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INFORME FINAL
SIP 20080580
Evaluación de la toxicidad producida por diclofenaco adicionado al
agua sobre Daphnia magna
Galar-Martínez M.1*, Gómez-Oliván L.2, Amaya-Chávez A.2, Razo-Estrada A.C. 1, García-
Medina S. 1
1 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN, Sección de Graduados.
2 Facultad de Química, Departamento de Farmacia, Universidad Autónoma del Estado de
México.
1. RESUMEN
La toxicidad producida por diversos contaminantes tales como metales pesados,
hidrocarburos y plaguicidas a los ambientes acuáticos ha sido ampliamente evaluada. Sin
embargo, son pocos los estudios relativos a los productos farmacéuticos y de higiene
personal a nivel mundial y en nuestro país son prácticamente inexistentes. Cabe destacar
que la comercialización de estos productos requiere la previa realización de estudios de
seguridad y toxicidad preclínica y clínica, pero desafortunadamente no se incluyen
pruebas para definir el impacto que ocasiona su desecho al ambiente.
En México los medicamentos son utilizados de forma irracional y uno de los grupos de
fármacos más empleados son los antiinflamatorios no esteroideos, entre los que se
encuentra el diclofenaco. Este principio activo es encontrado en una gran variedad de
formas farmacéuticas y su venta no requiere receta médica.
Debido a lo anterior, es de gran importancia realizar estudios toxicológicos para evaluar el
impacto que el diclofenaco puede producir al ambiente, siendo indispensable el uso de
especies centinela tales como Daphnia magna.
En este trabajo se realizaron 2 tipos de estudio: Evaluación de la toxicidad aguda
(determinación de la concentración letal media) y evaluación de la toxicidad subaguda
(determinación del estrés oxidativo producido a concentraciones subletales del fármaco.
Originalmente se planteó utilizar solo agua como matriz de prueba y D. magna como
bioindicador. Sin embargo, debido a la importancia de los sedimentos las pruebas fueron
realizadas también en esta matriz, utilizando a H. azteca como bioindicador.
Los resultados del estudio agudo muestran que el diclofenaco es tóxico para ambas
especies y matrices probadas a concentraciones por debajo de 1 mg/L, siendo éstas
consideradas como riesgosas por la legislación europea y norteamericana.
En cuanto a los estudios de toxicidad subletal, el fármaco produjo estrés oxidativo
(incremento del grado de lipoperoxidación y proteínas oxidadas, así como alteración de la
actividad de las enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa, catalasa y glutatión
peroxidasa) en ambas especies y matrices probadas.
2. INTRODUCCIÓN
2.1 El agua y los fármacos
Los productos farmacéuticos, tales como analgésicos, antibióticos, anticonvulsivantes,
psiquiátricos, hormonas y otros, se han encontrado en cuerpos de agua alrededor de todo
el mundo, siendo introducidos al ambiente después del uso en pacientes y animales, ya
que son excretados de forma inalterada o como metabolitos a través de la orina o las
heces en las descargas de agua doméstica hacia ríos y lagos. Aunque una pequeña parte
de estos productos puede ser removida por plantas tratadoras antes de ser reintroducida a
los cuerpos de agua, la gran mayoría persiste, y en nuestro país son pocas las plantas de
este tipo.
Una vez descargados al agua, los fármacos pueden afectar a la biota de la columna de
agua o bien adsorberse a la fase sólida; sólidos suspendidos, sedimentos o bentos, mismo
que puede también verse afectado.
2.2 Efecto de fármacos sobre la biota acuática
Un fármaco de uso humano no necesariamente producirá una actividad similar en otros
organismos, ya que el mismo blanco puede gobernar diferentes procesos en diferentes
especies. Esto es especialmente importante para los invertebrados, los cuales son
genéticamente diferentes a los humanos, pero comparten características metabólicas,
tales como la formación del ATP.
Diversas investigaciones han demostrado que los fármacos y sus metabolitos en el
ambiente producen diversos efectos tóxicos sobre la biota. Así, Jones y cols. (2004),
indican que diversos antibióticos tienen el potencial de inhibir el crecimiento de las
bacterias encargadas de la degradación de la materia orgánica y por lo tanto interfieren
con el proceso de nitrificación y desnitrificación. Por su parte, Nentwing (2007) reportó que
la fluoxetina disminuye el crecimiento del alga Pseudokirchneriella subcapitata y la
fecundidad de Ceriodaphnia dubia, por lo que este fármaco tiene la capacidad de afectar a
los organismos que habitan en los sedimentos así como en la columna de agua.
En peces se ha reportado que los medicamentos beta-bloqueadores tienen un efecto
inhibidor de la actividad espermática en algunas especies. Otros estudios refieren la
producción de vitalogenina en peces machos debido a componentes estrogénicos en el
agua que habitan, de tal modo que afectan el contenido de sus hormonas sexuales y su
homeostasis. Además Nentwing (2007) indica que el etilenestradiol afecta de forma
considerable la vida acuática en concentraciones de 10 ng/L, particularmente a la
población de peces.
Un estudio de toxicidad crónica (Heckmann, 2007) realizado con Ibunoprofeno
(antiinflamatorio no esteroide) sobre Daphnia magna mostró la disminución del
crecimiento, así como la reducción de la reproducción de los organismos.
En la India y Pakistán en 2004, ocurrió la muerte de tres especies de buitres a causa de un
analgésico y antiinflamatorio ampliamente utilizado para uso veterinario, el diclofenaco.
Estudios posteriores encontraron que éste producía falla renal debido a la acumulación de
ácido úrico en el cuerpo y malfuncionamiento renal.
De acuerdo a la clasificación de peligro ambiental y valoración de riesgo de ingredientes
farmacéuticos en Suecia (2002), el diclofenaco esta clasificado como peligroso para el
ambiente, además se considera que es potencialmente bioacumulable.
Pruebas realizadas con diclofenaco sobre hepatocitos humanos y de ratas demostraron
que este fármaco puede inducir apoptosis posiblemente mediante la generación de
especies reactivas de oxígeno a causa de uno de sus metabolitos principales, el 5OH-
diclofenaco. Diversos estudios realizados en especies acuáticas, tales como Oryzias
latipes y Oncorhynchus mykiss demostraron que el diclofenaco produce daño celular así
como apoptosis e incremento en la expresión del gen para la producción de
vitalonogenina, por lo cual este fármaco puede ser un potencial agente estrogénico.
2.3 Legislación y valoración del riesgo ambiental para nuevos fármacos
Los requerimientos legales en algunas regiones como Europa, Estados Unidos y Canadá,
exigen una valoración del riesgo ambiental para los nuevos fármacos que van a ser
introducidos al mercado, donde se realizan estudios ecotoxicológicos en tres o cuatro
especies diferentes (algas, Daphnia sp y peces) para valorar su comportamiento en el
ambiente.
Para estos estudios es necesario calcular la concentración de fármaco que va a ser
introducida al ambiente, basada en cinco años de producción. Si la concentración del
fármaco o la de alguno de sus metabolitos es menor a 1 μg/L (1 ppb), es considerado
como aceptable y se le asigna una categoría de exclusión para posteriores análisis. Por el
contrario si la concentración es mayor a 1 μg/L se tiene que realizar una batería de
pruebas ecotoxicológicas, las cuales incluyen efectos en la respiración microbiana y
pruebas de toxicidad aguda en al menos una especie de alga, un invertebrado y un pez.
Las pruebas de toxicidad crónica son necesarias si el fármaco tiene la capacidad de
bioacumularse.
Con respecto a México, en la actualidad no se cuenta con alguna legislación que
contemple la presencia de productos farmacéuticos o de cuidado personal en el agua,
mucho menos limites permisibles de estos.
2.4 El diclofenaco
El diclofenaco (fig. 1) es un derivado del ácido benzenoacético, ejerce una acción
antiinflamatoria, analgésica y antipirética. El mecanismo de acción no esta totalmente
descubierto, pero se cree que actúa inhibiendo la síntesis de prostaglandinas causada por
la inhibición de la enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2). Su potencia es sustancialmente
mayor que la de la indometacina, naproxeno y otros medicamentos. Además disminuye
las concentraciones intracelulares del ácido araquidonico libre, en leucocitos. Existe
evidencia de que inhibe las funciones de la lipooxigenasa, por lo que reduce la formación
de leucotrienos (sustancias inflamatorias). También inhibe la producción de la enzima
fosfolipasa A2 en su mecanismo de acción.
Figura 1. Estructura química del diclofenaco.
2.4.1 Toxocinética
Absorción: después de la administración oral, el diclofenaco se absorbe rápida y
completamente en el tracto gastrointestinal.
Distribución: La concentración plasmática máxima se alcanza en una hora. La unión a
proteínas es del 99%.
Biotransformación: sufre el efecto del primer paso en un 60%, pasa a la circulación sin
cambio. Se metaboliza en el hígado por acción de la isoenzima de la subfamilia CYP2C
del citocromo P450 para 4-hidroxidiclofenaco que es el metabolito principal y otras formas
hidroxiladas; después de la glucoronidación y sulfatación.
Excreción: Se excreta en la orina (65 %) y por la bilis (35 %). Más del 90% es excretado
en 72 horas. El tiempo de vida media oscila entre 2 horas. Se acumula en el líquido
sinovial después de su ingestión, lo cual explica la duración del efecto terapéutico que es
mucho más larga que su vida media plasmática.
En el medio ambiente, la fotodegradación ha mostrado que es importante para la
degradación de algunos de sus componentes.
2.4.2 Toxodinamia
Se presentan efectos gastrointestinales. En el 5 al 15 % de los pacientes tratados
presentan un aumento ligero en los niveles de transaminasas hepáticas en plasma.
Efectos en el sistema nervioso central, erupciones, reacciones alérgicas, retención de
líquido y edema, en raras ocasiones se presenta deficiencia en la función renal. Interfiere
con el efecto antiplaquetario de la aspirina.
3. JUSTIFICACIÓN
El agua es indispensable para todos los organismos vivos y para las actividades
productivas del hombre. Sin embargo, su uso desmedido y la contaminación generada por
diversos procesos antropogénicos pone en riesgo la preservación de este recurso, la salud
humana y la integridad de los ecosistemas.
La toxicidad producida por diversos contaminantes tales como metales pesados,
hidrocarburos y plaguicidas a los ambientes acuáticos ha sido ampliamente evaluada. Sin
embargo, son pocos los estudios relativos a los productos farmacéuticos y de higiene
personal a nivel mundial y en nuestro país son prácticamente inexistentes. Cabe destacar
que la comercialización de estos productos requiere la previa realización de estudios de
seguridad y toxicidad preclínica y clínica, pero desafortunadamente no se incluyen
pruebas para definir el impacto que ocasiona su desecho al ambiente.
En México los medicamentos son utilizados de forma irracional y uno de los grupos de
fármacos más empleados son los antiinflamatorios no esteroideos, entre los que se
encuentra el diclofenaco. Este principio activo es encontrado en una gran variedad de
formas farmacéuticas y su venta no requiere receta médica.
Debido a lo anterior, es de gran importancia realizar estudios toxicológicos para evaluar y
conocer el impacto que el diclofenaco puede producir al ambiente.
3. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la toxicidad producida por el diclofenaco adicionado al agua y al sedimento sobre
Daphnia magna y Hyallela azteca.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.1.1 Determinar la toxicidad aguda producida por el diclofenaco adicionado al agua sobre
Daphnia magna.
3.1.2 Determinar la toxicidad aguda producida por el diclofenaco adicionado al sedimento
sobre Hyallela azteca.
3.1.3 Determinar el daño subletal producido por el diclofenaco adicionado al agua y al
sedimento sobre Daphnia magna y Hyallela azteca, mediante la evaluación del estrés
oxidativo utilizando los siguientes biomarcadores: concentración de proteínas totales,
grado de lipoperoxidación, actividad de superóxido dismutasa, catalasa y glutatión
peroxidasa.
3.1.4 Determinar el daño subletal producido por el diclofenaco adicionado al sedimento
sobre Hyallela azteca, mediante la evaluación del estrés oxidativo utilizando los siguientes
biomarcadores: concentración de proteínas totales, grado de lipoperoxidación, actividad de
superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa.
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Obtención y cultivo de los organismos de prueba
Los organismos utilizados fueron neonatos de Daphnia magna y Hyallela azteca cultivados
en el laboratorio sin exposición previa a contaminantes y se mantuvieron en agua sintética
NaHCO3 = 174 mg/L, MgSO4= 120 mg/L, KCl = 8 mg/L y CaSO4 ⋅2H2O = 120 mg/L. Las
características fisicoquímicas del medio consistieron: dureza medida a través de CaCO3 =
170 ± 10 mg/L, pH = 8.2 ±1º C, oxígeno disuelto = 5.48 ± 1º C y conductividad = 510
μhom/ cm. Los organismos fueron alimentados ad libitum con el alga Chlorella vulgaris.
4.2 Preparación de sedimentos artificiales
Los sedimentos artificiales serán preparados mezclando 70% de arena (tamaño de
partícula 0.05 a 0.2 mm), 20% de caolinita (tamaño de partícula < 0.002 mm) y 10% de
materia orgánica (tamaño de partícula de 0.2 mm). El origen de la materia orgánica será
excremento de bovino. Éste será inactivado por medio de calentamiento de 55-60 oC por
un periodo de 3 días. El sedimento artificial será esterilizado en autoclave durante 3 ciclos
de 15 min. a 121º C y 15 lb de presión por intervalos separados de una hora. El
sedimento será almacenado en contenedores de polietileno hasta su uso.
4.3 Determinación de la toxicidad aguda
Se probaron cinco diferentes concentraciones de diclofenaco adicionado al agua sintética
y a sedimentos artificiales. Se colocaron 10 organismos en cada sistema y un testigo que
no contenía diclofenaco (los bioindicadores fueron Daphnia magna para agua y Hyallela
azteca para sedimentos). Se observaron los sistemas por 48 horas y se determinó el
número de organismos muertos al finalizar el periodo de estudio. La CL50 de diclofenaco
se determinó a las 48 horas (CL50 48 horas) mediante el método de probits. El estudio se
realizó por quintuplicado.
4.4 Determinación de la toxicidad subletal
Se prepararon sistemas con agua sintética o sedimentos artificiales adicionados con
diclofenaco a una concentración equivalente a 1/10 CL50 obtenida del estudio agudo.
Posteriormente se incorporó 1 g del organismo de prueba (los bioindicadores fueron
Daphnia magna para agua y Hyallela azteca para sedimentos) y se expusieron durante 48
h. Transcurrido el tiempo de exposición, los organismos fueron homogeneizados para la
determinación del estrés oxidativo.
4.4.1 Homogeneización de tejido
Se pesó 1 g de tejido, se cortó finamente y se le adicionaron 2.0 mL de buffer de fosfatos a
pH 7.2. Posteriormente se homogeneizaron en forma mecánica durante un minuto y se
ultracentrifugó durante 15 min a 12,500 rpm a 4ºC. Finalmente se separó el sobrenadante
para la determinación del contenido de proteínas totales, el grado de lipoperoxidación y la
actividad de enzimas antioxidantes.
4.4.2 Determinación de la concentración de proteínas (Método de Bradford, 1976)
A 25 μL del sobrenadante se le agregaron 75μL de agua desionizada y 2.5 mL del reactivo
de Bradford (0.5 g de azul de commassine, 25 mL de etanol al 96% y 50 mL de H3PO4 en
500 mL de agua desionizada). Se agitaron en las celdas, se dejaron reposar por 5 min y
se determinó la absorbancia a 595 nm. Para la curva tipo se utilizó albúmina bovina
(1mg/mL)
Curva tipo para la prueba de las proteínas
Tubo Albúmina
(μL)*
Agua
deionizada (μL)1 10 90
2 25 75
3 50 50
4 75 25
5 100 0
Blanco 0 100
4.4.3 Determinación del grado de lipoperoxidación (Método de Buege y Aust, 1979)
A 300 µL del homogenizado (sin centrifugar) se le adicionaron 700 µL de la solución
reguladora tris-HCl 150 mM a pH 7.4. Se incubó a 37°C por 30 min. Después de la
incubación se agregaron 2 mL de la solución de ácido tiobarbitúrico al 0.375% (preparar al
momento) en ácido tricloroacético al 15% y se incubó a 37°C por 45 min. Concluido el
tiempo se centrifugó a 3000 rpm por 10 minutos y se determinó la absorbancia a 535 nm.
Los resultados se expresaron en mM de malondialdehído /mg proteínas/g tejido usando el
coeficiente de extinción molecular (CEM) el cual es de 1.56 x 105 M-1cm-1.
4.4.4 Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa (Método de Misra y
Fridovich 1972)
Se adicionaron 100 µL del homogenizado a la celda y se completó a 200 µL con la
solución amortiguadora de carbonatos (50 mM de carbonato de sodio y 0.1 mM EDTA) a
pH 10.2. Se agregaron 200 µL de adrenalina 30 mM, y se determinó la absorbancia a 480
nm, a los 30 seg y 5 min. Las lecturas de las muestras se extrapolaron en la curva tipo que
se obtuvo utilizando los datos de la siguiente tabla.
Curva tipo para la determinación de la SOD
Unidades
SOD
SOD
(µL)*
Adrenalina
(µL)**
Buffer
(µL)***
4.44 71 229 200
6.69 107 193 200
8.88 142 158 200
11.13 178 122 200
13.39 214 86 200
*De una solución de 375 U SOD.
** De una solución de 30 mM adrenalina.
***De una solución de 50 mM de NaCO3, 0.1 mM EDTA, pH 10.2.
4.4.5 Determinación de la actividad de la catalasa (Método de Radi et al, 1991)
A 100 µL del sobrenadante del homogenizado se le agregaron 900 µL de la solución
amortiguadora de aislamiento (0.3 M sucrosa, 1 mM EDTA, 5 mM HEPES y 5 mM
KH2PO4) y 200 µL de la solución de H2O2 20 mM. Posteriormente se determinó la
absorbancia a 240 nm, a 0 y 60 seg. Los resultados se obtuvieron sustituyendo la
absorbancia de ambos tiempos en la siguiente fórmula:
Concentración de catalasa = (A0- A60)/ CEM
Donde el CEM del H2O2 = 0.043 mM-1 cm-1; los datos son expresados en mM de
H2O2/min/g tejido.
4.4.6 Determinación de la actividad de la glutatión peroxidasa (Gunzler y Flohe,
1985) con modificaciones.
Se tomaron 200 µL de sobrenadante (fracción S9) en celda de cuarzo de 1.0 cm y se
agregaron 800 µL de solución buffer (50 mM de fosfato de potasio pH 7.0; 3.5 mM de
GSH, 1.0 mM de NaN3, 2 U de glutatión reductasa, y 0.12 mM NADPH / 1.0 mL). Se
adicionó 0.1 mL de H2O2 y se registraron la lectura inicial y a los 5.0 min. Se calculó la
actividad de la GPx por min por medio del coeficiente de extinción molar del NADPH de
6.22 nM-1 cm -1.
5. RESULTADOS
5.1 Determinación de la toxicidad aguda
La CL50 de diclofenaco adicionado al agua sobre Daphnia magna (48 horas) es 116.3
mg/L ± 7 mg/L, con un intervalo de confianza del 95 % de 109.3 a 123.7 mg/L. La CL50 de
diclofenaco adicionado al sedimento sobre Hyallela azteca (48 horas) es 46.7 mg/kg ± 9
mg/kg, con un intervalo de confianza del 95 % de 34.4 a 57 mg/kg.
5.2 Determinación de la toxicidad subletal
5.2.1 Determinación de la concentración total de proteínas (Método de Bradford)
Agua/Daphnia magna: En la figura 2, se observa la concentración total de proteínas por
gramo de peso en el testigo (0.6605 mg PT/g tejido) y en el grupo tratado con diclofenaco
(0.5962 mg PT/g tejido). Se observó una disminución de este biomarcador pero no se
encontraron diferencias significativas.
Sedimentos/Hyallela azteca: En la figura 3, se observa la concentración total de proteínas
por gramo de peso en el testigo. Se observó una disminución de este biomarcador,
encontrándose diferencias significativas.
Testigo Expuesto
mg
PT/g
tejid
o
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 2. Contenido total de proteínas en D. magna expuesta a diclofenaco adicionado al
agua.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 12 24 48 72
tiempo de exposición en horas
prot
eina
s to
tale
s (m
gpro
tein
as/g
te
jido)
Figura 3. Contenido total de proteínas en H. azteca expuesta a diclofenaco adicionado al
sedimento.
5.2.2 Determinación del grado de lipoperoxidación (Método de Buege y Aust)
Agua/Daphnia magna: La cantidad de malondialdehído formado en el grupo testigo fue de
1.7353e-4 mmol MDA/g PT, valor menor en comparación con el grupo expuesto con
4.3020e-4 mmol MDA/g PT (fig. 4). No se encontraron diferencias significativas.
Sedimentos/Hyallela azteca: Se observó un incremento del grado de lipoperoxidación
tiempo dependiente, estadísticamente significativo.
Testigo Expuesto
mM
MD
A/g
PT
0.0000
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
Figura 4. Grado de lipoperoxidación en D. magna expuesta a diclofenaco adicionado al
agua.
0.00E+00
5.00E-08
1.00E-07
1.50E-07
2.00E-07
2.50E-07
0 12 24 48 72
tiempo de exposición en horas
nive
les
de L
PO (m
MM
DA
/mg
prot
eina
/gte
jido)
Figura 5. Grado de lipoperoxidación en H. azteca expuesta a diclofenaco adicionado al
sedimento.
5.2.3 Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa (Método de Misra y
Fridovich)
Agua/Daphnia magna: La actividad de la superóxido dismutasa en el grupo expuesto fue
mayor 156.8850 U/mg PT en comparación con el grupo testigo 95.7606 U/mg PT (fig. 6).
No se encontraron diferencias significativas.
Sedimentos/Hyallela azteca: Se observó un incremento en la actividad enzimática tiempo
dependiente, estadísticamente significativa.
Testigo Expuesto
U/ g
PT
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Figura 6. Actividad de superóxido dismutasa en D. magna expuesta a diclofenaco
adicionado al agua.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 12 24 48 72
tiempo de exposición (horas)
SOD
(U/g
de
tejid
o)
Figura 7. Actividad de superóxido dismutasa en H. azteca expuesta a diclofenaco
adicionado al sedimento.
5.2.4 Determinación de la actividad de la catalasa (Método de Radi et al)
Agua/Daphnia magna: En la figura 8, se observa la actividad de la catalasa tanto del
testigo (9.9314 mmol de H2O2 min-1 g PT-1) y del grupo expuesto al diclofenaco (8.7760
mmol de H2O2 min-1 g PT-1). No se encontraron diferencias significativas.
Sedimentos/Hyallela azteca: Se observó un incremento en la actividad enzimática tiempo
dependiente, estadísticamente significativa.
Testigo Expuesto
mm
ol H
2O2/m
in g
PT
0
2
4
6
8
10
12
Figura 8. Actividad de catalasa en D. magna expuesta a diclofenaco adicionado al agua.
Figura 9. Actividad de catalasa en H. azteca expuesta a diclofenaco adicionado al
sedimento.
5.2.5 Determinación de la actividad de la glutatión peroxidasa (Gunzler y Flohe, con
modificaciones).
0.00E+002.00E-024.00E-026.00E-028.00E-021.00E-011.20E-011.40E-011.60E-011.80E-01
0 12 24 48 72
tiempo de exposición en horas
activ
idad
de
la C
AT
(Mm
H2O
2/m
in/g
tejid
o)
Agua/Daphnia magna: En la figura 10, se observa que la actividad de la glutatión
dismutasa en el grupo expuesto es menor (2.8308e-3 μmol/ min mg PT) que en el testigo
(0.0346 μmol/min mg PT). No se encontraron diferencias significativas.
Sedimentos/Hyallela azteca: Se observó un incremento en la actividad enzimática tiempo
dependiente, estadísticamente significativa.
Testigo Expuesto
μ mm
ol/m
in g
PT
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
Figura 10. Actividad de glutatión dismutasa en D. magna expuesta a diclofenaco
adicionado al agua.
0.00E+005.00E-041.00E-031.50E-032.00E-032.50E-033.00E-033.50E-034.00E-034.50E-035.00E-03
0 12 24 48 72
tiempo de exposición en horas
glut
atió
n pe
roxi
dasa
m
Mcm
deN
AD
PH/m
in/g
tejid
o
Figura 11. Actividad de glutatión dismutasa en H. azteca expuesta a diclofenaco
adicionado al sedimento.
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante un análisis de variancia unifactorial
con una p<0.05.
6. DISCUSIÓN
Los fármacos son componentes biológicamente activos, los cuales pueden tener efectos
similares en mamíferos, así como en organismos acuáticos, por lo tanto es posible que los
efectos adversos se puedan presentar tanto en los mamíferos e incluso en vertebrados e
invertebrados. En el país no se ha reportado ningún estudio que evalué la posible
toxicidad sobre organismos acuáticos causada por productos farmacéuticos, por lo que es
importante llevar a cabo la evaluación de la toxicidad de estos productos para conocer el
impacto que estas sustancias tienen sobre el ambiente acuático.
En este estudio se planteó como objetivo principal evaluar la toxicidad del diclofenaco
adicionado al agua sobre Daphnia magna. Sin embargo, se observó la necesidad de
evaluar el efecto tóxico de este fármaco adicionado también a sedimentos, empleándose
como bioindicador a H. azteca, por lo que se realizaron ambos estudios. Uno de los
objetivos específicos planteado fue la determinación de la CL50 de diclofenaco a las 48 H
de exposición, el resultado que se obtuvo tras la exposición de los organismos fue de
116.3 mg/L con un intervalo de confianza del 95 % de 109.3 a 123.7 mg/L para D. magna
expuesta al fármaco adicionado al agua; mientras que para H. azteca expuesta al fármaco
en sedimentos fue de 46.7 mg/kg con un Intervalo de confianza de 34.4 a 57 mg/kg. Un
estudio realizado por Cleuvers (2004), clasificó al diclofenaco como una sustancia de alto
riesgo para Daphnia magna, de acuerdo a la clasificación europea, donde se señala que
una sustancia puede ser potencialmente peligrosa para los organismos acuáticos cuando
su DE50 o DL50 sea menor a 100mg/L, por lo que de acuerdo con los resultados obtenidos,
el diclofenaco podría ser considerado como una sustancia potencialmente dañina para los
organismos acuáticos, ya que el valor de DL50 se encuentra muy cercana a el valor de
referencia en el caso de D. magna y por debajo de este valor para H. azteca..
Tras haber obtenido el valor de la concentración letal media del diclofenaco para ambas
especies, se realizó la evaluación de la toxicidad subletal, mediante la determinación
biomarcadores de la respuesta antioxidante.
Se evaluó el grado de lipoperoxidación, observándose una elevación de éste parámetro
para ambos esquemas de intoxicación y especies evaluadas. Cabe señalar que la
generación de ROS se presenta de forma general en el organismo debido a la reducción
incompleta del oxígeno generando especies reactivas de oxígeno. Adicionalmente,
Gómez y cols (2003), encontraron que durante la biotransformación del diclofenaco, a 5
OH-diclofenaco, se generaban ROS, y se identificó que el fármaco induce la producción de
RL en Oryzias latipes (Schwaiger y cols, 2004), las cuales pueden dañar a lípidos,
proteínas y al material genético.
En cuanto a la actividad de las enzimas antioxidantes, se observó que la superóxido
dismutasa que cataliza la conversión del anión superóxido a peróxido de hidrógeno,
incrementaba su actividad en ambos casos. Este aumento puede indicar que la exposición
al fármaco o a productos de su biotransformación son capaces de generar ROS y un
aumento en la actividad de la SOD como un mecanismo de defensa ante estas especies.
En los organismos expuestos se encontró un incremento de esta actividad enzimática con
referencia al grupo testigo, de acuerdo a Vander Oost (2003) el 22% de los estudios de
laboratorio en peces se reporta una actividad de la SOD elevada.
Como segunda línea de defensa enzimática ante RL y ROS se encuentran la catalasa y la
glutatión peroxidasa, las cuales toman el producto generado por la SOD para generar
oxígeno y agua. En los grupos de D. magna tratados con diclofenaco en agua, la catalasa
se encontró disminuida con respecto al testigo debido a un posible daño generado por el
diclofenaco directamente sobre la enzima, debido a que las ROS y los RL no sólo afectan
a los lípidos, sino las proteínas también son susceptibles de sufrir daño por estas
especies. Sin embargo un efecto contrario se encontró en H. azteca, probablemente como
un mecanismo de defensa. Un efecto similar (disminución de la actividad en D. magna e
incremento en H. azteca) se observó en el caso de la GPX.
7. CONCLUSIONES
• La CL50 encontrada fue de 116.3 mg/L con un intervalo de confianza del 95 % de
109.3 a 123.7 mg/L para D. magna expuesta a diclofenaco adicionado al agua;
mientras que para H. azteca expuesta al fármaco en sedimentos fue de 46.7 mg/kg
con un Intervalo de confianza de 34.4 a 57 mg/kg. Con base a la clasificación
europea puede ser clasificado como peligroso para estos organismos.
• El diclofenaco produjo un aumento del grado de lipoperoxidación en los
organismos, así como modificaciones en la actividad de las enzimas antioxidantes
(incremento de SOD y disminución de CAT y GPX), por lo que este fármaco
provoca estrés oxidativo sobre D. magna y H. azteca a la concentración y tiempo
de exposición probados.
8. IMPACTO
Los resultados obtenidos indican que el diclofenaco tanto en agua como en sedimentos es
letal y capaz de inducir estrés oxidativo en para H. azteca y D. magna a concentraciones
por debajo de las marcadas por la UE como peligrosas para la biota acuática. En nuestro
país, la investigación y en consecuencia legislación acerca de fármacos y productos de
higiene personal son prácticamente inexistentes, por lo que este trabajo sienta un
precedente al respecto y abre la posibilidad de abordar esta problemática en diversos
foros de opinión y toma de decisiones.