifican de forma significativa: K representa
la pendiente de las curvas de activación que también fueron
ajustadas con la ecuación de Boltzmann (Ecuación 1). Los
valores obtenidos en condiciones control fueron: Vh = 20.90
mV, K = 12.46 mV y z = 0.32 y con sota101 (50 PM); Vh =
20.83 mV, K = 11.07 mV y z = 0.29.
Bloqueo de la corriente transitoria por 4-AP (Itol). *rSe sabe que la corriente transitoria de salida
(Ita) tiene dos componentes; un componente activado por
voltaje y sensible a 4-AP ( 1tal) y un segundo componente que
es activado por el calcio intracelular e insensible a 4-AP
(Ito2).
44
CURW D E FKTIVFICION (Ik>
K : 11.07V’4= 9 .80
Em (mV1F i g u r a 12.-mioci tos
R e g i s t r o d ea u r i c u l a r e s d e
c o r r i e n t e sg a t o e n
s a l i e n t e s (A), e nr e s p u e s t a p u l s o sd e s p o l a r i z a n t e s ( e l p r o t o c o l o d e p u l s o s s e muest:a e n e l
i n s e r t o ) . E n B s e m u e s t r a l a c u r v a d e a c t i v a c i ó n h e c h a c o nl o s v a l o r e s d e a m p l i t u d d e c o r r i e n t e s d e c o l a e n funcibn d e lv o l t a j e d e m e m b r a n a .de los datos con
La 1 L i n e a c o n t i n u a c o r r e s p o n d e a l a j u s t el a
p e r f u s i ó n : Ca’+/Co++.e c u a c i ó n d e B o l t z m a n n , Solucibn d e
So’luc1bn d a la p i p e t a : N o r m a l + E G T A .
45
CURVA DE ACTIVACION (1~)
60.T C
250.31K=12.46
z= 0.29K: 11.07
o: t
Vk=20.83
I-40 -20 0 20 40 60
o CONTROLl SOTALOL
Em (mV)
Figura 13.- Efec to d e l s o t a 1 0 1 (100 I-AM) s o b r e l a Ic:. L o st r a z o s d e c o r r i e n t e d e 1, f u e r o n r e g i s t r a d o s e n r e s p u e s t a ap u l s o s d e s p o l a r i z a n t e s a c i n c o d i f e r e n t e s p o t e n c i a l e s c o ni n c r e m e n t o s d e 2 0 m V e n t r e - 2 0 a +60 mV, despues d e apl icaru n p r e p u l s o a -30 mV de 500 ms de duracien d e s d e u npo tenc ia l de manten im ien to de - 60 mV . An tes (cóntrol,penelAI y despues d e a p l i c a r 1 0 0 PM d e sota101 ( p a n e l BI. L a sc u r v a s d e activacien d e l p a n e l C s e o b t u v i e r o n e n p r e s e n c i a(0) y ausencia (0) de s o t a l o l . Las 1 ineas c o n t i n u a sc o r r e s p o n d e n a l a j u s t e d e l o s d a t o s c o n l a ecuacidn d eBol tzmann.
46
Con 10 mM de EGTA en la pipeta y con la corriente
de calcio bloqueada por el Co++ de la solución externa (Sol.
Ca++-Co++) suponemos que la corriente transitoria registrada
corresponde a Itol, tal como se muestra en la figura 12-A.
Después de agregar 3 mM de 4-AP Itol es bloqueada
por completo . Sin embargo la 4-AP produce además un marcado
aumento de aproximadamente un 150% en la corriente de
rectificación tardia (Fig. 14-B). El efecto de este farmaco
sobre las corrientes Itol e IE se presentó tanto en las
células epicárdicas como en las endocárdicas (Fig. 15).
La corriente transitoria dependiente de Ca++(Ito2).
Se sabe que esta corriente es activada por el
calcio liberado por el reticulo sarcoplásmico (RS) y que los
fármacos que alteran la liberación y recaptura del Ca++ en
este organelo, como la cafeina y la rianodina, bloquean la
Ito2. En el presente trabajo se exploró la posibilidad de
que esta corriente estuviera participando en la
repolarización del PA.v
Con la técnica de fijación de voltaje en célula
completa en la modalidad de parche perforado y utilizando
una solución externa con alto Ca++ (3.6 mM) + 3mM de 4-AP,.así como una solución intracelular sin EGTA (ver
soluciones), se obtuvieron los registros de la figura 16.
Estos trazos de corriente se obtuvieron en respuesta a
pulsos de voltaje de -30, -10, +lO, +30 y +50 mV partiendo
de un potencial de mantenimiento de -60 mV.
4 7
En la figura 16-A se puede observar un pequeño
componente transitorio mejor definido para los pulsos a +30
y +50 mV seguido de el componente dependiente de tiempo
(Q). Este pequeño componente transitorio desaparece cuando
a la solución extracelular se agregan 10 I.IM de rianodina
permaneciendo solamente la corriente de rectificación tardía
(Fig.ló-B).
‘ONTRoL 48
.:;
: :. ’.
0.:...
.*
0.
.
:.
;
.
.
.
1 0 0 pA
L-50 ms
3 mM 4-AP
. ..
” , 1 0 0 pA
: 150 ms
-60 .’:l
.
.
.
Figura 14.- Efecto del 4-CIP (3 mM) s o b r e xto, e Ib. Lo5trazos de corriente se obtuvieron con p u l s o s despo la r i zan tesa c inco d i f e r e n t e s p o t e n c i a l e s con i n c r e m e n t o s d e 2 0 m Ve n t r e -20 d +60 mV. an tes ( c o n t r o l , p a n e l AI despues( p a n e l B) d e l a aplicacion d e 3 mM d e 4-AP. V e d s e c?omo e l 4-AP b 1 oquea a l a c o r r i e n t e t r a n s i t o r i a (Ita,) Y e l n o t a b l ei n c r e m e n t o d e l a corriente d e rectlficaclon t a r d i a (Ic:).
AENDOCARDIO
49
(PA)
T 7 0 0
( v>m-o--o-----o-7
0II 4
/ 0
EPICARDIO
8(PA)
T 500I A
/,a0 Control (500 ms)
0 4-AP (500 ms)-- 400
A Corriente al pico ctd.
A Corriente al pico 4-AP -- 300
3 0 5 0
CJ-q---- --T I
, I I -4
- - 5 03 0 5 0- 1 0
Figura 15.- Reepicardio (B).
lacibn I - E m e n c&lude la c o r r i e n t e
l a s d e e n d o c a r d i o (6) ym e d i d a a l p i c o tito+;
triAngulos) Y l a corriente m e d i d a a l f i n a l d e l p u l s o ( I,.;circulos), an tes (s ímbo los vacios) y despues (s ímbo losn e g r o s ) d e l a aplicaclon d e 3 mM d e 4-AP.
50
3mM 4-AP
3 mM 4 -AP t fOO@l RIANODINA
Figura 16.-t ransi tor ia
E f e c t o s d e r i a n o d i n a ( 1 0 0 /“M) I
a c t i v a d a p o r C a + +sobre la corriente
Icorr iente fueron LOSd e s p o l a r i z a n t e s a r e g i s t r a d o s
uto+ t r a z o s d ec i n c o u t i l i z a n d o
incrementos de 20 mV entre d i f e r e n t e s p u l s o spotencia les c o n(8) d e a p l i c a r l a r i a n o d i n a .-30 a +50 mV antes (A) y después
51,
Registros de potenciales de accibn.
En varias preparaciones cardiacas de mamíferos se
ha demostrado que existen diferencias morfológicas
significativas entre los PA del epicardio y el endocardio
(Litovsky y Antzelevitch, 1988; Furukawa et al. 1990 ). Esta
heterogeneidad morfológica entre los PA se debe a marcadas
diferencias en la amplitud relativa de la Itol (de mayor
tamaño en epicardio que en endocardio).
Caso contrario, los resultados obtenidos en el
presente estudio muestran que no existen diferencias
significativas ni en la morfología ni en la duracibn de los
PA entre preparaciones multicelulares de epicardio y
endocardio auricular de gato. Además la respuesta a los
cambios en la frecuencia de estimulo y a la administración
de fármacos como el 4-AP es similar en ambas regiones de la
aurlcula.
Se sabe que el 4-AP a concentraciones mayores a
0.5 mM produce un eficiente bloqueo sobre Itol. Este fármaco
en la aurícula de gato prolonga el DPAsO y produce un
levantamiento de la meseta hacia potenciales mas positivos,
por lo que suponemos que ItoI participa en la primera fase
de la repolarización. Por otro lado el hecho de que exista
una relación inversa entre la frecuencia de estimulo y la
duración del PA aunado a la notoria disminución del DPAgO en
respuesta al 4-AP, nos lleva a pensar en la posible
52
participación de otra u otras corrientes en el proceso de
repolarización.
Un acortamiento en la duración del PA puede ser
explicada por un aumento en una corriente saliente o una
disminución en una corriente entrante. En las preparaciones
cardiacas donde se ha encontrado la corriente de la
rectificación tardía o IK, puede producirse su aumento
cambiando inversamente la frecuencia de estimu1ación.y como
consecuencia un acortamiento en la duracion del PA. A este
fenómeno se le conoce como acumulación activa de
rectificadores tardios (Gintant, 1992).
Por la respuesta del PA a la frecuencia de
estimulo (Fig. 3 y 4) IK es otro candidato idóneo para ser
considerada como participante importante en la
repolarización de los PA de las células aurículares del
gato. La IK es una de las corrientes que ha sido descrita
para muchas de las preparaciones cardiacas estudiadas hasta
hoy (Gintant et al. 1992). Por los trabajos de Carmeliet
(1985) t Komeichi et al. (1990) y Varro et al. (1991)
principalmente, se sabe que la 1 K puede ser bloqueada de
forma selectiva por el sota101 un antiarrltmico clase III.
En los resultados de este trabajo se puede
observar cómo el sotalol (100 PM) prolonga la duración del
PA, sin modificar la primera fase de la repolarización (Fig.
5) l
,53
tEste efecto del sota101 sobre el PA era un
argumento mas que nos permite suponer la participación de la
IK en los PA de la aurícula de gato.
Registros de corrientes en miocitos aislados.
Con la técnica de fijación de voltaje en células
aisladas es posible registrar las corrientes de membrana, lo
cual es una evidencia directa que permite conocer cualés son
las distintas corrientes involucradas en la génesis de los
PA. En el presente estudio se muestra que utilizando esta
técnica y con los protocolos antes mencionados es posible
separar básicamente cuatro corrientes repolarizantes en
miocitos aislados de la auricula izquierda del gato ; Ito1,
Ito2! IK e IKlt con base en su dependencia de tiempo y
voltaje así como su sensibilidad a fármacos.
En el presente trabajo se encontró que las
corrientes antes mencionadas se encuentran presentes tanto
en miocitos de la región epicárdica como endocárdica. Siendo
la densidad de corriente similar en ambas regiones de la
aurkula.
.
La corriente del rectificador anómalo (IKa).
IKl se ha descrito como una corriente de fondo
independiente de tiempo y que se activa con pulsos
hiperpolarizantes (Gintant et al. 1992). En ventriculo de
conejo, gato y perro se ha demostrado que participa en la
54
fase final de la repolarización del PA (Giles 6 Imaezumi,
1988). Nuestros resultados muestran que IFI es una corriente
que se activa con pulsos hiperpolarizantes con una marcada
rectificación hacia adentro a potenciales menores a -80 mV.
Pero esta corriente no presenta, en el rango de
los potenciales negativos, ningdn componente de salida
claramente distinguible por esta razán suponemos que IFI no
esta participando en la repolarización de los PA (Fig. 8 y
9) l
La corriente transitoria de salida (Ita).
Estudios recientes han demostrado que esta
corriente consta de dos componentes; un componente activado
por voltaje que es bloqueado selectivamente por 4-AP (ItoI)
y un segundo componente activado por Ca++ (liberado por el
retículo sarcoplásmico) y sensible a cafeína, rianodina y
cationes divalentes como Co++ o Sr++ (Ito3) (Kenyon y Sutko,
1987). En nuestros registros puede observarse la presencia
de un componente transitorio (Itol) activado por voltaje, el
cual se define con mayor claridad a potenciales más
positivos a los -30 mV y que además es sensible a la 4-AP..Estos resultados confirman la participacion de
Itol en la primera fase de la repolarización de los PA
En nuestros registros se puede observar también un
componente transitorio insensible a 4-AP. Esta corriente es
de menor amplitud que Itol y la rianodina la suprime por
completo. Tales evidencias nos hacen pensar que se trata de
la corriente transitoria activada por calcio (Itoa).
La corriente de rectificacib tardía (IR).
IK se sabe participa en la repolarizacion de los
PA de la mayoría de las preparaciones cardiacas estudiadas
hasta ahora (Giles c Imaizumi, 1988). En los registros
obtenidos en las células auriculares de gato existe una
corriente saliente voltaje y tiempo dependiente clu=
aparentemente no muestra inactivación. Estas características
concuerdan con las descritas para IK en otras preparaciones.
Además hemos probado que IK es bloqueada por el sotalol, un
antiarrltmico clase III que se supone tiene una alta
selectividad por esta corriente (Carmeliet, 1985; Varro
et al. 1990). El efecto de este fármaco sobre IK no parece
ser voltaje dependiente y tampoco parece modificar la
valencia de la compuerta de activación (Fig. 13).
Estos resultados confirman que el alargamiento en
la duración del PA en respuesta al sota101 obedecen a una.
disminución en la corriente de rectificación tardía.'
Uno de los puntos que nos parece de importancia es
la respuesta de IK a la 4-AP. En la mayoría de los trabajos
este farmaco se ha descrito como un bloqueador de las
56
corrientes de potasio, en especial de Itol por la que tiene
una gran selectividad. Pero nunca se ha reportado el hecho
de que la 4-AP pudiera aumentar alguna corriente saliente
tal como lo hace con IK en las células de la aurícula de
gato.
Este efecto de la 4-AP sobre la 1 K podría explicar
el acortamiento de los PA (DPA9D) después de aplicar el
mismo fármaco en las preparaciones multicelulares (fig. 5).
Sin embargo otro mecanismo por el cual se podría
generar una mayor activación del rectificador tardIo y
producir esta misma respuesta, es el levantamiento de la
meseta a potenciales mas positivos producido por el bloqueo
de la 4-AP sobre Itol.
Nuestros resultados no permiten saber cual de los
dos mecanismos mencionados es el de mayor contribución en la
disminución del DPA9u en respuesta al 4-AP, si es que tienen
alguna participación en este fenómeno.
Aunque en el presente trabajo sólo se
identificaron cuatro corrientes; tres de potasio (Itol, IK e
IK1) y posiblemente una de cloro (Ito2) (Sánchez-Chapula,
1992) no puede descartarse la participación de otras.corrientes en el proceso de repolarización de los PA de la
aurícula de gato, como se ha descrito en otras preparaciones
cardiacas (ver introducción).
57
Finalmente la similitud en la respuesta de los PA
a la 4-AP entre las células auriculares del humano (Shibata
et. al. 1989) y del gato, observados en este trabajo nos
hacen pensar que ésta preparación puede ser un buen modelo
fisiológico para el estudio de los efectos de farmacos de
uso clinico.
EN LAS CELULAS DE LA AURICULA IZQUIERDA DE GATO:
1) NO EXISTEN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS NI EN LA MORFOLOGIANI EN LA DURACION DE LOS POTENCIALES DE ACCION ENTRE ELEPICARDIO Y EL ENDOCARDIO.
EN LOS MIOCITOS AISLADOS ENZIMATICAMENTE PUEDEN SEPARA RSEAL MENOS CUATRO CORRIENTES:
2) UNA CORRIENTE TRANSITORIA DE POTASIO ACTIVADA POR VOLTAJEY SENSIBLE A 4-AMINOPIRIDINA (Itol)
3) UNA CORRIENTE TRANSITORIA POSIBLEMENTE DE CLORO ACTIVADAPOR CALCIO Y SENSIBLE A RIANODINA (Ito2)
4 ) UNA CORRIENTE DE POTASIO QUE ACTIVA LENTAMENTE, NOPRESENTA INACTIVACION Y ES BLOQUEADA POR EL SOTALOL (IX).
5) UNA CORRIENTE DE POTASIO QUE ACTIVA CON PULSOSHIPERPOLARIZANTES Y CON UNA CLARA RECTIFICACION HACIAADENTRO PARA POTENCIALES MAS NEGATIVOS A LOS -80 mV (IEl).
59
Bean, B. P. 1985. Two kinds of calcium channels in canine
atrial cels. Differences in kinetics, selectivity and
farmacology. J. Gen. Physiol. 86:1-30.
Beeler, G. W. y McGuigan, A. S. 1978. Voltage clamping of
multicellular myocardial preparations: Capabilities and
limitations of existing methods. Prog. Biophys. Mol. Biol.
34:219-254.
Benndorf, K. y Nilius, B. 1988. Properties of an early
outward current in single cells of the mouse ventricle. Gen.
Physiol. Biophys. 7:449-466.
Boyett, M. R. y Jewell, B.R. 1980. Analysis of de effects
of changes in rate and rhythm upon electrical activity in
the heart. Prog. Biophys. Mol. Biol. 36:1-52.
Brown, A.M., Lee, K.S. y Powell, T. 1981a. Voltage clamp
and interval perfusion of single rat heart cells. J.
Physiol. 318: 455-477.
Carmeliet E. 1985. Electrophysiologic and voltage clamp.analysis of the effects of sota101 on isolated 'cardiac
muscle and Purkinje fibers. J. Pharmacol. Exp. Ther. 232,
817.
Carmeliet E. 1987. Slow inactivation of sodium current in
rabbit cardiac Purkinje fibers. Pflufers Arch. 408:18-26.
60
Carmeliet E. 1989. K+ channels in cardiac cells: mechanisms
of activation, inactivation, rectification and K+e
sensitivity. Pfliigers Arch. 414:88-92.
Cohen, 1. S., DiFrancesco, D., Mulrine, N. K. y
Pennefather, P. 1989. Interna1 and externa1 K+ help gate the
inward rectifier. Biophys. J., 55:197-202
Deck K. A. y Trautwein W. 1964. Ionic currents in cardiac
excitation. Pflugers Arch. 280:63-80
Escande, D., Coloumbre, A., Faives. J. F., Deroubaix, E. y
Caraboeuf, E. 1987. Two types of transient outward currents
in adult human atrial cells. Am. J. Physiol. 252:142-148
Fozzard H. y Hanck D. A. 1992. Sodium Channels.The Heart
and Cardiovascular System. Chapter 41:1091-1119.
Furukawa T., Myerburg R. J., Furukawa N., Bassett A. y
Kimura S. 1990. Differnces in transient outward currents of
feline endocardial and epicardial myocytes. Cure. Res.
67:1287-1291. .
Gintant G. A., Cohen, N. B. Datyner, y R. P. Kline. 1992.
Time-dependent outward currents in the heart. The Heart and
Cardiovascular System. Chapter 42:1121-1169.
61
Gintant G. A., Datyner N. B. y Cohen 1. S. 1985. Gating of
delayed rectification in acutely isolated canine cardiac
Purkinje myocytes. Biophys. J. 48:1059-1064.
Giles W.R. y Imaizumi Y. 1988. Comparison of potassium
currents in rabbit atrial and ventricular cells. J. Physiol.
405:123-145. Great Britain.
Harvey, R. D., y Ten Eick, R. E. 1988. Characterization of
the inward-rectifying potassium current in cat ventricular
myocytes. J. Gen. Physiol. 91:593-615.
Hagiwara, N., Irisawa, H., y Kameyama, M. 1988.
Contribution of two types of calcium currents to the
pacemarker potentials of rabbit sinoatrial node cells. J.
Physiol. (Lond.), 395:233-253.
Harvey, R.D. y Ten Eick, R.E. 1988. Caracterization of the
inward rectifying potassium current in cat ventricular
myocytes. J. Gen. Physiol. 91:593-615.
Horn, R., y Marty, A. (1988). Muscarinic activation of.
ionic currents measured by a new Whole-ce11 recording
method. J. Gen Physiol 92: 145-159.
i
62
Hume J. R., Giles W., Robinson K., Shibata E. F. y Nathan
R. D. 1986. A time and voltage-dependent K+ current in
single cardiac cells from bullfrog atrium. J. Gen. Physiol.
88:777-798.
Hume, H. y Giles, W. 1983. Ionic currents in single
isolated bullfrog atrial cells. J. Gen. Physiol. 81:153-194.
Hume, J.R. y Harvey, D. 1991. Chloride conductance pathways
in heart. Invited review. Am. J. Physiol. 30:399-412.
Irisawa, H. 1984. Elecrophysiology of single cardiac cells.
Japanese Journal of Physiol. 34:375-388.
Imaizumi, Y. y Giles, W. 1987. Comparison of K+ currents in
single cells from rabbit atrium and ventricle. Biophysical
Journal. 51. 256a.
James, T.N. y Sherf, L. (1968). Ultastructure of the human
atrio-ventricular node. Circulation 37:1049-1070.
Josephson, 1. R., Sánchez-Chapula, J. y Brown A. M. (1984)..
Erly outword current in rat single ventricular celld. Circ.
Res., 54:157-162.
63
Kenyon J. L. y Sutko J. L. 1987. Calcium and voltage-
activated plateau currents of cardiac Purkinje fibers. J.
Gen. Physiol. 89:921-957
Komeichi, K., Tohse, N., Nakaya, H., Shimizu, M., Zhu, M-Y
y Kanno, M. 1990. Effects of N-actylprocainamide and sota101
on ion currents in isolated guinea-pig ventricular myocytes.
European J. of Pharm. 187:313-322.
Kimura, T., Myerburg, R. J., Furukawa, N., Bassett, A. 1. y
Kimura, S. (1990). Differences in transient outward currents
of feline endocardial and epicadial myocytes. Circ. Res.,
67:1287-1291.
Litovsky S. y Antzelevitch C. 1988. Transient outward
current prominent in canine ventricular epicardium but not
endocrdium. Circ. Res. 62:116-126
Liu Y., DeFelice L. y Mazzanti M. 1992. Na channels that
remain open throughout the cardiac action potential plateau.
Biophys. J. 63:654-662.
.Mc Allister, R.E., Noble, D. y R. W. Tsien; 1975.
Recostruction of the electrical activity of cardiac Purkinje
fibres. J. Physiol. 251: l-59.
64
McNutt, N.S. y Fawcett. D.W. (1974). Myocardial
ultrastructure. On the Mammalian Myocardium, ed. Langer,
G.A. y Brady, A.J. pp. l-49. New York: Wiley.
Nacayama, T. y Irisawa, H. 1984. Transient outward current
carried W potassium and sodium in quiescent
atrioventricular node cells of rabbit. Circ. Res. 57:65-73.
Nacayama, T. y Fozzard, H.A. 1988. Adrenergic modulation of
the transient outward current in isolated canina Purkinje
cells. Circ. Res. 62:162-172.
Noble, D. y Tsien, R. W. 1968. The kinetics and rectifier
properties of the slow potassium currents in cardiac
Purkinje fibers. J. Physiol. (Lond.). 195:185-214.
Noble, D. y Tsien, R.W. 1972. The repolarization precess of
heart cells. In Electrical Phenomena in the Heart ed. de
Mello. W. C. pp. 133-161. New York; Academic Press Inc.
Noma, A., Nacayama, T., Kurachi, Y. y Irisawa, H. 1984.
Resting K conductances in pacemarker and non-pacemarker.
heart cells of the rabbit. Japanese J. of Physiol. '34:245-
254.
65
McDonald, T.F. y Trautwein, W. 1978b. The potassium current
underlying delayed rectivication in cat ventricular muscle.
J. Physiol. 274:217-246.
Pelzar, D., Pelzar, S. y McDonald, T. F. 1992. Calcium
channels in Heart. The Heart and Cardiovasc. Sys. Chapter
40:1049-1091.
Sánchez-Chapula, J. (1987). Mecanismos iónicos responsables
del potencial de acción de las células cardiacas. En:
Mtisculos esqueléticos y cardiacos. Ed. Pastelín, G. y Muñoz-
Martínez, J. pp. 357-386. Sociedad Mexicana de Ciencias
Fisiológicas. Alambra. México D. F.
Sanchez-Chapula, J. A. (1992). La corriente transitoria de
salida activada por calcio en miocitos ventriculares de gato
es acarreada por cloro. XXXV congreso nacional de ciencias
fisiologicas. 025.
Sanguinetti M. C. y Jurkiewicz N. K. 1990. Two components
of cardiac delayed rectifier K+ current: Differential
sensitivy to block by class III antiarrhythmic agents. J.
Gen.Physiol. 96:195-215.
Sakmamm, B. y Neher, E. (1984). Patch clamp tecniques for
studyng ionic channels in excitable membranes. Ann. Rev.
Physiol. 46:455-72.
66
Shibata, E. F. y Giles, W. R. 1985. Ionic currents the
spontaneous diastolic depolarization in individual cardiac
pacemaker cells. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA. 82:7796-7800.
Shibata, E. F., Drury, T., Refsum, H., Aldret, V. y Giles,
W. (1989). Contributions of a transient outward current to
repolarization in human atrium. Am. J. Physiol., 257:H1773-
1781.
Sommer, J.R. y Johnson, E.A. (1979). Comparative
ultraestructure of cardiac membane specialization. A review.
Am. J. Cardiol. 25:184-194.
Tourneur Y., Mitra R., Morat M. y Rougier 0. 1987.
Activatrion propeties of the inward-rectifyin potassium
channel on mammalian heart cells. J.Membr. Biol. 97:127-135.
Tseng, G. N., Robinson, R. B. y Hoffman, B. R. 1987.
Passive properties and membrane currents of canine
ventricular myocytes. J. Gen. Physiol. 90:671-702.
.
Varró A., N6n6si P. P. y Lathrop D. A. 1991. Effect of
sota101 on transmembrane ioinic currents resposible for
repolarization in cardiac ventricular myocytes form rabbit
and guinea pig. Life Sciences. 49:7-12.
67
Wang, Z., Fermini, B. y Nattel S. (1991). Repolarization
differences between ginea pig atrial endocardium and
epicardium: evidente for a role of Ita. Am. J. Physiol.,
260:H1501-1506.
Weidmann, S. 1970. Electrical constants of trabecular
muscle from mammalian heart. J. Physiol. 210:1041-1054.
Yanagihara, K. y Irisawa, H. 1980. Inward current activated
during hyperpolarization in rabbit sinoatrial node cell.
Pflugers Arch. 385:11-19
Zygmunt A. C. y Gibbons W. R. 1991. Calcium-activated
chloride current in rabbit ventricular myocytes. Circ. Res.
68:424-437.