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Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y

su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

Liliana Patricia Lesmes Sarmiento

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, posgrado Interfacultades de Microbiología

Bogotá, Colombia

2011

Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y

su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

Liliana Patricia Lesmes Sarmiento

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de: Magister en Ciencias-Microbiología .

Director (a):

José Manuel Lozano Moreno, Químico, DrSc en Ciencias Químicas

Línea de Investigación:

Biología Molecular de agentes infecciosos

Grupo de Investigación:

Grupo Funcional de Biocatálisis, Fundación Instituto de inmunología de Colombia FIDIC

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, posgrado Interfacultades de Microbiología

Bogotá, Colombia

2011

Bienaventurado el hombre que halla la sabiduría y

que obtiene la inteligencia; porque su ganancia es

mejor que la ganancia de la plata, y sus frutos más

que el oro fino.

Proverbios 3-13

A Dios padre celestial a ti te lo debo todo.

A mis padres Luis Enrique y Nohora quienes

con su sacrificio y entrega hicieron posible estar hoy

aquí.

A mi esposo Orlando y a mis hijos Paula

Sofía y Andrés son la razón de mi vida.

Agradecimientos

Mis más sinceros agradecimientos al postgrado Interfacultades de Microbiología de la

Universidad Nacional de Colombia a su directora Martha Raquel Fontanilla y a Socorrito

Prieto. A los diferentes grupos funcionales de investigación de la Fundación Instituto de

Inmunología de Colombia-FIDIC en cabeza del Profesor Manuel Elkin Patarroyo. En

especial al Grupo Funcional Biocatálisis. Al Doctor José Manuel Lozano por sus

enseñanzas, por su entrega, apoyo y dedicación. A la doctora Lilian Spencer-Valero del

Departamento de Biología Celular de la Universidad Simón Bolívar (Caracas, Venezuela)

por la donación de la cepa de Plasmodium yoelii 17XL y a la doctora Silvia Blair del

Laboratorio de Malaria, Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia (Medellín,

Colombia) por la donación de la cepa de Plasmodium berghei ANKA.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La malaria es un problema global de impacto en salud pública causada por parásitos del

género Plasmodium. La obtención de vacunas contra esta enfermedad está limitada por

evasión de la respuesta inmune frente antígenos nativos de carácter peptídico o proteico.

Este trabajo propone el uso de peptido-miméticos diseñados de manera sitio-dirigida

basados en antígenos clave de malaria, para la obtención de nuevos agentes

terapéuticos. Así, se estableció un modelo de infección experimental con P. yoelii y P.

berghei en ratones BALB/c.

Se obtuvieron anticuerpos poli y monoclonales y sus fragmentos F(ab)2’ inducidos por

peptido-miméticos derivados de los antígenos MSP-1 y MSP-2. Se logró el cambio de

isotipo in vitro de inmunoglobulinas IgM a subclases de IgG y su purificación. Estas

inmunoglobulinas revelaron nuevos epítopes no antes reportados.

La transferencia pasiva de las inmunoglobulinas específicas o sus fragmentos F(ab)2’ a

los animales demostró el control de la infección o protección total en algunos casos,

constituyendo una nueva herramienta inmunoterapéutica en malaria.

Palabras clave: péptido-mimético, pseudopéptido, an ticuerpo, F(ab) 2´,

inmunoterapia, vacuna sintética

X Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

Abstract

Malaria is a global problem having impact in public health and is caused by parasites of

the Plasmodium genus. Obtaining new vaccines against this disease is limited by evasion

of the host immune response to native antigens having protein an peptide nature.

The current work has proposed using site-directed designed peptido-mimetics based on

malarial key antigens for obtaining novel therapeutic agents. Thus, an experimental

BALB/c mice infection model was established with both P. yoelii and P. berghei malaria.

Poly- and monoclonal antibodies and their F(ab)2’ fragments induced by peptido-mimetics

from the malarial antigens MSP-1 and MSP-2 were obtained. Immunoglobulin isotype

switch from IgM to IgG sub-classes was afforded as well as their isolation. These

antibodies revealed novel epitopes on the sequence not reported before.

Passive transfer experiments of specific immunoglobulins or their F(ab)2’ fragments into

infected animals demonstrated efficiently controlling the infection or total protection in

some cases constituting a new tool for immunotherapy in malaria.

Key words: peptido-mimetic, pseudopeptide, antibody, F(ab) 2´, immunotherapy, synthetic vaccine

Contenido XI

Contenido

.............................................................................................................................. Pág.

Resumen ........................................... .............................................................................. IX

Lista de figuras .................................. .......................................................................... XIV

Lista de tablas ................................... .......................................................................... XVI

Lista de Símbolos y abreviaturas .................. ................................................................. 1

Introducción ...................................... .............................................................................. 5

Capítulo 1 ........................................ ................................................................................. 7

1.1 Ciclo de vida del Plasmodium falciparum ....................................................... 9

1.2. Proteínas de superficie del merozoito MSP-1 y MSP-2 de Plasmodium falciparum .......................................................................................................... 12

1.4. Anticuerpos ................................................................................................. 14

1.5. Vacunas sintéticas contra la malaria ........................................................... 15

1.6. Pseudopéptidos como nuevos inmunógenos sintéticos .............................. 16

1.9.1. Objetivo general ....................................................................................... 21

1.9.2. Objetivos específicos ............................................................................... 21

2. Capítulo 2 ..................................... .............................................................................. 23

Actividad funcional de anticuerpos policlonales ind ucidos por pseudopéptidos derivados del antígeno MSP-1 del Plasmodium falciparum en conejos Nueva Zelanda............................................ ............................................................................... 23

2.1. Metodología y diseño para la obtención de los pseudopéptidos derivados del antígeno MSP-1 42-61 y evaluación funcional de sus anticuerpos ........ ........................ 23

2.2.1 Análisis bioinformático .............................................................................. 23

2.2.3. Absorción con albúmina sérica bovina de los sueros de conejo .............. 24

2.2.4. Digestión con papaína de inmunoglobulinas para obtención de fragmentos F(ab)2´ ............................................................................................................ 24

2.2.5. Purificación del fragmento F(ab)2' por cromatografía de afinidad ............. 25

2.2.6. Transferencia pasiva de fragmentos F(ab)2´ ............................................ 25

2.2.7. Perfil estructural de los fragmentos F(ab)2´por Dicroísmo Circular (DC) .. 27

2.3.1 Análisis de polimorfismo genético del antígeno MSP-1, diseño y obtención de los análogos modificados y su conjugación a la proteína transportadora de albúmina. .......................................................................................................... 27

2.3.2. Aislamiento y caracterización de anticuerpos policlonales producidos en conejo ............................................................................................................ 30

XII Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

2.3.3. Obtención, purificación y caracterización del fragmento F(ab)2´ ...............37

2.3.4. Mapeo epitópico de los anticuerpos policlonales de péptido 1513 y sus análogos ............................................................................................................38

2.3.5. Patrones de estructura secundaria determinados por dicroísmo circular del péptido 1513 sus análogos y sus fragmentos F(ab)2´ ...................................40

2.3.6 Estudios de estructura secundaria por Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno RMN -1H del péptido 1513 y sus derivados .......................................42

2.4 Ensayos de actividad funcional in vivo de los fragmentos F(ab)2´ ................44

2.4.1 Estandarización del modelo de infección in vivo con P. yoelii ...................44

2.4.2. Inmunización pasiva con los fragmentos F(ab)2´ inducidos por el péptido 1513 y sus análogos pseudopeptídicos .............................................................45

2.5. Ensayos de actividad funcional in vitro de los fragmentos F(ab)2´ ...............47

3. Capítulo 3 ..................................... ..............................................................................51

3.1 Análisis bioinformático .................................................................................51

3.3. Fusión celular ..............................................................................................51

3.4. Inducción del cambio de isotipo por inmunización in vitro de los clones reactivos52

3.5. Purificación de anticuerpos monoclonales ..................................................52

3.5.1. Etapa de precipitación con sulfato de amonio ..........................................52

3.5.2 Etapa de cromatografía de intercambio aniónico ......................................53

3.6. Mantenimiento y cultivo de las cepas de malaria murina P. berghei-ANKA y P. yoelii XL17 .....................................................................................................53

3.8. Transferencia pasiva de anticuerpos monoclonales y desafío experimental54

3.8.1. Tinción de parásitos del Plasmodium con colorante de Wright .................55

3.9. Ensayo de inhibición de la invasión y desarrollo biológico del P. falciparum in vitro 55

3.10 Actividad in vitro de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos con P. berghei ANKA y P. yoelii 17XL ...........................................................................56

3.11 Técnicas inmunoquímicas ..........................................................................56

3.12 Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno (1H- RMN) para análisis de estructura secundaria .........................................................................................58

3.13.1 Análisis de bioinformático y polimorfismo genético del antígeno MSP-2, diseño y obtención de los análogos ...................................................................58

3.13.2 Generación y cultivo de los clones de anticuerpos monoclonales inducidos por los dos análogos del péptido 4044 ...............................................61

3.13.3 Aislamiento, purificación y caracterización de Igs secretadas en los sobrenadantes de los clones inducidos por los pseudopéptidos ψ-128(129) y ψ-130(131) ............................................................................................................63

3.13.4 Estandarización de modelos de infección por malaria con P. berghei y P. yoelii in vivo .......................................................................................................66

3.13.5 Ensayos funcionales con las inmunoglobulinas de isotipo definido IgG3b, IgG3 e IgM in vivo vs P. berghei y P. yoelii ........................................................67

3.13.6 Ensayos funcionales in vitro con las inmunoglobulinas de isotipo definido IgG3b, IgG3 e IgM vs P. berghei y P. yoelii ........................................................71

3.13.7 Ensayos funcionales con las inmunoglobulinas de isotipo definido IgM in vitro vs P. falciparum ..........................................................................................73

3.13.8 Perfiles de estructura de los pseudopéptidos ψ-128 (129), ψ-130 (131) y el péptido 4044 por dicroísmo circular ................................................................74

3.13.9 Estudios de estructura secundaria por Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno RMN -1H ...........................................................................................75

Contenido XIII

4. Conclusiones y recomendaciones ................. .......................................................... 79

A. Anexo: Artículos publicados y sometidos para pub licación ................................. 81

B. Anexo: Reconocimiento de pares académicos a los trabajos publicados ........... 83 C. Anexo: Certificado de calidad de ratones BALB/c

Bibliografía ...................................... .............................................................................. 87

Contenido XIV

Lista de figuras ............................................................................................................................. Pág.

Figura 1-1: Mapa de endemicidad de la malaria 7 Figura 1-2: Ciclo de vida del Plasmodium falciparum 10 Figura 1-3: Principales antígenos expresados en el estadío merozoito del

P. falciparum 10 Figura 1-4: Proceso de invasión al Glóbulo rojo 11 Figura 1-5: Organización genética y procesamiento proteolítico de la proteína

MSP-1. Se muestra la ubicación de los péptidos 1513 y 1585 12 Figura 1-6: Organización genética de la proteína MSP-2. Se muestra

la ubicación del péptido 4044 12 Figura 1-7: Estructura y dominios de la molécula de inmunoglobulina 15 Figura 1-8: Pseudopéptidos como isósteros del enlace peptídico 17 Figura 1-9 : Diseño experimental para la síntesis sitio-dirigida de los pseudopéptidos

ψ-128 y ψ-130 19 Figura 1-10: Derivatización de fenilalanina e isoleucina para la obtención de

sus correspondientes t-Boc-L-aminoácido-aldehídos 20 Figura 1-11: Síntesis en fase sólida de péptido-miméticos derivados del antígeno

de malaria MSP-2. 20 Figura 2-1: Análisis bioinformático del péptido 1513 derivado de la proteína

MSP-1 de P. falciparum 28 Figura 2-2: Diseño de pseudopéptidos derivados de MSP-1 42-61 29 Figura 2-3: Remoción de anticuerpos contra albúmina con BSA 30 Figura 2-4: Antigenicidad de anticuerpos policlonales inducidos por el péptido 1513

y sus análogos producidos en conejo 31 Figura 2-5: Reconocimiento específico de proteínas nativas de P. falciparum por anticuerpos policlonales producidos en conejos inducidos por los análogos del

péptido 1513 33 Figura 2-6: Reactividad del péptido nativo 1513 y sus análogos 34 Figura 2-7: Caracterización electroforética de inmunoglobulinas inducidas por el

péptido 1513 y sus análogos y sus fragmentos F(ab)2´ 36 Figura 2-8: Mapeo epitópico de anticuerpos policlonales inducidos por el péptido

1513 y sus análogos por la técnica de ELISA 38 Figura 2-9: Perfil estructural por Dicroísmo Circular (DC) de monómeros y polímeros

del péptido 1513 y sus análogos 40 Figura 2-10: Perfil estructural por Dicroísmo Circular (DC) de los fragmentos

F(ab)2´α-1513, α-ψ-437, α-ψ-439, α-ψ-440, α-ψ-441 y α-ψ-442 41 Figura 2-11: Conectividades TOCSY y NOESY-RMN-1H para el péptido 1513 y

sus análogos 42 Figura 2-12: Modelización molecular y cálculo de estructura para la secuencia

nativa 1513 y sus análogos ψ-437 y ψ-439 43

Contenido XV

Figura 2-13: Evaluación de la parasitemia inducida por P. yoelii 17XL en ratones

BALB/c 45 Figura 2-14: Extendido de sangre periférica de ratones infectados con P. yoelii 17XL 45 Figura 2-15: Patrones de supervivencia de ratones transferidos pasivamente con

los fragmentos F(ab)2´ α-1513 y sus análogos 46 Figura 2-16: Propiedades neutralizantes in vitro de los anticuerpos inducidos por el

péptido 1513 conjugados a BSA y sus fragmentos F(ab)2´ 47 Figura 3-1: Análisis bioinformático del péptido 4044 derivado de la proteína MSP-2

del P. falciparum 57 Figura 3-2: Diseño de pseudopéptidos derivados de MSP-2 21-40 58 Figura 3-1: Árbol genealógico de los hibridomas que dieron origen a los clones

productores de anticuerpos inducidos por los pseudopéptidos ψ-128(129) y ψ-130(131) 59

Figura 3-4: Reactividad específica de los clones productores de inmunoglobulinas anti-ψ-128(129) y anti-ψ-130(131) 60

Figura 3-5: Reactividad de las fracciones purificadas por cromatografía de intercambio aniónico. A. Fracciones reactivas anti-ψ-128(129). B. Fracciones reactivas anti-ψ-130(131) 62

Figura 3-6: Perfil electroforético de los clones anti-ψ-130(131) 63 Figura 3-7: Perfil electroforético de las fracciones eluídas por cromatografía de

intercambio aniónico de las inmunoglobulinas anti-ψ-130(131) 64 Figura 3-8: Parasitemia inducida por infección con las cepas de P. berghei ANKA

y P. yoelii 17XL 64 Figura 3-9 : Ensayo de actividad funcional in vivo de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos derivados del péptido 4044 vs P. berghei 66 Figura 3-10: Perfil de supervivencia de ratones tratados con los diferentes

anticuerpos anti pseudopéptidos derivados del peptido 4044 y desafiados experimentalmente con Plasmodium berghei 67

Figura 3-11: Ensayo de actividad funcional in vivo de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos derivados del péptido 4044 vs P. yoelii 67

Figura 3-12: Perfil de supervivencia de ratones tratados con los diferentes anticuerpos anti pseudopéptidos derivados del peptido 4044 y desafiados experimentalmente con Plasmodium yoelii 68

Figura 3-13: Actividad anti Plasmodium in vitro de anticuerpos inducidos por los ψ-129 y ψ-131 derivados del antígeno MSP-2 70

Figura 3-14: Perfiles de estructura secundaria de pseudopéptidos y sus polímeros derivados de la secuencia 4044 72

Figura 3-15: Conectividades NOE y TOCSY-RMN-1H 4044 y sus análogos 73 Figura 3-16: Modelos moleculares predictivos de la estructura 3D del péptido nativo

4044 y sus peptidomiméticos 74

Contenido XVI

Lista de tablas ............................................................................................................................. Pág.

Tabla 2-1: Características de las inmunoglobulinas purificadas y su fragmento F(ab)2´...32 Tabla 2-2: Mapeo de anticuerpos inducidos por el péptido nativo 1513 (MSP-142-61) y

sus peptido-miméticos mediante secuencias truncadas del péptido 1513 39 Tabla 3-1: Características del péptido 4044 y sus pseudopéptidos 53 Tabla 3-2: Inducción del cambio de isotipos de inmunoglobulinas por inmunización in vitro 61 Tabla 3-3: Características de los anticuerpos monoclonales producidos en sobrenadantes de cultivo 62 Tabla 3-4: Grupos de fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio aniónico 64 Tabla 3-5: Grupos de ratones transferidos pasivamente con los anticuerpos monoclonales 66 Tabla 3-6: Ensayo de inhibición in vitro de la invasión del P. falciparum FCB2 a glóbulos rojos humanos con anticuerpos inducidos por el pseudopéptido ψ-130(131) 71

Lista de Símbolos y abreviaturas Abreviaturas usadas en los aspectos sintéticos AcOH Ácido acético Ac2O Anhídrido acético Ala Alanina (A) Arg Arginina (R) Asn Asparagina (N) Asp Ácido aspártico (D) BOP 1H-benzotriazol-1-il-oxi-tris(dimetilamino)

fosfoniohexafluorofosfato Bzl Bencil Cbz Benciloxicarbonilo COSY Espectroscopia de correlación Cross-peak Entrecruzamiento de picos en espectros de

RMN bidimensionales Cys Cisteina dαN Distancia entre el H del carbono α al H del nitrógeno amido dαβ Distancia entre el H del carbono α al H del carbono β dβN Distancia entre el H del carbono β al H del nitrógeno amido dNN Distancia entre el H del nitrógeno amido del primer residuo y el H del nitrógeno amido del segundo DCM Diclorometano CH2Cl2 DIEA Diisopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida DCC Diciclohexilcarbodiimida DMSO Dimetilsulfóxido EM o MS Espectrometría de masas Et2O Éter etílico EtOAc Acetato de etilo Fmoc 9-fluorenilmetiloxicarbonilo Gln Glutamina (Q) Glu Ácido glutámico (E) Gly Glicina (G) HF Ácido fluorhídrico (fluoruro de hidrogeno) His Histidina (H) HOBt Hidroxibenzotriazol HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia CLAE

2 Introducción

Ile Isoleucina (I) IPA Isopropanol o alcohol isopropílico K Grado Kelvin Leu Leucina (L) LiAlH4 Tetrahidruro de Litio y Aluminio Lys Lisina (K) MALDI-TOF MS Espectroscopía de masas de desorción ionización de

láser asistida por matrices – tiempo de vuelo Met Metionina (M) Mr Masa relativa MBHA 4-Metilbencidrilamina Me Metilo NaCNBH3 Cianoborihidruro de sodio nM Unidades de concentración nano molar NOE Señal registrada en un espectro RMN NOESY

producida por un núcleo atómico NOESY Espectroscopia de efecto nuclear Overhausser O-Bzl Oxibencil ONDMH O,N-dimetilhidroxilamina p-MeBzl p-metilbencil Phe Fenilalanina (F) Pro Prolina (P) ψ o Pse Carácter griego psi que representa el criterio pseudo RMD Dinámica Molecular Restringida RMN Resonancia magnética nuclear RP Fase reversa FR SA Anillamiento simulado (“simulated annealing”) Ser Seina (S) SPPS o SPFS Síntesis de péptidos en fase sólida t-Boc tert-butiloxicarbonilo TEA Trietanolamina Et3N TEMED N,N,N’,N’-tetrametilen-etilendiamina Thr Treonina (T) TFA Acido trifluoroacetico TFE 2,2,2-trifluoroetanol THF Tetrahidrofurano TLC Cromatografía en capa delgada CCD TOCSY Espectroscopia de correlación total Tyr Tirosina (Y) uma Unidad de masa atómica Val Valina (V) W Triptofano (W) X-RC Cristalografía por difracción de rayos X Z Benciloxicarbonilo, puede estar halogenado con Cl o Br.

Introducción 3

Abreviaturas usadas en aspectos bioquímicos y bioló gicos

ADN Acido desoxirribonucleico Ag Antígeno Ac Anticuerpo ARN Ácido ribonucleico BCA Ácido bicinconínico BCR Receptor de los linfocitos B BSA Albúmina sérica bovina Buffer Solución tamponadora de pH CD Célula dendrítica CH Cadena constante pesada de una Ig CL Cadena constante liviana de una Ig CPA Célula presentadora de antígenos (APC) DO Densidad óptica EBA-175 Antígeno de unión a eritrocitos de 175 kDa EDTA Acido etilendiaminotetraacético ELISA Inmunoensayo enzimático en fase sólida Fab Fragmento de unión al antígeno de una Ig Fc Fragmento cristalizable o constante de una Ig GPI Glicosilfosfatidilinositol HLA Antígenos leucocitarios humanos IFI o IFA Inmunofluorescencia indirecta Ig Inmunoglobulína IgG Inmunoglobulína G IgM Inmunoglobulína M i.p Intra peritoneal i.v Intravenoso Jκ o Jλ. Segmento de unión de cadena κ o λ. de las Igs µL Microlitro Mab Anticuerpo monoclonal AcMo MHC-I/ II Molécula del complejo mayor de histocompatibilidad

de clase I o II MSP-1 Antígeno de superficie del merozoito-1 MSA-2 Antígeno de superficie del merozoito-2 PMSF Fenilmetilsulfonilfluoruro P.f Plasmodium falciparum P.v Plasmodium vivax P.y Plasmodium yoelii P.b Plasmodium berghei pfEMP1 Proteína de membrana del eritrocito-1 P. falciparum RAP Proteina asociada a las roptrias-1 RBC Glóbulos rojos GR RESA Antígeno de superficie de eritrocitos infectados con anillos sc Sub cutáneo SERA Antígeno repetitivo en Serinas del P.f. SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de

dodesilsulfato de sodio SFB Suero Fetal Bovino TCR Receptor del linfocito T RLT Th1/ Th2 Célula T ayudadora de tipo 1 o 2

4 Introducción

TNF Factor de necrosis tumoral FNT Tween Polioxietilen-sorbitan monolaurato V-D Segmento de variabilidad y diversidad de las Igs VH Cadena variable pesada de una Ig VL Cadena variable liviana de una Ig WB Análisis por Inmunotransferencia (“Western Blot”) WHO Organización mundial de la salud OMS

Introducción 5

Introducción

La malaria es una enfermedad transmisible causada por parásitos protozoarios intracelulares del género Plasmodium, transmitidos por el mosquito hembra del genero Anopheles, se han descrito cinco especies de Plasmodium que infectan al humano (P. falciparum, P. vivax, P malariae, P ovale y P. knowlesi), siendo P. falciparum una de las especies más virulentas y la causante de más enfermedad y muerte, y P. vivax la cepa de mayor prevalencia. (Hall & Carlton, 2005, Cox & Singh, 2008). En las últimas décadas la incidencia de la malaria ha alcanzado tasas alarmantes. Todos los años se registran aproximadamente entre 300 a 500 millones de casos clínicos de malaria Según la OMS (Organización Mundial de la Salud), el 90% de las muertes por malaria se presentan en África tropical, principalmente en niños menores de 5 años (Carter & Mendis, 2002).

Por otra parte, el uso de medicamentos antimaláricos de tipo antibiótico derivados de la quinina y de extractos de la Artemisia cuyo valor terapéutico es alto, se ha visto limitado debido a que los parásitos causantes de la malaria han generado o adquirido mecanismos moleculares de resistencia a estos medicamentos. Debido a la problemática mencionada anteriormente, se hace necesaria la búsqueda de otro tipo de moléculas que ofrezcan una alternativa inmunoprofiláctica para el control de los niveles de parasitemia y en consecuencia la resolución de los síntomas asociados con la enfermedad y a la protección de las poblaciones susceptibles. En este trabajo proponemos a los pseudopéptidos amida reducida y a sus anticuerpos transferidos pasivamente como inductores de una respuesta protectora contra la malaria.

Capítulo 1

Estado del arte y propósito del trabajo

La malaria es una de las enfermedades infecciosas más ampliamente distribuidas en el mundo y constituye uno de los mayores problemas de salud pública global, las cifras de la Organización Mundial de la Salud (OMS) son desalentadoras; el 40% de la población mundial vive en zonas endémicas de malaria donde se registran 300 millones de casos nuevos anualmente y un millón mueren como consecuencia de la enfermedad (http://www.who.int/rbm/,2002). Esta ha sido estimada como el 2.3% de causa de enfermedad a nivel global y representa el 9% de las causas de enfermedad en África (Snow, et al., 1999). Las zonas endémicas de malaria son clasificadas en tres niveles de riesgo: sin riesgo, riesgo de transmisión inestable (brotes focales ocasionales) y riesgo de transmisión estable (en áreas endémicas donde la enfermedad está siempre presente), Figura 1-1. Figura 1-1: Mapa de endemicidad de la malaria, 2010 Organización Mundial de la Salud, http://www.map.ox.ac.uk/MAP_publications.html.

8 Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el

desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para la malaria

En 2007, 1382 millones de personas vivían en zonas con riesgo de transmisión estable de malaria. De ellas, 759 millones vivía en condiciones de nivel endémico muy bajo de malaria, en el Centro y Sureste Asiático (604 millones, 79,55%), África, Yemen y Arabia Saudita (115 millones, 15,09%) y América (41 millones, 5,36%). El resto de la población global expuesta a riesgo estable de malaria es, en su inmensa mayoría, africana: 197 millones viven bajo riesgo y 345 millones bajo condiciones de alto riesgo. En las áreas de riesgo intermedio, modelos matemáticos sugieren que la interrupción de la transmisión de P. falciparum puede lograrse con una distribución masiva de mosquiteros tratados con insecticidas. Por otro lado, en áreas de alto riesgo la transmisión de malaria será más intratable y requerirá de un control más agresivo que incluya la suma de intervenciones complementarias (Hay, et al., 2009). Según el Fondo de Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF) en los países del África con altos índices de malaria, se enlentece el crecimiento económico y el desarrollo y se perpetúa el círculo vicioso de la pobreza. La malaria es una enfermedad relacionada con la pobreza; sobre todo afecta poblaciones de zonas rurales expuestas a la enfermedad, que normalmente viven en construcciones deficientes que ofrecen escasa o ninguna protección contra los mosquitos transmisores. Mientras que la enfermedad está determinada en gran parte y principalmente por el clima y la ecología, y no por la pobreza misma, el impacto de la malaria afecta sobre todo a aquellos a los que les es menos posible costearse medidas preventivas y tratamiento médico o carencias de medidas de salud pública. En el África, 30 millones de mujeres que viven en áreas endémicas de malaria quedan embarazadas cada año, para ellas la malaria se convierte en una doble amenaza así como para los niños. Así, más de 200000 recién nacidos mueren cada año como resultado de la malaria en el embarazo (Brabin, 1983). La infección por malaria durante el embarazo constituye la principal causa de morbilidad en áreas tropicales y subtropicales del mundo. En las áreas endémicas en el África, las mujeres embarazadas constituyen el principal grupo de riesgo dentro de los adultos. La principal carga de infección por malaria en la gestación resulta de la infección con Plasmodium falciparum, que incide directamente sobre la mortalidad, mientras que el impacto de los otros cuatro tipos de parásitos humanos (Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y P. knowlesi) están menos definidos (Snow, et al., 2005; White, 2008). Las mujeres embarazadas son particularmente vulnerables a la malaria debido a la reducción de la inmunidad durante esta etapa de su vida, haciéndolas más susceptibles a adquirirla e incrementando el riesgo de otras condiciones clínicas, anemia severa y muerte. Para el feto la malaria materna incrementa el riesgo de aborto espontáneo, muerte fetal, prematuridad, y bajo peso al nacer, siendo estas las causas fundamentales de mortalidad infantil. En este contexto el desarrollo de nuevos y más potentes fármacos de naturaleza diferente a los antibióticos convencionales, como podrían ser anticuerpos transferidos pasivamente que no induzcan reacciones secundarias que puedan afectar a la madre o al feto, constituiría una terapia de choque muy útil para el control de la infección en esta población vulnerable. Uno de los principales factores que ha contribuido al incremento de la mortalidad y morbilidad por malaria es el aumento generalizado de la resistencia del Plasmodium

Capítulo 1 9

falciparum a antimaláricos convencionales, como la cloroquina, la sulfadoxina-pirimetamina y la amodiaquina. La creciente oleada de antimaláricos adulterados y de calidad insuficiente en algunas zonas de África y Asia, sumado a la automedicación, contribuye a agravar el problema de la farmacorresistencia. La malaria por Plasmodium falciparum polifarmacorresistente también está muy extendida en Asia Suroriental y en Suramérica. El Plasmodium falciparum es el agente responsable de la mayoría de muertes por malaria, una vez en el hospedero el parásito sufre una serie de procesos de diferenciación celular en el hígado y dentro del eritrocito, produciendo la sintomatología clínica asociada con la enfermedad. El merozoito es la forma invasiva del parásito y es importante inmunológicamente porque está extracelularmente por un breve periodo de tiempo y por lo tanto está expuesto al ataque por anticuerpos. Cada merozoito contiene toda la maquinaria molecular necesaria para evadir la respuesta inmune y poder llegar a su célula blanco, la invade donde rápidamente se replica. El merozoito tiene características especiales para la invasión al eritrocito como proteínas de superficie que recubren al merozoito dándole un aspecto rugoso (Bannister, et al., 2000).

1.1 Ciclo de vida del Plasmodium falciparum

El Plasmodium alterna su vida entre dos hospederos uno invertebrado (mosquito) y otro vertebrado (humano). Los estadios infectivos son llamados esporozoitos que se encuentran en las glándulas salivales de las hembras del mosquito Anopheles, estos son inyectados en el torrente sanguíneo del hombre a través de la probóscide del mosquito, después de circular por sangre periférica durante aproximadamente 20 – 30 minutos, los esporozoitos penetran en las células parenquimatosas del hígado mediante receptores heparán- sulfato o a través de las células de Küpffer donde forman una vacuola que no es afectada por los lisosomas y en las células hepáticas comienzan a multiplicarse, convirtiéndose en merozoitos que pasan al torrente sanguíneo e infectan eritrocitos. Durante la fase eritrocítica los merozoitos sufren una serie de cambios adoptando una forma de “anillo” llamada trofozoito, este entra en división esquizogónica dando lugar a esquizontes inmaduros que al madurar liberan nuevos merozoitos. Después de varios ciclos eritrocíticos, algunos merozoitos se transforman en macrogametocitos (femeninos) y microgametocitos (masculinos) sexuales. Cuando un mosquito libre de parásitos pica a un humano infectado ingiere estos gametocitos, dando lugar al inicio de la reproducción sexual (Sherman, 2001). Dentro del estómago del mosquito, el microgametocito se une al macrogametocito formándose un ooquineto que atraviesa a través del estómago, transformándose en ooquiste, del ooquiste se liberan esporozoitos no infectivos que gracias a su capacidad de movilidad y desplazamiento, migran a las glándulas salivales donde maduran, convirtiéndose en infectivos. De esta manera se cierra el ciclo biológico como se observa en la Figura 1-2.



Figura 1-2: Ciclo de vida del Plasmodium falciparum (http://marudg.wordpress.com/26.04.11).

Debido a la complejidad del merozoito y siendo esta la forma invasiva del parásito, se han dirigido varios esfuerzos para la obtención de moléculas sintetizadas químicamente a partir de las proteínas relevantes para este proceso como las mostradas en la Figura 1-3. Figura 1-3: Principales antígenos expresados en el estadío merozoito del P. falciparum (Patarroyo y Patarroyo, 2008).

Capítulo 1 11

Algunas de estas proteínas clave para la invasión de los eritrocitos, como los principales antígenos de superficie del P. falciparum, son potenciales candidatos a vacuna e importantes blancos terapéuticos. Los eventos llevados a cabo durante el proceso de invasión del parásito de la malaria a sus células blanco parecen ser muy similares para todas las especies del Plasmodium (Richie & Saul, 2002). El parásito utiliza determinados receptores en el glóbulo rojo para poder unirse y llevar a cabo el proceso de reorientación apical, la unión y posteriormente desencadenar la señalización molecular que permite la viabilidad del mismo, el parásito induce una vacuola en la célula hospedera luego de estar dentro de ella (Figura 1-4). Existen tres organelos celulares del terminal apical las roptrias, los micronemas y los gránulos densos que definen al parásito como el philum Apicomplexa. La ubicación estratégica de los ligandos en los organelos mencionados, probablemente sirva como un mecanismo evasor que protege al parásito del ataque neutralizador de los anticuerpos generados por el hospedero, hasta que estas moléculas se liberen desde los organelos apicales, después del contacto con los glóbulos rojos (Sherman, 2001)

Figura 1-4: Proceso de invasión al Glóbulo rojo (Patarroyo y Patarroyo, 2008).

Estas proteínas funcionan como ligandos necesarios en la unión a los receptores ubicados en la superficie de la célula blanco, algunas de las proteínas relevantes en el proceso de invasión son: El antígeno o proteína de superficie del merozoito-1 (Merozoite surface protein-1) MSP-1; proteína de superficie del merozoito 2 MSP-2 (Merozoite surface protein-2); Antígeno Apical de Membrana AMA-1 (Apical Membrane Antigen-1); proteína de unión a los eritrocitos EBA -175 (Erythrocyte binding antigen- 175); proteína rica en histidina-1 HRP-1 (Histidin rich protein), entre otras proteínas de carácter antigénico del parásito de la malaria.



1.2. Proteínas de superficie del merozoito MSP-1 y MSP-2

de Plasmodium falciparum

El antígeno MSP-1 es uno de los antígenos que se expresa en la superficie de los merozoitos, como resultado de un procesamiento proteolítico de un precursor de 190 – 200 kDa. Esta glicoproteína está procesada proteolíticamente en fragmentos de 83 kDa, 30 kDa, 38 kDa, y 42 kDa. (Figura 1-5) Esta proteína ha sido propuesta como blanco efectivo para el diseño de vacunas contra la malaria, puesto que hay evidencia de que la proteína MSP-1 de Plasmodium falciparum provoca una respuesta inmune protectora contra la infección por el parásito (Freeman & Holder, 1983; Holder, 1988). Figura 1-5: Organización genética y procesamiento proteolítico de la proteína MSP-1. Se muestra la ubicación de los péptidos 1513 y 1585.

El antígeno MSP-2, es una glicoproteína que presenta una masa molecular relativa entre 35 a 56 kDa. Existen evidencias que sugieren que anticuerpos contra MSP-2 podrían estar involucrados en inmunidad protectora frente a malaria. Figura 1-6: Organización genética de la proteína MSP-2. Se muestra la ubicación del péptido 4044.

Capítulo 1 13

Anticuerpos monoclonales inducidos por MSP-2 han mostrado inhibición de la invasión in vivo e in vitro, siendo uno de los antígenos reconocidos por los anticuerpos que inhiben la liberación de los merozoitos y también se ha demostrado en ratones a los que se ha transferido pasivamente anticuerpos poli y monoclonales provenientes de péptidos nativos y modificados de la región N-terminal de la proteína MSP-2 de Plasmodium falciparum son protegidos frente a la infección producida por Plasmodium berghei, parásito causante de malaria en roedores (Martínez ,et al.,2009), Figura 1-6.

1.3. Inmunidad en malaria A diferencia de otras infecciones con patógenos intracelulares incluidos virus, bacterias y algunos protozoarios, en los cuales el papel de la respuesta inmune innata ha sido bien investigado (Stevenson & Riley, 2004), existen relativamente pocos estudios acerca del papel de la inmunidad innata en malaria en modelos de ratón y en humanos Una pregunta clave que debe resolverse es la identidad de las células presentadoras de antígenos (APCs siglas en inglés para Antigen Presenting Cells) que activan células T particularmente linfocitos TCD4 +, que producen interferón gamma y median la respuesta protectora por anticuerpos citolíticos de tipo IgG subclases IgG2a e IgG2b en ratones o IgG1 e IgG3 en humanos durante la infección aguda. Células dendríticas derivadas de médula ósea, macrófagos y linfocitos B, aislados de ratones inmunizados han mostrado tener la capacidad de presentar antígenos de malaria a células T. Durante la infección con P. yoelii hay sobre regulación de la expresión de moléculas del CMH clase II y de CD80 y continúa la expresión de CD86 por células dendríticas esplénicas, macrófagos y linfocitos B (Lamb, et al., 2010). Esas poblaciones celulares pueden procesar y presentar antígenos y producir interferón gamma, pero no producir IL-2 producida por los linfocitos T. La inhibición de la producción de la IL-2 por las APCs, podría ser una posible explicación para la respuesta sub óptima a los antígenos no relacionados durante la malaria aguda. Por otro lado, los macrófagos tienen un papel importante en la respuesta inmune innata en malaria debido a su habilidad para fagocitar eritrocitos infectados en ausencia de anticuerpos opsonizantes o citolíticos específicos para malaria; esta interacción probablemente involucre la unión de CD36 a el P falciparum con la proteína de membrana del eritrocito-1 (pfEMP1) sobre las células infectadas. La adherencia de eritrocitos infectados a CD36 podría modular la respuesta inmune adaptativa. Se ha visto que las células dendríticas DCs (por Dendritic Cells) tienen una función importante tanto en inmunidad innata como en la respuesta inmune adaptativa especialmente en respuesta a su habilidad para responder a señales microbianas, recepción, procesamiento de antígenos y presentación a linfocitos T (Stevenson & Riley, 2004). Las células naturales asesinas NK también tienen una función en la respuesta inmune frente al parásito causante de la malaria por su actividad citolítica sobre las células del patógeno, estas células también son una fuente de interferón gamma (INF-γ). Las NK también juegan un papel importante en mecanismos tempranos de resistencia a las formas sanguíneas del Plasmodium mediados por la producción de INF-γ (Carter, et al., 1989), esta función secretora de las citoquinas es la vía usada por estas células para inactivar el Plasmodium. De la misma forma se ha sugerido en un estudio realizado por



De Souza en Tanzania, que existe un control genético de la respuesta inmune frente al parásito y se han asociado algunos marcadores genéticos del HLA (Human Leucocyte Antigens) como el A2 y el A30 respecto a títulos de anticuerpos antimaláricos elevados.(De Souza, et al., 1997).

1.4. Anticuerpos Los anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas solubles o en forma anclada a la membrana de las células B, son moléculas multivalentes constituidas por dos cadenas pesadas (H) de masa relativa entre 50 a 55 kDa y dos cadenas livianas que pesan de 20-25 kDa, estas cadenas están unidas entre sí por puentes disulfuro, existen dos clases de cadenas κ y λ y cinco clases de cadenas pesadas α, γ, δ, ε y µ que corresponden a los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas IgA, IgG, IgD, IgE e IgM y a los subtipos IgG1, 2, 3,4 en el humano e IgG1, 2a, 2b y 3 en ratón. Las inmunoglobulinas están organizadas en tres fragmentos evidenciados por primera vez por Porter en 1959 (Porter, 1959), dos fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que está compuesto por una cadena liviana y una pesada, que participan en el sitio de unión al antígeno y un fragmento cristalizable Fc que está formado por las dos cadenas pesadas restantes además tiene sitios de unión para el sistema del complemento. En la región Fcv es donde se observan las diferencias entre los isotipos y subtipos de inmunoglobulinas. Los dos fragmentos Fab permanecen unidos al fragmento Fc por una región de bisagra que varía en longitud y flexibilidad de acuerdo al isotipo y subclase del anticuerpo (Figura 1-7). La efectividad del sistema inmune en vertebrados reside en la diversidad de los anticuerpos que es capaz de generar. Cada linfocito B fabrica un modelo de inmunoglobulina único que puede ser expresado como una forma del anticuerpo anclada a la membrana del linfocito B o como forma soluble también existe un receptor para estos linfocitos B (BCR) que juega un papel determinante dentro de la respuesta de los linfocitos B a los agentes patógenos y a otras sustancias extrañas en el organismo. Por medio de este receptor hay internalización del antígeno para su endocitosis y transporte a través de los compartimentos donde sufrirá proteólisis y donde será cargado por las moléculas de presentación antigénica del MHC clase II y presentado a las células T. La estimulación del BCR por el antígeno conduce a la transducción de señales que regulan la actividad del linfocito B.

Capítulo 1 15

Figura 1-7: Estructura y dominios de la molécula de inmunoglobulina (Ig). http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/3 y http://patoral.umayor.cl/inmunodef/ap_inmuno (28.10.10).

1.5. Vacunas sintéticas contra la malaria

Debido al limitado número y baja eficacia protectora de vacunas biológicas basadas en esporozoitos irradiados y atenuados, así como basadas también en inmunógenos de origen biológico, proteínas recombinantes y vacunas de ADN, las vacunas sintéticas parecen ofrecer la mejor alternativa para la prevención de esta letal enfermedad.

La respuesta inmune en individuos con infección por malaria es compleja y pueden desarrollar una inmunidad parcial contra la enfermedad, esta respuesta involucra tanto componentes humorales como celulares involucrados en mecanismos de protección frente a la enfermedad sin embargo, el parásito se vale de múltiples mecanismos para evadir la respuesta inmune. Además las condiciones medioambientales, socioeconómicas y el estado inmune del individuo contribuyen a que la enfermedad pueda desarrollarse con más facilidad aumentando así la susceptibilidad del huésped por la infección. Debido a que el sistema inmune no resuelve la infección naturalmente, se ha hecho necesaria la búsqueda de vacunas que ofrezcan una efectiva protección frente a la enfermedad.

Para este propósito se han estudiado algunas moléculas provenientes de diferentes estadios del parásito y se han probado como posibles candidatos a vacuna.

Las proteínas de superficie del estadio merozoito han sido los antígenos más promisorios como blanco para el desarrollo de vacunas, además de las proteínas de las roptrias y los micronemas. Estas han sido capaces de inducir inmunidad protectora contra el parásito de la malaria. (Rodríguez, et al., 2008)



Por otro lado, algunos investigadores (Munesinghe, et al., 1991) han tratado de identificar epítopes T y B para ser incluidos en posteriores antígenos candidatos a vacuna. Es probable que una vacuna contra esta enfermedad sea efectiva cuando logre estimular la respuesta inmune humoral y celular. Algunos de los mecanismos propuestos han sido inhibir el proceso de invasión al glóbulo rojo y otros que permitan la eliminación intraeritrocítica del parásito con estas estrategias se lograría disminuir la carga parasitaria y las complicaciones asociadas con la enfermedad (Patarroyo, et al., 2008). A mediados de los años ochentas se desarrolló la primera vacuna sintética contra la malaria denominada SPf-66, la cual mostró una eficacia protectora contra la enfermedad de un 30 a 50 % dependiendo de la región geográfica donde fue ensayada (Patarroyo, et al., 1988). Se han realizado otros esfuerzos dirigidos hacia la obtención de vacunas contra la malaria, basadas en proteínas recombinante, sondas de ADN y péptidos sintéticos todos derivados de diferentes antígenos del Plasmodium sin arrojar resultados promisorios hasta la fecha (Chitarra, et al., 1999). La experiencia ganada en este campo demuestra que las futuras vacunas contra la malaria deben ser diseñadas racionalmente teniendo en cuenta la biología del parásito, las propiedades químicas de sus proteínas y de los ligandos, reconociendo los sitios críticos de unión a la célula blanco. Aprovechando las propiedades inmunogénicas que han demostrado tener estas proteínas cuyas secuencias son conocidas, se han diseñado y sintetizado moléculas peptídicas de regiones relevantes para la invasión al eritrocito como la MSP-2 (Ocampo, et al., 2000). Estas secuencias nativas son inmunológicamente poco activas, inestables y de fácil degradación proteolítica por lo que, en los últimos años se ha introducido una nueva estrategia en la cual se modifican químicamente los enlaces peptídicos para formar pseudopéptidos que podrían estabilizar las estructuras del péptido nativo que a su vez contienen motivos de unión específica a eritrocitos ofreciendo un blanco estratégico para el diseño de vacunas e inmunoterapia por transferencia de anticuerpos inducidos por tales pseudopéptidos (Lozano, et al.,1998).

1.6. Pseudopéptidos como nuevos inmunógenos sintéticos

La modificación química o sustitución del enlace peptídico natural el cual se define como el enlace que une dos aminoácidos formando un dipéptido, este enlace se establece entre la función amino de un aminoácido con la función carboxilo de otro aminoácido, permite a los pseudopéptidos adoptar cambios estructurales que les confiere propiedades inmunogénicas más potentes que las proteínas nativas. Se ha demostrado que tienen la posibilidad de modular la respuesta inmune del hospedero, evitando el proceso de invasión a la célula blanco, por lo tanto estas moléculas podrían ser incluidas en el diseño de vacunas contra la malaria.

Capítulo 1 17

Se han generado una gran cantidad de pseudopéptidos, entre ellos los conocidos como amida reducida en los cuales un enlace peptídico normal CO-NH se sustituye por un enlace isostérico del tipo ψ-[CH2-NH-] (Figura 1-8).

Los pseudopéptidos ofrecen una herramienta muy útil para el desarrollo de posibles análogos de estados de transición, debido a sus propiedades estructurales y a la posibilidad de modular las propiedades químicas naturales del enlace peptídico, haciéndolos más resistentes a la degradación por proteasas debido a que esta modificación permite estabilizar algunas estructuras del péptido nativo.

Figura 1-8: Pseudopéptidos como isósteros del enlace peptídico. El carácter griego “ψ” representa esta familia de moléculas. Debido a que el P. falciparum utiliza algunos de los antígenos de superficie mencionados anteriormente para invadir al glóbulo rojo, la generación de anticuerpos poli y monoclonales inducidos por pseudopéptidos, dirigidos contra estas proteínas proporciona una herramienta importante para el control terapéutico e inmunoprofiláctico de la enfermedad.

1.7. Estrategia de síntesis de peptido-miméticos o pseudopéptidos del tipo amida reducida ψψψψ[[[[CH2-NH]]]] La síntesis de pseudopéptidos involucra etapas de síntesis orgánica alternas, como lo son la reducción a aminoaldehído del aminoácido comprometido en el enlace modificado de la secuencia peptídica; la reducción de cada uno de los aminoácidos modificados usados en este trabajo, se realizó siguiendo el procedimiento propuesto por Fehrentz y Castro. (Fherentz & Castro, 1983). El procedimiento estándar para la reducción del grupo carbonilo del aminoácido involucra la síntesis de un intermediario (carboxamida), seguido de la reducción con LiAlH4 sobre éter seco. Este proceso tiene un rendimiento global cercano al 80% para la mayoría de los aminoácidos; a pesar de ser una síntesis bastante limpia y la cual presenta un bajo porcentaje de reacciones colaterales, es necesaria una caracterización tanto del aminoácido como de la carboxamida y del producto final. Nosotros empleamos para la

L,D- péptido L,D-pseudopéptido amida reducida



caracterización de los compuestos obtenidos, técnicas analíticas de infrarrojo (IR), RMN-1H, y cromatografía de capa fina (TLC). Posteriormente se incorporan los aminoácidos modificados de manera sistemática para la síntesis de los pseudopéptidos ψ-437 (52V-ψ[CH2NH]-L53), ψ-439 (51M-ψ[CH2NH]-V52), ψ-440 (50K-ψ[CH2NH]-M51), ψ-441 (49E-ψ[CH2NH]-K50) y ψ-442 (48K-ψ[CH2NH]-E49) derivados del péptido codificado como 1513 ubicado en la posición MSP-142-61 en el antígeno y cuya secuencia de aminoácidos es 42GYLFQKEKMVLNEGTSGTA61, los aminoácidos subrayados conforman el motivo de unión a eritrocitos determinado en esta molécula. De forma semejante se plantea del diseño y síntesis de los análogos derivados del péptido codificado originalmente como 4044 (21KMESKYSNTFINNAYNMSIR40), proveniente del extremo amino terminal conservado del antígeno MSP-2. Siendo estos los análogos ψ-128 (F-ψ[CH2NH]-I), ψ-130 (I-ψ-[CH2NH]-N) y de manera simultánea se realiza la síntesis de todos las moléculas pseudopeptídicas en sus correspondientes formas poliméricas, estas últimas contiene un residuo de cisteína en cada extremo amino y carboxilo. La síntesis química de todos los pseudopéptidos se lleva a cabo empleando aminoácidos protegidos con el grupo t-Boc en el amino alfa, siguiendo el procedimiento de síntesis de péptidos en fase sólida, descrito por Merrifield (Merrifield,1963). El acople del aminoaldehído a la secuencia requiere unas condiciones de síntesis diferentes a las de un acople normal entre aminoácidos; es necesario mencionar que el tiempo de reacción de este acople es mayor al de un acople normal entre aminoácidos. La reacción de condensación de cada t-Boc-L-aminoaldehído, consiste en disolver tres equivalentes del aminoaldehído en 2 ml de DMF/ácido acético al 1% y luego poner en contacto con la resina-péptido manteniendo agitación por un período de tres horas. Terminado este tiempo, descartar la solución aminoaldehído/DMF y realizar lavados con DMF, IPA y DCM 3ml de cada uno por un minuto; preparar una solución de un equivalente de NaBH3CN en DMF/ácido acético al 1% y poner a reaccionar con ella la resina-péptido por una hora. Finalizado este tiempo, se realizan los mismos lavados del paso anterior y se hace el test de ninhidrina; si el resultado es positivo se repite el procedimiento las veces que sea necesario, hasta observar que aparentemente no hay aminos libres. Como ya se mencionó, esta reacción es un poco lenta; no es de extrañarse que se haga necesario repetir el acople aproximadamente cinco veces hasta obtener una reacción completa; sin embargo, no es recomendado dejar el acople por períodos más largos a los sugeridos en este documento, puesto que se podrían inducir reacciones laterales no deseadas como, por ejemplo, la unión de dos moléculas del mismo sintón alterando así la identidad del análogo diseñado. Terminada la reacción de este acople, se desprotege el grupo amino y se continúa la síntesis en la forma estándar. Para ilustrar la estrategia tomemos como ejemplo la obtención de las formas poliméricas para los análogos pseudopeptídicos del peptido 4044, es decir las moléculas ψ-129 y ψ-131 las cuales son idénticas a sus formas monoméricas ψ-128 y ψ-130, respectivamente; pero se diferencian en que las primeras contienen el par de residuos Cys-Gly en el amino terminal y Gly-Cys en el carboxi-terminal. Al ser desancladas de la resina estos pro-polímeros, se disuelven en solución salina y se llevan a una concentración de 4 mg/mL y se someten a burbujeo de N2 a pH

Capítulo 1 19

7,4 a temperatura ambiente, hasta que no se detecte la presencia de grupos sulfhidrilo libres mediante la prueba de Ellman, prueba de lo cual todos ellos estarán comprometidos en puentes disulfuro intermoleculares. Los pseudopéptidos utilizados para el estudio que se describe en este documento, son análogos a la secuencia del péptido denominado 4044, el cual corresponde, como ya se mencionó, a la región de aminoácidos 21 a 40 de la proteína MSP-2. En la tabla 1 se muestran dichas secuencias y su respectivo código. Los pseudopéptidos sintetizados se obtuvieron con un rendimiento promedio del 70% y se garantizó un nivel de pureza superior al 99% según los análisis de HPLC-FR y su identidad evaluada por espectrometría de masas MALDI-TOF. A continuación se muestra en la Figura 1-9, el diseño para obtener dos análogos, en este caso derivados del peptido 4044. Figura 1-9: Diseño experimental para la síntesis sitio-dirigida de los pseudopéptidos ψ-128 y ψ-130, en los cuales se sustituye un enlace peptídico de tipo amida [CO-NH] por su isóstero ψ[CH2NH] amida reducida entre los residuos Phe-Ile en el análogo ψ-128 y entre los residuos Ile-Asn para generar el análogo ψ-130, respectivamente.



Para la obtención de cada pseudopéptido del tipo amida reducida se procedió de acuerdo a los esquemas mostrados a continuación. En el primer esquema mostrado en la Figura 1-10, se muestra la obtención del derivado carboxamida del aminoácido Fenilalanina (tomado como ejemplo) para su posterior incorporación a la cadena peptídica en fase sólida y la posterior reducción del ion iminium por tratamiento con un agente reductor suave según se observa en la Figura 1-11. La estrategia sintética diseñada para la modificación sitio-dirigida de enlaces peptídicos tomó en cuenta aquellos aminoácidos relevantes para la unión del patógeno Plasmodium a sus células blanco. Figura 1-10: Derivatización de fenilalanina e isoleucina para la obtención de sus correspondientes t-Boc-L-aminoácido-aldehídos. (1) es el aminoácido comercial protegido en su función amino primario con el grupo t-Boc (tert-butiloxicarbonilo). (2) es el derivado carboxamida obtenido por condensación de O,N-dimetilhidroxilamina con el aminoácido (1) activado en su función de ácido carboxílico, rendimiento de reacción mayor del 90%. (3) es la molécula objetivo t-Boc-L-aminoácido-aldehído obtenido por reducción selectiva de (2) con LiAlH4 e hidrolizado con KHSO4 1M, rendimiento de reacción superior al 60%.

Capítulo 1 21

Figura 1-11: Síntesis en fase sólida de péptido-miméticos derivados del antígeno de malaria MSP-2. (1) la función amino primaria del residuo Asn de la secuencia anclada a la resina metilbenzhidrilamina (MBHA) se condensa con el carbono carbonílico del sintón t-Boc-L-Ile-H (2), para dar lugar a la formación del ion iminium en el producto (3). Éste da lugar a la formación del grupo metileno en producto (4) luego de ser tratado con el agente reductor NaCNBH3. Luego de incorporar los restantes aminoácidos normales a la cadena peptídica se genera el producto final esperado ψ-130 (5) al ser liberado de la resina por tratamiento con bajas y altas concentraciones de HF.

1-8. Resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN -1H) para análisis de estructura secundaria Todos los pseudopéptidos derivados del péptido 1513 del antígeno MSP-142-61, así como el péptido no modificado MSP-221–40 (4044) y sus análogos pseudopeptídicos se caracterizaron por análisis RMN-1H en experimentos conducidos en un espectrómetro Bruker DRX-600 MHz a 295 K. Los datos se procesan y analizan en una estación de trabajo Silicon Graphics empleando el programa XWIN-NMR 1.3 (Bruker, Darmstadt, Alemania). Se realizan experimentos por las técnicas bidimensionales denominadas: double quantum filter-correlation spec-troscopy (DQF-COSY), total correlation spectroscopy (TOCSY), y nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY), con el objetivo de caracterizar y asignar todos los átomos de hidrógeno vecinos en la secuencia de cada molécula. El desplazamiento en 4,75 ppm, señal de los hidrógenos del agua se emplea como referencia. Los coeficientes de temperatura se determinaron a partir de los espectros TOCSY, empleando un rango de temperatura entre 285-315 K. Se obtiene la pendiente de la curva calibrada para la relación entre el desplazamiento químico frente a la temperatura para cada uno de los hidrógenos de los grupos amida (-∆δHN/∆T, ppm/K). Las constantes de acoplamiento 3JHNHα se miden a partir de la separación de los multipletes de los picos-cruzados (cross-peaks) obtenidos en los experimentos unidimensionales DQF-COSY. Teniendo en cuenta todos los antecedentes anteriormente mencionados se plantearon para este trabajo los siguientes objetivos. 1.9. Objetivos

1.9.1. Objetivo general

Evaluar las propiedades funcionales de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos derivados de las proteínas MSP-1 y MSP-2 del Plasmodium falciparum y su potencial como nuevos agentes contra la malaria.

1.9.2. Objetivos específicos

1.9.2.1. Aislar, purificar y caracterizar bioquímicamente anticuerpos policlonales derivados del antígeno MSP-1 y monoclonales del antígeno MSP-2 del P. falciparum.



1.9.2.2. Evaluar la actividad funcional de fragmentos F(ab)2´ de anticuerpos policlonales producidos en conejos, inducidos por pseudopéptidos derivados del antígeno MSP-1.

1.9.2.3. Evaluar la actividad funcional de anticuerpos monoclonales inducidos por pseudopéptidos del antígeno MSP-2. 1.9.2.4. Determinar la actividad funcional de los anticuerpos generados en ensayos in vitro e in vivo.

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