+Clostridium perfringensIntroduccin

Las superficies mucosas del organismo son la principal barrera de proteccin contra la permanente carga antignica del medio ambiente frente a la colonizacin y proliferacin de microorganismos en el tracto intestinal, siendo una de las principales puertas de entrada para los microorganismos potencialmente patgenos (Neutra et al., 2001). Sin embargo, a pesar de desarrollarse un complejo sistema de defensa, es necesario que esta respuesta no sea exagerada, establecindose un grado de tolerancia inmunolgica hacia la flora normal (Liu y Lefranois, 2004; Kaiserlian et al., 2005). Los camlidos sudamericanos, entre ellas la alpaca, son la principal fuente econmica de las comunidades altoandinas de nuestro pas. Actualmente existe una alta mortalidad y morbilidad en cras que va desde el periodo perinatal (0-7 das) hasta el destete (6-8 meses) (Martn, 2010; Rosadio, 2010). La enterotoxemia, es una enfermedad aguda responsable del 85 % de mortalidad en alpacas (More, 2013) y es causada por toxinas del Clostridium perfringens, estando implicado principalmente en el Per el tipo A y slo en algunos casos el tipo C (Maturrano y col, 2010).La presentacin cclica de la enfermedad est asociada al aumento de la precipitacin pluvial y esta relacionada con la inmunidad en masa debido a infecciones naturales, que permiten la transmisin de anticuerpos hacia las nuevas generaciones. La disminucin progresiva de la cantidad y calidad de anticuerpos incrementa la susceptibilidad en las cras de alpacas (Yaya y Rosadio, 2005).Una caracterstica biolgica determinante en la aparicin de cuadros infeccioso en cras de alpaca, es que estas nacen hipogammaglobulinmicas debido a la placentacin epiteliocorial difusa de los camlidos (Cid, 2010) y absorben las inmunoglobulinas (principalmente IgG) del calostro ingerido (Ramrez y col,. 1998). La falla en la transferencia pasiva de inmunoglobulinas presentes en el calostro ha sido asociada a la mortalidad de cras (Garmendia y col, 1987); es as que se debe garantizar una adecuada toma de calostro en las primeras 24 horas de vida, tiempo a partir del cual la absorcin del mismo disminuye en eficacia (Cid y Martn, 2010). Otra particularidad del sistema inmune de las alpacas es que presenta inmunoglobulinas G, carentes de cadena ligera (Chiok, 2012), por lo que es necesario esclarecer los mecanismos moleculares de la respuesta inmune de mucosa.El presente estudio se enfoca en que el sistema inmune de mucosas presenta su propio perfil de expresin de genes de protenas asociados frente al Clostridium perfringens y citoquinas asociadas.Para ello se caracterizar mediante tcnicas moleculares los mecanismos de la respuesta inmune intestinal en cras de alpacas frenteClostridium perfringens.Similarmente a lo que ocurre en aves, la infeccin previa con protozoarios del grupo Eimeria sp. seguida de infeccin por Clostridium perfringens suelen causar enteritis necrticas en ambas especies.La enfermedad est causada por toxinas del Clostridium perfringens estando implicado en el Per principalmente el tipo A y slo en algunos casos el tipo C (Maturrano y col, 2010). Se trata de un bacilo anaerbico esporulado (Ramrez y col, 1998) capaz de producir potentes toxinas (Fernndez-Baca, 2005) en el lumen intestinal provocando alteracin de la permeabilidad de la pared intestinal y resultando en acumulacin de fluidos y electrolitos dentro del lumen, as como la absorcin de toxinas al torrente sanguneo (Ramrez y col, 1998).

En el Per, se ha genotipificado y subtipificado aislamientos de C. perfringens obtenidos de 47 casos clnicos de enterotoxemia en cras de alpaca, diagnosticados por signos clnicos, lesiones histopatolgicas y aislamiento bacteriano. Se encontr que el 70.2% de estos aislamientos correspondieron al genotipo A (cpe-, cpb2-), el 27.7% correspondi al genotipo A subtipo cpe-cpb2+ y el 2.1% fue del subtipo cpe+ cpb2+. Este estudio ha demostrado la predominancia del genotipo A en nuestro territorio (Prez, 2006).Sobre los camlidos sudamericanos, se ha clonado y secuencia las citoquinas IFN,IL-2, IL12p35 e IL12p40 obtenindose cDNA de 501, 465, 669 y 993pb de longitud con marcos de lectura abierto codificando 166, 154, 22 y 330 aminocidos, respectivamente. El anlisis filogentico revela relacin cercana con las secuencias de mamfero del orden Artiodactyla como el cerdo y el bovino, de manera similar a lo encontrado en el camello bactriano (Odbileg y col., 2004).Recientes publicaciones sealan como agentes patgenos causantes de infecciones entricas en cras de camlidos sudamericanos menores de 7 meses de edad a la Salmonella sp., Clostridium perfringens, Rotavirus (2%), Coronavirus (42%), y ciertos parsitos como Giardia duodenalis (18%), Cryptosporidium spp (9%), Eimeria spp (13%), nemtodos (2%) (Genova y col., 2008).

Materiales y Mtodos

AnimalesLos animales fueron obtenidos de la Estacin Experimental IVITA-Marangan y de zonas aledaas a la estacin. Se emplearon dos grupos de cras de alpaca de recin nacido a 45 das de edad que provendrn bajo ciertas condiciones experimentales.

El primer grupo fue de cras sanas que fueron evaluadas bajo condiciones normales de crianza para la caracterizacin inmune de mucosas y un segundo grupo de cras nacidas de madres bajo buenas condiciones nutricionales durante el ltimo tercio de gestacin, las cuales tambin se evalu las variaciones de la expresin de citoquinas y protenas del sistema inmune de mucosas en cras con o sin estimulacin de inmungenos orales, que fueron enfrentadas al Clostridium perfringens; para lo cual se formaron grupos de animales:

a. No tratados y enfrentados al Clostridium perfringensb. Tratados (con inmungeno oral) y luego enfrentadas a Clostridium perfringensc. No tratadas y no enfrentadas a Clostridium perfringensSe emple una combinacin de Ketamina (20 mg/Kg IM) y clorhidrato de Xylacina (2 mg/Kg IM) para conseguir la anestesia general del animal. Finalmente, se aplic una sobredosis de Pentobarbital sdico (70 mg/Kg IV) produciendo en el animal un paro cardio-respiratorio Swindle (1998). Se comprobaron los signos vitales para confirmar el deceso de los animales y proceder con las necropsias y toma de muestras.

Toma de muestra

Se colect las muestras durante las necropsias realizadas a los animales. Para las tcnicas moleculares, se tomaron porciones de 2cm de longitud del segmento medio del duodeno, yeyuno e ilion de forma asptica. Los segmentos fueron inmediatamente lavados con suero fisiolgico al 0.9% estril para eliminar restos de contenido intestinal potencialmente inhibidores de las tcnicas moleculares. Los segmentos fueron colocados en crioviales estriles de 2ml de capacidad, rotulados y congelados en nitrgeno lquido (-196 C) para su transporte hacia el laboratorio.

Procesamiento de muestras

Los segmentos intestinales fueron descongelados gradualmente desde -196 C seguido de -70 C, -20 C y a 4 C. Seguidamente, se procedi a realizar el raspado profundo del tejido intestinal mediante hoja de bistur a 4 C sobre placa Petri estril. El contenido obtenido del raspado fue lavado 3 veces en PBS 0.15M pH 7.2 para eliminar restos de contenido intestinal inhibidores del PCR y el pellet final fue resuspendido en 500l de agua libre de nucleasas y congelado a -70 C hasta la extraccin de ARN total.

Extraccin de ARN

Se emple para la extraccin el reactivo TRIZOL (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este mtodo se basa en el uso de una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidina para la lisis de las clulas y la separacin de la muestra en dos fases (acuosa y orgnica), seguida de la extraccin y precipitacin del ARN total con cloroformo e isopropanol respectivamente a partir de la fase acuosa. Brevemente, los pellets fueron incubados a temperatura ambiente por 3 minutos con el reactivo para luego adicionarles cloroformo fro. Tras centrifugar, se tom la fase acuosa de la mezcla y el ARN total fue precipitado con alcohol isoproplico fro, centrifugado e inmediatamente lavado con Etanol fro al 70%. Finalmente, el ARN fueresuspendido en 60l de agua libre de nucleasas y almacenado a -70 C hasta su uso en el RT-PCR.

Sntesis de ADNc (Transcripcin reversa)

El ARN obtenido de cada una de las muestras fue tomado como templado para la sntesis de ADNc (ADN complementario) empleando el kit SuperScriptTM III First-StrandSynthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, USA), segn las instrucciones del fabricante. El kit emplea la transcriptasa reversa MuLV H+ para generar ADNc a partir de molculas de ARN templado en las muestras y viene provedo de dNTP, hexmeros al azar (0.2M, concentracin final) y sales para optimizar la reaccin.

PCR Tiempo Real

Se emple el ADNc de cada una de las muestras como templado para la reaccin de PCR con el kit SuperScriptTM III First-StrandSynthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La reaccin PCR utiliza la polimerasa hotStartTaqPlatinum modificada para mayor estabilidad contenida en 2x qPCR Master mix que contiene SYBR Green II, buffer, 5mM de MgCl2, dNTP mix (0,2 M concentracin final) y como referencia pasiva se utiliz ROX 50x tambin provedo por el kit. Los oligonucletidos fueron diluidos en agua libre de nucleasas para obtener soluciones de trabajo de 10 M de forma que su concentracin final en la reaccin fue de 0.2 M en todos los casos.

Anlisis estadstico

Para el nmero de animales en estudio, se determino si las variables a analizar seguan la distribucin normal, empleando la prueba de Shapiro Wilk. Para estimar si la diferencias entre los individuos tratados en comparacin con los no tratados, y el anlisis segn grupo etario, fueron estadsticamente significativas, se emple la prueba no paramtrica U de Mann- Whitney-Wilcoxon. Los resultados se presentan como la mediana de las variables, y los rangos promedios de cada una de las variables fueron utilizados para realizar el anlisis estadstico. Todas las pruebas fueron realizadas en el programa estadstico STATA 12.Referencias:

Chiok K. 2012. Expresin de Citoquinas de la respuesta TH1 (Ifne Il2) y TH2 (Il4 e Il10) en mucosa intestinal de cras de alpaca (Vicugna Pacos) sanas y con Enteropata. Tesis para optar el Grado Acadmico de Magster en Ciencias Veterinarias con mencin en Salud Animal.Kaiserlian D, Cerf-Bensussan N, Hosmalin A. 2005. The mucosal inmune system from control of inflammation to protection againt infections. J. Leukoc. Biol. 78: 311-318.

Liu Z, LefranoisL. 2004. Intestinal Epithelial Antigen Induces Mucosal CD8 T cell Tolernce. Activation and Inflammatory Response. The Journal of Inmunology. 173: 4324-4330.

Martin C, Pinto C, Cid M. 2010. Camlidos sudamericanos: estado sanitario de sus cras. Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 4(1): 37-50.

More J. 2013. Efecto de antgenos clostridiales con cido retinoico sobre la expresin de citoquinas de la respuesta inmune humoral y celular de la mucosa intestinal de cras de alpacas (Vicugna pacos). Tesis para optar el Grado Acadmico de Magster en Ciencias Veterinarias con mencin en Salud Animal.

Neutra MR, Mantis NJ, Kraehenbuhl JP. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat Immunol 2001; 2 (11): 1004-9.

Ramrez A. 1987. Alpaca Clostridium perfringens type Aenterotoxemia: purification and assays of the enterotoxin. PhD Thesis. USA: Colorado StateUniversity. 201 p

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Yaya K, Rosadio R. 2005. Ensayo de tres programas de vacunacin anticlostridial en alpacas. RevInvVet Per; 16 (1):49-55.

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49. (Maturrano y col, 2010).Kim-tesis de maestria50. (Cid, 2010) 51. (Ramrez y col,. 1998). 52. (Garmendia y col, 1987); 53. (Cid y Martn, 2010).