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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016
Memorias
Expresión histológica de IL-6 y TNFα durante la reparación tisular
experimental tratada con películas delgadas de quitosano y nanopartículas de
plata.
Daniela Anel Cabrera Zamora
Universidad Autónoma de Guerrero
Unidad Académica de Ciencias Naturales
Programa Verano UAGro
Área en la que participa: III Medicina y Ciencias de la Salud
Dra. Irinea Yañez Sánchez
Profesor-Investigador de la Universidad de Guadalajara
Resumen
Un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro, la ciencia que se encarga de aplicar la
tecnología a esta escala en el área de la medicina se le denomina Nanomedicina, dentro de los
retos a los que se enfrenta la medicina en este siglo es el desarrollo de técnicas de diagnóstico
precoz para numerosas enfermedades así como el desarrollo de técnicas de regeneración de
órganos y tejidos dañados dentro de nuestro cuerpo, por ello la realización de este estudio en el
cual se le aplico al modelo experimental (ratones) un tratamiento tópico que consiste en una
película delgada de quitosano con nanopartículas de plata en diferentes concentraciones como
son 10μl, 20μl y 50 μl, después de doce días se tomó una muestra a los diferentes tejidos a los
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cuales se les hizo una Inmunohistoquimicas y se foto documento la presencia de las citocinas IL-
6 y TNF-α, en donde se apreciaba la coloración marrón en todos los tejidos es especial se
consideró predominante la presencia de estas citocinas en los tejidos con el tratamiento a 20μl por
lo tanto en comparación y complementación a lo que menciona Ojeda et al., el mecanismo
antiinflamatorio de las nanopartículas de plata se lleva a cabo mediante citocinas y quimiocinas
diferentes a las mencionadas ya que a pesar de estar reparado el tejido se seguían expresando, por
ello el mecanismo antiinflamatorio de las nanopartículas de plata sigue siendo un tema de
estudio.
Palabras Clave: Ag nanopartículas, quitosano, reparación tisular, IL-6 y TNFα.
Introducción
Uno de los grandes retos a los que se enfrenta la medicina en este siglo es el desarrollo de
técnicas de diagnóstico precoz para numerosas enfermedades así como el desarrollo de técnicas
de regeneración de órganos y tejidos dañados dentro de nuestro cuerpo. Encontrar una adecuada
solución a estos retos podría tener una gran repercusión en la calidad de vida de nuestra sociedad
en un futuro cercano. La aparición de una nueva disciplina, denominada Nanomedicina, promete
alcanzar estos ambiciosos objetivos, pero para poder hacer más entendible esto es necesario
mencionar primero que es un nanómetro el cual hace referencia a la milmillonésima parte de un
metro, lo más interesante de trabajar a esta escala, no es trabajar en pequeñas dimensiones, sino el
cambio radical que sufren las propiedades físicas y químicas de la materia a esta escala
manométrica: la conductividad eléctrica, el color, la resistencia o la elasticidad, entre otras
propiedades, se comportan de manera diferente a como lo hace el material en volumen, por lo que
es de gran aplicación en diferentes campos, como la Nanotecnología que es la ciencia que
interviene en el diseño, la producción y el empleo de estructuras u objetos que cuentan con un
tamaño de 1-100 nanómetros, la Nanotecnología aplicada en el área de la medicina se denomina
Nanomedicina la cual agrupa tres áreas principales: el Nanodiagnóstico, la liberación controlada
de fármacos (o Nanoterapia) y la medicina regenerativa.
En esta investigación se tomó en cuenta la importancia de la nanomedicina y su aplicación en la
regeneración tisular ya que como mencionan Swaminathan, Hui, Ganapathy, Suresh, Prakash,
Hande en el año 2012 es un proceso complejo en el que la piel u otros tejidos, se reparan después
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de una lesión accidental, enfermedad o intervención quirúrgica, esto implica una serie de eventos
biológicos que de acuerdo a la literatura se llevan a cabo en tres fases, la fase inflamatoria, fase
de proliferación y fase de remodelación en las cuales intervienen diversas moléculas como las
siguientes:
Factor de necrosis tumoral alfa (TNFα): Pertenece al grupo de citocinas que estimulan la
fase aguda de la reacción inflamatoria, el gen de TNF está ubicado en el cromosoma 6
Interleucina 6 (IL-6): Es una glicoproteína secretada por los macrófagos, células
T, células endoteliales y fibroblastos. Localizado en el cromosoma 7, su liberación está
inducida por la IL-1 y se incrementa en respuesta a TNFα, es una citocina con actividad
antiinflamatoria y pro inflamatoria.
Las películas delgadas de quitosano y nanopartículas de plata tienen grandes propiedades que
influyen en la pronta regeneración o reparación tisular, la plata es antibacteriana, antivírica y
antifúngica, de acuerdo al artículo publicado en el 2011 por Goycoolea, Remuñan, Alonso el
quitosano tiene propiedades como buena solubilidad, buena capacidad de biodegradarse,
mucoadhesividad, alta biocompatibilidad, baja toxicidad, disponibilidad a bajo costo,
permeabilidad al oxígeno y facilidad de modificación química, debido a estas características
se buscó comprobar su efecto en las citocinas proinflamatorias (IL-6 Y TNF-α), tomando en
cuenta investigaciones anteriores en las que se comprobó su afecto en la reparación de tejido
en un modelo experimental.
Materiales y Métodos
El diseño experimental consiste en dos etapas: la primera está relacionada con la síntesis y
caracterización de películas de quitosano y de AGNPS (Nanopartículas de plata); la segunda
etapa evalúa los efectos de curación de heridas del sistema anterior en ratones. (Véase la figura
1). Para el establecimiento de la metodología se tomó en cuenta al autor Jong-Seok, K. (2007) ya
que habla acerca de las propiedades que se obtienen al trabajar nanopartículas de plata con PVP.
La síntesis de las películas con nanopartículas de quitosano y plata se logró disolviendo 5,3 mg
del polvo polimérico en 2 ml de una solución acuosa de 1,75 × 10-2 M de ácido acético. El vaso
de precipitado que contiene esta mezcla se colocó en un baño de ultrasonidos durante 10 min para
la completa disolución del quitosano. Tres muestras diferentes fueron preparadas por la adición
de 10, 20, y 50 μl, respectivamente, de 5,224 × 10-3 M Ag dispersión coloidal a la mezcla
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anterior. Las mezclas resultantes se agitaron durante 30 min a temperatura ambiente, y
posteriormente, cada una de las tres mezclas de quitosano y AGNPS se colocó en una placa de
Petri para asegurar una gelificación completa y la solidificación de películas de quitosano ambas
técnicas de caracterización de la dispersión coloidal Ag y las películas de quitosano que
contienen AGNPS depositados se caracterizaron mediante espectros UV-Vis obtenido a partir de
un espectrofotómetro UV-Vis Varian Cary. Los espectros infrarrojos se registraron en un
espectrómetro FTIR 660 Varian con una resolución de 4 cm-1. XRD se realizó en un instrumento
difractómetro Siemens D-5000 utilizando una radiación CuK con un tamaño 0,017 los estudios
de visualización HRTEM se llevaron a cabo en un microscopio JEM2010F FasTEM que opera a
200 kV. Las muestras de películas de quitosano que contienen AGNPS depositados se preparan
por recubrimiento por centrifugación a 6000 r min-1. Estas películas estaban descansando sobre
cristales de NaCl, capturado en rejillas de cobre de malla 300, y posteriormente se secaron al aire
antes de ser analizados por HRTEM.
Protocolo de cicatrización de la herida
Se utilizaron ratones BALB / c machos con un peso de 20-22 g, fueron alojados por grupos, se
mantuvieron en una dieta de comida y agua corriente, se trataron en el bioterio de la Universidad
de Guadalajara, donde se llevaron a cabo todos los estudios con animales de acuerdo con los
principios y procedimientos descritos en la Guía Oficial de Norma Mexicana para el Cuidado y
Uso de animales de laboratorio, así como en el Manual de Manejo de Animales de Laboratorio de
la experimentación y Teaching.38 los ratones fueron anestesiados antes y durante la imposición
de las heridas experimentales. Las intervenciones quirúrgicas se llevaron a cabo en condiciones
estériles usando anestesia de ketamina (120 mg kg-1 de peso corporal). Los animales fueron
observados de cerca en busca de cualquier tipo de infección, en cuyo caso se separaron y se
excluyeron del estudio (esto es un criterio de no inclusión, con el fin de que todos los grupos de
ratones fueran completamente sanos desde el principio. La piel dorsal se afeitó con una
maquinilla eléctrica; los campos de aplicación se describen con un rotulador antes de la escisión
de la piel, y el área quirúrgica se desinfecto con una solución de etanol al 70%. En la parte
posterior de cada ratón, se hizo una herida con un diámetro de 1cm. Las muestras se dividieron
aleatoriamente en seis grupos el grupo 1, 3, 4, 5, con tres ratones cada uno, el grupo 6 con 4
ratones y el grupo 8 con 1 raton. Dos grupos de control se incluyeron (es decir, ratones sometidos
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a ningún tratamiento con la película de quitosano), mientras que el resto de los grupos recibieron
la aplicación de película de quitosano con AGNPS con tres volúmenes diferentes, es decir, 10,
20, y 50 con μl de la dispersión coloidal de Ag. Una evaluación periódica se realizó en cada
grupo experimental para la determinación de la recuperación del tejido durante el estudio, y el
área dañada se midió con un calibrador (Vernier) cada 2 días durante 12 días.
Análisis histológico
Tras el tratamiento de 12 días, los animales fueron sacrificados después de haber sido
anestesiados previamente con Zoletil 50®, y se extrajo una parte del tejido de la piel dañada para
el análisis histológico. Los tejidos extraidos de la piel se sumergieron en paraformaldehído (4%
en peso, pH 7.4) por alrededor de 5 min, después de lo cual las muestras biológicas se incluyeron
en parafina y se sometieron a hematoxilina y eosina (H & E) tinción con rojo Sirio en secciones
de 5 micras de grosor. El análisis histológico se realizó en 15 campos al azar para evaluar las
proteínas de arquitectura y fibrilares (colágeno) en el tejido de la piel de todos los grupos. El
espesor epitelial, la incidencia de los vasos sanguíneos, así como la abundancia de células
inflamatorias (IL-6 y TNF-α) y fibroblásticas fueron evaluadas. El análisis morfométrico para la
determinación del espesor neoepidermis en secciones teñidas con H y E se llevó a cabo a partir de
microfotografías obtenidas por un sistema microscópico en 20 × y 40 x evaluados mediante el
software ImageJ 1.46r. El espesor neoepidermis se midió desde la unión dermo-epidérmica a la
parte más externa de la capa granular. Tres campos al azar por animal se analizaron mediante el
objetivo 20 × y 40 x con el fin de evaluar el área de la epidermis en cada campo. Como se dijo
anteriormente, la incidencia de los vasos sanguíneos, los depósitos de la -matriz extracelular, así
como las poblaciones de células inflamatorias (IL-6 Y TNF-α) y fibroblásticas fueron evaluadas.
Del mismo modo, la proliferación celular se estimó por el análisis inmunohistoquímico utilizando
una IgG de ratón contra antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA; Abcam, MA, EE.UU.).
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Figura 1. En esta figura se muestra de manera sintetizada e ilustrada la metodología llevada a
cabo en esta investigación, con el fin de brindar una idea general de lo realizado.
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Resultados
Los resultados obtenidos en esta investigación se hicieron en dos partes la observación
macroscópica y la microscoscòpica. La macroscópica consistió en la revisión de la herida de los
ratones la cual al finalizar el periodo de 12 días en el caso de los ratones en los que se les aplico
el tratamiento tópico de 20 μl presento la herida reparada y el área casi cubierta con cabello lo
que da una idea de lo rápido que se llevó a cabo la reparación tisular, los demás ratones en los
que se ocuparon 10 μl y 50 μl de Nanopartículas de plata y quitosano en las películas delgadas
presentaron avances buenos en la reparación sin embargo no presento la reparación tan avanzada
a comparación de los ratones en los cuales se les aplico 20μl, se comprueba también la capacidad
antibacteriana, antivírica, y antifúngica de las nanopartículas de plata ya que no se presentó
ninguna infección en la herida. (Véase la figura 2). En la observación microscópica se realizó la
foto documentación de los tejidos a los que se le realizo la Inmunohistoquimicas y se observó que
en el tejido de 20 μl la citocinas IL-6 y TNF-α estuvieron presentes a pesar de que el tejido se
reparó lo que señala que el mecanismo por el cual se lleva a cabo la reparación se debe a la
intervención de otras citocinas por lo tanto este estudio sigue en proceso. (Véase la figura 3 y 4).
Figura 2. En esta serie de fotografías se demuestra el gran avance en la reparación tisular
obtenida hasta el día 12 en orden de izquierda a derecha se observa el tratamiento de 20μl 10μl y
50 μl.
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Figura 3. En esta figura se observan las fotos tomadas a los tejidos de los diferentes grupos de
ratones y el color marrón característico de las citocinas TNF-α se encuentra en las imágenes de
20 μl.
Sano Quitosano Quitosano + Ag 50μL
Quitosano + Ag 20μL
TNF-α
Quitosano + Ag 10μL
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Figura 4. En esta figura se observan las fotos tomadas a los tejidos de los diferentes grupos de
ratones y el color marrón característico de las citocinas IL-6 se encuentra en las imágenes de 20
μl.
IL-6
Sanos QuitosanoQuitosan
o + Ag 10μL
Quitosano + Ag 20μL
Quitosano + Ag 50μL
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Discusión y conclusiones
Discusión
La curación de heridas implica una serie de eventos moleculares y celulares que hay que tener en
cuenta en este estudio, se mostraron diferencias macroscópicas en los tejidos sin embargo, en las
dos citocinas que se estudiaron el mejor efecto se observó en las películas delgadas con 20μl de
dispersión coloidal de plata el resultado se pudo observar mediante una evaluación longitudinal
de la zona de la herida después de 12 días periodo en el que el tratamiento mostró que las
estructuras de la epidermis y la dermis estaban bien organizadas; la estructura del folículo piloso
fue bien formado, y la mayor parte del área de la herida estaba cubierta de pelo, en comparación
con las demás concentraciones los cuales aún presentaban la herida en proceso de reparación, de
acuerdo con Ojeda et al. El proceso inflamatorio es un fenómeno complejo inducido por
diferentes vías, y por lo tanto, hay muchas posibilidades hipotéticas por el que ocurrir la acción
anti-inflamatoria de las AgNPs Como es bien sabido, la producción de interleucina-6 (IL -6) y el
factor de necrosis tumoral (TNF) citoquinas se reconoce como un iniciador de eventos en las
alteraciones fisiológicas de la inflamación para el reclutamiento y la activación de las células
inmunes, tales como neutrófilos y macrófagos, al sitio de la infección. Además, las
nanopartículas de Ag-PVP-cubierta reducen significativamente los niveles de IL-6 y TNF. La
capacidad de las nanopartículas de Ag-PVP para regular a la baja la expresión de genes de los
niveles de IL-6 y TNF sugiere la aplicación de nanopartículas de Ag-PVP de amplios rangos de
tamaño, por lo que es un potente sistema anti-inflamatorio estas nanopartículas no sólo ajustan
los niveles de IL-6 y TNF, sino también regulan una plétora de otras citocinas y quimiocinas,
tales como el factor de IL-12, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF), IL-1α, estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), CXCL10, y CCL5, esto ha
sido comparado con los resultados obtenidos dando como errónea la idea de que el mecanismo
de reparación actué sobre interleucina-6 y factor de necrosis tumoral ya que en las
Inmunohistoquimicas estas citocinas están presentes en los tejidos de 20μl a pesar de su
reparación evidente al igual que en el estudio de Ojeda et al. El mayor efecto de reparación se
llevó en la película delgada de 20 μl de dispersión coloidal de plata y la señalización de este
mecanismo aún sigue siendo sujeto de estudio ya que como se menciona intervienen otras
citocinas y quimiocinas por las cuales podría actuar el mecanismo antiinflamatorio de la plata.
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Conclusión
El desarrollo de nuevos Nanomateriales ha permitido que a través de la Nanomedicina se mejore
el tratamiento de diversas patologías, como la cicatrización de heridas en la piel, diversos
estudios han revelado que el conjunto de Nanopartículas de plata con quitosano en concentración
de 20μL es la concentración idónea para lograr un 50% más rápido la reparación tisular debido
a que actúa en las citocinas proinflamatorias como son IL-6 Y TNF-α aun el proceso por el cual
sucede no está bien definido ya que se esperaba que la presencia de Il-6 y TNF-α fuera menor en
los ratones en los cuales se les aplico la película delgada de 20 μl ya que en estudios anteriores se
demuestra su eficacia en la reparación tisular, tal y como se muestra en los resultados, las
características y propiedades de las nanopartículas aún no son conocidas por completo por lo cual
este sigue siendo un tema de estudio relevante dentro de la Nanomedicina que abre la posibilidad
de llegar a un tratamiento de reparación tisular más innovador.
Agradecimientos
El presente trabajo de investigación fue realizado bajo la supervisión de la Dra. Irinea Yañez
Sánchez y del Dr. Francisco Javier Gálvez Gastelum, a quienes me gustaría expresar mi más
profundo agradecimiento, por hacer posible la realización de esta investigación.
A mi madre, y abuelos.
A ti mi gema preciosa por darme la vida y apoyarme en todo lo que me he propuesto por
brindarme tu amor y tu vida, a mis queridos viejos por su amor y motivación para salir adelante.
A mis hermanos.
Ustedes son los motores que me impulsan a ser mejor cada día para que siempre estén orgullosos
de mí.
A Dios por brindarme la oportunidad de vivir, por permitirme disfrutar cada momento de mi vida
y guiarme en mi camino.
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Referencias
1. Goycoolea, F.M., Remuñan, C., Alonso M. J. (2011). Nanopartículas a base de
polisacáridos: quitosano. Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela,
Santiago de Compostela.
2. Jong-Seok, K. (2007). Reducción de nitrato de plata en etanol por poli (N-
vinilpirrolidona). Colegio Nacional Iksan, Departamento de Química Industrial.
3. Ojeda, M. L., Yañez I., Velásquez, Celso., Martínez, M. M., Álvarez A., García, M. A.,
Rojas, F., Gálvez, F.J. (2015). La cicatrización de heridas con películas delgadas de
quitosano con adición de nanoesferas de plata. Centro de investigación en nanociencia y
nanotecnología, Centro universitario de los valles, Universidad de Guadalajara, Ameca,
México.
4. Swaminathan, S., Hui L., Ganapathy, B., Suresh, V., Prakash, Hande. (2012). Differential
regulation of intracellular factors mediating cell cycle, DNA repair and inflammation
following exposure to silver nanoparticles in human cells. University of Singapore,
Department of Chemistry, Faculty of Science, Singapore.