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EXPRESIÓN DE CAIX, GLUT-1 y HK II Y SU POSIBLE ASO CIACIÓN CON

CANCER ESCAMOCELULAR INVASIVO DE CUELLO UTERINO

SCHYRLY ANDREA CARRILLO Código: 597796

Magíster en Genética Humana

DIRECTOR

PABLO MORENO ACOSTA .Ph.D Investigador Grupo de Biología del Cáncer

Instituto Nacional de Cancerología

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA MAESTRIA DE GENÉTICA HUMANA

BOGOTA; D.C 2010

2



SCHYRLY ANDREA CARRILLO Maestría de Genética Humana

DIRECTOR

PABLO MORENO ACOSTA .Ph.D Investigador Grupo de Biología del Cáncer

Instituto Nacional de Cancerología

ASESORES

ALFREDO ROMERO ROJAS MD. Patólogo

OSCAR ANDRES GAMBOA GARAY MD. Estadístico

JINETH ACOSTA. MD Patóloga

INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA MAESTRIA DE GENÉTICA HUMANA

BOGOTA; D.C 2010

3



NOTA DE ACEPTACIÓN

____________________________

____________________________

____________________________

Firma del presidente del Jura do

____________________________

Firm a del Jurado

_____________________________

Firma del Director ____________________________

Bogotá; D.C; Noviembre de 2010

4

DEDICATORIA

A Dios por impulsarme a continuar el camino de la ciencia, con el apoyo de una gran mujer como lo es mi Madre, quien con su infinita paciencia y amor me ha ayudado en los diferentes trayectos de mi vida.

5

AGRADECIMIENTOS Laboratorios del Grupo de investigación en Biología del Cáncer (GIBC), de Inmunohistoquímica (IHQ) en el área de patología y área de Bioestadística del Instituto Nacional de Cancerología (INC), al área de patología y a la Maestría de Genética Humana de la Universidad Nacional de Colombia (UNAL). Doctor Pablo Moreno Acosta, PhD, (GIBC) por darme la oportunidad de desarrollar este trabajo bajo su dirección, guía en el quehacer científico y permitirme hacer parte del grupo de investigación de Biología en Cáncer. Doctor Alfredo Romero, MD. Patólogo Oncólogo del INC, por su participación en la lectura de Inmunohistoquímica. Doctor Oscar Gamboa, MD. Bioestadista del INC, por su colaboración y tiempo dedicado para realizar los análisis estadísticos. Doctora Jineth Acosta, MD. Patóloga de la UNAL, por su participación en la lectura de Inmunohistoquímica. Doctor Alejandro Giraldo, MD. PhD. Director de la Maestría de Genética Humana (UNAL), por su apoyo en momentos claves de mi carrera. Laboratorio IHQ (INC): Adrey González, Yuli Castro, Yuli Gómez y Luli. González, por ayudarme en la realización del proceso de Inmunohistoquímica. Compañeros y amigos del GIBC: Mónica Molano. PhD, Alba Combita. PhD, María Mercedes Bravo.MSc Carolina Martín, Msc. por convertirte en mi amiga y cómplice, escucharme, aconsejarme y apoyarme para salir adelante con la maestría, el proyecto de tesis y el trabajo en el INC. Josefa Rodríguez, Andrés Quiroga, Diana Nuñez, Esperanza Trujillo (Panchita), Oscar Buitrago, Antonio Huertas, Elizabeth Martínez, Diego Duarte.

6

Docentes de la Maestría: Cristina Alava, Sandra enciso, Mónica Guzmán, Harvy Velasco, Edgar Garavito, Mauricio Rey, Clara Arteaga, Indiana Bustos, por el conocimiento y la orientación que me brindaron sobre Genética. Compañeritas de Maestría: Carolina Martín, Diana Nuñez, Martha De Olano, Jacqueline Ladino, María Eugenia Chamorro y Claudia Méndez, por los momentos que compartimos. Secretaria de la Maestría: Islena Bonilla, por su inmensa colaboración y estar pendiente de los procesos a seguir para cumplir con los requisitos de mi carrera. A todas aquellas mujeres que aceptaron hacer parte de la investigación en cáncer, porque hicieron posible el desarrollo de este trabajo.

7



RESUMEN

En Colombia, el cáncer de cuello uterino ocupa el primer lugar en incidencia,

siendo la principal causa de muerte en mujeres. La mayoría son diagnosticadas

en estadios avanzados IIB y IIIB, tratadas con radioterapia exclusiva o

radioterapia concomitante a quimioterapia. El 40-70% de las pacientes no

responden a estos tratamientos por factores como el microambiente tumoral,

caracterizado por los fenotipos hipóxico, glicolítico y acidosis. En este entorno,

las células tumorales presentan cambios en la expresión de genes y proteínas,

favoreciendo así su supervivencia frente al tratamiento. En esta investigación

se evaluó mediante inmunohistoquímica la expresión de las proteínas CAIX,

GLUT 1, HKII y su posible relación con la respuesta al tratamiento, en una

cohorte retrospectiva de 66 pacientes en estadios IIB y IIIB, tratadas con

radioterapia exclusiva y radioterapia concomitante a quimioterapia. Se encontró

un mayor incremento en la expresión de GLUT 1 (74%), seguido de CAIX

(41%) y HKII (18%). El análisis estadístico de variables clínico-patológicas

como niveles de hemoglobina (Hgb) mostró una diferencia significativa entre

los pacientes con respuesta y no respuesta al tratamiento (p=0.0127),

pacientes con Hgb≤11 g/dl mostraron un riesgo de tener una menor

supervivencia libre de enfermedad (4.33; p= 0.02). La expresión de GLUT 1 y

co-expresión de GLUT 1, CAIX y HKII mostraron una tendencia de riesgo de no

respuesta al tratamiento, sugiriendo que GLUT 1 es necesario para la

progresión del tumor y es un elemento pre-existente al tratamiento que puede

influir en la respuesta como lo describen otros estudios.

Palabras Claves: cáncer de cuello uterino, CAIX, GLUT 1, HKII, radioterapia exclusiva, radioterapia concomitante con quimioterapia.

8

EXPRESSION OF CAIX, GLUT 1, HKII AND ITS POSSIBLE ASSOCIATION WITH SQUAMOUS CELL CANCER INVASIVE CERVICAL.

ABSTRACT

In Colombia, cervical cancer ranks first in incidence, remains the leading cause

of death in women. Most are diagnosed in advanced stages IIB and IIIB, treated

with radiotherapy only or radiotherapy concurrent with chemotherapy. 40-70%

of patients do not respond to these treatments by factors such as the tumor

microenvironment, characterized by the phenotypes hypoxic, glycolytic and

acidosis. In this environment, tumor cells show changes in the expression of

genes and proteins, thus promoting their survival in treatment. In this research

was evaluated by immunohistochemistry the expression of proteins CAIX,

GLUT 1, HKII and its possible relationship to treatment response in a

retrospective cohort of 66 patients with stages IIB and IIIB, treated with

exclusive radiotherapy and radiotherapy with chemotherapy. We found a

greater increase in the expression of GLUT 1 (74%), followed by CAIX (41%)

and HKII (18%). The statistical analysis of clinic pathologic variables such as

hemoglobin (Hgb) showed a significant difference between responders and 11

g / dl showed a≤non-response to treatment (p=0.0127), patients with Hgb lower

risk of disease-free survival (4.33, p=0.02). The expression of GLUT 1 and co-

expression of GLUT 1, CAIX and HKII showed a trend of risk of treatment

response, suggesting that GLUT 1 is required for tumor progression and is a

pre-existing treatment may influence in the response as described by other

studies.

Keywords: cervical cancer, CAIX, GLUT 1, HKII, exclusive radiotherapy or concomitant chemotherapy.

9

TABLA DE CONTENIDO Pag. RESUMEN

iv

INTRODUCCIÓN

1

1. PLANTEAMIENTO 3 1.1 PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3 2. HIPÓTESIS OPERATIVA 6 3.

OBJETIVOS

7

3.1 OBJETICO GENERAL 7 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 7 4.

MARCO TEÓRICO

7

4.1 CANCER DE CUELLO UTERINO 7 4.1.1 Clasificación 9 4.1.2 Tratamiento 12 4.1.2.1 Seguimiento 15 4.1.3 Factores pronósticos relacionados con respuesta a tratamiento 16 4.2 IMPLICACIONES BIOLOGICAS y MOLECULARES EN CANCER

CERVICAL 17

4.2.1 Infección por el virus del papiloma humano 17 4.2.2 Fenotipos del tumor 18 4.2.2.1 Estudios clínicos sobre CAIX, GLUT1 HKII como marcadores en

Cáncer de cuello uterino (CCU). 28

5.

METODOLOGIA

31

5.1 DISEÑO DEL ESTUDIO 31 5.1.1 Consideraciones éticas 31 5.2 SELECCIÓN DE LAS PACIENTES 32 5.2.1 Criterios de inclusión 33 5.2.2 Criterios de Exclusión 33 5.3 DETECCIÓN POR INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ) DE LA

EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS CAIX, GLUT-1 Y HKII 33

5.3.1 Clasificación histopatológica 33 5.3.2 Inclusión de los tejidos en parafina 34 5.3.3 Anticuerpos 35 5.3.4 Controles 35 5.3.5 Técnica de Inmunohistoquímica (IHQ) 35 5.4 EVALUACIÓN DE LA TINCIÓN IHQ 35 5.5 DETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO 36 5.5.1 Respuesta mediata 36 5.5.2 Supervivencia 37 5.6 MÉTODOS ESTADÍSTICOS 37 6. RESULTADOS 39 6.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICO- HISTOPATOLÓGICAS 39 6.2 EXPRESIÓN POR INMUNOHISTOQUÍMICA (IHQ) DE LAS

PROTEÍNAS CAIX, GLUT1 Y HKII 41

6.2.1 Comparación de la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII

43

6.3 RESPUESTA AL TRATAMIENTO 44

10

6.3.1 Respuesta mediata al tratamiento 45 6.3.2

Respuesta al tratamiento y expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII.

45

6.4 POSIBLE ASOCIACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON LAS VARIABLES CLÍNICO-PATOLÓGICAS Y LA EXPRESIÓN.

46

6.5 CORRELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES CLÍNICO-PATOLÓGICAS, LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS Y LA RESPUESTA INCOMPLETA AL TRATAMIENTO.

48

6.5.1 Niveles de hemoglobina (Hb) y expresión de GLUT1. 50

6.6 POSIBLE CORRELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES CLÍNICAS Y EL PRONOSTICO DE SUPERVIVENCIA

51

6.6.1 Expresión de CAIX, GLUT1 y HKII y supervivencia 52 7.

DISCUSION

55

7.1 EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS CAIX, GLUT1 Y HKII 55 7.1.1 Expresión de GLUT1, CAIX, HKI y fenotipos del tumor 56 7.2 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO 59 7.2.1 Expresión y respuesta mediata 60 7.2.3 Expresión y supervivencia 61 7.3 RESPUESTA AL TRATAMIENTO Y VARIABLES CLÍNICO-

PATOLÓGICAS. 62

7.4 NIVELES DE HEMOGLOBINA Y LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO 62 8.

CONCLUSIONES

63

9.

RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS

65

ANEXOS

Anexo 1 DATOS DE LAS PACIENTES INCLUIDAS EN EL ESTUDIO 66

Anexo 2 ESCALAS DEL INDICE KARFSNOFSKY Y ECOG 67 Anexo 3 PROTOCOLO DE INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ) 69

BIBLIOGRAFIA

70

11

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Incidencia por cáncer de CCU en Colombia.

8

Figura 2. Progresión de una lesión cervical benigna hacia cáncer cervical invasivo.

10

Figura 3. Modelo propuesto para la progresión de cáncer de cuello uterino invasor.

19

Figura 4. Modelo sistemático de la estructura de GLUT-1 en membrana celular.

23

Figura 5. Modelo sistemático de la estructura Proteica de HKII

25

Figura 6. HKII clave para la producción de energía requerida por las células malignas en cáncer.

26

Figura 7. Acidosis como parte del microambiente tumoral.

28

Figura 8. Histología de los tumores.

40

Figura 9. Controles positivos usados en la estandarización del protocolo de inmunohistoquímica (IHQ).

41

Figura 10. Casos representativos de la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII por IHQ, en carcinoma escamocelular de CCU.

42

Diagrama 1. Selección de las 66 pacientes incluidas en el estudio.

32

12

INDICE DE TABLAS Y GRAFICAS

Tabla 1. Clasificación Histológica de tumores epiteliales de cuello uterino

10

Tabla 2. Estadios FIGO para cáncer de cuello uterino

11

Tabla 3. Descripción de los Anticuerpos (Ac) utilizados en la IHQ 35

Tabla 4. Escalas de valoración por inmunohistoquímica para las proteínas CAIX, GLUT-1 Y HKII

36

Tabla 5. Resumen de las pruebas estadísticas 38

Tabla 6. Características de las pacientes 39

Tabla 7. Descripción histológica de los tumores 40

Tabla 8. Expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII. 44

Tabla 9. Expresión de las proteínas en relación al estadio FIGO. 44

Tabla 10. Asociación entre las variables clínico-patológicas y la expresión de las proteínas con la respuesta al tratamiento.

47

Tabla 11. Análisis de regresión logística en el grupo de respuesta incompleta al tratamiento (n=13).

50

Tabla 12. Análisis Cox de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia Global.

53

Grafica 1. Incidencia y mortalidad por cáncer de CCU en Colombia 8

Grafica 2. Comparación entre los niveles de expresión de CAIX, GLUT1 y HKII 43

Grafica 3. Expresión de CAIX, GLUT 1 y HKII en el grupo respuesta completa y respuesta incompleta

46

Grafica 4. Niveles de Hemoglobina (Hb) y respuesta al tratamiento 48

Grafica 5. Niveles de Hb en función de la expresión de GLUT1.

51

Grafica 6. Supervivencia en pacientes con carcinoma escamocelular de cuello uterino.

54

13

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial el cáncer de cuello uterino (CCU) ocupa el tercer lugar entre las

neoplasias que afectan a la mujer, con una incidencia de 529. 000 casos reportados

para el 2008 en Globocan por la agencia internacional para investigación en cáncer

(IARC). La incidencia estimada para Colombia es de 21,8 casos nuevos por 100.000

mujeres al año, siendo la primera causa de muerte que afecta la mujer en edad

reproductiva. 1,2

En países en vía de desarrollo (Colombia), el índice de mujeres con CCU invasivo, es

más alto respecto a países desarrollados, donde gracias a la implementación y

adecuada aplicación de programas de tamizaje mediante citología se ha disminuido su

incidencia y mortalidad hasta en un 75%. 1,3

Clínicamente el CCU invasivo se clasifica en cuatro estadios FIGO, considerándose el I

como etapa temprana de la enfermedad y II, III y IV enfermedad localmente

avanzada. El Instituto Nacional de Cancerología (INC) para el 2008, reportó 641

(11,8%) casos nuevos, de los cuales 92 casos (14,4%) fueron estadio IIB y 133 casos

(20,7%) estadio IIIB, 4,5 considerándose estos estadios avanzados los más frecuentes.

Las mujeres con CCU en estadios IIB y IIIB son tratadas con radioterapia exclusiva o

con radioterapia concomitante con quimioterapia. 6-9 El modelo terapéutico que se elija

depende de la condición clínica de la paciente, valorada a través de exámenes

rutinarios para el diagnóstico de la enfermedad. Los dos tratamientos se dan con

intención curativa, con la finalidad de eliminar el volumen tumoral, utilizando

radiaciones ionizantes que se aplican en dos fases: la teleterapia (radiaciones a

distancias de 30-100cm de la zona abdominopélvica de la paciente) y la braquiterapia

(radiaciones directas sobre el tumor) en diferentes tasas de dosis medidas en cGY o

GY. 4 En los casos que se da radioterapia concomitante a quimioterapia (esquema

neoadyuvante), se administra vía endovenosa el fármaco cisplatino, un agente

anticancerígeno con acción citotóxica. 10 La evidencia que existe sobre la efectividad de

dichos tratamientos en CCU, indica que la supervivencia a 5 años de pacientes tratadas

solo con radioterapia oscila entre el 25% al 80 %, siendo la mortalidad

aproximadamente del 18.6%. 11,12 Por otra parte en pacientes manejadas con

radioterapia y quimioterapia la supervivencia oscila entre un 40% a un 90%,

disminuyendo la mortalidad aproximadamente a un 8.9%. 4,13 De acuerdo con estos

datos, entre un 40% a un 70% de los casos la terapia puede no ser efectiva.

14

Algunas de las investigaciones clínicas realizadas en CCU, 14-19 señalan que existe una

asociación significativa entre la respuesta al tratamiento y factores del fenotipo

tumoral, como cambios en la expresión génica, proteica y metabólica, los cuales

también se han considerado en experimentos biológicos dirigidos a evaluar el micro-

ambiente del tumor y mecanismos moleculares que lo regulan.

Los fenotipos característicos del micro-ambiente tumoral son la hipoxia (bajos niveles

de oxigeno hasta 1%), la glicólisis aumentada y la acidosis (pH bajo). 20,21 Bajo estas

condiciones las células malignas emplean vías metabólicas alternas a las que

comúnmente utilizan células normales para suplir sus necesidades, adaptarse, y

favorecer así su proliferación y supervivencia. El modelo hipotético propuesto para el

desarrollo tumoral de CCU invasivo incluye dichos fenotipos,22,23 que acompañan el

proceso de desarrollo hacia cáncer invasivo. Este inicia con la aparición de lesiones

neoplásicas como consecuencia de la infección por VPH (virus papiloma humano ) en la

zona de transformación del tejido epitelial del cuello uterino, 24,25 las cuales mantenidas

en el tiempo continúan hasta formar el carcinoma in situ, caracterizado por excesiva

proliferación celular, que da lugar a la condición hipóxica.1,3,26-29 Esta se conserva

durante la siguiente etapa de invasión celular (cáncer invasivo), en la que se hacen

evidentes los fenotipos glicolítico y de acidosis. Junto con estos eventos,22,30,31 se

modula la expresión de proteínas, algunas de ellas consideradas con posible valor

pronóstico en CCU, como las que se evaluaron en este estudio: CAIX (anhidrasa

carbónica), GLUT-1 (Transportador de glucosa 1) y HKII (Hexoquinasa II).1,3,32-35

CAIX es considerada un marcador endógeno de hipoxia, condición bajo la cual

incrementa su expresión, regulada a través del factor inducible por hipoxia tipo 1(HIF-

1).36,37 Su expresión también puede depender de factores como: bajo nivel de glucosa

(en el cual se impide su expresión),36,38 bajo nivel de bicarbonato 36,39 y la densidad

celular36,40. Además tiene importancia a nivel del fenotipo de acidosis por su

participación en regulación del pH extracelular del tumor.

GLUT-1, es otra proteína importante que se suma al desarrollo del CCU, al

igual que CAIX, participa en progresión maligna, invasión, metástasis y se asocia con

mal pronóstico de la enfermedad.41 Su expresión se ha visto incrementada en lesiones

precursoras de CCU y en CCU invasivo (estadios I-IV). Esta se ha encontrado

relacionada con el grado de diferenciación del tumor, bajo nivel de oxígeno

(considerado por ello otro marcador endógeno de hipoxia) y el incremento de la

captación de glucosa, que se ha valuado en tumores CCU in vivo, mediante PET

15

(tomografía por Emisión de Positrones).19,35,42 También se ha encontrado que tiene una

asociación significativa con bajas tasas de supervivencia libre de enfermedad y

supervivencia global. 43 Las investigaciones que han evaluado el consumo de glucosa

por PET y su relación con la expresión de GLTU 1 en CCU, discuten la importancia que

puede tener la enzima HKII (Hexokinasa II), ya que participa en la transformación de

la glucosa a glucosa-6-fosfato durante la glicólisis44,45 y desempeña un papel en

inhibición de apoptosis y muerte celular, a través de su estabilización y unión a

membrana mitocondrial. Por esto se cree que su actividad esta incrementada,

ayudando al mantenimiento del fenotipo maligno celular, lo que supone su

contribución en proliferación y supervivencia celular en cáncer.19,22,46,47

En conclusión las publicaciones que relacionan estas proteínas apuntan a que puedan

ser consideradas como biomarcadores, planteando que podrían servir en pronóstico de

pacientes con cáncer y posiblemente en la generación de nuevas estrategias

terapéuticas para su manejo. Por lo tanto se propuso en este trabajo realizar un

tamizaje de su expresión proteíca en cáncer de cuello uterino invasivo, utilizando

Inmunohistoquímica (IHQ), una técnica que se ha consolidado como esencial en el

diagnóstico patológico por su significancia pronóstica y de utilidad clínica para la

identificación de marcadores en muestras tisulares como en este caso, biopsias

tumorales de mujeres con cáncer de cuello uterino.

1. PLANTEAMIENTO

1.1 PROBLEMA Y JUSTIFICACIÒN

En Colombia las tasas de incidencia y mortalidad continúan siendo elevadas a

causa del cáncer de cuello uterino (CCU), por lo que se considera un problema de

salud pública.

Las mujeres con CCU invasivo, dependiendo del estadío clínico en que se encuentren

son tratadas con diferentes esquemas terapéuticos, como: la cirugía, la radioterapia

exclusiva y la radioterapia concomitante a quimioterapia. En todos los casos el manejo

se realiza con intensión curativa, sin embargo, se ha visto que la respuesta al

tratamiento varía entre las pacientes.

16

Se ha visto que quienes son tratadas con cirugía, la tasa de respuesta es muy buena,

representada en la tasa de supervivencia a 5 años que oscila en un 80- 90%. En el

grupo de mujeres sometidas a radioterapia exclusiva o concomitante a quimioterapia

que están en estadios invasivos avanzados II y III, se ha encontrado que las tasas de

respuesta no son muy buenas, como lo refleja la disminución de las curvas de

supervivencias global y libre de enfermedad, calculándose aproximadamente un 40%-

70% de pacientes que no responden al tratamiento (11 -12, 23,24).

De acuerdo a investigaciones que han evaluado el proceso del desarrollo a CCU

invasivo, se conocen diferentes factores que podrían estar involucrados en la respuesta

al tratamiento, unos están relacionados con la condición clínica de la paciente como:

los bajos niveles de hemoglobina (anemia) y funcionamiento del sistema inmunológico

y otros implican el estatus del tumor, como el grado de diferenciación y el micro-

ambiente tumoral que reúne componentes de tipo biológico, fisiológico, químico y

genético.

Respecto al micro-ambiente tumoral, ensayos experimentales indican que se trata de la

presencia de fenotipos adaptativos, conocidos como hipóxico, glicolítico y acidosis, los

cuales permiten a las células malignas diferenciarse, proliferar y sobrevivir,

conllevando así a que la enfermedad sea más agresiva. Bajo dichas condiciones

ocurren cambios en la expresión de genes y proteínas, de los cuales algunos se han

propuesto como marcadores pronósticos en CCU. Entre ellos el factor inducible por

hipoxia alfa (HIF-1α), el cual bajo hipoxia se estabiliza y ayuda en la activación del

HIF-1, un factor modulador de la expresión de aproximadamente 70 genes, algunos de

los cuales participan en procesos metabólicos como glicólisis y acidosis.

De esos genes se ha considerado para este trabajo, evaluar la expresión proteica de

tres: la anhidrasa carbónica (CAIX), el transportador de glucosa tipo 1 (GLUT-1) y la

hexoquinasa II (HK II ó HK2). Se han seleccionado estas proteínas, teniendo en cuenta

que tienen relación con los fenotipos antes mencionados y porque estudios clínicos

sobre CCU realizados en países desarrollados, han mostrado que su expresión está

incrementada, relacionándose con progresión de la enfermedad y aparición de

metástasis luego de tratamiento, y con pobres tasas de supervivencia, por lo que se

propone podrían ser marcadores útiles en pronóstico.

Las evidencias sobre las tres proteínas muestran que su elevada expresión es

dependiente del bajo nivel de oxigeno en el tumor, específicamente CAIX y GLUT-1 se

han caracterizado como marcadores endógenos de hipoxia al igual que HIF-1α. Por

17

otra parte también hay una dependencia del aumento de glicólisis, como en el caso de

GLUT-1 y HKII, dado que participan durante dicho proceso, el cual es utilizado por las

células malignas, estratégica y activamente como vía alterna para suplir la necesidad

energética que requieren en su proliferación y supervivencia para ayudar en el

desarrollo del tumor. Sumado a este proceso participa también la CAIX, la cual es

dependiente de cambios en el pH intra-celular y extra-celular (acidosis), los cuales a su

vez son mediados por la aparición de hipoxia y el incremento de glicólisis.

Algunos estudios de asociación han demostrado que la hipoxia y los cambios

metabólicos a nivel del tumor, son mecanismos que están asociados con resistencia al

tratamiento de radioterapia, y con disminución de la eficacia de drogas citotóxicas

como el cisplatino, empleado en protocolos de quimioterapia neo-adyuvante a

radioterapia para el manejo de CCU.

En general son contadas las investigaciones en las que se ha evaluado la expresión de

dichas proteínas en CCU relacionándolas con tratamiento, en ellas se muestran datos

sobre supervivencia global a 5 a años y/o supervivencia libre de enfermedad y/o

supervivencia libre de metástasis.43,48-50 En ninguna se describe como tal la relación

entre la expresión de las proteínas y la respuesta a los tres meses de finalizar el

tratamiento (respuesta mediata), la cual se valora en ginecología y radioterapia,

considerando el volumen tumoral final comparado con el inicial medido antes del

tratamiento, teniendo en cuenta los criterios establecidos por la OMS (Respuesta

completa, parcial, sin respuesta, progresión de la enfermedad).

En la literatura Colombiana no existen reportes sobre la expresión de CAIX, GLUT-1 y

HKII y su relación con la repuesta al tratamiento en cáncer de cuello uterino. El único

reporte conocido sobre marcadores evaluados en este tipo de cáncer y respuesta a

tratamiento, esta descrito en un resumen sobre el estudio de la expresión génica de

IGF-IR como biomarcador de respuesta a radioterapia en pacientes con cáncer de

cuello uterino localmente avanzado, en el cual se encontró que su expresión se asocia

a la falta de respuesta al tratamiento (p= 0.04), además de observarse una relación

entre la expresión de GAPDH e IGF-IR y coexpresión de IGF-IR e IGF-II bajo

condiciones de hipoxia anémica, demostrando una posible activación de una vía

glicolítica como respuesta al requerimiento metabólico de las células tumorales. Este

trabajo fue realizado por Moreno y col. (2007)18 en el Instituto Nacional de

cancerología, quien posteriormente da continuidad a su trabajo con la propuesta de

18

evaluar otros marcadores como GAPDH, GLUT-1,HIF-1α, ERCC1 y Survivina, y con la

dirección del presente estudio para evaluar dos marcadores adicionales,CAIX y HKII.

Teniendo en cuenta los anteriores trabajos y estudios en los que se considera la

importancia de identificar posibles biomarcadores predictores de respuesta a

tratamiento, su papel en la progresión del tumor y su potencial uso como blancos

terapéuticos, se realizó la presente investigación, utilizando la técnica de

Inmunohistoquímica aplicada al diagnóstico de tumores, para explorar, describir la

expresión proteica de CAIX, GLUT-1 y HK II en 66 biopsias de pacientes colombianas

con CCU, diagnosticadas en el Instituto Nacional de Cancerología entre 2001 y 2006 y

estudiar su posible relación con la respuesta mediata al tratamiento.

Se espera que los resultados de este trabajo, permitan proponer estudios futuros con

una muestra poblacional más amplia para hacer análisis de mayor profundidad en la

parte biológica, enfocados a cómo podría ayudarse a mejorar los esquemas de

tratamiento para favorecer la respuesta mediata y las supervivencias global y

supervivencia libre de enfermedad, en pacientes con CCU tratadas con Radioterapia

exclusiva o concomitante a quimioterapia.

2. HIPÓTESIS OPERATIVA

Ho = Hay incremento en la expresión de las proteínas CAIX, GLUT-1 y HK II en

biopsias de pacientes con cáncer de cuello uterino escamocelular invasivo

avanzado.

H1 = No hay incremento en la expresión de las proteínas CAIX, GLUT-1 y HK II en

biopsias de pacientes con cáncer de cuello uterino escamocelular invasivo

avanzado.

3. OBJETIVOS

19

OBJETIVO GENERAL

Estudiar la expresión de las proteínas CAIX, GLUT-1 y HKII en tejido tumoral de

mujeres con cáncer escamocelular invasivo de cuello uterino y la respuesta al

tratamiento.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

• Evaluar la expresión de las proteínas CAIX, GLUT-1 y HKII, en tejido escamocelular

invasivo de cuello uterino de tumores en estadios invasivos IIB-IIIB y en tejido

normal de cuello uterino.

• Determinar si existe una posible relación entre la expresión de las proteínas CAIX,

GLUT-1 y HKII en tejido de cáncer de cuello uterino invasivo.

• Correlacionar la expresión de las proteínas analizadas con variables clínico-

patológicas descritas para las pacientes con carcinoma escamocelular de cuello

uterino invasivo y la respuesta al tratamiento.

4. MARCO TEORICO

4.1 CÁNCER DE CUELLO UTERINO

De acuerdo al reporte global de la agencia internacional para la investigación en

cáncer (IARC), Globocan 2008 a nivel mundial el cáncer de cuello uterino (CCU) por su

incidencia ocupa el séptimo lugar entre todos los tipos de cáncer descritos y es el

tercero entre las neoplasias que afectan a la mujer. El estimado es de 5029,000 casos

nuevos de al año, de los cuales 2390 corresponden a Sur América, clasificada como

una región de alto riesgo por esta enfermedad.2,51 Aproximadamente el 80% de los

casos se presentan en países en vía de desarrollo,1,2 entre ellos Colombia, donde por su

frecuencia ocupa el segundo lugar entre las neoplasias que afectan a la mujer

(Grafica 1) . Presenta una de las más altas incidencias de CCU respecto a otros

20

países (Figura 1) , con 21,5 casos nuevos por 100.000 mujeres, (4.736 casos) y la tasa

de mortalidad es de 10 casos al año (2.154 muertes).1,6

Grafica 1. Incidencia y mortalidad por cáncer de CCU en Colombia GLOBOCAN 2008–IARC. http://globocan.iarc.fr/factsheets/populations/factsheet.asp?uno=170#WOMEN

Figura 1. Incidencia por cáncer de CCU en Colombia. GLOBOCAN 2008–IARC. http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/ce

En el año 2002 el Instituto Nacional de Cancerología (INC) en Bogotá-Colombia,

reportó el CCU como el cáncer más frecuente, entre todos los canceres diagnosticados

21

en mujeres, reportando 750 casos (23.4%) de los cuales el 39,7% fueron estadios

avanzados IIIB y IVA.1 Posteriormente para el 2008 el INC indica que continua la

incidencia con 641 (11,8%) casos nuevos de CCU, de los cuales el 1.6% fueron estadio

IA (10 casos), el 15.6% estadio IB (100 casos), el 1.4 % estadio IIA (9 casos), el

14.4% estadio IIB (92 casos), el 0,9% estadio IIIA (6 casos), el 20.7% estadio IIIB

(133 casos), el 2.7% estadio IVA (17 casos) y 0.8 estadio IVB (5 casos).4,5 Como se

observa los estadios invasivos avanzados que se presentan en mayor número son IIB y

IIIB, tenidos en cuenta para este trabajo.

En países desarrollados es bajo el porcentaje de CCU invasivo, se han logrado

disminuir significativamente las tasas de incidencia y mortalidad hasta un 75%, gracias

a la adecuada implementación de la citología como técnica de tamizaje, para la

detección temprana de lesiones neoplásicas, controlando así el paso hacia cáncer.

Situación contraria ocurre en países poco desarrollados como el nuestro donde es

elevado el porcentaje de mujeres con cáncer de cuello uterino invasivo avanzado, lo

que constituye un problema de salud pública.1,7

4.1.1 Clasificación

En el diagnóstico del CCU invasivo son considerados la clasificación

histopatológica y el estadío clínico del tumor.

El cuello del útero (cérvix uterino) está formado por dos zonas: el exocérvix que está

recubierto por epitelio escamoso estratificado y el endocérvix recubierto por una capa

de epitelio cilíndrico (columnar) y glándulas. La unión exoendocervical

(escamocolumnar), denominada zona de transformación es el lugar donde suceden

cambios neoplásicos asociados a VPH (Virus de papiloma Humano), clasificados en

lesiones de bajo grado (NICI) y alto grado (NICII, NICIII). De acuerdo a la historia

natural del CCU, la lesión NIC III es precursora del desarrollo a carcinoma in situ, el

cual no detectado y tratado a tiempo se convierte en cáncer invasivo (figura 2). El

CCU invasivo se define como la presencia de uno o más grupos de células malignas,

que rompen la membrana basal del epitelio del cuello uterino y penetran al estroma

subyacente, conllevando a la formación del tumor. Esas células se caracterizan por

variaciones en la maduración citoplasmática e irregularidades nucleares que se

observan en la citología con coloración de Papanicolaou (Pap).7,24

22

FIGURA 2. Progresión de una lesión cervical benigna hacia cáncer cervical invasivo.

Fuente adaptada por Carrillo Schyrly para este trabajo, fue tomada de http://www.albany.edu/cancergenomics/faculty/jaguirre/research.html.

De acuerdo a las células que conforman los tumores en CCU, existen dos tipos

de clasificación, que son: el carcinoma escamocelular (células escamosas) y el

adenocarcinoma (células glandulares), de los cuales existen variaciones, descritas en la

tabla 1. Un 85-90% de los casos de cáncer CCU son de tipo escamoso, originados en

la zona de transformación.52,53

Tabla 1. Clasificación Histológica de tumores epiteliales de cuello uterino Tomado de Benda, JA, 1994 Y FIGO, 2009.54,55

Respecto al grado de diferenciación histopatológico, los tumores se clasifican en

tres grados: G1: bien diferenciados. G2: moderadamente diferenciados, G3: poco

diferenciados. Al respecto se ha reportado que mujeres menores de 35 años con

23

tumores pobremente diferenciados presentan una disminución significativa en la

supervivencia global.17

A partir de 1969 con el descubrimiento de la historia natural del CCU, surge su

clasificación clínica, basada en el estadio tumoral. Desde entonces se fueron

estableciendo diferentes sistemas de clasificación, que permitieron implementar la

nomenclatura actualmente utilizada.55 En el momento hay tres sistemas de clasificación

para su estadificación, que son: el M.D. Anderson, el TNM del AJCC y FIGO

(Internacional Federation of Gynecology and Obstetrics). Este último establecido en

1985 define los criterios más aceptados para CCU y se utiliza en el INC, de acuerdo a

los parámetros que sigue son cuatro estadios clínicos para CCU (I-IV), los cuales se

dividen así: el estadio I en estadios IA (IA1, IA2) y IB (IB1, IB2), el estadio II en

estadios IIA (IIA1, IIA2) y IIB, el estadio III en estadios IIIA y IIIB y el estadio

IV en estadios IVA y IVB. Las características de cada uno se resumen en la tabla

2.8,23 Se ha considerado que cuando el CCU se encuentra en estadio I la enfermedad

esta en etapa temprana y es avanzada en los estadios II al IV.

Tabla 2. Estadios FIGO para cáncer de cuello uterino

La profundidad de invasión al estroma, se mide desde la base del epitelio. Tomado de FIGO COMMITTEE ON GYNECOLOGIC ONCOLOGYC. 54

En los estadios avanzados IIA-IVB, se observan variaciones de tumores según su

localización, los hay exofíticos, endofíticos y la combinación exo-endofítica. Los

ESTADIO DESCRIPCIÓN 0 Carcinoma-in situ, carcinoma intraepitelial I Carcinoma limitado estrictamente la cuello uterino IA Carcinomas invasores sólo diagnosticados por microscopio

IA1 Invasión del estroma de no más de 3mm de profundidad y una extensión no mayor de 7 mm

IA2 Invasión del estroma de más de 3mm pero no más de 5mm de profundidad y no mayor de 7 mm de diámetro

IB Lesiones clínicas limitadas la cuello uterino o lesiones preclínicas mayores que en la etapa IA2

IB1 Lesiones clínicas de no más de 4 cm de diámetro IB2 Lesiones clínicas mayores de 4 cm de diámetro

IIA No hay compromiso obvio del parametrio pero se encuentra la vagina afectada hasta los 2/3 superiores

IIA1 Lesiones clínicas de no más de 4 cm de diámetro IIA2 Lesiones clínicas mayores de 4 cm de diámetro

IIB Compromiso parametrial pero sin llegar a la pared pélvica implica que el carcinoma se ha extendido a la pared pélvica, o el tumor afecta el tercio inferior de la vagina. Se deben incluir todos los casos con hidronefrosis o con insuficiencia renal, a menos que se deba a otras causas

IIIA Sin extensión a la pared pélvica, pero sí al tercio inferior de la vagina IIIB Extensión a la pared pélvica, hidronefrosis o insuficiencia renal. Implica que el carcinoma ha

afectado clínicamente la mucosa vesical y/o rectal ó se ha extendido más allá de la pelvis IVA Extensión del tumor a la mucosa de vejiga y/o recto IVB Metástasis a distancia

24

tumores exofíticos son los más comunes (63%), se caracterizan por invadir la

superficie, la mayor parte de su masa se proyecta hacia la luz vaginal y adoptan una

apariencia de coliflor con excrecencias pólipoideas o papilares. Por lo general son

masas friables (deshacen fácilmente) y con frecuencia necrosadas. Los tumores

endofíticos son menos comunes (36%), infiltran profundamente el estroma,

distorsionan el cuello uterino, y forman zonas induradas (endurecidas) o nódulos

superficiales. El aspecto del cuello toma forma de barril y se aumenta su tamaño. La

variedad exo-endofítica se observa con ulceraciones, infiltración profunda al estroma

subyacente. Todas las variantes, suelen sangrar facilmente, síntoma asociado a anemia

y con frecuencia se necrosan, proceso asociado a hipoxia tumoral.56

4.1.2 Tratamiento

Para considerar el tipo de tratamiento que deben recibir las pacientes de CCU

se tiene en cuenta la clasificación clínica del estadio tumoral. A continuación se

describen los tratamientos que hasta el momento se utilizan.

Lesiones preinvasoras (estadio 0): Se utilizan técnicas conservadoras que

preservan la fertilidad de la mujer, como: cirugía con rayo láser, conización (extracción

de tejido en forma de cono) y electro-cirugía. En estos casos la tasa de recurrencia es

baja (10-15%) y la progresión a enfermedad invasiva es rara.7

Enfermedad invasiva: Hay tres tipos de tratamiento: cirugía, radioterapia exclusiva y

radioterapia concomitante a quimioterapia. A mujeres en estadios tempranos IA1 y IA2

se les realiza histerectomía (cirugía para extraer el útero solo o con tejidos vecinos

según el caso), vía abdominal o vaginal. En estadios avanzados IB y IIA, el tratamiento

estándar es la histerectomía radical total dada la afección a ganglios linfáticos. Las

tasas de supervivencia con este tipo de tratamiento oscilan entre un 80-90%.7 Cuando

el tumor sobrepasa los 4 cm se da radioterapia exclusiva.

En estadios avanzados IIB, IIIA, IIIB y IVA los tratamientos con intención curativa son

la radioterapia exclusiva y la radioterapia concomitante a quimioterapia y las tasas de

supervivencia oscilan ente el 40% y el 70%. Pacientes que llegan a estadio IVB reciben

radioterapia exclusiva con intención paliativa.4

25

RADIOTERAPIA

Es un procedimiento que utiliza radiaciones ionizantes, proporcionadas en

fracciones con el fin de reducir el riesgo de lesión del tejido normal y aumentar la

acción terapéutica en tejido tumoral. Esas fracciones se dan en dos sesiones:

Teleterapia: se aplica a distancias de 30 a 100 cm de la paciente, dividida en

20-30 tratamientos separados al día durante 4-6 semanas. Maneja energía de

magavoltaje, preferiblemente con fotones de 6 MeV que se dirigen al volumen tumoral

y la enfermedad ganglionar pélvica. Considera 2 a 4 campos (antero-posterior y/o

laterales). El fraccionamiento de 180 – 200 cGy, 5 veces a la semana hasta una dosis

que oscila entre 4500 – 5040 cGy. Dosis de refuerzo a parametrios con protección de

línea media hasta completar una dosis entre 6000 – 7000 cGy en puntos B (situado

sobre el eje transversal que pasa por los puntos A).

Braquiterapia: Son radiaciones a corta distancia dirigidas directamente sobre

el tumor a través de aplicadores radiactivos (radioisótopos: 222 Radio, 137 Cesio y 192

Iridio.) que se introducen en la vagina y cavidad uterina,10 tales como: sonda

intrauterina, ovoides o cilindro intravaginal. Las dosis de braquiterapia pueden ser de

baja tasa (dosis entre 40 y 200 cGys/hora) o de alta tasa (dosis mayores de 1200

cGys/hora) 4 Los cGY (equivalente a 1 rad) miden la cantidad de energía absorbida por

unidad de masa (tejidos).10

La braquiterapia de baja dosis se da después de terminar la teleterapia. La paciente

recibe la radiación en cGy calculada para los puntos A (situados a 2 cm del centro del

canal del útero). Si se contempla un segundo implante (punto B), éste debe realizarse

dentro de las tres semanas siguientes de haber completado la radioterapia. La

braquiterapia de alta dosis se suministra en puntos A, repartidas en 5 fracciones cada

una de 600 cGy, concomitante con la teleterapia, iniciándola la cuarta semana de

tratamiento, realizando un implante semanal.7

El principio biológico que utiliza la radiación consiste en los efectos directos e

indirectos que produce. Los primeros son debidos a la interacción y absorción de la

radiación por alguna macromolécula como el DNA, RNA, proteínas, enzimas, entre

otras, transformándolas en estructuras anormales. Los efectos indirectos se producen

por la absorción de la radiación ionizante por el medio en que están suspendidas las

macromoléculas, en el que interviene el agua como mediador principal, para la

26

formación de partículas secundarías como iones y radicales libres los cuales interactúan

con los ácidos nucleicos y están asociados a estrés y muerte celular. Se ha visto que la

letalidad celular se relaciona con el número de rupturas de cadena doble y sencilla del

DNA nuclear. La capacidad de las células para repararlas varía entre tejido normal y el

tipo de tumor.

La sensibilidad de los tejidos a la radioterapia depende de su habilidad para reparar el

daño de la radiación, repoblar y re-oxigenar. La habilidad de repoblar es importante,

porque las células rápidamente se dividen reemplazando las células muertas por

radiación. En el caso de carcinomas escamosos se ha encontrado que dicha habilidad

es muy marcada lo que repercute en el fallo del tratamiento con radiación.10

Como los tumores crecen, desarrollan nuevos vasos sanguíneos para nutrir las células

que lo conforman. Esos vasos sanguíneos son de naturaleza primitiva por lo que el

suministro de sangre es insuficiente para abastecer todo el tumor, debido a esto

aparecen áreas necróticas, caracterizadas por contener células hipóxicas, las cuales

son una fuente de radio-resistencia. Sin embargo, puede suceder que durante la

radioterapia se reoxigenen, volviéndose sensibles a la radiación (10).

En el CCU la radioterapia al igual que la cirugía, se da para eliminar la enfermedad

presente en el cuello del útero, en los tejidos locales (tejidos paracervicales) y en los

ganglios regionales.7 Sin embargo, se ha observado que las tasas de supervivencia a 5

años que varían entre pacientes, son bajas. En el caso del estadio IIB la supervivencia

es de un 50-80% y de un 25-50% para el estadio IIIB.11,12

QUIMIOTERAPIA

Hasta 1999 la radioterapia exclusiva fue el tratamiento estándar para CCU en

estadios IIB-IVA, desde entonces hasta la actualidad se implementó la quimioterapia

como tratamiento concomitante a la radioterapia como esquema neoadyuvante (previo

al tratamiento principal).10 Los agentes quimioterapéuticos empleados actualmente son

citotóxicos y actúan tanto en tejido maligno como tejido normal. En el cáncer de CCU

se utilizan derivados del platino como el cisplatino, un agente alquilante (causa daño

en el DNA celular) que actúa en la fase G2 y la transición de la fase G1 a S,

bloqueando proliferación celular.10

Estudios de meta-análisis indican que este tipo de tratamiento en CCU, ayuda a

aumentar el control local de la enfermedad, las tasas de supervivencia, a reducir la

27

metástasis y la mortalidad en un 29% si se compara con la respuesta a radioterapia

exclusiva.57

En un estudio de ensayo clínico realizado en el Instituto Nacional de Cancerología

(INC) entre 2000 y 2001, con la participación de 100 pacientes con CCU en estadio

IIIB, distribuidas aleatoriamente a radioterapia exclusiva o concomitante con

quimioterapia (40 mg/m2 de cisplatino - 6 ciclos), se encontró que el porcentaje de

muerte fue mayor en el grupo de radioterapia exclusiva (18,6% vs. 8,9%) y la curva

de supervivencia fue más alta para el grupo de radio-quimioterapia.5,7 Respecto a las

tasas de supervivencia a 5 años con este tipo de tratamiento en relación al estadio del

tumor, el INC ha reportado un porcentaje del 75% para estadios II y de menos del

50% en estadio III y IV.23,24

Solís y col en 20079 en su investigación con pacientes con CCU en estadio IIIB,

describen que cuando las pacientes no reciben el tratamiento completo por no

realizarse braquiterapia y solo recibir 5 ciclos de cisplatino, las supervivencias global

(SG), la libre de enfermedad (SLE) y la libre de recurrencia loco-regional (SLRLR),

disminuyen presentando tasas del 68,8%, 66,3% y 83,1%,respectivamente.

En resumen el INC muestra que el 32% de los estadios avanzados (II, III y IV),

representan entre el 40 -50% de la tasa de supervivencia a 5 años luego de recibir los

tratamientos convencionales antes mencionados.

4.1.2.1 Seguimiento.

El régimen de vigilancia de las pacientes tratadas se efectúa cada 3 meses

durante el primer año, y comprende: exploración ginecológica, toma citológica,

examen colposcópico y eventual biopsia cervical. Posteriormente se pasa a una

vigilancia cada 6 meses durante los primeros 5 años, para seguir con un examen anual

el resto de la vida.7

4.1.3 Factores pronósticos relacionados con respuesta a tratamiento

En CCU así como en otros modelos, se ha demostrado que los tumores son

sensibles a radioterapia sea tipo exclusiva o concomitante a quimioterapia, de modo

28

que la respuesta al tratamiento es completa, considerando los 5 años de supervivencia

sin recurrencia de la enfermedad. Sin embargo se ha visto que entre pacientes hay

variabilidad en la respuesta dado que los tumores pueden presentar resistencia a la

radiación y a los agentes terapéuticos.58 Cabe precisar por ello que a pesar de los

avances en el tratamiento, la mortalidad continúa siendo muy alta en mujeres con

CCU.

Al respecto numerosas variables clínico patológicas se han estudiado como valor

pronóstico, tales como: el estadio clínico, tamaño del tumor, grado de invasión,

espacio linfo-vascular comprometido y la extensión del tumor más allá del cuello

uterino. De ellos se han considerado el tamaño y el estadio tumoral como indicadores

de pronóstico.59,60 Kim y Col sugieren que los médicos para determinar un tratamiento

en pacientes con CCU en estadio FIGO III deben considerar que esta etapa comprende

subgrupos heterogéneos de acuerdo a la extensión del tumor, como lo observaron en

su estudio.61

Otros factores pronósticos que participan en procesos biológicos, se han estudiado por

relacionarse con resistencia al tratamiento, tales como: el nivel de Hemoglobina (Hb),

la hipoxia tumoral, y el incremento de la glicólisis.

El nivel de Hb, es un factor contribuyente en la oxigenación de los tumores y tiene que

ver con la curación del cáncer.28,62-64 En tumores sólidos la oxigenación es limitada,

característica que reconocieron Tholimson y Gray hace 50 años, como resultado de la

proliferación exagerada de las células malignas, restringiéndose su crecimiento

alrededor de 10 células por vaso sanguíneo, lo cual implica gradientes de O2 cada vez

menores, conllevando a hipoxia (bajo nivel de O2) y en algunos casos anoxia (ausencia

de O2).65 El incremento de hipoxia regula la expresión de genes y proteínas que

permiten al tumor volverse más agresivo, contribuyendo con la resistencia a los

tratamientos, la disminución del control local de la enfermedad y con pobre

supervivencia.66

Junto con la hipoxia, en los tumores el metabolismo alterado cuenta como una de las

modificaciones biológicas que desempeñan un papel importante en cuanto al tema de

radio-resistencia. Especialmente se ha visto que la glicólisis se incrementa favoreciendo

el suplemento energético requerido por las células para que ellas proliferen y se

mantengan su supervivencia, ello con ayuda de la participación de un numero de

proteínas, algunas de ellas consideradas importantes en el desarrollo de CCU y

propuestas como posibles marcadores en pronóstico de esta enfermedad.

29

Estos factores biológicos se explicarán más adelante en detalle, en el tema de los

fenotipos tumorales.

4.2 IMPLICACIONES BIOLÓGICAS y MOLECULARES EN CANCER CERVICAL

4.2.1 Infección por el virus del papiloma humano

El principal agente etiológico causante del cáncer de cuello uterino es el VPH

(Virus papiloma Humano). Su transmisión se da principalmente por contacto sexual,

asociada a conductas de riesgo como: el inicio precoz de relaciones sexuales, el

número de parejas (promiscuidad), la multiparidad, el uso de anticonceptivos orales

(relación con adenocarcinomas), el tabaco y algunos factores genéticos.23

Se estima que aproximadamente entre el 75% y el 80% de los adultos

sexualmente activos ha padecido una infección por este virus durante su vida.67 En

individuos inmunocompetentes, la infección por VPH es asintomática siendo la mayoría

de estas (70-90%) controladas y en algunos casos donde la infección conduce a

lesiones escamocelulares de bajo grado (NICI), es frecuente la regresión

espontánea.52,68 Tan sólo un bajo porcentaje de las infecciones persistentes (10-15%),

con un mismo tipo de VPH oncogénico, están asociadas con un mayor riesgo de

desarrollar lesiones neoplásicas e incluso cáncer invasivo.69,70 Dicho proceso ocurre

lentamente como muestran estudios de tipo longitudinal en los que entre un 30% y el

70% de las pacientes con cáncer cervical in situ no tratadas, desarrollarán carcinoma

invasor en un período de 10 a 12 años.52 El mecanismo que explica la aparición de la

enfermedad varios años después de la infección está asociado al resultado de la

integración del DNA viral dentro del DNA del huésped, los efectos combinados entre los

genes de VPH, en particular, las oncoproteínas E6 y E7, y una serie de eventos

genéticos y epigenéticos en los genes celulares.71-73

En algunos estudios se ha observado que hasta un 28% de todas las mujeres pueden

tener infección oculta por VPH.74 En tumores invasores de CCU se ha identificado la

existencia de ADN del virus en un 99.7%.25

Numerosos estudios epidemiológicos han mostrado que el desarrollo de CCU se asocia

particularmente con virus VPH de alto riesgo. De acuerdo con su potencial oncogénico,

15 tipos de VPH han sido clasificados como virus de alto riesgo (16, 18, 31, 33, 35, 39,

45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82), tres como posiblemente de alto riesgo (26, 53 Y

66) y 12 de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108) 75,76. El

VPH 16 es el tipo más prevalente y se encuentra en aproximadamente un 60% de las

30

biopsias de CCU.77 En pacientes Colombianas con cáncer invasivo se ha detectado VPH

16 en un 57.6 - 69.9%.(78 76)

4.2.2 Fenotipos del tumor

El fenotipo maligno que adquieren las células de cáncer se da como resultado

de cambios a nivel bioquímico, molecular y por transformaciones de tipo funcional que

en ellas ocurren, viéndose reflejados en la capacidad que tienen para evadir los

mecanismos reguladores de su crecimiento y favorecer al mismo tiempo su continua

proliferación y supervivencia. Este proceso es considerado una ventaja adaptativa, que

de acuerdo a los avances en genómica, proteómica y bioquímica y se ha logrado

explicar por: el uso de estrategias metabólicas alternas a las que comúnmente

emplearían las células normales, disfunción de la mitocondria, la alteración de

oncogenes que contribuyen en el control de vías metabólicas y como respuesta

adaptativa al micro-ambiente tumoral.21,31

Ese microambiente observado en tumores sólidos que permite a las células

adaptarse a condiciones que resultarían ser no benéficas para células de tejidos

normales,20,31 se caracteriza por presentar condiciones de hipoxia, aumento de

glicólisis,vascularización alterada, estrés oxidativo, alcalinización y acidosis, todas ellas

dependientes de los niveles de una serie de factores tales como: nutrientes (oxigeno,

glucosa, entre otros), pH, y precursores que participan en procesos metabólicos. Bajo

este contexto se han definido tres(3) fenotipos propios de progresión tumoral que son:

el fenotipo hipóxico, el fenotipo glicolítico y la acidosis.22,31 En el modelo de progresión

para CCU, se observan esos fenotipos (figura 3), en los que se da la transformación

de células normales del tejido epitelial del cuello uterino a células neoplásicas por

lesiones VPH, las cuales si persisten en el tiempo, favorecen la formación de células

tumorales que progresan hacia CCU. Durante este proceso se da lugar a la formación

del tumor, que es beneficiado por la aparición de los tres fenotipos mencionados y por

el incremento de la expresión de una serie de genes y proteínas.

Otro evento asociado con la formación del tumor es la presencia de mutaciones en

células malignas que contribuyen en la generación de variantes o clones celulares que

son funcionalmente más especializados y permiten la progresión de un fenotipo más

agresivo.20,31

31

Algunos autores plantean además que la alteración genética de precursores

involucrados en vías de señalización ayuda en la formación de células tumorales, bajo

el control del micro-ambiente del tumor.21,31,45 Entre esas vías están: la vía ERK

(extracellular signal-regulated kinase) y la vía PI3K-AKT (phosphatidylinositol-3-

kinase), ellas tienen que ver con la promoción del crecimiento y supervivencia celular y

son las que mayormente están afectadas en cáncer.

Figura 3. Modelo que se ha propuesto para la progresión de cáncer de cuello uterino invasor (Tomado de Lee et al. 2008) 22

(Células del epitelio proliferan, conllevado a hipoxia. Esta ayuda a incrementar la expresión de genes, como. HIF-1α, asociado a hipoxia. GLUT-1 asociado al transporte de glucosa y consumo energético, requerido por las células invasoras. CAIX asociado a resistencia a apoptosis y la ventaja de romper la membrana basal y acceder a vasos sanguíneos y linfáticos para hacer metástasis. 22

Fenotipo Hipóxico

La condición más comúnmente hallada en tumores sólidos es la hipoxia (bajos

niveles de oxigeno hasta 1% en un rango de pO2 < 5 mm Hg ).20,21,79 Investigaciones

en las que han evaluado el estatus de oxigenación de tumores de tipo carcinoma

escamocelular de cuello uterino localmente avanzado, muestran que un 60% de su

área es hipóxica y/o anóxica.22,80 Por tanto el promedio de pO2 (presión parcial

oxigeno) es substancialmente bajo oscilando entre 10 mmHg y 16 mm Hg (1.3 % pO2

ó 2.1% O2) al compararse con tejido normal cervical de pacientes nulíparas en quienes

los valores promedio de pO2 están entre 40 mmHg y 60 mmHg (5.3–7.9% pO2).29,62,81

32

Bajo la condición de hipoxia ocurre la activación del factor de transcripción inducible

por hipoxia 1 (HIF-1),3,45 la cual se lleva a cabo por la unión entre las dos

subunidades proteicas que lo conforman: HIF-1αααα y HIF-β.β.β.β.29,47

La proteína HIF-1αααα se ha considerado un marcador endógeno de hipoxia, ya que su

actividad depende del bajo nivel de oxigeno, condición bajo la cual se estabiliza y se

trasloca al núcleo para unirse a HIF-1ββββ. Por el contrario HIF-1α α α α bajo condición de

normoxia (niveles normales de oxigeno en un rango de 10 y 70 mm Hg) se localiza en

el citoplasma celular, donde es degradada rápidamente vía proteasoma (mecanismo

que regula la degradación de proteínas en las células). Su degradación ocurre por la

hidroxilación del dominio ODDD (dominio de degradación dependiente de oxigeno), de

los aminoácidos prolina localizados en las posiciones 402 y/o 564, que llevan a cabo

enzimas PDHs (hidroxilasas de prolina), entre ellas la isoforma PDH2 que actúa como

sensor/dependiente de la pO2, en respuesta a la activación de HIF-1 y a hipoxia. La

otra proteína HIF-1ββββ/ARNT (receptor nuclear translocador aryl hidrocarbono) se

encuentra localizada en el núcleo, donde espera a que se transloque HIF-1α para

unirse a ella y así conformar el complejo HIF-1 activo.15,45

Estudios sobre HIF-1 han demostrado que modula la expresión de aproximadamente

70 genes, de los cuales algunos están asociados con el fenotipo glicolítico, acidosis y

angiogenesis (neo-vascularización), entre los que estan: CAIX (CAIX) (anhidrasa

carbónica 9), GLUT1 (Transportador de glucosa tipo 1), HK II (Hexoquinasa II), y

VEGF (Factor de crecimiento endotelial vascular).47 Estos desempeñan un papel

importante en la adaptación de las células malignas para el establecimiento de tumores

sólidos primarios, la progresión de enfermedad y la estimulación de angiogénesis,

proceso de vital importancia en el suplemento de nutrientes de tumores sólidos.82

CAIX al igual que HIF-1α se le ha considerado un marcador endógeno de hipoxia, ya

que bajo esta condición es fuertemente inducida, como lo demuestra un estudio de

análisis serial comparativo de la expresión entre 24,500 genes.36,37,83 Resultados

similares mostrados por otro estudio con células HeLa (células inmortales de cáncer

cervical), señalan que CAIX fue la primera en detectarse 4h después de exposición a

hipoxia, manteniéndose este efecto por aproximadamente 38h. Por esto los autores

proponen que probablemente CAIX puede ser un marcador en evaluación de hipoxia

crónica pero para medir hipoxia aguda.39,83 Además se ha encontrado que la expresión

de CAIX está asociada con proliferación celular y a su vez se correlaciona con

33

pronóstico,83,84 hallazgo que apoya el proceso de progresión tumoral bajo hipoxia.

Resultados contradictorios muestran que el patrón de expresión de CAIX no está

relacionado con proliferación medida a través del marcador Ki-67.29,81,83

Además de la hipoxia, la expresión de CAIX depende de otros factores como: bajo nivel

de glucosa (en el cual se impide su expresión),38,83 bajo nivel de bicarbonato 39,83 y la

densidad celular.40,83

A pesar del amplio conocimiento sobre hipoxia, aún faltan aspectos por dilucidar como

el de si la hipoxia puede generar un fenotipo agresivo tumoral o el fenotipo agresivo

tumoral genera la hipoxia?.22,27,80

Hipoxia tumoral y su relación con el nivel de hemoglobina

La presencia de hipoxia en tumores sólidos es una preocupación a nivel clínico

por su impacto negativo en el pronóstico de la enfermedad y respuesta al tratamiento

en cáncer. Tanto estudios experimentales como clínicos sugieren que hay una relación

directa entre la disminución de los niveles de hemoglobina y disminución de

oxigenación en el tumor.85 En tumores sólidos de tipo escamocelular (incluyendo CCU)

se ha observado que el máximo nivel de oxigenación ocurre cuando el rango de

hemoglobina (Hb) es de 12g/dL <cHb<14g/dL en el caso de mujeres. Por el contrario

bajo condición de anemia se disminuye el nivel de oxigenación del tumor. Este hallazgo

tiene especial consideración cuando las pacientes van a ser tratadas.62

El CCU es el clásico ejemplo en el que la hipoxia está relacionada con el nivel de Hb y

el control del tumor.85 Las evidencias demuestran que bajos niveles de Hb (anemia),

están asociados con un desfavorable control local de la enfermedad y

supervivencia,62,64,86 por tanto el estatus de oxigenación del tumor se ha establecido

como factor relevante influyente en la respuesta al tratamiento para control del

tumor.58,85,87,88 Los estudios que confirman estos hallazgos, han encontrado una

correlación significativa entre el nivel de O2 del tumor y el de Hb durante el tratamiento

de las pacientes. En pacientes con CCU uterino tratadas con radioterapia exclusiva o

radioterapia más quimioterapia utilizando cisplatino, se ha visto que hay un aumento

significativo en la supervivencia a medida que se elevan los niveles de hemoglobina

(variando de 1g/dL hasta 10.0g/dL), optimizándose cuando el rango esta entre 11g/dL

- 12.0 y por encima de este valor, sin significancia.63,87

34

Sin embargo, es controversial si la Hb es un factor pronóstico en cancer, ya que

algunos estudios no han encontrado una correlación significativa con hipoxia tumoral

(pO2 < 5mg) previo a tratamiento de radioterapia (RT) o radio-quimioterapia (CT/RT)

en CCU. Además porque algunas investigaciones sugieren que el efecto adverso de

anemia es debido a la enfermedad avanzada.62,64,89

Fenotipo glicolítico

En cáncer el fenotipo glicolítico (incremento de glicólisis) puede darse tanto en

condiciones de normoxia (glicólisis aerobia) como en hipoxia (glicólisis anaerobia).

Usualmente las células tumorales presentan este perfil metabólico alterado. Quien lo

observó por primera vez fue por Otto Warburg en 192031 en sus estudios comparativos

entre células cancerígenas y normales, hallando bajo condición de normoxia un notable

incremento de la glicólisis, la cual propuso como propiedad universal y principal causa

de las células cancerígenas, que denominó “Efecto Warburg”.90,91

En células normales la glicolisis es una vía que aporta aproximadamente el 10%

de la energía, a través de la conversión del metabolito glucosa en ATP, el 90%

restante de energía es producido por la mitocondria a través de la fosforilación

oxidativa. En secciones tumorales se ha visto que aproximadamente el 50% de la

energía es producida por la glicolisis. La tasa de glicolisis se eleva con el fin de suplir la

necesidad energética que las células malignas requieren para mantener su potencial

proliferativo.92 Esa producción lleva consigo un incremento en el consumo de glucosa

para hacer más eficiente la producción de ATP.

En células normales de la mayoría de mamíferos, la glicólisis depende del continuo

suplemento de glucosa como recurso predominante para la generación de ATP. En

cuanto a la cantidad, la glucosa libre es poca y la mayor parte de ella a nivel

intracelular se encuentra en forma fosforilada gracias a enzimas hexokinasas o

almacenada en forma de glicógeno.93 Por ser una molécula hidrófila, no es capaz de

traspasar la membrana de las células, por ello su internalización la llevan a cabo

proteínas transportadoras de glucosa como: GLUT-1 (transportador de glucosa tipo 1),

a través del proceso de difusión facilitada en favor del gradiente de concentración de

glucosa interno celular, mecanismo independiente de energía.32

GLUT-1 también conocido como 2A (SLC2A), hace parte de una familia

conformada por 13 proteínas GLUTs (transportadores de glucosa), cuya característica

común es su estructura (figura 4), en la que se encuentran 12 dominios

35

transmembranales, los dos extremos amino y carboxi-terminal localizados en el

citoplasma celular y un oligosacarido en el primer loop extracelular, sitio donde se lleva

a cabo la glicosilación (adición de carbohidratos para hacer parte de la superficie y

transportar glucosa).94,95

Figura 4. Modelo sistemático de la estructura de GLUT-1 en membrana celular (Tomado de Thomas Amann & Claus Hellerbrand, 2009) 22

Los dominios transmembranales están marcados del 1 al 12. El sitio de glicosilacion (N) y se muestran los dominios de unión – ATP (ABD)

GLUT-1 se encuentra expresado en tejidos humanos fetales como: el cerebro y la

placenta y en tejidos adultos normales como:la barrera hematoencefálica, colon,

pulmón, estomago, esófago, riñón, seno, piel y sus anexos.35,43,94

En algunos tipos de cancer como el colorectal, de esófago, hepático, de ovario, de

pulmón de células no pequeñas, de vejiga urinaria, renal, escamocelular oral, hueso,

de tejidos blandos, endometrio, de cuello uterino, se ha visto que su expresión se

incrementa, asociándose a proliferación celular, progresión tumoral, metástasis, pobre

pronóstico 41 y resistencia a terapia, por lo que se le ha considerado un marcador y un

blanco de intervención terapéutica.35 En estudios de CCU, la expresión de GLUT-1 se

eleva tanto en lesiones pre-invasoras como en cáncer invasivo, por lo que se le

considera desempeña un papel importante durante el desarrollo de este tipo de

cáncer.17

Hasta el momento se conoce que el aumento de la expresión de GLUT-1 además de

ser dependiente de la necesidad del transporte de glucosa, puede ser modulada por

HIF-1activo en condición de hipoxia y por la vía de señalización Akt/PI3K, activada por

insulina y factores de crecimiento, que están asociados con el estimulo del

metabolismo de glucosa.21,96 En ausencia de factores de crecimiento el precursor

36

kinasa Akt es activado por la molécula mTOR (mammalian target of rapamycin),

ayudando a mantener la expresión de GLUT-1 en superficie de membrana21 y

participando en antiapoptosis.21,30 Este efecto Akt en favor de la supervivencia celular

depende de la disponibilidad de glucosa y de su metabolismo, en células tumorales ,

en las que es suficiente para mediar el cambio de metabolismo oxidativo a la forma

glicolítica.17,21

Junto con el incremento de la expresión de GLUT-1, se han encontrado cambios en la

actividad basal y en los niveles de expresión de enzimas que participan en la vía de

glicólisis, entre las que esta la Hexokinasa (HK).97

HK es la enzima que cataliza el primer paso de la glicólisis, convirtiendo la

glucosa a glucosa-6-fosfato, para evitar que de nuevo se externalise por difusión a

través del transporte bidireccional. En células de mamíferos hay 4 isoformas de Hk (I,

II, III, IV),46,97,98 que son especificas de tejido. La HKIV también conocida como

glucocinasa, solo se ha hallado en hígado y páncreas, la HKI predomina en cerebro, y

la HKII, sensible a Insulina, se ha hallado en músculo esquelético y tejido

adiposo.46,97-99 La expresión de las proteínas HKI y HKII se ha visto incrementada en

células tumorales 100-102 y en cultivo celular se ha visto que protegen contra muerte

inducida por estrés oxidativo,102,103 por lo que se cree tiene importancia en cáncer. La

HKII es la mayor forma que se ha encontrado sobre-regulada en varios tipos de

cáncer21,46,97,98 tales como: seno, pulmón, páncreas, tiroides y carcinoma

hepatocelular.33,104-107 De manera significativa se le ha encontrado incrementada en

canceres que exhiben el “efecto Warburg” y se ha encontrado implicada en

inmortalización de células cancerigenas.98,108

La estructura proteica descrita para HKII (figura 5), presenta en su extremo N

terminal una secuencia de 21 aminoacidos que se considera necesaria y suficiente para

unirse a mitocondria, y sus dos mitades amino y carboxi terminales tienen una

interacción funcional catalítica importantes en la fosforilación de glucosa.102

37

Figura 5. Modelo sistemático de la estructura Proteica de HKII Esquema elaborado por Schyrly Carrillo, tomando como referencia a Sun y col.102

En HKII Las dos mitades N y C (amino y carboxi), interaccionan entre si de manera funcional y tienen actividad catalítica, son importantes en fosforilación de glucosa. 102

Esta enzima puede hallarse localizada en citoplasma por su participación en glicólisis 21

y en la membrana externa mitocondrial,46 (figura 6), donde se une a la proteína

VDCA (canal aniónico dependiente de voltaje), la cual conforma el mPTP (Poro

transición permeable mitocondrial), requerido en la cascada desencadenante del

proceso de apoptosis. A este nivel se ha planteado la unión HKII-VDAC causa el cierre

del mPTP, evitando la translocación de Bax y liberación de Cyto C para apoptosis. En el

caso contrario, si se desplaza HKII hay apoptosis,109-112 por tanto se ha considerado

esta enzima importante en supervivencia celular.96,113,114

En modelos experimentales In Vitro donde se ha visto que la actividad de HIF-1α es

necesaria para los efectos que media Akt en el metabolismo de glucosa y

tumorogénesis, también se ha encontrado una marcada activación de HKII.22,31 En

estudios in vivo utilizando PET (Tomografía de emisión de positrones) para medir el

consumo de glucosa en tumores de pacientes con CCU mediante de la captación de 18F-FDG (18 F-Fluorodesoxiglucosa un sustrato que compite con la glucosa), se ha

planteado la posibilidad de que HKII este incrementada ya que participa en la

transformación de glucosa a glucosa- 6- fosfato en glicolisis al igual que se ha

observado una elevada expresión del transportador de glucosa GLUT-1,19,22,33 sin

embargo, el mecanismo exacto que explicaría esta hipótesis aún se debate al igual que

su importancia como blanco terapéutico.115

En conclusión el fenotipo glicolítico caracterizado por el perfil metabólico alterado en

células malignas, representa un punto central entre muchas cascadas de señalización

asociadas al evento de progresión tumoral.

38

-

Figura 6. HKII clave para la producción de energía requerida por las células malignas en cáncer

(Tomado de Mathupala y Col) 46

HKII Cataliza la formación de glucosa a glucosa-6-fosfato (G-6-P) en glicólis (1). El producto G-6-P es convertido en piruvato y acido láctico. El piruvato va a mitocondria para ser sustrato en el ciclo de acido tri-carboxílico (TCA) (7), para producción de citrato (8), esencial en la síntesis de componentes de membrana (fosfolípidos y colesterol), requeridos en proliferación celular tumoral. El acido láctico va fuera de las células (6) donde favorece la acidosis un ambiente no favorable para células normales. El G-6-P puede ir a otra ruta, la vía de pentosas para la biosíntesis de los ácidos nucleicos y sus precursores. La HKII en la membrana externa de la mitocondria (5), se une a la proteína (VDAC canal aniónico dependiente de voltaje) (4), que conforma el poro transportador, para el acceso de ATP generado por la sintasa (2), para su transporte a través de la membrana mitocondrial por el translocador nucleótido adenina (3). Fenotipo de acidosis

La acidosis es la disminución del pH extracelular. En células malignas los

valores reportados de pH están en un rango de 6.2 - 6.9, comparado con el de células

normales, en las que los valores de pH son entre 7.3 y 7.4.116,117 La acidosis se ha

considerado clave en el proceso de progresión del tumor observándose especialmente

en aquellos que son hipóxicos,118,119 y conlleva a un fenotipo maligno con capacidad de

invasión y metástasis.31,120,121

En tumores sólidos, la acidosis resulta por diferentes causas como: aumento de

lactato, un metabolito regulador de pH, la regulación del intercambio de NA+/H+ y de

enzimas como anhidrasa carbónica (CA).3 Estos procesos son dependientes de HIF-1

de manera directa e indirectamente (modulación de enzimas) (Figura 7A).

39

La acidosis extracelular en tejidos normales tiene un efecto secundario a nivel del pH

intracelular (pHi), que constituye una amenaza para su supervivencia ya que en la

interrupción de múltiples funciones biológicas, como: la producción de ATP, síntesis de

proteínas, proliferación celular, migración y apoptosis.122,123 Las células malignas en

tumores hipóxicos, han desarrollado estrategias que ayudan a controlar esos cambios

de Ph para favorecer su proliferación y supervivencia. Entre ellas están el incremento

de la expresión de proteínas localizadas en membrana celular, como transportadores,

intercambiadores y enzimas.3 De ellas, participan activamente en la regulación de pH,

el intercambiador 1 de Na+/H+ (NHE-1),124,125 que interviene en la producción acido

láctico, favoreciendo la acidez extracelular y recíprocamente la alcalinización

intracelular, que ayuda a disminuir H+ en el citosol, el gradiente electroquímico de H+

en la membrana mitocondrial y por defecto limita la síntesis de ATP promovida por

fosforilación oxidativa en mitocondria (Figura 7B).118,126 Este proceso es ayudado por

vías opuestas a la extrusión de H+, como el flujo de HCO-3, a través de

cotransportadores (NBC) y el intercambio de Cl-/HCO-3 mediante intercambiadores

(AE).127,128 Algunas evidencias sugieren que la alcalinización activa el ciclo de

glicólisis,31,45,128-130 activa HIF-1 y tiene efecto sobre la proteína P53,117

desestabilizándola y haciendo que pierda su función e induzca también actividad de

HIF-1.45,131

En ese proceso de alcalinización también se ha visto la contribución de la anhidrasa

carbónica (CA)130,132 una glicoproteína transmembranal, que actúa como una

metaloproteína zinc (proteína que contiene un ión metálico Zinc para su óptima

actividad), que cataliza la hidratación reversible de dióxido de carbono en iones

bicarbonato y protones, interviniendo en regulación del pH.66,119,133 Hasta el momento

se conocen 14 isoformas CAs que se expresan en las células de mamíferos,134 todas

tienen un sitio activo conservado y niveles variables de actividad (3 son inactivas) y se

diferencian por su distribución en tejido y localización celular. Entre ellas esta CAIX

(CA9), conocida tambien como MN, por el gen que la codifica, al detectarse por

primera vez en células HeLa cocultivadas con células de carcinoma de seno.134

Normalmente CAIX se expresa en tejidos normales fetales y adultos. Entre ellos se

incluyen: el epitelio de la cavidad corporal y visceral de los órganos (mesotelio) y

remanentes del epitelio de la cavidad celómica (rete testis, rete ovari), el epitelio del

estómago, la vesicular biliar, glándulas de Brunner, en células crípticas del duodeno y

el intestino delgado y en células columnares del intestino grueso.135-138

40

Se ha visto que está incrementada su expresión tanto en membrana como en

citoplasma en celulas malignas de múltiples tipos de tumores,116,120,139 tales como

carcinoma celular renal primario y metastático,140-142 escamocelular oral,143 carcinoma

del tracto urinario 144 de vejiga,145 de próstata,99 de seno,146 de cabeza y cuello 84,147 de

cuello uterino y metástasis 66,83,130,148-150 y en diferentes líneas celulares malignas como

hepatoma (Hep3B),151 de seno y páncreas.152

El incremento de la expresión de CAIX en tejidos tumorales es dependiente de hipoxia

peri-celular,119,153 la densidad celular primaria en tumores y tiene que ver con

proliferación celular en el caso de tumores colorrectales y carcinomas

escamocelulares.43,83 Se ha encontrado que la co-expresión de HIF-1a y CAIX esta

asociada con pobre pronóstico en varios tipos cáncer.143 Por esto también se le ha

considerado CAIX un marcador endógeno de hipoxia al igual que HIF-1α y GLUT-1 83,118 y además se propone como un marcador candidato tumoral.79,118,119,130

Figura 7. Acidosis como parte del microambiente tumoral. 7A. Mecanismo de hipoxia que media la expresión de CAIX. 7B. Componentes que participan en la regulación del ph bajo hipoxa. La producción excesiva de lactato, protones y alta cantidad de CO2 .

126 4.2.2.1 Estudios clínicos sobre CAIX, GLUT1 y HKII como marcadores en cáncer de cuello uterino (CCU).

Varias proteínas están implicadas en la regulación del proceso que sigue la

progresión hacia cáncer de cuello uterino invasor (CCU). Entre ellas se encuentran

CAIX, GLUT-1 y HKII, las cuales están asociadas a los fenotipos hipóxico, glicolítico y

de acidosis. Su expresión se ha visto incrementada tanto en el tumor primario como en

A B

41

enfermedad metastásica, considerándose por ello marcadores candidatos de pronóstico

y blancos terapéuticos en este tipo de cáncer. A continuación se describen

investigaciones clínicas con CCU que han estudiado dichas proteínas mediante

inmunohistoquímica y han asociado su expresión con pronóstico de la enfermedad.

CAIX: Su expresión por Inmunohistoquímica tiene un patrón de coloración a nivel de

membrana.36,141,149 En los estudios en los que se ha encontrado elevada la expresión de

CAIX en tejido tumoral de CCU y enfermedad metastásica,49,84,133,154 se ha visto que se

colocaliza con marcadores de proliferación celular (Ki67) y de hipoxia

(pimonidazole).30,84,154 Estos resultados concuerdan con aquellos en los que se ha

observando muerte celular bajo condición de hipoxia al bloquear CAIX.66,134,150,153,155 Sin

embargo otras investigaciones no han hallado asociación entre CAIX y procesos de

malignidad.30 La explicación a estas discrepancias posiblemente esté relacionada con la

hipótesis de Lakovlev y col, en la que afirman que hay una distribución heterogénea de

la expresión de CAIX en los tumores, que observaron al analizar 24 biopsias de CCU

escamocelular, encontrando una variación > 40% de la expresión de CAIX entre

muestras del mismo paciente, lo cual dependió del tamaño de la muestra tomada

(siendo mayor en biopsias pequeñas con respecto a aquellas de mayor tamaño).

Liao y col156 en su estudio ( USA), también documentan que la expresión elevada de

CAIX está asociada con el tamaño del tumor, según la categoría de < 2cm, 2-2.9cm y ≥

3cm (expresión: 4.7% vs, 23.2% vs. 32.5%, P= 0.003). Describen además que CAIX

se asocia con invasión cervical (limitada a los 2/3 del interior del cervix comparado con

el tercio exterior del cérvix) y que no se relaciona con la edad, raza, estadio, tipo

histológico, extensión parametrial, nódulos linfoides positivos o invasión del espacio

linfovascular y algún tipo de supervivencia: libre de progresión (PFS), libre de

metástasis y global (OS).66,156

Por el contrario Kirkpatrick y col y Joo-Young Kim49,50 demuestran que sí existe una

correlación con supervivencia libre de metástasis a distancia (FFMD) en aquellos casos

en los la expresión incrementada de CAIX esta acompañada de la presencia de nódulos

linfoides positivos (+NL).

Todos estos estudios concuerdan en que la expresión de CAIX, se incrementa

significativamente tanto en estadios clínicos (FIGO) tempranos como avanzados de la

enfermedad.49,50,66,149

GLUT-1: El patrón de coloración de su expresión por Inmunohistoquímica se ha visto

a nivel de membrana celular y de citoplasma.33,42,157

42

Al igual que CAIX, GLUT-1 se incrementa en tumores de los diferentes estadios clínicos

(FIGO) de la enfermedad 14,19,28,42,43,48. Su expresión está correlacionada con el grado

histológico del tumor, especialmente en tumores pobremente diferenciados es

altamente significativa la expresión de CAIX (P =0.0027).34

Rudlowski y col158 sugieren que la expresión elevada de GLUT-1 es un evento que

ocurre tempranamente, teniendo en cuenta su observación en tejidos de lesiones

neoplásicas (NIC1, NIC2, NIC3) de cuello uterino así como en CCU invasivo. Por su

parte Mendez y col34 refutan ese fundamento, ya que ellos solo encuentran relación

entre la expresión incrementada de GLUT1 con el grado del tumor y no con lesiones

neoplasias.33

Las investigaciones que han apuntado evaluar GLUT-1 en CCU, han tenido en cuenta la

evidencia del alto consumo de glucosa que tienen los tumores malignos, lo cual

explicaría que su expresión se incremente. Xue F y col (en USA)19 y Yen TC y Col (en

Taiwán),42 en sus estudios logran demostrar que en pacientes con CCU, la tasa de

captación de glucosa en los tumores es elevada, evaluada mediante el consumo del

sustrato FDG (18F-Fluor-desoxiglucosa) a través de PET.

Airley y Col48 y Mayer A y Col43 (en Reino Unido), señalan en sus investigaciones que

la expresión elevada de GLUT-1 se colocaliza con el marcador pimonidazole, lo que

también demuestra su asociación significativa con hipoxia (p < 0.009). Mientras que

Mayer y Col28 (en Alemania ) obtienen resultados contrarios a pesar de que

encontraron elevada la expresión de GLUT-1 en la mayoría de los tumores (P

=0.0001).

En estos estudios hay acuerdo en cuanto a que la expresión de GLUT1 tiene asociación

significativa con supervivencia global (P = 0.004) y supervivencia libre de enfermedad

(P = 0.007).43,48

HKII: Su expresión por inmunohistoquímica se observa a nivel de citoplasma y en

mitocondria.44 En la literatura son pocos los estudios clínicos que se encuentran

enfocados en la evaluación de la proteína HKII, en los primeros estudios realizados

hace diez años aproximadamente (Tokio y Dinamarca),101,159 se demostró que en

epitelio cervical uterino es elevada la actividad de enzimas HKs, especialmente de la

HKI y la HKII.

En los estudios que se ha evaluado la proteína GLUT1 y la retención del sustrato 18-

FDG en CCU, ha sido punto de discusión la HKII, considerando que su expresión

también debe estar elevada en este tipo de cáncer, ya que participa en el proceso de

43

glicólisis en la transformación de glucosa, en respuesta al aumento del índice de

captación de glucosa, que son característicos en cáncer.19,42

5. METODOLOGIA

5.1 Diseño del estudio

Este fue un estudio de tipo cohorte retrospectiva, considerando que se

analizaron biopsias de pacientes con cáncer escamocelular de cuello uterino, tomadas

antes de que fueran tratadas.

El trabajo se llevó a cabo en el Instituto Nacional de Cancerología (INC) en el GIBC

(Grupo de Investigación en Biología del Cáncer), con la participación y orientación de

las áreas de patología (Laboratorio de inmunohistoquímica), bioestadística y consultas

de radioterapia, oncología clínica y el área de patología de la Universidad Nacional de

Colombia.

Población

Las 66 pacientes con CCU incluidas en el estudio fueron remitidas al Instituto

Nacional de Cancerológica durante los años 2001 a 2007, a la consulta de ginecología.

Las muestras utilizadas para este trabajo, correspondientes a biopsias CCU de cuello

uterino fueron recolectadas durante el primer examen ginecológico, preservándolas en

formol tamponado al 10%, para incluirlas en parafina.

5.1.1 Consideraciones éticas

De acuerdo a la resolución No. 008430 de 1993 (normas científicas, técnicas y

administrativas para la investigación en salud), este estudio se clasifica como

investigación sin riesgo, ya que no se realizó ninguna intervención o modificación

intencionada de las variables biológicas, fisiológicas, sicológicas o sociales de los

individuos que participan en este estudio.

Este estudio se desarrolló con la aprobación del comité de ética del INC. Se utilizaron

bloques de parafina del archivo de patología (tomadas a las pacientes con previo

consentimiento informado) y se revisaron las historias clínicas de las respectivas

pacientes, con el fin de obtener información sobre las variables clínicas de estudio.

44

Estos datos se manejaron confidencialmente y se utilizaron únicamente con fines

investigativos.

5.2 Selección de las pacientes

Se hizo la revisión de 218 historias clínicas de pacientes diagnosticadas con cáncer

de cuello uterino, a partir de las cuales se seleccionaron las 66 pacientes incluidas en

este estudio, de ellas se registraron datos clínicos, histopatológicos y del tratamiento

(Anexo 1). El proceso de selección se realizó de la siguiente manera:

Revisión de las historias clínicas

No se encontraron bloques de parafinas en el archivo de patología -INC

Selección de muestras

46 Pacientes excluidas46 Pacientes excluidas

72 pacientes incluidas 72 pacientes incluidas Todas la pacientes tenían biopsia incluida en parafina en el archivo de patología -INC

Selección final

66 pacientes incluidas 6 pacientes excluidas

Escaso tejido en los bloques de parafinaEscaso tejido en los bloques de parafina

Base de datos de 470 pacientes que consintieron participar en estudios de investigación en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobación del comité del INC

Base de datos de 470 pacientes que consintieron participar en esBase de datos de 470 pacientes que consintieron participar en estudios de tudios de

investigaciinvestigacióón en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobacin en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobacióón del comitn del comitéé del INCdel INC

Se realizó el presente estudio


Selección

218 pacientes tenían diagnostico de CCU en estadios FIGO IIB y IIIB218 pacientes ten218 pacientes teníían diagnostico de CCU en an diagnostico de CCU en estadiosestadios FIGO IIB y IIIBFIGO IIB y IIIB

118 Pacientes clasificaron118 Pacientes clasificaron118 Pacientes clasificaron

Pacientes en estadios clínicos IIB o IIIBPacientes con carcinoma escamocelularPacientes que recibieron TTO completo

100 pacientes no clasificaron100 pacientes no clasificaron100 pacientes no clasificaron

46 No recibieron TTO 17 con TTO incompleto13 progresaron a estadio FIGO IV antes del TTO13 con reporte patológico adenoescamoso

3 estadio FIGO 1B1 Vs IIB7 con una patología adicional al CCU 1 paciente con antecedente de histerectomía

Revisión de las historias clínicas

No se encontraron bloques de parafinas en el archivo de patología -INC

Selección de muestras

46 Pacientes excluidas46 Pacientes excluidas

72 pacientes incluidas 72 pacientes incluidas Todas la pacientes tenían biopsia incluida en parafina en el archivo de patología -INC

Selección final

66 pacientes incluidas 6 pacientes excluidas

Escaso tejido en los bloques de parafinaEscaso tejido en los bloques de parafina

Base de datos de 470 pacientes que consintieron participar en estudios de investigación en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobación del comité del INC

Base de datos de 470 pacientes que consintieron participar en esBase de datos de 470 pacientes que consintieron participar en estudios de tudios de

investigaciinvestigacióón en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobacin en el GIBC entre 2001 y 2007 con la aprobacióón del comitn del comitéé del INCdel INC



Selección

218 pacientes tenían diagnostico de CCU en estadios FIGO IIB y IIIB218 pacientes ten218 pacientes teníían diagnostico de CCU en an diagnostico de CCU en estadiosestadios FIGO IIB y IIIBFIGO IIB y IIIB

118 Pacientes clasificaron118 Pacientes clasificaron118 Pacientes clasificaron

Pacientes en estadios clínicos IIB o IIIBPacientes con carcinoma escamocelularPacientes que recibieron TTO completo

100 pacientes no clasificaron100 pacientes no clasificaron100 pacientes no clasificaron

46 No recibieron TTO 17 con TTO incompleto13 progresaron a estadio FIGO IV antes del TTO13 con reporte patológico adenoescamoso

3 estadio FIGO 1B1 Vs IIB7 con una patología adicional al CCU 1 paciente con antecedente de histerectomía

Diagrama 1. Selección de las 66 pacientes incluidas en el estudio.

CCU (cancer de cuello uterino). TTO (Tratamiento). FIGO (Federación internacional de ginecologia y obstetricia).

INC (Instituto Nacional de Cancerologia).

45

5.2.1 Criterios de inclusión

• Pacientes que habían consentido donar una muestra del tumor con fines

investigativos.

• Pacientes con diagnóstico de cáncer escamocelular invasivo de cuello uterino

(CCU), clasificadas clínicamente en estadios FIGO IIB y IIIB.

• Pacientes que recibieron tratamiento completo de radioterapia exclusiva o

radioterapia concomitante a quimioterapia en el INC.

5.2.2 Criterios de exclusión

• Pacientes con CCU que presentaran diagnóstico histopatológico de tipo

adenoescamoso.

• Mujeres con expectativa de vida menor a tres meses, luego de ser

diagnosticadas con cáncer de cuello uterino.

• Pacientes con cáncer de cuello uterino, tratadas extraintitución – INC, con

radioterapia exclusiva o concomitante a quimioterapia.

• Pacientes con antecedente de histerectomía.

• Pacientes a quienes no se les encontró biopsia incluida en bloque de parafina,

en el archivo de patología del INC.

5.3 DETECCIÓN POR INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ) DE LA EXPRESIÓN DE

LAS PROTEÍNAS CAIX, GLUT-1 Y HKII

5.3.1 Clasificacion Histopatológica

Se revisaron las preparaciones histológicas coloreadas con H&E (Hematoxilina y

eosina) de las biopsias tomadas a las pacientes incluidas en el estudio, con el fin de

confirmar que los tejidos a utilizar en el procedimiento de inmunohistoquímica

correspondieran a carcinoma escamocelular de cuello uterino. Este procedimiento se

realizó con la ayuda de un patólogo oncólogo del INC, la clasificación se hizo teniendo

en cuenta las siguientes características:

46

Células grandes

Citoplasma variable en la forma y tamaño, comprado con

células de referencia (células basales del epitelio normal), sin

llegar a ser pleomórficas (formas celulares variables).

TAMAÑO CELULAR (población celular)

Células Pequeñas

De menor tamaño (apariencia de linfocitos), monótonas,

numerosas, con escaso citoplasma y núcleo ovoide.

Presente

Visualización de un componente de espirales, con células

epidermoides (epiteliales) formadas por nidos centrales de

queratina (perlas de queratina) y núcleos grandes e

hipercrómicos, con cromatina gruesa.

QUERATINIZACIÓN

Ausente

Ausencia de perlas de queratina, con apariencia de nidos

irregulares y dentados, con células poligonales hinchadas

invadiendo el estroma cervical. Posibles puentes

intercelulares.

G1

Bien diferenciados

Con células bien definidas, parecidas entre si y con núcleos

similares entre si. Poco pleomorfismo, presencia de menos

de 2 mitosis por campo. Con abundante queratina.

G2

Moderadamente

diferenciados

Con células menos definidas, vesiculadas (abundante

citoplasma), moderado pleomorfismo. Núcleos con

cromatina clara y más de 2 nucleolos. Evidencia de 2 a 4

mitosis por campo. Con o sin queratina.

GRADO DE DIFERENCIACIÓN

(patrón arquitectural

del tumor) G3

Pobre

diferenciación

Las células sin diferenciación, escaso citoplasma, no se

observa distribución definida. Núcleos grandes y de forma

variable entre si. Generalmente con más de 4 mitosis por

campo. Sin queratina.

5.3.2 Inclusion de los tejidos en parafina

La inclusión en parafina de los tejidos utilizados en este estudio se llevo a cabo

entre el año 2001 y 2007, en todos los casos se utilizó el mismo procedimiento.

Primero se fijaron las biopsias, colocándolas en formol tamponado al 10% y luego en

alcohol y xilol (utilizando el equipo procesador de tejidos - criostato). Posteriormente

fueron embebidas en los bloques de parafina (en el equipo central de inclusión), a

partir de los cuales se realizaron los cortes para hacer el proceso de IHQ en este

estudio.

Previo a la realización de los cortes, los bloques se colocaron a 4ºC durante 24h - 98h.

Cada corte fue de 3µm y se colocó en lámina de vidrio cargada manualmente o en

algunos casos en láminas cargadas comerciales.

En total se procesaron 3 láminas por paciente, una para cada marcador, obteniendo

198 cortes para la IHQ.

47

5.3.3 Anticuerpos (Ac)

Tabla 3. Descripción de los Anticuerpos (Ac) utilizados en la IHQ

Anticuerpos

primarios

Laboratorio

Dilución

Incubación

Temp. ambiente

Policlonal

Sitio detección de la proteína

humana CAIX

(H-120): SC-25599

Santacruz

1/50

45 min.

conejo

Aminoácidos 41-160

GLUT 1 RB-9052-P

Thermo

Scientific

1/100

45 min.

conejo

epitope c-terminal

HK II ab37593

abcam

1/50

45 min.

conejo

aminoácidos 400-500

5.3.4 Controles

Positivos (Figura 9 d,e,f)

� Tejido de carcinoma renal de célula clara (RCC) para CAIX (recomendación en el

inserto del AC).141

� Tejido de carcinoma canalicular infiltrante de seno para GLUT 1 (recomendación

en el inserto del AC).48

� Tejido de osteosarcoma de alto grado tipo condroblástico y fibroblástico para

HKII (recomendación en el inserto del AC).160

Negativos (Figura 9 a,b,c)

� Se utilizaron los mismos tejidos de los controles positivos sustituyendo la

incubación del anticuerpo por PBS.

Tejidos normales de cuello uterino (Figura 9 g,h,i)

� Obtenido de histerectomías realizadas a mujeres por otra patología diferente a la

de estudio.

5.3.5 Técnica de Inmunohistoquímica (IHQ)

En el proceso de la IHQ se utilizó el estuche Dako En vision + Dual Link system-

HRP, la técnica que se estandarizó se describe en el anexo 3.

48

5.4 Evaluación de la tinción IHQ

La valoración de cada marcador se llevó a cabo por un patólogo oncologo del

INC y una patologa de la UNAL, para ello se tuvo en cuenta la localización de cada

proteína a nivel celular, de acuerdo a escalas reportadas en la literatura (Tabla 4).

Tabla 4. Escalas de valoración por inmunohistoquímica para las proteínas CAIX, GLUT-1 Y HKII

Para el análisis estadístico las escalas se clasificaron en cuatro categorías: Negativa (escala 0% y escala < 10%),

débil (escala + y escala 1), moderada (escala ++ y escala 2-3) y fuerte (escala +++ y escala 4-5).

5.5 Determinación de la respuesta al tratamiento

5.5.1 Respuesta mediata

La respuesta mediata al tratamiento se entiende como la respuesta evaluada

tres meses después de haber terminado el tratamiento y fue definida de acuerdo a los

criterios de la OMS, así: Respuesta Completa (RC): cuando hubo una reducción del

100% del volumen tumoral inicial (VTI) y no evidencia clínica ni radiológica de la

enfermedad; Respuesta Parcial (RP): cuando se presentó una reducción del VTI mayor

al 50% y no respuesta: cuando hubo menos del 25% de reducción del VTI o persiste

el VTI o hay progresión por incremento en el tamaño del tumor inicial.

PROTEINA ESCALA Según % de células marcadas

REPORTE LITERATURA

Negativa (< 10%)

+ (10-24%)

++ (25-49%)

GLUT 1 (Citoplasma - membrana)

Positiva

+++ (>50%)

Mayer y Col.2005 43

Negativa ( 0%)

+ (1-25%)

++ (26-50%)

CAIX (Citoplasma - membrana)

Positiva

+++ (>50%)

Kirpatrick y col. 2008 50

Al-ahmadie y col.2008 141

Negativa 0 (0%)

1 (1–20%)

2 (21–40%)

3 (41–60%)

4 (61–80%)

HKII (Citoplasma –mitocondria)

Positiva

5 (81–100%)

Mamede y Col.2005 33

Lyshchik y Col. 2007 44

49

Para hacer el análisis estadístico se incluyeron dos grupos de pacientes; el de pacientes

con respuesta (incluyó la Respuesta Completa) y el de no respuesta al tratamiento

(incluyó la Respuesta Parcial y no respuesta).

5.5.2 Supervivencia

El seguimiento de las pacientes para hacer el análisis de supervivencia se realizó a

través de la historia clínica y en algunos casos por contacto vía telefónica.

Para este estudio se consideraron dos tipos de supervivencia:

1. Supervivencia libre de enfermedad: Se tuvo en cuenta la fecha que inició

el tratamiento hasta la primera recaída loco-regional de la enfermedad (CCU) o

muerte por cualquier causa.

2. Supervivencia Global: Se tuvo en cuenta la fecha en que inició el tratamiento

hasta la muerte por cualquier causa.

5.6 Métodos Estadísticos

� Análisis descriptivo: Se calcularon las medidas de tendencia central y dispersión

para variables continuas y proporciones para variables categóricas.

Analisis para determinar la respuesta al tratamiento:

� Análisis Bivariado: Para determinar qué variables estan asociadas a la no

respuesta al tratamiento, se realizaron análisis bivariados usando la prueba de Mann

Whitney para variables continuas y la prueba de ji cuadrado o el test exacto de

Fisher´s, si no se cumplió el supuesto de Ji cuadrado para las variables categóricas.

Se tuvieron en cuenta para el análisis las variables clínico-histopatológicas y la

expresión de CAIX, GLUT-1 y HKII. Se calcularon OR crudos y ajustados con sus

intervalos de confianza utilizando un modelo de regresión logística. El modelo fue

ajustado usando las variables con resultados significativos en el análisis bivariado y

aquellas con plausibilidad biológica (factores de riesgo para no respuesta descritos en

la literatura).

50

� Análisis de sobrevida: Se construyeron curvas de sobrevida para la supervivencia

global y libre de enfermedad usando el método de Kaplan Meier, las curvas fueron

comparadas usando la prueba de sumas de rangos logaritmicos. Para determinar que

variables estaban asociadas a la supervivencia se construyó un modelo de regresión

de Cox, se calcularon HR crudos y ajustados, para el ajuste se usaron las variables

con resultados significativos en la prueba de suma de rangos logaritmicos y aquellas

con plausibilidad biológica. Los análisis se realizaron a dos colas, considerando el

valor p < = 0.05 para la significancia estadística. En el análisis se usaron los paquetes

estadísticos SPSS 17, y stata 9.2.

Tabla 5. Resumen de las pruebas estadísticas

Comparación realizada Prueba estadística

Supuestos

Dos medias (dos muestras independientes) población con distribución normal

Prueba no paramétrica Test de Wilconsom rank (Mann Whitney)

Ausencia de normalidad

Pearson Chi 2

Menos del 50% de las celdas con conteos esperados inferiores a 5

Comparación de proporciones

Test de Fisher

50% o más de las celdas con conteos esperados inferiores a 5

Relación entre variables binarias independientes (predictoras) y la variable dependiente

Regresión logística

Independencia de las observaciones

Relación de las variables del estudio con el tiempo de sobrevida

Regresión cox`s

Proporcionalidad

Comparación entre las curvas de supervivencia definidas por las variables del estudio

Long-range

Prueba No parametrica

51

6 RESULTADOS

6.1 Características clínico- histopatológicas

Las características clínicas de las pacientes incluidas en este estudio se

describen en la tabla 6. Su edad osciló entre 27 y 72 años. Todas tenían diagnóstico

de CCU invasivo avanzado, 24 de ellas en estadio clínico FIGO IIB y 42 en estadio IIIB.

La clasificación histológica de todos los tejidos tumorales correspondió a

carcinoma escamo-celular, sus características se muestran en la Figura 8 y se

describen en la tabla 7.

Tabla 6. Características de las pacientes

Características No. de pacientes

Edad (promedio/ rango) 47 ( 26 -72)

Estadio FIGO (%)

IIB 24 (36.4) IIIB 42 (63.6)

Localización del tumor (%) Exofítico 48 (72.7)

Endofítico 8 (12.1) Exo-endofítico 10 (15.2)

Tamaño del tumor (antes de TTo) (%)

≤4CM 9 (13.6) > 4CM 57 (86.4)

Compromiso Parametrios (%) Unilateral 25 (37.9) Bilateral 41 (62.1)

(IK) * (%) 70% 1 (1.5) 80% 4 (6.1) 90% 16 (24.2)

100% 45 (68.2) * IK (índice de Karnofsky)

52

Tabla 7. Descripción histológica de los tumores

Características No. de pacientes

Grado Diferenciación* (%)

G1 5 (7.6)

G2 53 (80.3)

G3 8 (12.1)

Tamaño célula (%)

Grande 66 (100,0)

Pequeña 0

Queratinización (%)

Ausente 58 (87,9)

Presente 8 (12,1)

* Tumor: G1 (bien diferenciado), G2 (moderadamente diferenciado), G3 (Mal Diferenciado).

Figura 8. Histología de los tumores. Fotografías tomadas a casos

representativos de carcinoma escamocelular (CE), que muestran las diferentes

características estructurales y morfológicas de cada tipo

histológico.

A. CE bien diferenciado (BD) queratinizante (Q) de célula grande (CG), con Áreas

necróticas (AN)

B. CE moderadamente diferenciado (MD) no queratinizante de célula grande

(CG).

C. CE pobremente diferenciado (PD) no queratinizante de célula grande (CG).

(E) Infiltración epitelial al

estroma. (CBE) Células basales del epitelio que limitan con el

estroma.

53

6.2 Expresión por inmunohistoquimica (IHQ) de las proteínas CAIX, GLUT1

y HKII

En la Figura 9 se muestra la expresión de las proteínas en los tejidos utilizados como

controles para la estandarización de la técnica IHQ y la expresión de las proteínas en

los tejidos de CCU se observa en la figura 10.

Figura 9. CONTROLES PARA LA ESTANDARIZACION DEL PROTOCOLO DE INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ).

Las fotografías a, b, c corresponden a los controles negativos y d, e, f, a los controles positivos. CAIX se evaluó en carcinoma renal de célula clara (RCC), en el que su expresión se detectó en citoplasma (Cit.) y membrana celular (MC). GLUT 1 se evaluó en carcinoma de seno, en el cual marcó a nivel de membrana celular (MC). Para HKII se utilizó tejido de osteosarcoma, en el que se vió marcación limitada a citoplasma (Cit.).Las fotografias g, h, i, muestran tejido normal de cuello uterino en el que se evaluado

CAIX, GLUT 1 y HKII, respectivamente. En estos casos las tres proteínas no marcaron en epitelio del exocervix (Ex), pero marcaron de manera específica en la zona de transformación (zt). y parte del endoncervix (End.). (Las magnificaciones son de 100x y 400x).

54

Negativa Débil Moderada Fuerte

A

100 X

400 X

B

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

C D

J

E F G H

I K L

400 X

100 X

G

100 X

400 X400 X

Negativa Débil Moderada Fuerte

A

100 X

400 X

B

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

400 X

100 X

C D

J

E F G H

I K L

400 X

100 X

G

100 X

400 X400 X

Figura 10. Casos representativos de la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII por IHQ, en carcinoma escamocelular de CCU.

Para cada proteína se muestran los niveles de expresión Negativa (-), débil (+), moderada (++) y fuerte (+++). Las fotografías A,B,C,E,F,G,I,J, corresponden a casos en estadios FIGO IIIB y las fotografías D,H,L son casos estadios IIB.Las flechas en los casos negativos indican inmunoreactividas de CAIX y GLUT1 en eritrocitos.

55

6.2.1 Comparación de la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII

Se observó una variación en los niveles de expresión de las tres proteínas como

se muestra en la grafica 2. De las 66 biopsias analizadas se encontró que GLUT1 fue

la proteína que más se expresó, encontrándose en 49 muestras (74.4 %), 27 (41%)

con fuerte expresión y 17 (25.6%) que no la expresaron. Le siguió CAIX hallada en 27

(41%) muestras, 12 (18%) con fuerte expresión, versus 39 (59%) negativas y luego la

HKII con la menor expresión en 12 muestras (18.2%), teniendo 5 (7.6%) fuerte

expresión, versus 54 (81.8%) muestras negativas.

Grafica 2. Comparación entre los niveles de expresión de CAIX, GLUT1 y HKII

CAIX GLUT 1 HKII Marcador

Expresión n (%) n (%) n (%)

NEGATIVA

39 (59)

17 (25.6)

54 (81.8)

DÉBIL

10 (15)

11 (16.7)

4 (6.1) MODERADA 5 (8) 11 (16.7) 3 (4.5)

Positi

va

FUERTE 12 (18) 27 (41) 5 (7.6)

En la tabla 8, se resume el número de muestras que co-expresaron tres de las

proteínas o dos de ellas y la expresión de solo una de ellas. En 6 (9,1%) muestras se

expresaron las tres proteínas, mientras que en 17 (25,8%) ninguna se expresó, en 24

(36.4%) muestras se expresaron dos de las proteínas y en 19 (28,8%) se encontró

expresado solo una de ellas. Ningún caso (0,0%) de los analizados presentó inmuno-

reactividad para solo HKII.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CAIX GLUT1 HKII

Por

cent

aje

de c

asos

NEGATIVO DEBIL MODERADA FUERTE

56

Tabla 8. Expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII.

Expresión

Proteína(s)

Total casos n=66 (%)

GLUT1, CAIX, HKII 6 (9,1)

GLUT1, CAIX 18 (27,3)

GLUT1, HKII 6 (9,1)

CAIX, HKII 0 (0,0)

GLUT1 17 (25,8)

CAIX 2 ( 3,0)

POSITIVA

HKII 0 (0,0)

Tanto en el estadio FIGO IIB como IIIB, se encontró que GLUT 1 fue la proteína que

más se expreso. Además se observó que la co-expresión de GLUT1 y CAIX fue mayor

respecto a las otras co-expresiones (tabla 9).

Tabla 9. Expresión de las proteínas en relación al estadio FIGO. EXPRESIÓN DE LA (S) PROTEÍNA(S)

POSITIVA NEGATIVA

ESTADIO FIGO

GLUT1, CAIX, HKII

GLUT1, CAIX

GLUT1, HKII

CAIX, HKII

GLUT1 CAIX HKII GLUT1, CAIX, HKII

GLUT1 CAIX HKII

IIB (n= 24)

4 10 1 0 5 0 0 5 0 6 10

IIIB (n= 42)

2 9 5 0 12 2 0 12 2 17 28

Total

6

(9.1%)

18

(27.3%)

6

(9.1%)

0

(0.0%)

17

(25.8%)

2

(3.0%)

0

(0.0%)

17

(25.8%)

2

(3.0%)

23

(34.9%)

38

(57.6)

6.3 Respuesta al tratamiento

Las pacientes presentaron un buen estado funcional antes de recibir el

tratamiento, como lo indican los valores de IK (tabla 6), que oscilaron entre el 70% y

100%. Todas recibieron el esquema completo de la terapia asignada, 22 (33,3 %) de

ellas fueron al protocolo de radioterapia exclusiva y 44 (66,7 %) al protocolo de

radioterapia concomitante a quimioterapia.

A todas las pacientes se les administró radioterapia externa (teleterapia) e

intracavitaria (braquiterapia). Las dosis mínimas y máximas de teleterapia oscilaron

entre 4320-5580 cGy y las de braquiterapia entre 2500-5040 cGy en puntos A y entre

660-3500 cGy en puntos B (dosis dadas a 36 (54,5 %) pacientes). 55 (83,3 %)

pacientes recibieron braquiterapia de baja tasa y 11 (16,7 %) de alta tasa.

57

Quienes recibieron quimioterapia fueron tratadas con 6 ciclos de cisplatino, 1 dosis

semanal entre 44 a 70 mg.

6.3.1 Respuesta mediata al tratamiento

De la 66 pacientes incluidas, 53 (80,3%) tuvieron respuesta, de ellas 16

(30,2%) recibieron radioterapia exclusiva y 37 (69,8%) radioterapia concomitante a

quimioterapia. De las 13 (19,7%) pacientes restantes sin respuesta al tratamiento, 6

(46,2%) recibieron radioterapia exclusiva y 7 (53,8%) radioterapia concomitante a

quimioterapia (tabla 10).

6.3.2 Respuesta al tratamiento y expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII.

Los niveles de expresión de las proteínas en el grupo de respuesta y no

respuesta al tratamiento se muestran en la grafica 3. En general se observa que los

niveles de expresión de las tres proteínas fueron mayores en el grupo de respuesta

respecto al de no respuesta.

En el grupo de pacientes que respondieron (53 pacientes), se observó que la

mayor expresión fue de GLUT 1 (73.6%), seguido de CAIX (43.4%) y HKII (17%).

En el grupo que no respondió (13 pacientes), también se observó que GLUT1 presentó

mayor expresión, (77%) respecto a CAIX (30.8%) y HKII (23.1%). En este grupo se

hallaron 2 (15.4%) muestras que co-expresaron las tres proteínas, otras 2 (15.4%)

que co-expresaron GLUT1 y CAIX, 1 (7.7%) que co-expresó GLUT1 y HKII, y ninguna

co-expresión de GLUT1 y HKII.

58

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CAIX GLUT1 HKII

Por

cent

aje

de c

asos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CAIX GLUT1 HKII

Por

cent

aje

de c

asos

FUERTE

MODERADA

DEBIL

NEGATIVO

NO RESPUESTA RESPUESTA

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CAIX GLUT1 HKII

Por

cent

aje

de c

asos

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CAIX GLUT1 HKII

Por

cent

aje

de c

asos

FUERTE

MODERADA

DEBIL

NEGATIVO

FUERTE

MODERADA

DEBIL

NEGATIVO

NO RESPUESTA RESPUESTA

0

Grafica 3. Expresión de CAIX, GLUT 1 y HKII en el grupo respuesta y no respuesta al tratamiento.

6.4 Posible asociación de la respuesta al tratamiento con las variables

clínico-patológicas y la expresión.

Mediante los test de Mann Witney, chi2 y Fisher, se realizó la comparación entre

los dos grupos de respuesta al tratamiento teniendo en cuenta las variables clínico-

patológicas y la expresión de las proteínas (tabla 10), encontrándose una diferencia

significativa en cuanto al nivel medio de Hb (p= 0.0127), mientras que no se halló una

diferencia significativa con las otras variables y la expresión de las proteínas.

No respondedoras Respondedoras Proteína Escala

CAIX n (%)

GLUT1 n (%)

HKII n (%)

CAIX n (%)

GLUT1 n (%)

HKII n (%)

NEGATIVO 9 (69.2) 3 (23.0) 10 (76.9) 30 (56.6) 14 (26.4) 44 (83) DEBIL

2 (15.4) 2 (15.4) 2 (15.4) 8 (15.1) 9 (17) 2 (3.8) MODERADA

0 (0) 2 (15.4) 1 (7.7) 5 (9.4) 9 (17) 2 (3.8)

Positiva

FUERTE 2 (15.4) 6 (46.2) 0 (0) 10 (18.9) 21 (39.6) 5 (9.4)

59

Tabla 10. Asociación entre las variables clínico-patológicas y la expresión de las proteínas con la respuesta al tratamiento.

Respuesta

SI NO

Variables

(n =53) (n=13) Valor – p

Edad (Media) 46 47 0.82 ┼

(SD) 11 (26 ± 72)

13 27 ± 65

Tamaño tumor (Media) 6 7 0.1618 ┼ (SD) 2

(3 ± 10)

2 3 ± 12

Hemoglobina (g/dl) (Media) 12,7 10,6 0.0127 ┼

(SD) 2,3 (5, 2 ± 16,0 )

3,0 4,3 ± 15,3

Estadio FIGO (%) IIB 21 (39,6) 3 (23,1) IIIB 32 (60,4) 10 (76,9)

0.345 *

Grado diferenciación (%) G1 4 (7,5) 1 (7,7) G2 43 (81,1) 10 (76,9) G3 6 (11,3) 2 (15,4)

0.851 *

Tipo Célula Grande 53 (100,0) 13 (100,0)

Pequeña 0 (0,0) 0 (0,0)

___

Queratinización (%) Presente 6 (11,3) 2 (15,4) Ausente 47 (88,7) 11 (84,6)

0.651 *

Compromiso Parametrios (%) Unilateral 21 (39,6) 4 (30,8) Bilateral 32 (60,4) 9 (69,2)

0.752 *

Índice de karnosky 70% 1 (1,9) 0 (0,0) 80% 2 (3,8) 2 (15,4) 90% 11 (20,8) 5 (38,5)

100% 39 (73,6) 6 (46,2)

0.17 ⊙⊙⊙⊙

Tipo de tratamiento (%) Radioterapia 16 (30.2) 6 (46.2)

Radioterapia + Quimioterapia 37 (69.8) 7 (53.8)

0.331 *

Tipo tasa braquiterapia Baja 45 (84,9) 10 (76,9) Alta 8 (15,1) 3 (23,1)

0.79*

Tipo expresión de las proteínas Negativo 13 (24.52) 3 (23.07)

GLUT1 12 (22.64) 5 (38.46) GLUT1 y HKII 5 (9.43) 1 (7.7) GLUT1 y CAIX 19 (35.84) 2 (15.38)

GLUT1 y HKII y CAIX 4 (7.54) 2 (15.38)

0.535 ⊙⊙⊙⊙

┼ test Mann-Whitney - * Test exacto Fisher. P <<<< 0.05 (significancía). ⊙⊙⊙⊙ Test pearson Chi2.

60

En el grupo de pacientes que no tuvieron respuesta el nivel medio de Hb estuvo por

debajo de 11g/dl, (rango de 4,3 a 15,3 g/dl), respecto al grupo de pacientes que

tuvieron respuesta, en quienes el nivel de Hb fue > 11 g/dl (grafica 4).

No respuesta Respuesta

Niv

el d

e H

emog

lobi

na (

g/dl

)

No respuesta Respuesta

Niv

el d

e H

emog

lobi

na (

g/dl

)

Grafica 4. Niveles de Hemoglobina (Hb) y respuesta al tratamiento.

6.5 Correlación entre las variables clínico-patológicas, la expresión de las proteínas y no respuesta al tratamiento.

La correlación se realizó mediante regresión logística, incluyendo las pacientes

que no tuvieron respuesta y ajustándolo con las variables de plausibilidad riesgosa

para no responder al tratamiento como posibles factores de pronóstico, que fueron: el

estadio FIGO IIIB, el tamaño del tumor > 4cm, tumores queratinizantes y pobre

diferenciación, el compromiso bilateral de Parametrios, niveles de Hb ≤ 11g/dl,

tratamiento con radioterapia exclusiva y braquiterapia de alta tasa.

Para el análisis de las variables biológicas de riesgo (expresión de las proteínas), se

consideró evaluar la expresión de solo GLUT1 y la co-expresión de GLUT 1 y CAIX,

p = 0.0127

61

GLUT1 y HKII y de las tres proteínas, ya que solo 2 muestras expresaron solo CAIX y

no se detecto solo expresión de HKII.

En el análisis univariado al hacer la relación entre cada variable clínico-

patológica y la expresión de cada proteína con la no respuesta al tratamiento (tabla

11), se encontró que hay una relación significativa con el nivel de Hb (OR= 3.99; p =

0.032), considerándose por ello un factor predictor de riesgo. Este hallazgo fue

concordante con el análisis de asociación de la respuesta al tratamiento. Con las otras

variables no se halló una relación significativa, sin embargo se observó que las

pacientes pueden tener algún riesgo de no responder al tratamiento cuando:

presentan alguna de las siguientes características: estadio FIGO IIIB (OR =2,19),

tumores queratinizantes (OR= 1,42), tumores con pobre diferenciación G3 (OR= 1,33),

tumores de tamaño mayor a 4cm (OR= 2,13), compromiso bilateral de Parametrios

(OR= 1,48) , recibir radioterapia exclusiva (OR= 1,98) y braquiterapia de alta tasa

(OR= 1.69) .

Con respecto al análisis de relación entre la expresión de CAIX, GLUT 1 y HKII y

no respuesta al tratamiento, tampoco se encontró una asociación significativa (tabla

11), pero se observó un posible riesgo (0R= 1,70) en las pacientes que expresaron

GLUT1. De acuerdo a esto se consideró evaluar si se presentaba un efecto aditivo que

aumentara el riesgo de no responder al tratamiento cuando se expresan

conjuntamente GLUT1 y CAIX, GLUT1 y HKII y GLUT1 con CAIX y HKII. Al respecto no

se encontró alguna significancia, pero se observo un posible riesgo cuando se expresan

las tres proteínas (OR= 1,43).

En el análisis multivariado (tabla 11), se encontró que las pacientes pueden

tener un riesgo de 4.31 veces de no responder al tratamiento, cercano a la

significancia (p= 0.07) cuando presentan niveles de Hb<11g/dl.

62

Tabla 11. Análisis de regresión logística en el grupo de no respuesta al tratamiento (n=13).

Análisis univariado Análisis Multivariado (a) Variables OR ∗∗∗∗

95% CI Valor P ♦♦♦♦ OR ∗∗∗∗

95% CI Valor P ♦♦♦♦

Estadio FIGO IIB 1.00 1.00 IIIB 2.19 0.54 - 8.89 0.274 1.17 0.13 – 10.8 0.893

Grado diferenciación G1 1.00 1.00 G2 0.93 0.09 - 9.25 0.951 1.73 0.03 – 104.32 0.794 G3 1.33 0.09 - 2.01 0.835 1.75 0.02 – 155.04 0.806

Queratinización tumor Presente 1.00 1.00 Ausente 1.42 0.25 - 8.03 0.689 1.77 0.075 – 41.82 0.72

Compromiso de Parametrios Unilateral 1.00 1.00 Bilateral 1.48 0.40 - 5.42 0.557 1.16 0.16 – 8.52 0.891

Tamaño del tumor >>>> 4cm No 1.00 1.00 Si 2.13 0.24 - 18.76 0.495 1.56 0.12 – 21.04 0.737

Hb ≤ 11g/dl No 1.00 1.00 Si 3.99 1.13 – 14.14 0.032 4.31 0.89 – 20.93 0.07

Tipo de Tratamiento Radioterapia concomitante

a quimioterapia 1.00

1.00

Radioterapia exclusiva 1.98 0.58 - 6.84 0.279

2.95 0.49 – 17.67 0.237

Braquiterapia Baja tasa 1.00 1.00 Alta tasa 1.69 0.38 - 7.51 0.492 1.22 0.16 – 9.37 0.850

Tipo de Expresión Negativo 1.00 1.00

Expresión GLUT 1 1.81 0.59 - 7.76 0.478 1.70 0.22 - 13.10 0.611 Expresión GLUT 1 y CAIX 0.46 0.07 – 3.12 0.424 0.35 0.40 – 3.15 0.351 Expresión GLUT 1 y HKII 0.87 0.07 – 10.4 0.910 0.74 0.52 – 10.47 0.821

Expresión GLUT 1, CAIX y HKII 2.17 0.26 - 13.89 0.473 1.43 0.75 – 27.50 0.812

∗∗∗∗ OR (ODDS RATIO: valor de riesgo) > 1.0 (significativo). ♦♦♦♦P (probabilidad │Z│) < 0.05 (Valor significativo). CI: intervalo de confianza

(a) Analisis ajustado por las variables con plausibilidad de riesgo (tumores con moderada (G3) y pobre (G4) diferenciación, tumores no

queratinizantes, comopromiso de parametrios bilateral, tamaño del tumor > 4cm, Hb ≤ 11g/dl, recibir radioterapia exclusiva y braquiterapia de alta

tasa. Presentar expresión o coexpresion de las proteínas GLUT1, CAIX y HKII)

6.5.1 Niveles de hemoglobina (Hb) y expresión de GLUT1.

Teniendo en cuenta que la Hb presento un riesgo cercano a la significancia

asociado a no respuesta y que la expresión de GLUT1 mostró un posible riesgo para no

respuesta, se considero analizar la relación entre estas dos variables, encontrándose

que no hay dependencia. Como se aprecia en la grafica 5 los niveles medios de

hemoglobina estuvieron por encima de 11g/dl tanto en los casos GLUT1 positivos

(rango 7,6– 16 g/dl) como negativos (rango 4,3– 16 g/dl).

63

GLUT1FUERTEMODERADADEBILNEGATIVO

20.0

15.0

10.0

5.0

0.0

4

2

57

EXPRESION DE GLUT1

Nivel de Hb(g/dl)

Grafica 5. Niveles de Hb en función de la expresión de GLUT1.

6.6 POSIBLE CORRELACIÓN ENTRE LAS VARIABLES CLÍNICAS Y EL PRONOSTICO DE SUPERVIVENCIA

Mediante el modelo de regresión de COX ajustado (tabla 12) se demostró que

no tener respuesta al tratamiento (OR= 34.7; p= 0.000) y presentar bajos niveles de

hemoglobina (OR= 4.33; p= 0.02), representan un alto riesgo en la disminución de la

supervivencia libre de enfermedad. Mientras que no tener respuesta al tratamiento es

el único riesgo de disminución de la supervivencia global de pacientes con CCU (OR=

40.6; p= 0.000).

Al igual que en análisis de regresión logística se observaron valores de riesgo

mayores a 1.0 en otras de las variables clínico- patológicas analizadas, tales como: el

estadio IIIB, los tumores de moderada (G2) y pobre (G3) diferenciación, tumores

queratinizantes, tumores de tamaño mayor a 4 cm, tener compromiso bilateral de

parametrios y el manejo con tratamiento de radioterapia exclusiva. Sin embargo al

considerar los valores de p y los intervalos de confianza se muestra que no son

factores predictores para evaluar la supervivencia libre de enfermedad y para la

supervivencia global.

64

6.6.1 Expresión de CAIX, GLUT1 y HKII y supervivencia

Como se indica en la tabla 12, la relación entre la expresión de las proteínas

con supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global no mostró tener

significancia, sin embargo se observó un riesgo de 1.18 veces de disminución de la

tasa de supervivencia global, cuando se co-expresan GLUT1 y HKII. Mediante el

análisis de Kaplan Meier (gráfica 6) se encontró que las tasas de supervivencia libre de

enfermedad y supervivencia global decayeron entre un 20 a un 80% en un periodo

promedio de 2 años cuando se co-expresaban GLUT 1 y HKII. Además se observó que

las tasas de los dos tipos de supervivencia fueron similares en pacientes que

expresaban GLUT 1, co-expresaban GLUT 1 y CAIX y que no expresaban ninguna de

las proteínas, entre un 50 a un 90 %, respectivamente, en un periodo de

aproximadamente 5 años.

Las mayores tasas de supervivencia libre de enfermedad, a 3 años y medio, y

supervivencia global a 4 años y medio, fueron del 65 y 75%, respectivamente, en

pacientes que co-expresaban GLUT1, CAIX y HKII.

65

Tabla 12. Análisis Cox de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia Global.

SUPERVIVENCIA LIBRE DE ENFERMEDAD (SLE)

SUPERVIVENCIA GLOBAL (SG)

Modelo COX Univariado Modelo COX Multivariado a Modelo COX Univariado Modelo COX ajustado Multivariado a

Variables RR∗∗∗∗ 95% CI P♦♦♦♦ RR∗∗∗∗ 95% CI P♦♦♦♦ RR∗∗∗∗ 95% CI P♦♦♦♦ RR∗∗∗∗ 95% CI P♦♦♦♦ Respuesta al TTO

No 1.00 1.00 1.00 1.00 Si 24.5 8.11 – 73.69 0.00 34.7 7.95 – 151.45 0.00 15.5 6.26 – 38.35 0.00 40.6 8.10 – 203.5 0.00

Estadio FIGO IIB 1.00 IIIB 1.52 0.66 – 3.49 0.32 0.31 0.75 – 1.33 0.12 1.63 0.64 – 4.17 0.31 0.22 0.04- 1.13 0.07

Grado diferenciación G1 1.00 1.00 1.00 1.00 G2 1.61 0.36 – 7.10 0.53 5.07 0.38 – 68.28 0.22 1.04 0.24 – 4.49 0.96 2.57 0.15 – 44.9 0.52 G3 0.76 0.10 – 5.57 0.78 1. 72 0. 70- 42.11 0.74 0.55 0.078 – 3.97 0.56 1.49 0.051 – 43.23 0.82

Queratinización tumor Presente 1.00 1.00 1.00 1.00 Ausente 1.43 0.53 – 3.86 0.49 2.48 0.42 – 14.63 0.32 1.60 0.54 – 4.74 0.40 2.37 0.29 – 19.44 0.42

Compromiso Parametrios Unilateral 1.00 1.00 1.00 1.00 Bilateral 1.42 0.62- 3.28 0.41 2.49 0.63 – 9.78 0.19 1.37 0.56 – 3.35 0.50 2.04 0.47 – 8.84 0.33

Tamaño del tumor >>>> 4cm No 1.00 1.00 1.00 1.00 Si 4.27 0.57 – 31.9 0.16 1.22 0.12 – 12.06 0.86 3.22 0.43 – 24.0 0.25 1.01 0.097 – 10.59 0.99

Hb ≤ 11g/dl No 1.00 1.00 1.00 1.00 Si 3.27 1.51 – 7.07 0.03 4.33 1.22 – 15.44 0.02 2.12 0.91 – 4.98 0.08 4.33 0.88 – 21.33 0.07

Tipo de Tratamiento Radioterapia concomitante

a quimioterapia

1.00

1.00

1.00

1.00

Radioterapia exclusiva 1.70 0.79 – 3.64 0.18 3.02 0.63 – 14.45 0.17 2.08 0.90 – 4.81 0.09 4.58 0.67 – 31.50 0.12 Braquiterapia

Baja tasa 1.00 1.00 1.00 1.00 Alta tasa 0.64 0.22 – 1.9 0.42 0.74 0.17 – 3.25 0.69 0.61 0.18 – 2.08 0.43 1.07 0.19 – 6.09 0.94

Expresión proteínas b Negativa 1.00 1.00 1.00 1.00 GLUT 1 0.93 0.32 – 2.68 0.90 0.50 0.11 – 2.16 0.35 0.87 0.26 – 2.85 0.82 0.44 0.083 – 2.39 0.35

GLUT 1 y CAIX 0.90 0.31 – 2.58 0.85 0.89 0.21 – 3.65 0.87 0.93 0.30 – 2.89 0.89 0.89 0.18 – 4.28 0.88 GLUT 1 y HKII 1.60 0.45 – 5.76 0.47 0.90 0.19 – 4.24 0.90 2.38 0.67 – 8.49 0.18 1.18 0.25 – 5.60 0.84

GLUT 1, CAIX y HKII 0.68 0.14 – 3.26 0.67 0.15 0.011 – 2.01 0.15 0.37 0.44 – 3.05 0.35 0.013 0.00 – 0.59 0.03

∗∗∗∗ RR (razón de riesgo: Hazard ratio) >>>> 1 (Valor significativo). ♦♦♦♦ P (probabilidad │Z│) < 0.05 (Valor significativo). CI: intervalo de confianza.

a Analisis ajustado por las variables con plausibilidad de riesgo (tumores con moderada (G3) y pobre (G4) diferenciación, tumores no queratinizantes, comopromiso de parametrios bilateral, tamaño del tumor > 4cm, Hb ≤ 11g/dl,

recibir radioterapia exclusiva y braquiterapia de alta tasa. Presentar expresión o coexpresion de las proteínas GLUT1, CAIX y HKII)

b Se considero hacer el análisis de solo GLUT1 junto con CAIX y HKII, dado que no se hallaron muestras con solo expresión de HKII y fueron muy solo dos muestras expresaron CAIX.

66

AA

BB100

Supervivencia Libre de en

ferm

edad (%

)Superviven

cia Libre de en

ferm

edad

(%

)

0 2.7 5.5 8.2

Tiempo al evento (años)

50

25

0

75

Negativo

GLUT1

GLUT1 y HK

GLUT1 y CAIX

GLUT1, HK y CAIX

BB

AA

BB100

Supervivencia Libre de en

ferm

edad (%

)Superviven

cia Libre de en

ferm

edad

(%

)

0 2.7 5.5 8.2

Tiempo al evento (años)

50

25

0

75

Negativo

GLUT1

GLUT1 y HK

GLUT1 y CAIX

GLUT1, HK y CAIX

BB

Grafica 6. Supervivencia en pacientes con carcinoma escamocelular de cuello uterino. Curvas de supervivencia de Kaplan Meier de acuerdo a la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y

HKII. La figura 6A supervivencia global y 6B supervivencia libre de enfermedad y figura

67

7. DISCUSION

Estudios experimentales y clínicos han demostrado que los tumores de cáncer

de cuello uterino (CCU) se caracterizan por ser altamente hipóxicos20-23,29,64,80,81 y

presentar una elevada tasa de glicólisis,17,20,41,97 Estos fenotipos están implicados en

resistencia a tratamientos, como la radioterapia y/o quimioterapia y se asocian con

inestabilidad genética, que puede reflejarse en el incremento de la expresión de ciertas

proteínas, entre las que están: CAIX, GLUT1 y HKII,19,22,23,97 consideradas como

posibles marcadores pronósticos de progresión de la enfermedad, metástasis y

supervivencia.

En este estudio se determinó la expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII,

mediante inmunohistoquímica en 66 muestras de carcinoma escamocelular invasivo de

cuello uterino en estadios IIB y IIIB, con el fin encontrar una posible relación entre la

expresión de estas proteínas y su efecto sobre la respuesta al tratamiento con

radioterapia exclusiva o radioterapia concomitante a quimioterapia.

7.1 Expresión de las proteínas CAIX, GLUT1 y HKII La detección molecular de marcadores endógenos relacionados con hipoxia,

glicolisis y acidosis, como las proteínas evaluadas en este estudio, fue posible a través

del uso de una de las técnicas de fácil acceso y aplicabilidad, como la

inmunohistoquímica, en la cual se utilizan muestras de rutina clínica como son los

tejidos embebidos en parafina (biopsias). Esta técnica tiene la ventaja de ser de bajo

costo, en especial cuando se utiliza en tejidos microarrays, si se compara con

tecnologías de alto costo que deben utilizarse in vivo para medir marcadores

extrínsecos de hipoxia, glicólisis y acidosis 66,161.

Diferentes estudios han demostrado que la expresión de CAIX, GLUT 1 y HKII evaluada

por inmunohistoquimica, se encuentra incrementada en tejidos tumorales. Algunos de

ellos realizados en cáncer de cuello uterino (CCU) han señalado que la expresión

elevada de CAIX se ha visto entre un 21.1 % hasta aproximadamente un 99% de los

casos analizados.36,66,130,135,149,156 Por ptra parte la expresión elevada de GLUT 1 puede

oscilar entre un 7 % a un 94.1% de los casos.34,42,43,131 Acerca del porcentaje de

expresión de HKII por inmunohistoquimica en CCU no se tiene información, pero

68

reportes en otros tipos de cáncer han mostrado que su elevada expresión es variable,

por ejemplo se ha encontrado en un 16% (carcinoma de tiroides), 58% (carcinoma

oral), 76% (carcinoma de seno), 81 % (carcinoma colangiocelular) y 98% (cacinoma

de pulmón).33,44,104,106,107,161 En este estudio se halló expresión elevada de GLUT 1 en el

49% de las muestras, de CAIX en el 12% y de HKII en el 8%, datos que se ubican

dentro de los porcentajes de los estudios citados.

7.1.1 Expresión de GLUT1, CAIX, HKI y fenotipos del tumor

El micro-ambiente observado en tumores sólidos bajo el cual las células se

adaptan a condiciones que resultarían ser no benéficas para células de tejidos

normales,20,31 se ha definido por tres fenotipos: el fenotipo hipóxico (bajos niveles de

oxigeno hasta 1%), el fenotipo glicolítico (Incremento de glicólisis) y la acidosis (pH

bajo).22,31 En el modelo propuesto para el desarrollo de cáncer de cuello uterino, se

plantea la participación de estos fenotipos, los cuales pueden medirse mediante

marcadores como GLUT 1, CAIX y HKII, entre otros, de los cuales se ha visto

incrementada su expresión.

El incremento de la expresión de GLUT1 se ha visto correlacionada con el aumento de

los valores que miden fracciones hipóxicas, como lo demuestra el estudio de Airley y

col,161 razón por la que se le considera marcador endógeno de hipoxia. Frente a este

hallazgo MAYER y col43 encuentran resultados contradictorios, ya que en biopsias

hipóxicas la expresión de GLUT1 es negativa o leve y en biopsias normóxicas hay una

expresión moderada y fuerte. En este estudio encontramos que en el 28 % de las

muestras analizadas el patrón de expresión estuvo entre negativo y débil y en el 58%

entre moderado y fuerte, por ello y dado que no medimos directamente hipoxia, se

podría llegar a pensar que los tumores en su mayoría se caracterizaron por ser

normóxicos, sin embargo considerando que en algunas pacientes (16.7%) presentaron

bajos niveles de hemoglobina (anemia) previo al tratamiento, es posible que los

tumores presentaran hipoxia de tipo episódica (aguda), la cual se ha relacionado con la

condición de anemia como se menciona en otro aparte más adelante.

Además de la hipoxia, tal como sucede en otros tipos de cáncer 35,43,94 el incremento de

la expresión de GLUT1 también depende del aumento de glicólisis Yen y col,42 proceso

69

que implica una alta tasa de captación de glucosa y significa elevado gasto energético.

En nuestro caso observamos que solo en el 26% de las muestras fue negativa la

expresión de GLUT 1 y en el 74% hubo expresión, lo que demostraría la necesidad del

requerimiento energético en los tumores en cáncer de cuello uterino, a pesar de que

los niveles de expresión no fueran semejantes en las muestras que fueron positivas.

Algunos autores explican que esas diferencias en los niveles de expresión de GLUT 1

posiblemente sean causados por aspectos como: La heterogeneidad intratumoral,

evento que puede dificultar la evaluación de marcadores moleculares.66,162 La extensión

e intensidad de coloración de marcadores endógenos, las cuales quizá dependan de la

técnica utilizada.50 La clasificación histológica del tejido tumoral analizado, en el que se

hav visto bajos niveles de expresión de GLUT 1 cuando el tumor es pobremente

diferenciado respecto a los moderadamente diferenciados Yen y col,42,50 tal como lo

observamos en este estudio, en el que la mayoría de las muestras fueron

moderadamente diferenciadas. Sin embargo, puede ocurrir que en tejido pobremente

diferenciado la coloración sea intensa, comparando con epitelio displásico y tejido

normal, en el cual la expresión de GLUT 1 se limita a las células basales del epitelio,

como lo muestra el estudio de Mendez y col,34 ese patrón de coloración se ha

relacionado con el proceso de diferenciación de la epidermis.158 Nosotros también

hallamos que la expresión de GLUT 1 estuvo limitada a partes específicas del epitelio

normal, en la zona de transformación y porciones del endocervix. Este patrón de

coloración también se observó con CAIX y HKII.

Otros estudios clínicos han validado a CAIX, al igual que GLUT 1, como

marcador endógeno de hipoxia en carcinoma de cuello uterino avanzado,66,156 porque

se ha encontrado co-localizada con el marcador endógeno hipoxico pimonidazole en

estudios con Inmunohistoquímica.14 En ensayos in vitro se ha demostrado que tanto la

expresión de CAIX como GLUT 1, dependen directamente de la actividad de HIF-1α,

factor que es regulado la mayor parte del tiempo por hipoxia y en ocasiones por

mediadores como citoquinas y factores de crecimiento,83 esta relación causa efecto

sigue siendo tema de investigación.50

MAYER y COL,83 toman como referencia los estudios de Loncaster 66 y Hedley,162 para

proponer dos fundamentos acerca de la expresión de CAIX y su relación con la hipoxia

tumoral: el primero hace referencia a que la ausencia de hipoxia no puede predecirse a

partir de la carencia de la expresión de CAIX, mientras que el segundo considera que

70

la expresión fuerte de CAIX se identifica en tumores que exhiben hipoxia comparada

con tumores normóxicos que carecen de la expresión de CAIX.

Por otra parte Loncaster y col muestran hallazgos adicionales sobre la potencial

relación entre hipoxia y el fenotipo de acidosis.66 Bajo hipoxia el nivel de pH

extracelular se disminuye conllevando a acidosis, conociéndose que la participación de

CAIX ayuda a contrarrestar esta condición. Otros trabajos han encontrado que el

proceso de acidosis extracelular es también inducido vía incremento de glicólisis, lo que

significa que bajo esta condición se eleva la expresión de CAIX.

En nuestro caso encontramos que el 59% de las muestras fueron negativas para CAIX

y el 41% presentaron diferentes niveles de positividad, siendo la débil y fuerte la más

frecuente en la mayoría de tumores moderadamente diferenciados en comparación con

el tejido normal. Este hallazgo apoyaría la tesis que antes mencionamos sobre la

posibilidad de que los tumores evaluados fueron en su mayoría normóxicos, sin

embargo considerando el fundamento expuesto por MAYER y col, esta afirmación

debería estudiarse más a fondo. También podría suponerse que los tumores no

presentaron glicolisis incrementada, por lo que no se estimuló la acidosis extracelular y

por ello tampoco se incrementó la expresión de CAIX. Pero teniendo en cuenta que la

expresión de GLUT 1 ocurrió en un mayor porcentaje de las muestras, este supuesto

no sería válido. Por lo tanto la baja expresión de CAIX podría explicarse así:

posiblemente los tumores presentaron hipoxia aguda, condición que no es suficiente

para inducir CAIX,45 y adicional a la presencia de hipoxia e incremento de glicólisis,

CAIX depende de factores biológicos adicionales, que incluyen alteración en algunas

vías de señalización de transducción, transformación oncogénica162 y densidad

celular.72

Varios estudios muestran que los factores reguladores de GLUT 1 son los mismos que

regulan la expresión de HKII, entre ellos están: el incremento de glicolisis, hipoxia,

estrés, transformación y carcinogénesis.44 Por tal razón se ha considerado que al

tiempo que se da el incremento de GLUT 1 sucede incremento de HKII, además

porque durante el proceso glicolítico, esta enzima contribuye en la retención de

glucosa, contribuyendo así a la obtención del requerimiento energético que favorece el

rápido crecimiento de las células tumorales.107 Por el contrario en este estudio se

observó una considerable diferencia de expresión entre GLUT 1 (49%) y HKII (8%),

71

resultados que hacen pensar que su expresión pudo depender del tipo de tejido

evaluado y de la técnica utilizada.

En lesiones malignas como cáncer de pulmón33 y carcinoma hepático107 se ha visto que

la expresión de HKII se correlaciona con el grado de diferenciación de los tumores, su

mayor detección ha sido en tejidos pobre y moderadamente diferenciados, respecto a

los bien diferenciados. De las muestras estudiadas, el 18.2% (12) fueron positivas para

HKII, correspondiendo el 6.1% (4) a tejidos pobremente diferenciados, el 10.6% (7) a

moderadamente diferenciados y el 1.5 % (1) a bien diferenciado. En el 81.2% restante

no se detecto HKII. Estos datos discrepan de los hallazgos antes descritos,33 107

discrepancia que podría ser explicada por las siguientes razones: La expresión de HKII

es específica de ciertos tipos de tumor, el uso de técnicas distintas a la

Inmunohistoquímica,163 y presencia de heterogeneidad intratumoral.

7.2 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO

Se consideró evaluar la respuesta al tratamiento (radioterapia exclusiva y

radioterapia concomitante a quimioterapia) según control clínico realizado en la

consulta de radioterapia y ginecología a los tres meses de finalizado este (respuesta

mediata), como parámetro y variable de importancia clínica y pronóstica en el manejo

de pacientes con cáncer de cuello uterino, estadios FIGO IIB y IIIB. Se distinguió entre

respuesta (respondedores) y no respuesta.

Se espera que con el uso de este tratamiento mejore la supervivencia de las pacientes,

sin embargo, se ha observado un porcentaje de casos que no responden

adecuadamente, siendo mayor este cuando se da radioterapia exclusiva respecto a

cuándo se acompaña de quimioterapia, situación observada en nuestro estudio. De las

pacientes tratadas con radioterapia exclusiva, el 27.2% no tuvieron respuesta frente al

15.9% de las pacientes tratadas con radioterapia concomitante a quimioterapia. Estos

resultados confirman la recomendación hecha por la Sociedad Americana de Oncología

Clínica, la cual aconseja el manejo terapéutico de radioterapia concomitante a

quimioterapia de pacientes con cáncer cervical localmente avanzado.

La no respuesta al tratamiento, como en los 13 casos reportados podría explicarse por

dos razones: la primera se basa en que los carcinomas escamo-celulares, como el de

72

cáncer cuello uterino, se caracterizan por tener una marcada habilidad de repoblar, es

decir las células se dividen rápidamente reemplazando aquellas que mueren por

radiación o por agentes químicos, hecho que precisa resistencia al tratamiento.10 La

otra posible explicación se relaciona con la participación de diferentes factores

preexistentes que podrían estar involucrados en la respuesta al tratamiento,14-19 tales

como: bajos niveles de hemoglobina (anemia), bajo funcionamiento del sistema

inmune, estatus del tumor, como por ejemplo el grado de diferenciación y el micro-

ambiente tumoral que reúne la hipoxia tumoral, el incremento de glicólisis y acidosis

extracelular.

De los factores biológicos preexistentes analizados en este estudio con relación a los

resultados del tratamiento, a los tres meses de finalizado este, al igual que la

supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad, el microambiente tumoral

tiene gran importancia en cuanto a la respuesta al tratamientom,64,156 por ello este

estudio se enfoco en el análisis de marcadores moleculares que lo representan, tal

como la expresión de las proteínas CAIX, GLUT 1 y HKII.

7.2.1 Expresión y respuesta mediata

Aunque son varios estudios los que se han reportado sobre CAIX, GLUT 1 y

HKII con relación a los resultados del tratamiento en cáncer cervical localmente

avanzado, sobre su relación con la respuesta a los tres meses de finalizado este

(respuesta mediata) aun no hay nada publicado; trabajos como el de Lloret y col,

analizan la expresión de IGF-IR con relación a la respuesta mediata, no encontrando

asociación, sin embargo Moreno y col, analizaron la expresión de IGF-IR, IGF-II y

GAPDH, y reportan un riesgo de 4.6 veces de respuesta inadecuada cuando IGF-IR se

expresa. En nuestro estudio reportamos un riesgo cercano a la significancia de no

respuesta al tratamiento cuando se expresa GLUT 1 y se co-expresan GLUT 1, CAIX y

HKII. Es posible que este hallazgo de no significancia haya dependido del tamaño de

muestra analizado, el cual fue relativamente pequeño y por otra parte, tal vez se deba

al evento de heterogeneidad intratumoral, por el cual se encuentran diferentes niveles

de expresión de las proteínas a sociadas a la respuesta del tratamiento.

Bajo el criterio de los mecanismos de resistencia al tratamiento, se podría pensar que

la expresión de proteínas implicadas en el micro-ambiente tumoral está ausente o es

73

mínima cuando hay respuesta al tratamiento, mientras que esta aumentada cuando no

hay respuesta. Sin embargo lo que se ha visto en los diferentes estudios 14,19,28,42,43,48 y

como se mostró en este trabajo el patrón de expresión las proteínas puede ser

variable, además de encontrar que GLUT 1 se expresó en la mayoría de los casos

mientras que CAIX y HKII presentaron una menor expresión. Estos resultados permiten

confirmar que ocurren cambios en los niveles de expresión de proteínas a nivel intra-

tumoral, como lo representa GLUT 1, previos al tratamiento que pueden influir para

que no haya respuesta, sin embargo se debe tener en cuenta que no es un

requerimiento absoluto, si no que sucede como efecto aditivo de otros mecanismos

biológicos, que desempeñan u papel importante para la respuesta al tratamiento.

7.2.3 Expresión y supervivencia

Un problema clínico en cuanto al manejo del cáncer de cuello uterino ha podido se

establecido entre radioterapia exclusiva o concomitante a quimioterapia cual

tratamiento es el más adecuado, con el fin de favorecer la supervivencia de las

pacientes. A pesar de que los dos tratamientos se han establecido con intención

curativa, se ha visto que las tasas de supervivencia varían entre un 40% y 70% 4,11,12,14

y al compararlos se ha encontrado que la efectividad del tratamiento de radioterapia

concomitante a quimioterapia es mayor, presentando tasas de supervivencia mas altas

respecto al tratamiento de radioterapia exclusiva.5,7

Las tasas de supervivencia a 5 años varían entre pacientes y van disminuyendo en

relación al estadio FIGO, en los casos que las pacientes presentan estadio IIB se ha

visto que la supervivencia es de un 50-80% y de un 25-50% para el estadio IIIB.11,12

Al igual que en los estudios de Loncaster y col66 y Liao y col,156 en este estudio no se

encontró una correlación significativa entre la expresión de CAIX con la supervivencia

libre de enfermedad y la supervivencia global.

Los estudios de supervivencia en relación a GLUT 1, señalan que cuando su ausencia

se asocia significativamente con un aumento de la supervivencia global,43 y puede

existir una tendencia para que se incremente la supervivencia libre de enfermedad.48

74

En este estudio se encontró que las tasas de supervivencia libre de enfermedad y

supervivencia global decayeron entre un 20 a un 80% en un periodo promedio de 2

años cuando se co-expresaban GLUT 1 y HKII. Además se observó que las mayores

tasas de supervivencia libre de enfermedad, a 3 años y medio, y supervivencia global a

4 años y medio, fueron del 65 y 75%, respectivamente, ocurrieron cuando se co-

expresaban GLUT1, CAIX y HKII.

Estos hallazgos hacen pensar que posiblemente hay un efecto de GLUT 1

relacionado con la respuesta al tratamiento, el cual es necesario pero no suficiente, por

lo que requiere del efecto aditivo de la expresión de HKII y CAIX. Por ello se espera

que estas proteínas puedan ser medidas en un número de muestras mayor que

permita ver su importancia como marcadores pronósticos.

7.3 Respuesta al tratamiento y variables clínico-patológicas

Los análisis no mostraron correlación entre las variables clínico-patológicas de

riesgo para no respuesta al tratamiento con la respuesta incompleta. Estos resultados

concuerdan con los de otros estudios que han evaluado variables como: el estadio

clínico, tamaño del tumor, grado de invasión, compromiso del espacio linfo-vascular y

la extensión del tumor más allá del cuello uterino, para ver su asociación con la

efectividad del tratamiento, valorada a través de supervivencia.66,149,156 Mientras que

contradicen los resultados de otros estudios en los que han considerado que el tamaño

y el estadio tumoral son indicadores de pronóstico 59,60 y se sugiere que en la

determinación del tratamiento de pacientes con CCU en estadio FIGO III, debe

considerarse la existencia de subgrupos, de acuerdo a la extensión del tumor 61.

7.4 Niveles de hemoglobina y la respuesta al tratamiento

Se encontró que las pacientes que no respondieron al tratamiento presentaron

niveles de hemoglobina (Hb) menores a 11g/dl, hecho que se considera condición de

anemia, la cual se ha relacionado directamente con hipoxia tumoral, la cual se ha

denominado hipoxia anémica,60,83 estos dos eventos son relevantes en cáncer de cuello

uterino ya que se han asociado con un desfavorable control local de la enfermedad 7,39,83 y bajas tasas de supervivencia.62,86

75

Los resultados del análisis comparativo mostraron que hubo una diferencia

significativa (p= 0.0127) entre los niveles de Hb del grupo de pacientes que no

tuvieron respuesta y el grupo que respondió al tratamiento. Este hallazgo está de

acuerdo con los estudios en que se considera que la anemia es un factor predictor de

riesgo para la respuesta al tratamiento.

En el análisis multivariado, mostró que existe un riesgo cercano a la significancia para

que las pacientes no respondan al tratamiento cuando presentan anemia.

En conjunto estos hallazgos se extienden a la hipótesis sobre tener especial

consideración en aquellos casos de pacientes bajo condición de anemia dado que se

disminuye del nivel de oxigenación del tumor, lo cual repercutiría cuando van a ser

tratadas.60,83

8. CONCLUSIONES

� Mediante este estudio se logró explorar la expresión de GLUT 1, CAIX y HKII en

muestras tumorales de un grupo de pacientes colombianas con cáncer de cuello

uterino en estadios avanzados IIB y IIIB. Hasta el momento no se conoce

alguna publicación en nuestro país, acerca de la expresión de dichas proteínas

en relación a la respuesta al tratamiento.

� Se encontró que GLUT 1 fue la proteína que más se expresó en comparación

con CAIX y HKII, patrón que se observó tanto en muestras en estadios IIB

como IIIB. Este hallazgo conduce a la propuesta de que los tumores de cáncer

de cuello uterino tienen alto consumo de glucosa, proceso asociado al elevado

requerimiento energético que demandan las células para mantener su fenotipo

tumoral.

� Al evaluar GLUT 1 y CAIX se midió de forma indirecta hipoxia tumoral,

hallandose diferencias entre sus niveles de expresión, siendo mayor la de GLUT

1 (74.4%) respecto a CAIX (41%), por lo que se cree que los tumores quizá

fueron normóxicos o tal vez presentaron hipoxia tipo episódica debida a la

heterogeneidad intra-tumoral.

76

� Se observó que la expresión de GLUT 1 y co-expresión de GLUT 1, CAIX y HKII

representa un riesgo de no respuesta al tratamiento, aunque no se halló alguna

asociación significativa. Este hecho señala que el efecto de GLUT 1 es necesario

para la progresión del tumor y es un elemento pre-existente al tratamiento que

puede influir en la respuesta como lo describen otros estudios. Ademas podría

considerarse que su efecto es aditivo, teniendo en cuenta que puede existir un

posible riesgo como el observado cuando se co-expresa con CAIX y HKII.

� El riesgo cercano a la significancia para no responder al tratamiento, cuando se

expresa GLUT 1 y se co-expresa GLUT 1, CAIX y HKII, es un indicio del papel

biológico que puede desempeñar el microambiente tumoral frente a la acción

de las terapias estándar para el manejo de cáncer de cuello uterino en estadios

IIB y IIIB.

� Las pacientes que se manejaron con radioterapia exclusiva presentaron un

menor porcentaje (30,2%) de respuesta al tratamiento respecto al de aquellas

que fueron manejadas con radioterapia concomitante a quimioterapia (69,8%).

Esta diferencia marcada, es consistente con los estudios clínicos que muestran

mejores resultados del tratamiento cuando combina la radioterapia y la

quimioterapia.

� Al comparar los niveles de hemoglobina (Hb) entre el grupo de pacientes con

respuesta y el grupo que no tuvo respuesta, se encontró que niveles de (Hb)

≤11g/dl confieren una desventaja para la efectividad de los tratamientos de

radioterapia exclusiva o concomitante con quimioterapia.

� Aunque no se obtuvieron asociaciones significativas entre la expresión de las

proteínas y supervivencia, se observó que tasas de supervivencia global y libre

de enfermedad decayeron en un 20% cuando se co-expresaron GLUT 1 y HKII,

y aproximadamente hasta un 80% cuando se co-expresaron GLUT 1, CAIX y

HKII.

77

9. RECOMENDACIONES Y PERSPECTIVAS

Es necesario realizar investigaciones futuras de corte prospectivo que

permitan continuar con el estudio de biomarcadores en cancer de cuello

uterino, incluyendo un tamaño de muestra mayor con el fin de potenciar el

valor estadistico y encontrar asociaciones significativas con la respuesta

mediata al tratamiento y la supervivencia.

El estudio e identificación de factores biológicos preexistentes como la

expresión de CAIX, GLUT 1 y HKII, y nivel de hemoglobina en muestras de

tumores de pacientes con cáncer de cuello uterino avanzado antes de ser

sometidos a tratamiento, que pueden influir en la respuesta al tratamiento y

que pueden llegar a considerarse como marcadores predictores de respuesta,

permitirán a futuro escoger el mejor tratamiento para cada paciente de forma

individual.

Generar interés en la investigación clinica para que se vincule al estudio

y la identificación de biomarcadores en cancer de cuello uterino, involucrados

en la progresión del tumor y que son posibles candidatos para prediccción de

respuesta al tratamiento.

78

Anexo 1

DATOS DE LAS PACIENTES INCLUIDAS EN EL ESTUDIO De las 66 pacientes incluidas e el estuodio se tuvieron en cuenta los siguientes datos:

A- Datos clínicos:

• Datos personales: edad, nº de historia clínica

• Fecha de consulta por primera vez a ginecología en el INC.

• Condición física de la paciente según criterios del Índice de Karnofsky (IK),

evaluada antes del tratamiento. (En los casos de reporte del estado físico según la

escala ECOG, se hizo la homologación a IK). (Anexo 2)

• Valores de Hemoglobina (Hb- d/L), antes y después del tratamiento.

• Estadio clínico según FIGO – IIB y IIIB.

• Volumen tumoral reportado en unidad de centímetros, evaluado en ginecología

antes del tratamiento y tres meses después de finalizarlo.

• Localización del tumor

• Compromiso de parametrios (ligamentos de tejido laxo ubicados a lado y lado

útero que ayudan a sostenerlo)

B- Datos Histopatológicos:

• Numero de protocolo de la biopsia incluida en parafina

• Reporte histopatológico de la biopsia tomada a cada paciente

C- Datos del tratamiento:

• Fecha de inicio y finalización del tratamiento

• Tipo de tratamiento recibido (radioterapia exclusiva o radioterapia concomitante a

quimioterapia).

• Dosis de radioterapia recibida reportadas en unidad de cGY: radioterapia externa

(teleterapia) y braquiterapia (radiación a puntos A y B)

• Dosis de quimioterapia - Cisplatino suministrado a cada paciente, reportada en

unidad de mg.

• Respuesta mediata al tratamiento (evaluada en ginecología según criterios OMS,

teniendo en cuenta el volumen del tumor tres meses después de finalizar el

tratamiento).

79

Anexo 2

ESCALAS DEL INDICE KARFSNOFSKY Y ECOG

La oncología ha introducido en clínica el concepto de calidad de vida, valorada

mediante diversos índices, dos de los cuales KARNOFSKY y ECOG, son los más

utilizados por su fácil aplicación.

En este estudio se hizo la homologación de los valores ECOG a la escala del IK,

reportados para 12 de las 66 pacientes incluidas, a quienes se les evalúo su estado

físico según criterios ECOG durante la primera consulta de ginecología. Actualmente en

el servicio de radio-oncología del INC el índice IK es la escala estándar utilizada para

valorar las pacientes antes de realizar los tratamientos de radioterapia exclusiva y

radioterapia concomitante a quimioterapia.

Indice de Karnosfky: Se valora de 0 a 100%. Fue utilizado por primera vez en 1948

para valorar el estado funcional de pacientes oncológicos tratados con quimioterapia.

Desde entonces este índice funcional ha sido ampliamente usado en estudios clínicos

mostrando buena correlación con otras medidas funcionales y del bienestar 164. Entre

sus aplicaciones están el establecer criterios de conveniencia para llevar a cabo

distintos tratamientos en pacientes con cáncer, medir de forma global el estado

funcional en pacientes oncológicos, predecir la evolución y supervivencia en dichos

pacientes 164.

Escala ECOG (OMS): Se estima de 0 a 5. Fue diseñada por el Eastern Cooperative

Oncologic Group (ECOG) de Estados Unidos y validada por la OMS. Mide la calidad de

vida de un paciente oncológico, cuyas expectativas de vida cambian en el transcurso

de meses, semanas e incluso días. La principal función de esta escala es la de objetivar

el resultado del tratamiento oncológico teniendo en cuenta la calidad de vida del

paciente.

80

Homologación entre los valores de IK y la escala ECOG

Criterios de clasificación para el Índice de Karnosfky y la escala ECOG.

Fuente tomada de http://www.secpal.com/foro/index.php?acc=vermsg&idmsg=1388

Índice de Karnofsky (%) Escala ECOG

100 – 90% 0

80 – 70% 1 60 – 50% 2

40 – 30% 3

20 – 10% 4

20 - 0% 5

IK ECOG

100 %

Normal, sin quejas, faltan indicios de la enfermedad. Actividad completa, puede cumplir con todos sus quehaceres al igual que antes de la enfermedad, sin ninguna restricción.

90 %

Capaz de llevar a cabo actividad normal, pero con signos o síntomas leves de la enfermedad.

0

Completamente activo, capaz de realizar toda actividad previa a la enfermedad sin restricciones.

80 %

Actividad normal con esfuerzo, unos signos o síntomas de la enfermedad.

70 % Capaz de cuidarse, incapaz de llevar a cabo actividad normal, o trabajo activo.

1

Tiene que limitar las actividades que requieren esfuerzos, pero sigue siendo ambulatorio y capaz de llevar a cabo trabajos ligeros o sedentarios.

60 % Requiere atención ocasional, pero es capaz de satisfacer la mayoría de sus necesidades.

50 % Necesita ayuda importante y asistencia médica frecuente.

2

En régimen ambulatorio y capaz de cuidarse, pero incapaz de llevar a cabo cualquier trabajo. Tiene que quedarse en cama durante < 50% de las horas de vigilia.

40 % Incapaz, necesita ayuda y asistencia especiales, hospitalización indicada; aunque la muerte no sea inminente.

30 % Totalmente incapaz, necesita hospitalización y tratamiento de soporte activo.

3

Capacidad limitada para cuidarse, en cama durante >50% de las horas de vigilia.

20 % Muy gravemente enfermo, tratamiento activo necesario.

10 % Moribundo irreversible.

4

Totalmente incapaz de cuidarse, confinado a la cama por completo.

0 % Muerto 5 Muerto

81

Anexo 3

PROTOCOLO DE INMUNOHISTOQUIMICA (IHQ)

En la estandarización de la técnica se utilizó el estuche Dako En vision + Dual Link system-HRP. Su realización se llevo a cabo en los siguientes pasos:

1. Desparafinar los tejidos CCU y tejidos control montados en las láminas cargadas, colocándolos en el horno a 60ºC mínimo 2 horas hasta 96 horas y luego pasándolos por tres xiloles y tres alcoholes entre 2-5 minutos cada pase.

2. Bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena, colocando los tejidos en una solución de H2O2 al 6% por 7 minutos.

3. Eliminación del H2O2, lavando las láminas con PBS para adicionar los anticuerpos primarios.

4. Incubación con los anticuerpos primarios por 45 minutos a temperatura ambiente.

5. Segundo lavado de las láminas con PBS para adicionar el anticuerpo secundario.

6. Incubación con el anticuerpo secundario durante 30 min, el cual viene marcado

con biotina más el complejo estreptavidina-peroxidasa del kit Dual Link system-HRP.

7. Ultimo lavado con PBS para realizar la reacción de revelado.

8. Adición del cromógeno 3,3`diaminobencidina (DAB-chromogen + substrate buffer; Dako), en una dilución de 2:1.

9. Contra-tinción de las láminas con hematoxilina por 1 minuto.

10. Montaje de las láminas para su evaluación.

82

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