EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEINAS: EL PASADO Y EL PRESENTE

La extracción de ADN, ARN y proteínas es un método básico usado en biología molecular. Estas biomoleculas pueden ser aisladas a partir de cualquier material biológico mediante una secuencia de procesos descendentes, propósitos analíticos y/o preparativos. En el pasado, los procesos de extracción y purificación de los ácidos nucleicos solían ser un proceso complicado, de gran consumo de tiempo, de arduo trabajo laboral, y limitado en términos del rendimiento total. Actualmente, existen algunos métodos especializados que pueden usarse para la extracción pura de las biomoleculas, así como extractos que tienen como base soluciones o una columna. Los métodos manuales han recorrido un largo camino en el tiempo con una variedad de ofertas comerciales que incluían un kit completo conteniendo los componentes necesarios para aislar ácidos nucleicos, pero desde luego estos requerían etapas de centrifugación repetidas, seguido por la eliminación del sobrenadante dependiendo del tipo de espécimen o tratamiento mecánico adicional. El sistema automático diseñado para laboratorios medianos a grandes, ha tenido una gran demanda en estos últimos años. Este sistema es una alternativa para los métodos manuales de intenso labor. La tecnología puede permitir un mayor rendimiento de las muestras; la producción, la pureza, reproductibilidad y la escabilidad de las biomoleculas así como la velocidad, exactitud, y seguridad del análisis podrá ser máxima, mientras se minimiza el riesgo de contaminación cruzada.

1. Introducción de extracción de biomoleculas

La extracción de biomoleculas ADN, ARN y proteínas es el método más crucial usado en biología molecular. Este es el punto de inicio para los procesos descendentes y el desarrollo de productos incluidos con kits de diagnóstico. ADN, ARN y proteínas pueden ser aislados a partir de cualquier material biológico así como tejidos vivos o conservados, células, partículas de virus u otro tipo de muestras para los propósitos analíticos o preparativos.

Las dos categorías que están envueltas en la purificación del ADN incluye la aislación del ADN recombinante así como construcciones de plásmidos o bacteriófago y el aislamiento del cromosoma o genoma del ADN a partir de organismos procariotas y eucariotas. Generalmente, el éxito de la purificación de los ácidos nucleicos requiere 4 importantes pasos: ruptura efectiva de las células o tejidos, desnaturalización de nucleoproteínas complejas, inactivación de las nucleasas, por ejemplo, RNasas para la extracción del ARN y las DNasas para la extracción del ADN; aparte de la contaminación. El objetivo de los ácidos nucleicos es que deben estar libres de contaminantes, incluyendo proteínas, carbohidratos, lípidos u otros ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN libre de ARN o ARN libre de ADN. La calidad y también la integridad del aislamiento de los ácidos nucleicos afectaran directamente los resultados de todo éxito en la investigación científica.

Por otro lado, el ARN es una molécula inestable y una vez que es extraído de la célula o tejido tiene un corto periodo de vida media. Existe una gran variedad de tipos de ARN de origen natural; incluyendo el ARN ribosomal (rARN) (80%-90%), ARN mensajero (mARN) (2.5%-5%) y ARN transferasa (tARN). Especiales cuidados y precauciones son requeridos para el aislamiento del ARN porque esta molécula es susceptible a la degradación. El ARN es

especialmente inestable debido a la presencia de ubicuos de RNasas que son enzimas que están presentes en la sangre, todos los tejidos, así como en la mayoría de bacterias y hongos en el ambiente. Fuertes desnaturalizantes siempre se han usado para el aislamiento intacto del ARN para inhibir endogenosos RNasas. La extracción del ARN se basa en buenas técnicas de laboratorio y una técnica de liberación de RNasas. Las RNasas son termoestables y se repliegan o eliminan tras una desnaturalización por calor. Ellos son difíciles de inactivarlos porque ellos no requieren cofactores.

El método de aislamiento más común puede estar dividido en 2 clases: utilizando 4 M guanidine thiocyanate y utilizando fenol y SDS.

La purificación de proteínas es uno de las partes más importantes para poder entender su función en la investigación de las proteínas, mientras ellos puedan en parte o completamente estar envueltos o involucrados en la síntesis del ADN. La purificación de proteínas es requerida para determinar sus características únicas, incluyendo tamaño, carga, forma y función. La extracción de cell-based es el primer paso para la purificación de casi todas las proteínas. Las proteínas pueden ser extraídas por unos pocos métodos: lisis con detergentes, fuerzas de cizallamiento, tratamiento con sal iónica, y rápidos cambios en la presión, cuyo objetivo es debilitar y romper las membranas que están alrededor de la célula para permitir a las proteínas escapar. Algunos factores podrían ser considerados durante la manipulación de las proteínas. Normalmente, la extracción de proteínas es realizada a muy baja temperatura (4°c) porque las proteínas son fácilmente desnaturalizadas una vez que son liberadas de las células. La condición del buffer es uno de los mayores factores que necesita ser considerado. Se recomienda que se mantengan las condiciones específicas para el buffer debido a la sensibilidad de las proteínas hacia los cambios de pH en el ambiente. La pureza del agua afectara al rendimiento de la producción final y esto es debida a que el agua no purificada contiene un gran grupo de microorganismos o proteasas que degradaran a las proteínas. El inhibidor de las proteínas que puede existir en soluciones o buffer, causa la hidrolizacion de las proteínas. Los Detergentes, otro significante factor que no puede ser descuidado en la purificación de las proteínas, consisten de una porción hidrofóbica de un hidrocarburo lineal o ramificado “cola” y una porción hidrofilica “cabeza”. Ellos solubilizan la membrana proteica y son moléculas anfipaticas que forma micelas con la cabeza hidrofilica de las proteínas. Los agentes reductores se adicionan en la solución o buffer para la extracción y purificación de la proteína, esto es para evitar la pérdida de su actividad o sus enzimas que es causada por la oxidación. El almacenamiento de proteínas es importante debido a que el tiempo de vida media de la proteína es comúnmente dependiente de la temperatura del almacenamiento.

La purificación de las proteínas requiere un específico análisis. Debe ser un conocido método de ensayo rápido y fácil para la purificación de proteínas de modo que un peso molecular conocido, una afinidad específica, o una immunoafinidad de proteínas non enzimáticas de interés puedan ser detectadas usando un método apropiado. Aquí hay muchos métodos comúnmente usados en la purificación de proteínas como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad y electroforesis en gel.

2. Historia

2.1 Extracción de ácidos nucleicos: el primer ADN aislado fue hecho por un físico suizo, Friedrich Miescher en 1869. El esperaba resolver los fundamentales principios de la vida, para determinar la composición química de las células. Para su experimento él trato de aislar células a partir de los ganglios linfáticos pero la pureza de los linfocitos fue fuerte e imposible de ser obtenidas en cantidades suficientes. Por ello el cambio a leucocitos, donde él los obtuvo del pus en los vendajes quirúrgicos.

Inicialmente, Miescher se enfocó en varios tipos de proteínas que formaban los leucocitos y mostro que las proteínas son los principales componentes del citoplasma celular. Durante su examen, él se dio cuenta que en la solución había una sustancia precipitada cuando se añadió un ácido y de nuevo se disolvió cuando se añadió una base. Así fue, como él obtuvo por primera vez un precipitado crudo de ADN.

Para separar el ADN de las proteínas a partir de su extracto, Miescher desarrollo un nuevo protocolo para separar el núcleo celular del citoplasma y luego aislar el ADN. Sin embargo, su primer protocolo fracaso en producir suficiente material para continuar con sus posteriores análisis. Él tuvo que desarrollar un segundo protocolo para obtener largas cantidades de núcleos purificados, que fue llamado más adelante “ácidos nucleicos” por su estudiante, Richard Altman.

2.2 Extracción de proteínas: en el siglo 18, las proteínas fueron conocidas como una distintiva clase de moléculas biológicas por Antoine Fourcroy y otros. Ellos distinguían esta molécula por su habilidad para coagular bajo un tratamiento con calor o acido. Sin embargo, la primera descripción de una proteína fue llevado a cabo por Gerhardus Johannes Mulder, un químico holandés, en 1983. Sus estudios en la composición de sustancias de origen animal, principalmente la fibrina, albumina y gelatina, mostro la presencia de carbono, hidrogeno, oxígeno y nitrógeno. Además, el reconoció que el sulfuro y el fosforo estuvieron presentes alguna veces en las sustancias de origen animal que consistió en un gran número de átomos y el estableció que esa sustancia eran macromoléculas.

La mayor parte de sus primeros estudios se enfoca en proteínas que pueden ser purificadas en grandes cantidades. Por ejemplo sangre, clara y varias toxinas. La mayoría de las proteínas son difíciles para purificar en grandes cantidades incluso con la avanza tecnología actual. La mayoría de técnicas para la purificación de proteínas fueron desarrolladas en un proyecto llevado a cabo por Edwin Joseph Cohn, un científico de proteinas, durante la segunda guerra mundial. Él fue el responsable de purificar la sangre y logro las técnicas para aislar fracciones de albumina sérica del plasma sanguíneo, que es importante para el mantenimiento de la presión osmótica de la sangre de las venas, que ayuda a mantener al soldado vivo.

3. Tendencias Actuales Después del predestinado evento donde Miescher se lo arreglo para obtener el ADN a partir de la célula, muchos otros han seguido adaptándose que les permite a mejorar el protocolo

(mejorar el aislamiento y purificación del ADN). La rutina inicial del laboratorio para los procedimientos de la extracción del ADN fueron desarrollados en estrategias de centrifugación por gradiente en equilibrio. Meselson y Stahl usaron este método en 1958 para demostrar la replicación semiconservativo del ADN. En procedimientos posteriores usaron las diferencias en la solubilidad del ADN cromosomal, plásmidos, y proteinas en soluciones alcalinas. Actualmente, existen muchos métodos especiales para la extracción de ADN puro, ARN o proteinas. Generalmente, ellos están divididos en extracciones que tienen como base soluciones o una columna según el protocolo. La mayoría de estos protocolos se han convertido en Kits que facilitan los procesos de extracción de biomoléculas.

3.1 Tipo de extracción de ácido nucleico

3.1.1 método convencional

1. extracción con guanidinium tiocianato fenol cloroformo: la sal es la impureza común en las muestras de ácidos nucleicos. Esta sal siempre ha sido removida de las muestras de ácidos nucleicos antes de cualquier proceso o análisis que se va hacer. Por lo tanto, un o múltiples pasos de separación y/o purificación son necesitados para desalar la muestra de ácidos nucleicos. El paso general de la purificación de los ácidos nucleicos incluye lisis de células, que interrumpen la estructura celular para crear la inactivación de nucleasas celulares como la DNasas y RNasas, y la separación de los ácidos nucleicos deseados a partir de restos celulares. La extracción con solventes orgánicos fenol y cloroformo es uno de los ejemplos, que es extensamente usado en el aislamiento de los ácidos nucleicos.

Aunque el fenol, un infamable, corrosivo, y toxico ácido carbónico puede desnaturalizar a las proteinas rápidamente, esto no inhibe completamente la actividad del RNasa. Este problema puede ser solucionado usando una mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isomilico (25:24:1). Las proteinas, carbohidratos, lípidos y restos celulares son removidos mediante una extracción de la fase acuosa con la mezcla orgánica de fenol y cloroformo. Se forma una emulsión bifásica cuando el cloroformo y el fenol son añadidos. La capa hidrofobica de la emulsión será sentado al fondo y la capa hidrofilica en la parte superior a causa de la centrifugación. La fase superior que contiene el ADN es recolectada y el ADN puede precipitarse a partir del supernadante por adición de etanol o isopropanol en 2:1 o 1:1 de grandes concentraciones de sal. El ADN precipitado es recogido por la centrifugación, y el exceso de sal es enjuagado con 70% de etanol y centrifugado para descartar el etanol supernadante. La bolita de ADN es disuelto con un buffer TE o esterilizado con agua destilada.

El uso de isotiocianato de guanidinium en la extracción del ARN fue mencionado por primera vez por ULRICH et al. (1997). El método fue laborioso. Por eso, estuvo desplazándose por una técnica de un solo paso, que es conocido como extracción con guanidinium tiocianato fenol cloroformo, por Chomczynski y Sacchi (1987), por el cual el homogenate es extraído con fenol/cloroformo a un pH reducido. El guanidinium tiocianato es un agente caotrópico usado en la degradación de las proteínas. El principio de esta técnica de un solo paso es que el ARN es separado del ADN después de la extracción con una solución acidica consistente de guanidinium tiocianato, acetato de sodio, fenol y cloroformo. En la condición acidica, el total de ARN permanecerá en la parte superior de la mezcla (fase acuosa), mientras que el ADN y proteínas permanecerán en la interfase o en la parte inferior (fase orgánica). Posteriormente la recuperación total del ARN se hará por una precipitación con isopropanol.

2. Método de extracción con alcalinos: la lisis de alcalino se ha usado para el aislamiento de ADN plasmidico y E.coli. Este método se trabaja muy bien con todo tipo de cepas de E.coli y con cultivos bacteriales que oscilan en tamaño de 1mL a más de 500mL en presencia de dodecil sulfato de soio (sds). El principio de este método está basado en la desnaturalización alcalina selectiva de cromosomas de mayor peso molecular mientras el ADN circular permanece de cerrado y doblemente atado. La proteína bacteriana, rompe las paredes celulares, y desnaturaliza al ADN cromosomal enredado en grandes complejos que están recubiertas con dodecil sulfato. El ADN plasmidico puede ser recuperado a partir del sobrenadante luego la materia desnaturalizada va ser recuperada mediante la centrifugación.

3. Método de extracción CTAB: para la extracción de plantas, el paso inicial que se necesita hacer es moler la muestra y luego congelarlo con un líquido nitrogenado. El propósito de hacer esto es romper el material de las paredes de la célula y permita acceder al ácido nucleico mientras las células enzimáticas nocivas y químicas permanezcan inactivas. Después de moler la muestra, esta se podrá resuspender con un adecuado buffer como CTAB.

Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) es un agente non-iónico que puede precipitar a los ácidos nucleicos y a los ácidos polisacáridos a partir de soluciones de baja fuerzas iónicas. Mientras tanto, las proteínas y polisacáridos neutrales en solución bajo esas condiciones. En soluciones de mayor fuerza iónica. CTAB no va precipitara a los ácidos nucleicos y formara complejos con proteínas. Por lo tanto CTAB es muy útil para la purificación de ácidos nucleicos a partir de organismo que produce grandes cantidades de polisacáridos así como las plantas y específicas bacterias Gram-negativa.

Este método también usa disolventes orgánicos y alcohol para la precipitación en pasos posteriores. Las partículas insolubles serán eliminadas por la centrifugación para la purificación de los ácidos nucleicos. Las proteínas solubles y otras materias serán separadas mediante una mezcla con el cloroformo y la centrifugación. Después de esto los ácidos nucleicos deberán precipitarse, a partir del sobrenadante y lavado a fondo para eliminar la contaminación de sales. Los ácidos nucleicos purificados son resuspendidos y luego almacenados en un buffer TE o esterilizados con agua destilada.

4. Bromuro de etidio (EtBr) -Cesium Cloruro (CsCl) con centrifugación por gradiente: Centrifugación por gradiente de CsCl es un método complicado, caro y requiere mucho tiempo en comparación con otros protocolos de purificación. Requiere cultivo bacteriano a gran escala. Por lo tanto, no es adecuado para la mini preparación del ADN plasmidico. Los ácidos nucleicos se pueden concentrar por centrifugación en un gradiente de CsCl - EtBr después de precipitación alcohólica y resuspensión. Intercalación de EtBr altera la densidad swimming de la molécula de alta molaridad (CsCl). Moléculas circulares cerradas covalentemente se acumularán a las de menor densidad en la gradiente de CsCl, ya que incorporan menos EtBr por par de base en comparación con las moléculas lineales. El EtBr hidrófobo es removido a continuación con disolventes hidrófobos apropiados después de la extracción. El ácido nucleico purificado se vuelve a precipitar con alcohol.

5. Purificación de poli (A) ARN por cromatografía de afinidad en columnas de oligo dT celulosa: El poli (A) ARN es un modelo para la transducción de la proteína y la mayoría de los mARNs eucarióticos llevan tractos de la misma. Se compone de 1 a 2 % del total de ARN y se puede separar por cromatografía de afinidad en oligo (dT) -celulosa. Las colas de Poli (a) forman estables cadenas cortas de ARN - ADN híbrido con oligo (dT) que se adhieren a diferentes matrices de soporte. Cuando hay elevación de la sal se debe agregar al buffer cromatografía para estabilizar el dúplex de ácidos nucleicos debido a que sólo unos pocos pares de bases dT -A se forman. Un buffer bajo en sal se utiliza después de ARNs nonpolyadenylated. Este búfer ayuda a desestabilizar la doble cadena estructuras y a eludir el poli (A) ARN a partir de la resina.

Hay dos métodos comúnmente utilizados en la selección de poli (A) + ARN de cromatografía en columna de oligo (dT) columnas y cromatografía por lotes. La cromatografía en columna normalmente se utiliza para la purificación de grandes cantidades (> 25 g) de poli no radiactivo (A) ARN aislados a partir de células de mamíferos. La Cromatografía por lotes, este método se prefiere cuando se trabaja con cantidades pequeñas (< 50 g) del total de ARN aislado de las células del mamífero. Se puede utilizar cuando se van a procesar muchas muestras de ARN, ya sea radiactivo o no. La cromatografía por lotes se

lleva a cabo con un grado fino de oligo (dT) celulosa a temperaturas óptimas para la unión y la elución.

3.2.1 Extracción de ácidos nucleicos en fase solida:

La purificación de los ácidos nucleicos en fase sólida se puede encontrar en la mayoría de los Kits comerciales de extracción disponibles en el mercado. Permite la rápida y la purificación eficiente en comparación con los demás métodos convencionales. Así como la solución en muchos de los problemas que están asociados con extracciones líquido/líquido por ejemplo impedir que la fase de separación quede incompleta. El sistema de fase sólida absorberá ácido nucleico en el proceso de extracción dependiendo del contenido de pH y sal del buffer. El proceso de absorción se basa en los siguientes principios: la interacción de unión con enlaces de hidrógenos con una matriz hidrófila bajo condiciones caotrópicas, intercambio iónico en condiciones acuosas por medio de un intercambiador de aniones y exclusión de afinidad y de tamaño de los mecanismos. Purificación en fase sólida se realiza normalmente mediante el uso de una columna de centrifugación, operado bajo la fuerza centrífuga. Este método puede purificar ácidos nucleicos rápidamente en comparación con los métodos convencionales. Matrices de sílice, partículas de vidrio, diatomeas, tierra y portadores de intercambio aniónico son ejemplos que se han ido utilizando como una forma de apoyo en una extracción de fase sólida. Son cuatro pasos clave que participan en la extracción en fase sólida y son: lisis celular, adsorción de los ácidos nucleicos, lavado y elución. El primer paso en un proceso de extracción en fase sólida es acondicionar la columna para la adsorción de la muestra. La columna se acondiciona mediante el uso de un buffer en particular, el uso del pH para convertir los grupos funcionales de la superficie o sobre el sólido en una particular forma química. A continuación, la muestra que ha sido degradada por el uso del buffer que le provoco lisis se aplica a la columna. El ácido nucleico deseado absorberá a restos de impurezas la columna con la ayuda de un pH alto y concentración de sal de la solución de unión. Otros compuestos, tales como proteínas pueden tener un fuerte vínculo específico con la superficie de la columna. Estos contaminantes pueden ser removidos en el lavado con el uso del buffer de lavado que contiene un agente competitivo. Para la etapa de elución, se introduce el buffer TE o agua para liberar el ácido nucleico deseado de la columna, de modo que puede ser recogido en un estado purificado. Normalmente, la rápida centrifugación, filtración a vacío o la columna de separación son requeridas durante las etapas de lavado y elución del proceso de purificación.

Las fases solidas de lecho mixto de esta invención están compuesta por las mezclas de por lo menos dos fases sólidas diferentes, puede ser sólido o semisólido, porosa o no porosa. Cada fase sólida se puede unir a la del ácido nucleico bajo diferentes condiciones de solución y también liberar el ácido nucleico bajo condiciones de elución similares.

(1) Matrices de sílice: La base para la mayoría de los productos relacionados a la purificación de los ácidos nucleicos son las propiedades únicas de las matrices de sílice selective ADN binding .los tipos de materiales de sílice incluyen partículas de vidrio, tales como polvo de vidrio, partículas de sílice y microfibras de vidrio que fueron preparados moliendo filtro de fibra de vidrio, e incluyendo tierra de diatomeas. La matriz de sílice hidratada, que se preparó por dióxido de silicio en reflujo con hidróxido de sodio o hidróxido de potasio en una relación molar de aproximadamente 2: 1 a 10: 1 durante al menos aproximadamente 48 horas, será introducido en la purificación de ADN. El ADN se une a la matriz inorgánica y se libera en el agua calentada.El principio de purificación de las matrices de sílice se basa en la alta afinidad del ADN cargado negativamente hacia las partículas de sílice cargados positivamente. El sodio juega un papel de puente de cationes que atrae a la carga negativa del oxígeno en el spine del fosfato del ácido nucleico. Los cationes de sodio rompen los puentes de hidrógeno entre el hidrógeno en el agua y el oxígeno cargado de iones negativos en sílice en condiciones salinas altas (pH ≤ 7) [22]. El ADN está fuertemente unido, lavado y extenso elimina todo contaminaciones. Las moléculas de ADN purificadas se pueden eludir a baja fuerza iónica (pH ≥ 7) mediante el uso de un buffer TE o agua destilada.

En adición a ello, de las matrices de sílice, nitrocelulosa y membranas poliamidas tales como matrices de nylon también se saben que se unen con ácidos nucleicos, pero con menos especificidad. Estos materiales se utilizan a menudo en la transferencia del ácido nucleico en fase sólida y matrices de hibridación. Las Matrices de poliamidas son más duraderas que las de nitrocelulosa y se sabe que se une a los ácidos nucleicos irreversiblemente. Los ácidos nucleicos se pueden inmovilizar en matrices de poliamidas con poca amortiguación de fuerza iónica.

(2) de partículas de vidrio: Las partículas de vidrio, el polvo y los granos son útiles para la purificación de ácido nucleico. Por ejemplo, el aislamiento del ADN es a partir de geles de agarosa que implica el uso de sales de caotrópico para facilitar la unión del ADN al vidrio de silicato comunes, el cristal de roca y vidrio de borosilicato (filtro de fibra de vidrio). La absorción de los ácidos nucleicos sobre el sustrato de vidrio se produce basado en el mecanismo y en el principio similar a la cromatografía de adsorción. La purificación de los ácidos nucleicos también se puede hacer sobre gel de sílice y la mezcla de vidrio. Esta invención se ha descubierto que en una mezcla de gel de sílice y partículas de vidrio se pueden utilizar para separar ácidos nucleicos a partir de otras sustancias en la presencia de solución de sales caotrópico.

(3) tierra de diatomeas. La tierra de diatomeas, que es también conocida como tierra de diatomeas o diatomita, tiene un contenido de sílice como 94%. Se ha utilizado para la filtración y en cromatografía y es útil para la purificación de plásmidos y otro ADN mediante la inmovilización de ADN sobre su partículas en

presencia de un agente caotrópico. El ADN resultante ligado a la tierra de diatomeas se lava a continuación con un buffer que contiene alcohol. El buffer que contiene alcohol es desechado después y el ADN que se eluye con un buffer de baja salinidad o en agua destilada.

(4) La purificación de ácidos nucleicos basada en partículas magnéticas: En la actualidad la separación magnética es una manera sencilla y eficaz que se utiliza en la purificación de ácidos nucleicos. Muchos portadores magnéticos están ahora disponibles comercialmente. Las partículas que tienen una carga magnética se puede eliminar mediante el uso de un imán permanente en un campo magnético. A menudo, los portadores magnéticos con ligando de afinidad inmovilizadora o preparados a partir de biopolímero que muestra afinidad a los ácidos nucleicos se utilizan para el proceso de aislamiento. Por ejemplo, las partículas magnéticas que se producen a partir de diferentes polímeros sintéticos, biopolímeros, vidrio poroso o partículas magnéticas están basados en materiales magnéticos inorgánicos tales como surfacemodified óxido de hierro.se prefiere las materias con una gran superficie para ser utilizado en la unión de los ácidos nucleicos. Las partículas magnéticas tales como perlas son más preferibles para servir de soporte en un proceso de aislamiento debido a su mayor unión y su capacidad de eficacia. Un imán puede ser aplicado al lado del recipiente, que contiene la mezcla de la muestra para la agregación de las partículas cerca de la pared del recipiente y verter fuera el resto de la muestra.

Las partículas que tienen propiedades magnéticas o paramagnéticasse emplean en inventos en donde estas partículas se encapsulanen un polímero como por ejemplo celulosa magnetizable. Los certainconcentrations de sal y polialquilenglicol, la celulosa magnetizable puede unirse a los ácidos nucleicos. Menorácido nucleico requiere mayores concentraciones de sal para un fuertela unión a las partículas de celulosa magnetizable. Por lo tanto,concentración de sal puede ser manipulado selectivamente para liberarácido nucleico unido a la celulosa magnetizable sobre la base detamaño. La celulosa magnetizable que ató con nucleicoácido se lava con tampón de lavado adecuado antes de quese ponen en contacto con un tampón de elución adecuado para separarel ácido nucleico deseado con celulosa. Separación decelulosa magnetizable de sobrenadante durante todo eletapas de purificación se puede realizar mediante la aplicación de un campo magnéticodibujar abajo o atraerlos hacia el lado de la embarcación [27].La celulosa magnetizable utilizado en esta invención tiene una planchacontenido de óxido de hasta alrededor de 90% en peso del totalmasa de la celulosa. El componente magnético de la celulosatambién puede ser sustituido por otros compuestos magnéticos talescomo óxido ferroso u óxido de níquel [27].Un kit de extracción basado en el talón ofmagnetic principiopurificación de ácidos nucleicos basado está disponible comercialmente

en el mercado [28]. La parte especial de este kit es quelos reactivos suministrados están diseñados para su uso con magnéticaherramientas. Se recomienda utilizar esta herramienta magnética si se trabaja enformato microtubo. Se trata de un dispositivo práctico para realizarseparaciones basadas en la tecnología de partículas magnéticas. Loskit no requiere disolventes orgánicos y eliminala necesidad de centrifugación repetida, filtración a vacío oseparación de la columna. El protocolo se basa en una versión modificadaprocedimiento de lisis alcalina seguida por la unión del nucleico