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FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA

MÉTODO ÓPTICO PARA DETECCIÓN DE

BIOMARCADORES EN PIEL DE PACIENTES CON

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

CUARTO AVANCE DE TESIS: MAYO 2017

ALUMNA: MARITZA FABIOLA LEÓN BEJARANO

ASESORES:

DR. MIGUEL G. RAMÍREZ ELÍAS DR. MARTÍN O. MÉNDEZ GARCÍA

I. Introducción

La espectroscopia Raman es una técnica óptica ampliamente utilizada para aplicaciones en

medicina y biología debido a las ventajas para analizar muestras biológicas [1-3]. Entre las

principales ventajas podemos citar, por ejemplo, que proporciona información de la muestra a nivel

molecular, es una técnica no invasiva o mínimamente invasiva, y relativamente rápida. [3-5]. Sin

embargo, el ruido es uno de los grandes problemas en la adquisición de espectros Raman de

muestras biológicas, lo cual hace complicado el análisis de los espectros Raman. Este ruido incluye

a la fluorescencia de fondo originada por la naturaleza de las moléculas que forman al tejido

biológico, así como otros tipos de ruido como fuentes externas o el ruido generado por el proceso

de medición. La fluorescencia de fondo tiene una magnitud mayor a la de la señal Raman por lo que

puede ocultar la información de interés [6]. Por tal motivo, los espectros deben ser tratados con

técnicas que faciliten la identificación de bandas Raman sin que exista pérdida de datos. La

separación de la fluorescencia se realiza utilizando métodos experimentales y computacionales,

siendo estos últimos los más usados dada su rapidez, fácil implementación y bajo costo [7] [8].

Debido a esto, los métodos computacionales se aplican de forma eficaz en espectros Raman de

tejido biológico, siendo los métodos basados en el ajuste polinomial los más utilizados, como es el

caso del Algoritmo de Vancouver, el cual se ha posicionado como método estándar debido a su

simplicidad [9] [10].

Adicional al problema del ruido de fondo, existen otros obstáculos para la extracción de la

información de interés de los espectros Raman, como las condiciones de la muestra. Para estudiar

tejido biológico, una de las técnicas histológicas más utilizadas es la del tejido embebido en parafina,

esto debido a la ventaja que presenta la parafina para preservar material orgánico. Dadas las

características químicas de la parafina, la cual está compuesta por mezclas de hidrocarburos

saturados, las bandas Raman de la parafina se traslapan con las bandas de tejido biológico [11], lo

cual representa un problema para el análisis de los espectros Raman. Una solución es remover la

parafina o proceso de desparafinado, [12], pero este proceso puede dañar la muestra y/o

contaminarla, además que consume mucho tiempo y no es un proceso simple. Lo que se propone

en este trabajo es el uso de algoritmos matemáticos para eliminación de parafina. Estos métodos

permitirían identificar los componentes del espectro Raman de muestras embebidas en parafina,

eliminar la contribución de la parafina del espectro Raman y conservar únicamente el espectro

Raman que contiene información de los componentes moleculares de la muestra o tejido.

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II. Objetivo general (4º. semestre)

Eliminar el ruido en espectros Raman debido a la fluorescencia y evaluar diferentes

algoritmos para la eliminación de parafina en muestras biológicas.

III. Objetivos específicos

Adquirir espectros Raman de tejido biológico de ratones (Espectrómetro Raman portátil).

Adquirir espectros Raman de biopsias de piel en parafina (Micro espectrómetro Raman).

Eliminar la fluorescencia de espectros Raman.

Revisión del artículo de eliminación de fluorescencia en espectros Raman de tejido

biológico.

Revisión del estado del arte para identificar componentes en espectros Raman.

IV. Actividades realizadas durante el periodo Enero-Julio 2017

Durante el periodo Enero-Julio 2017, las actividades programadas son:

Cursar el seminario de ética profesional.

Documentación de información bibliográfica: Marco teórico y estado del arte.

Adquisición de espectros Raman de biopsias de piel en parafina.

Adquisición de espectros Raman de tejido biológico de ratones.

Escritura y revisión de artículo titulado: Denoising of Raman spectroscopy for biological

samples based on Empirical Mode Decomposition.

Revisión del estado del arte para identificar métodos para separar componentes en señales.

V. Eliminación de ruido en espectros Raman de muestras biológicas

Para la eliminación del ruido de espectro Raman de muestras biológicas, se propuso el uso de

descomposición empírica de modos (EMD, por sus siglas en inglés). Considerando el ruido como la

contribución de la fluorescencia de fondo y el ruido debido al instrumento de medición. Se

obtuvieron espectros Raman de tejido biológico de 3 ratones silvestres y 3 ratones transgénicos

(proporcionado por el laboratorio de estrés de la Facultad de Ciencias, UASLP). Para la toma de

espectros Raman, lo ratones fueron sacrificados y se extrajeron diferentes órganos. Para el presente

trabajo se incluyeron los espectros de cerebro. Adicionalmente a los espectros de cerebro de ratón,

se incluyeron espectros de tabletas de paracetamol, vitamina E, uñas de humanos así como de piel

de humanos con diferencias patológicas fijadas en parafina, para contar con una base datos de

distintos tipos de espectros Raman de muestras biológicas y sintéticas.

Todos los espectros fueron obtenidos usando un espectrómetro Raman portátil excepto las

muestras de piel. El sistema Raman portátil (PeakSeeker, Agiltron) tiene un diodo láser de 785nm

con una potencia de 300mW, resolución espectral de 8 𝑐𝑚−1. Las mediciones se realizaron en el

rango espectral de 800 𝑐𝑚−1 a 1800 𝑐𝑚−1, con un tiempo de exposición de 60s. Para evaluar el

método de eliminación de ruido, se generaron espectros Raman artificiales basando en el espectro

Raman de Teflón sometido a diferentes condiciones de ruido Gaussiano y fluorescencia semejante

a la presente en tejido biológico, esto de acuerdo a la información existente en la literatura [10].

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A continuación la figura 1 muestra el resultado de las pruebas (b y c) realizadas en el espectro

simulado de teflón (a) con distintos niveles de ruido Gaussiano.

Figura 1. Coeficiente de correlación de aplicar EMD al espectro de teflón simulado (con distintas condiciones de ruido) con

fluorescencia (a) y comparar respecto al resultado de VRA para la señal sin ruido (b), así como entre la fluorescencia modelada por

EMD, VRA y la fluorescencia simulada

Una vez realizadas las pruebas en datos simulados posteriormente el método de

descomposición empírica de modos (EMD, por sus siglas en inglés) fue aplicado a 20 espectros de

muestras biológicas de: tabletas de paracetamol, vitamina E, uñas de humanos y cerebro de ratones.

La tabla 1, muestra los resultados de calcular el coeficiente de correlación para medir el rendimiento

de EMD respecto al algoritmo de Vancouver (método utilizado comúnmente en espectroscopía

Raman para remover fluorescencia) calculado para cada conjuntos de espectros (20 espectros por

cada muestra) esto para verificar la consistencia de cada método.

Datos

Coeficiente de correlación

Espectros sin procesar Procesados con EMD Procesados con VRA

Paracetamol 0.9969628 0.9470866 0.9991666

Vitamina e 0.9975227 0.9594442 0.9928150

Uñas de humano 0.9941054 0.7212941 0.9091770

Cerebro de ratón 0.8843356 0.8568437 0.9688818

b) c)

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A continuación la figura 2 muestra la aplicación de EMD (línea solida) y VRA 5 y 11 puntos de

suavizado (línea discontinua y punteada, respectivamente) en espectros Raman de cerebro de

ratones, identificando las bandas Raman registradas en la literatura (líneas verticales rojas): 962

𝑐𝑚−1, 991 𝑐𝑚−1, 1044 𝑐𝑚−1, 1302 𝑐𝑚−1, 1442 𝑐𝑚−1, 1542 𝑐𝑚−1, 1614𝑐𝑚−1 y 1725 𝑐𝑚−1[13]. La

figura 2 muestra como al aplicar VRA las bandas que se encuentran en el rango de 1200 𝑐𝑚−1 a

1500 𝑐𝑚−1 tienden a ser eliminadas y EMD tiende a preservar bien la forma de están bandas. Un

detalle importante es que EMD presenta aún una pequeña parte de la fluorescencia, pero no elimina

los detalles del espectro original.

Figura 2. Resultado de aplicar EMD (línea solida), VRA con 5 puntos de suavizado (línea discontinua) y VRA con 11 puntos de

suavizado (línea punteada) en espectro de cerebro de ratones

Por otra parte se utilizó análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) para

cuantificar la contribución de ruido después de aplicar EMD y VRA como Ramírez et al [14]. En donde

se extraen los componentes principales independientes, considerando un componente como

independiente cuando no se encuentran relacionados con otros componentes. Con este enfoque la

cantidad de varianza relativa de los componentes no incluidos como independientes es considerada

como la contribución de ruido, que es identificada a través de la resta de la varianza de los

componentes independientes. Mediante esta técnica se puede ver que al eliminar ruido se tiene

variabilidad entre los resultados.

La tabla 2, muestra la cantidad de componentes asociados en cada caso, así como su varianza

residual. En los resultados se observa como VRA tiende a mostrar mejores resultados al trabajar con

material no biológico, pero al aplicarse en material que proviene de tejido biológico EMD conserva

mejor los detalles en bandas Raman con menor y mayor intensidad y ancho.

Datos

EMD VRA Componentes

independientes

Porcentaje de

ruido

Componentes

independientes

Porcentaje de

ruido

Paracetamol 1 a 7 0.07 1 0.06

Vitamina e 1 a 4 0.1 1 a 2 0.05

Uñas de humano 1 a 5 0.04 1 a 3 0.38

Cerebro de ratón 1 a 6 0.14 1 a 4 0.33

Posteriormente fueron sometidas a VRA y EMD biopsias de piel con una proteína asociada a

Parkinson en estado de agregación de fibrillas y otra en su estado normal. Las biopsias fueron

sometidas a un micro espectrómetro Raman Xplora, Horiba Jobin Yvon (Proporcionado por el

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Laboratorio Nacional del CIACYT-UASLP). Se les aplico VRA y EMD y los resultados se muestran en la

figura 3 y figura 4.

Figura 3. Resultado de aplicar EMD (línea solida), VRA con 5 puntos de suavizado (línea discontinua) y VRA con 11 puntos de

suavizado (línea punteada) en espectros de biopsia de piel con la proteína en su estado basal

Figura 4. Resultado de aplicar EMD (línea solida), VRA con 5 puntos de suavizado (línea discontinua) y VRA con 11 puntos de

suavizado (línea punteada) en espectros de biopsia de piel con la proteína en estado de fibrillas

Las figura 3 y 4, muestran claramente como VRA depende mucho del suavizado aplicado a los

datos previo al ajuste polinomial, el cual en ciertas ocasiones puede llegar a desvanecer las bandas

Raman asociadas así como a agregar bandas Raman falsas. EMD, por otra parte logra definir bien

las bandas Raman descritas en la literatura por Apetri et al (líneas rojas verticales) [15].

VI. Eliminación de parafina en biopsias de piel

Dos biopsias de piel embebidas en parafina fueron sometidas a espectroscopía Raman

utilizando un micro espectrómetro Raman Xplora, Horiba Jobin Yvon (Proporcionado por el

Laboratorio Nacional del CIACYT-UASLP) con una longitud de onda de láser de 532nm, una potencia

de laser de 4 mW y en un rango espectral de 800 𝑐𝑚−1 a 1800 𝑐𝑚−1. Se realizó un barrido sobre la

muestra en una sección donde se fijó el tejido y en otra sección que solo contenía parafina como

referencia para identificar las bandas de la parafina. En la figura 5 se muestra el espectro de la

parafina.

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Figura 5. Espectro Raman del bloque de parafina pura

Un total de 1150 espectros Raman fueron tomados por cada biopsia de piel, los cuales se

recolectaron mediante el mapeo en una determinada sección en la que fueron recolectados cada

1.2 µm a lo largo del eje y y cada 2 µm a lo largo del eje x, con un tiempo de acumulación de 2 seg

cubriendo un área total de 50 µm por 23 µm, como se ilustra en la figura 6a y figura 6b.

Figura 6. Rejilla utilizada en biopsias de piel embebidas en parafina para realizar el mapeo de espectros Raman

El espectro promedio libre de fluorescencia por cada biopsia se muestra en la figura 7, en la cual

también se muestra la comparación con el espectro puro de parafina. En la figura 5 se observan las

bandas Raman que se traslapan entre la señal de parafina y la señal de piel, algunas de las bandas

identificadas de acuerdo a la literatura en piel son: 853 𝑐𝑚−1 proteína:𝛿(𝐶𝐶𝐻), 937 𝑐𝑚−1 proteína:

𝜐(𝐶𝐶), 𝑝𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎, 𝑣𝑎𝑙𝑖𝑛𝑎, 1005 𝑐𝑚−1 proteína: 𝜐(𝐶𝐶) 𝑎𝑛𝑖𝑙𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑛𝑖𝑙𝑜, 1030 𝑐𝑚−1 grasa: 𝜐(𝐶𝐶),

1080 𝑐𝑚−1 grasa 𝜐(𝐶𝐶), 1270 𝑐𝑚−1 proteína: 𝜐(𝐶𝑁), 𝛿(𝑁𝐻) amida III, 1304 𝑐𝑚−1 grasa: 𝛿(𝐶𝐻2)

y 1442 𝑐𝑚−1 proteína: 𝛿(𝐶𝐻2), 𝛿(𝐶𝐻3) [16]. Las bandas Raman identificadas en parafina son: 1063

𝑐𝑚−1, 1133 𝑐𝑚−1, 1171 𝑐𝑚−1, 1295 𝑐𝑚−1, 1430 𝑐𝑚−1 y 1480 𝑐𝑚−1. Traslapándose estas de forma

clara en la región espectral de 1000 𝑐𝑚−1 a 1500 𝑐𝑚−1.

Figura 7. Comparación del espectro Raman de parafina contra el espectro Raman asociado a las biopsias de piel

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De acuerdo al estado del arte se ha aplicado el método de análisis de componentes principales

(PCA, por sus siglas en inglés) y análisis de componentes independientes (ICA, por sus siglas en

inglés). Vrabie et al., analizaron espectros Raman de tejido de piel de tumores malignos y benignos

utilizando ICA, con lo que pudieron caracterizar el espectro asociado a piel de humanos [17].

Posteriormente Meksiarun et al., utilizaron ICA, mínimos parciales cuadrados (PLS, por sus siglas en

inglés) y la mezcla de estos dos para extraer el espectro asociado a la parafina [18].

Es así como en este avance de tesis se aplicó PCA para identificar las componentes asociadas a

los espectros Raman tomados de biopsias de piel embebidas en parafina y específicamente para

poder identificar al espectro asociado a piel de humanos que se encuentra oculto por las bandas

Raman de parafina.

1. Análisis de componentes principales (PCA)

Análisis de componentes principales es un método no supervisado, el cual tiene como objetivo

disminuir la dimensión de los datos, proyectándolos en un nuevo conjunto de variables conocidas

como componentes principales, los cuales explican un porcentaje de la información original. PCA

se aplica de la siguiente forma: se resta la media dimensional, se calcula la matriz de covarianza para

posteriormente calcular sus eigenvectores y eigenvalores, ordenando estos últimos y eligiendo los

de mayor valor, que serán los que representaran al nuevo plano de los datos. Sea X la matriz de

datos (dimensión m x n) que contiene los datos originales, E la matriz de eigenvectores y el nuevo

conjunto de datos Y (ver Ecuación 1) [17] [19].

Y=EX (Ec. 1)

2. Resultados preliminares

Se aplicó PCA a la matriz de espectros (dimensión 1150 x 636) una vez que se les eliminó el ruido

y la fluorescencia, posteriormente se identificó que los primeros 5 componentes principales explican

un 99.7 % del total de información. La figura 8 muestra un ejemplo de los loadings (contribución de

las variables) asociados a dos componentes al aplicar PCA.

Figura 8. Loadings después de aplicar PCA a los espectros Raman de tejido de piel en biopsias

Los componentes obtenidos por PCA mostraron la presencia de bandas Raman de parafina en

los cinco loadings y por tanto no se obtuvo una separación de los componentes de los espectros,

por lo cual será necesario someter estos resultados a otro método que permita la separación de

espectros sin que se solapen las bandas Raman.

El mismo proceso se aplicó a la segunda biopsia, la figura 9 muestra el resultado de aplicar PCA

a la matriz de espectros (dimensión de 1150 x 636).

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Figura 9. Loadings después de aplicar PCA

Los resultados de aplicar PCA en la segunda biopsia de piel proporcionaron resultados muy

parecidos en los que analizando los loadings asociados a los cinco primeros componentes principales

(debido a que son lo que preservan la mayor de información de los datos) muestran la presencia de

las bandas Raman de parafina en diferentes concentraciones, pero estas siempre están presentes

en cada componente obtenida.

VII. Conclusiones En relación a la eliminación de ruido, concluimos que después de aplicar EMD y VRA para

eliminar fluorescencia en espectros Raman que provienen de tejido biológico, EMD se puede

considerar como un método capaz de eliminar el ruido en espectros Raman dando resultados

similares a VRA y en los cuales no existe pérdida de información Raman ni se agregan picos Raman

falsos. En cuanto a la eliminación de parafina, los resultados preliminares muestran que el uso de

PCA no permite separar las componentes asociadas a la parafina pura, por lo que será necesario

utilizar otro método complementario o separado para identificar componentes en los espectros

Raman.

VIII. Trabajo para el quinto avance Después de evaluar EMD y VRA e identificar sus ventajas y desventajas particulares respecto a

la eliminación de ruido, el siguiente paso es proponer un método que considere el uso de ambos

métodos para eliminar ruido y fluorescencia en espectros Raman, aplicando primero EMD como un

filtro no lineal que sustituya al utilizado por VRA, el cual en ocasiones atenúa las bandas con menor

ancho de banda e intensidad. Debido a que EMD conserva la información asociada a las bandas al

eliminar el ruido, se propondrá aplicar EMD seguido de VRA para eliminar el resto fluorescencia

que queda presente en los espectros al utilizar EMD, como se observó en los resultados

mencionados previamente.

Respecto a la eliminación de parafina en biopsias, se planea realizar en los próximos meses

más pruebas con PCA y con análisis de componentes independientes (ICA, por sus siglas en inglés)

en biopsias de piel, así como evaluar otras técnicas para la eliminación de parafina, para

posteriormente ser aplicados a biopsias con alguna patología y así identificar diferencias en los

resultados.

IX. Cronograma de actividades

Periodo

9

Actividades Agosto

Enero

2015

Febrero

Julio

2016

Agosto

2016

Enero

2017

Febrero

Julio

2017

Agosto

2017

Enero

2018

Febrero

Julio

2018

Agosto

2018

Enero

2019

Febrero

Julio

2019

Clases X X

Seminario del PIE X X X X

Documentación bibliográfica

X X X X X X X X

Construcción y calibración de equipo

X

Prueba piloto X

Preprocesamiento de datos

X X

Escritura y publicación de artículo

X X X X X X

Análisis de datos X X X

Examen de candidatura

X

Validación de resultados

X X

Redacción de tesis X X X

Actividades realizadas.

Actividades programadas para el siguiente semestre.

X. Artículos enviados y en proceso

M. León-Bejarano, G. Dorantes-Méndez, M. Ramírez-Elias, M. O. Méndez, A. Alba, Ildefonso

Rodríguez-Leyva, Maria Jiménez, "Fluorescence background removal method for biological

Raman spectroscopy based on empirical mode decomposition," 2016 38th Annual

International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC),

Orlando, FL, 2016, pp. 3610-3613.

Maritza León-Bejarano, Miguel Ramírez-Elias, Martin O. Méndez, Guadalupe Dorantes-

Méndez, María del Carmen Rodríguez-Aranda, Alfonso Alba, “Denoising of Raman

spectroscopy for biological samples based on Empirical Mode Decomposition” (En

preparación).

XI. Referencias [1] T. Huser, J. Chan, “Raman spectroscopy for physiological investigations of tissues and cells,” Advanced Drug

Delivery Reviews, vol 89, pp. 57-70, Jul. 2015.

[2] F. J. González, J. Alda, B. Moreno-Cruz, M. Martínez-Escanamé, M. G. Ramírez-Elías, B. Torres-Álvarez, and

B. Moncada, “Use of Raman spectroscopy for the early detection of filaggrin-related atopic dermatitis,” Skin

Research. Technology, vol. 17, no. 1, pp. 45–50, Feb. 2011.

10

[3] F.J. González, R. Valdés-Rodríguez, M.G. Ramírez-Elías, C. Castillo- Martínez, V.M. Saavedra-Alanís, B.

Moncada, “Noninvasive detection of filaggrin gene mutations using Raman spectroscopy,” Biomedical Optics

Express, vol. 2, no. 12, pp. 3363–6. Dec. 2011.

[4] A. Bonifacio, S. Cervo, V. Sergo, “Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy of biofluids:

fundamental aspects and diagnostic applicautions,” Analytical and bioanalytical chemistry, vol. 407, no. 27,

pp. 8265-77, Nov. 2015.

[5] Ferraro John R. et al., “Introductory Raman Spectroscopy. Elsevier”, 2003.

[6] R.L. McCreery, Raman Spectroscopy for Chemical Analysis, John Wiley, vol. 157, pp. 49-59, 2000.

[7] A.P. Shreve, N.J. Cherepy and R.A. Mathies,” Effective Rejection of Fluorescence Interference in Raman

Spectroscopy Using a Shifted Excitation Difference Technique,” Applied Spectroscopy, 46, pp. 707, 1992.

[8] F. Knorr, Z.J. Smith and S. Wachsmann-Hogiu, “Development of a time-gated system for Raman

spectroscopy of biological samples, “Optics Express, 18, pp. 20049, 2010.

[9] Zhao Jianhua, Lui Harvey, Mclean David I. y Zeng Haishan, “Automated Autofluorescence Background

Subtraction Algorithm for Biomedical Raman Spectroscopy”, Applied Spectroscopy ,vol. 61:11, pp. 1225-1232,

2007.

[10] C.A. Lieber and A. Mahadevan-Jansen, “Automated Method for Subtraction of Fluorescence from

Biological Raman Spectra,” Applied Spectroscopy, 57, pp. 1363, 2003.

[11] J. Sánchez Caba, Purificación de parafinas de petróleo por hidrogenación catalítica [Tesis de doctorado],

Madrid, Universidad complutense de Madrid, pp. 14-21, 2003.

[12] G. ZAFRA SIERRA, O. FLÓREZ VARGAS, C. I. GONZÁLEZ RUGELES, “Influencia del método de

desparafinación y el tiempo de almacenamiento en la extracción de DNA a partir de tejidos de archivo”,

saluduis, no. 36, pp. 73-79, 2004.

[13] N. Huang, M. Short, J. Zhao, H. Wang, H. Lui, M. Korbelik and H. Zeng, “Full range characterization of the

Raman spectra of organs in a murine model”, Optics express, Vol. 19, No. 23, pp. 22892, 2011.

[14] M.G. Ramírez-Elias, J. Alda, F.J. González, “Noise and artifact characterization of in vivo Raman

spectroscopy skin measurement”, Applied spectroscopy, no. 66, pp. 650, 2012.

[15] M. M. Apetri, N. C. Maiti, M. G. Zagorski, P. R. Carey, and V. E. Anderson, “Secondary structure of α-

synuclein oligomers: Characterization by Raman and atomic force microscopy”, Journal of Molecular Biology,

no. 355, pp. 63, 2006.

[16] Y. Li, R. Chen, H. Zeng, Z. Huang, S. Feng and S. Xie, “Raman spectroscopy of Chinese human skin in vivo”,

Chinese Optics Letters, vol. 5, no. 2, pp. 105, 2007.

[17] V. Vrabie, C. Gobinet, O. Piot, A. Tfayli, P. Bernard, R. Huez, M. Manfait, “Independent component analysis

of Raman spectra: Application on paraffin-embedded skin biopsies, “Biomedical Signal Processing and Control,

no. 2, pp. 40-50,2007.

[18] P. Meksiarun, M. Ishigaki, Verena A.C. Huck-Pezzei, C. W. Huck, K. Wongravee, H. Sato and Y. Ozaki, “Comparison of multivariate analysis methods for extracting the paraffin component from the paraffinembedded cancer tissue spectra for Raman imaging,” Scientific Reports, pp.1-10,2017. [19] R. O. Duda, P. E. Hart, D. G. Stork, “Pattern classification”, Second edition, capítulo 10.