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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA

HIPOXIA EN LA SUPERVIVENCIA DE

CELULAS TUMORALES Y ENDOTELIALES

SOMETIDAS A RADIACIONES IONIZANTES

Paulo Alejandro Quintero Mejía

M.Sc. Física Médica

16/04/2013

1

Contenido

•Antecedentes

•Análisis y resultados

•Conclusiones y recomendaciones

•Agradecimientos

•Referencias

Contenido

2

Se estandarizaron las técnicas para el cultivo y conteo de

supervivencia celular, con lo cual se analizó el efecto

previo de la hipoxia en ambientes controlados de líneas

tumorales, así mismo la respuesta de células endoteliales

sanas.

Contenido

3

Eventos por radiación:

Estado del arte

Adaptado de E.I. Azzam et al. / Cancer Letters 327 (2012) 48–60 4

Estado del arte

Radiólisis del agua

Adaptado de E.I. Azzam et al. / Cancer Letters 327 (2012) 48–60

5

Estado del arte


Estado del arte

Adaptado de E.I. Azzam et al. / Cancer Letters 327 (2012) 48–60

Auger Decay Calculations with Core-Hole Excited-State Molecular Dynamic Simulations of Water O. Takahashi, M. Odelius, D. Nordlund, A. Nilsson, H. Bluhm and L. G. M. Pettersson J. Chem. Phys. 124 (2006) 064307.

Electrón acuoso

8

Estado del arte

Supervivencia Celular

Albert van der Kogel. Basic Clinical Radiobiology. Hodder Arnold, 2009.

EVENTOS DIRECTOS

EVENTOS INDIRECTOS

DAÑOS LETALES

DAÑOS SUB LETALES

9

Estado del arte

Posibles eventos

Giaccia Amato J. Hall Eric. Radiobiology for the radiologist, 6th edition. 2006.

Daño letal

Daño sub letal

Daño potencialmente

10

Estado del arte

Importancia del oxígeno

The role of the hypoxia-inducible factor in tumor metabolism growth and invasion. Bull Cancer 2006 ; 93 (8) : E73-80 11

Estado del arte

Condiciones adaptativas

The role of the hypoxia-inducible factor in tumor metabolism growth and invasion. Bull Cancer 2006 ; 93 (8) : E73-80 12

Estado del arte

En radioterapia

van der Kogel, A. Joiner, M. (ed.) Basic Clinical Radiobiology Hodder Arnold, 2009

Se busca re-oxigenar

13

Estado del arte

Mapas variables de hipoxia durante el transcurso la

radioterapia

14

Estado del arte

Mapas variables de hipoxia durante el transcurso la

radioterapia

15

Estado del arte

Supervivencia celular

Albert van der Kogel. Basic Clinical Radiobiology. Hodder Arnold, 2009. 16

Estado del arte



Estado del arte



Daño letal

18

Estado del arte


Daño sub letal

19


Estado del arte



Estado del arte

Supervivencia / Nivel de Oxigeno


EJE DE INVESTTIGACIÓN

Se analizó el efecto de los estados previos de hipoxia en la

supervivencia celular de líneas tumorales de cérvix y colon

al ser sometidos a radiaciones ionizantes.

Problema de investigación

22

Metodología

Metodología

Albert. Biología molecular de la célula. Barcelona: Omega, 2004.


Cultivos celulares

1. HeLa : Cáncer epitelial de cérvix

2. HT-29: Cáncer epitelial de recto

3. EA.hy926: Células endoteliales

Metodología

24

Por qué células endoteliales?

Metodología

Esther A. Kleibeuker, Arjan W. Griffioen. Combining angiogenesis inhibition and radioyherapy: A double edge sword. 25

Cultivos celulares




NORMOXIA

Cultivadas en un medio DMEM (Dubelco's Modied Eagle's medium -Gibco)

suplementado con suero fetal bobino (SFB) al 10 %. Crecimiento exponencial en

monocapa con una atmosfera a 5% de CO2 y 37°C durante 14 días para obtener

una confluencia de 90-100%.

Metodología

26

HIPOXIA FÍSICA

Se usó una cámara aislada C-Chamber (Biospherix) y un controlador de

concentración de oxígeno y dióxido de carbono Proox C-21 (Bioospherix) con la

composición de gases de 5%CO2, 1%O2 balanceado con N2 y una temperatura de

37°C. Confluencia del 70 - 80% con medio de cultivo fresco, 24h en condiciones

estables de gases.

Metodología

27

Cultivos celulares




HIPOXIA QUÍMICA

Se usó un mimético de hipoxia llamado mesilato de deferoxamina (DFO, Sigma

D95333) confluencia del 70 - 80 %, previo cambio de medio de cultivo,

condiciones en incubación a 5% CO2, a 37°C durante 24h.

28

Metodología

Cultivos celulares




Construcción del simulador físico para irradiar

Metodología

Densidad electrónica agua 3.344 *10E23 e-/g Densidad electrónica parafina 3,238*10 E23 e-/g Densidad electrónica aire 3.077*10E23 e-/g Harold Elford Johns. The physics of Radiology. Charles C. Thomas, 1983.

29

Verificación dosimétrica: Índice gamma.

Metodología

Sasa Mutic Purdy J. A. Low D. A., Harms W. B. A thecnique for the quantitative evaluation of dose distributions. Med Phys,

25:656661, 1998. 30

Metodología

Conteo de colonias

Supervivencia (S) / Eficiencia de sembrado (ε)

31

Metodología

Conteo de colonias

- Umbral 8bits - - imagen calibrada - - Resultado del conteo –

CONTEO AUTOMÁTICO 32

Metodología

Conteo de colonias

Conteo manual sobre la imagen

33

Metodología

Construcción de las curvas

Gnuplot Paquete matemático

34

Resultados

Resultados

35

Resultados

Simulador físico y planeación dosimétrica

36

Verificación dosimétrica

Imagen planeada (de Eclipse) Imagen coincidencia de distribcnes Imagen medida (MapCheck)

Factor gamma medio= 0.1

Resultados

37

Resultados

Conteo de colonias

g(x) =0, 994x + 6,49 dando una diferencia aprox del 0.6% y un p2 = 0,96

38

Resultados

Construcción de la curva

p2=0,00175 // α/β=3, 57

39

Variación del tipo de radiación

“OER”= 0.4

“OER”= 1.85

Electrones 6MeV Fotones 6MV

Normoxia Hipoxia Física Hipoxia Química

Alfa 0,1077 0,0708 0,207

Betha 0,0605 0,0496 0,0595

Alfa/Betha 1,78017 1,42742 3,47899

D50 2,6 3,14 2,06

Resultados

40

Comparación del efecto de la energía

Resultados

41

Comparación condiciones de normoxia e hipoxia células HeLa

con Fotones 6 MV

Resultados

42

Células HT-29

α/β= 7,87Gy

Resultados

43

Efecto de la hipoxia

Resultados

“OER”= 2.4 “OER”= 2.7

44

Células EAhy

Resultados

45

Comparación de curvas de supervivencia celular en

normoxia con fotones 6 MV

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Resultados

D50 = 5,67 D50 = 2,18 D50 = 2,60

Resultados

46

Comparación de curvas de supervivencia celular en

hipoxia física con fotones 6 MV

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Resultados

D50 = 2,54

D50 = 1,69

D50 = 3,14

Resultados

47

Conclusiones y recomendaciones

• Existe un comportamiento coherente de la supervivencia de las células que

obedece al modelo lineal cuadrático para regiones de bajas dosis.

• La hipoxia modifica la respuesta celular en términos de supervivencia

actuando como un agente radiosensibilizador o radioprotector de acuerdo a

las características de la energía, el agente estresor y la línea celular.

• El tipo de energía con que se irradió no varió el comportamiento en la

supervivencia en términos globales

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Conclusiones

48

Conclusiones y recomendaciones

• Las células endoteliales muestran comportamientos similares a las líneas

tumorales en cuanto a la supervivencia entro de los ensayos de

comparación en hipoxia, empero no mostraron una variación significativa

en supervivencia global cuando fueron irradiadas en condiciones de

hipoxia.

• Se verifica que al variar la energía de la radiación, su capacidad de

penetración en el tejido es distinta, de modo que los efectos químicos y

biológicos sobre las células son diferentes, lo que repercute en la

supervivencia global. Por lo tanto , los coeficientes α/β , relacionados, son

independientes entre sí y no pueden compararse definitivamente con los

valores teóricos que se reportan en la bibliografía

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Conclusiones

49

A futuro…

La continuación de la investigación tiende a reproducir ambientes tumorales

cercanos a la realidad incluyendo cultivos celulares tridimensionales.

50

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Bibliografía

52

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