EVALUACIÓN DE LA FRECUENCIA GENOTÍPICA DEL ALELO MCM6-C13910T EN NIÑOS

ECUATORIANOS DEL HOSPITAL DE ESPECIALIDADES FUERZAS ARMADAS No. 1, A

TRAVÉS DE PCR EN TIEMPO REAL

Autor:

Moreta Van Ronzelen, Francisco

Sangolquí, Febrero 2014

Contenido

1. Introducción– 1.1. Antecedentes– 1.2. Objetivos de la investigación– 1.3. Marco teórico– 1.4. Novedad e impacto científico– 1.5. Hipótesis de investigación

2. Materiales y métodos

3. Resultados y discusión

5. Conclusiones

6. Recomendaciones

Antecedentes

• En el Ecuador: – Tasa de natalidad: 20.8 nacidos vivos por cada 1.000

habitantes (INEC, 2011).– No existe información sobre la incidencia de la intolerancia a

la lactosa. – No esta disponible método diagnóstico preventivo.

• Productos lácteos:– Alta concentración del disacárido lactosa.

Elaborado por Moreta, 2013.

•Lactasa

Antecedentes

• En las poblaciones hispanas y europeas:– Se relaciona con el SNP

MCM6-C13910T– Cambio de la timina por la

citocina.• En el Ecuador:

– Mezcla-cruce de españoles con los incas

http://www.ibbl.lu/personalised-medicine/what-is-personalised-medicine/dna-genes-snps/

Antecedentes

• La intolerancia a la lactosa:– Diferentes niveles

sintomáticos.– Relacionado con la

cantidad de enzima funcional.

– Carga osmótica– Pérdida de vellosidades

intestinales.• Neonatos y niños

http://drjuanmanuelgregorio.wordpress.com/.

Objetivo general

Evaluar desde el punto de vista molecular la presencia del alelo MCM6-C13910T en niños de la población

ecuatoriana atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No. 1, a través de PCR en tiempo

real.

Objetivos específicos

Aplicar la técnica de análisis por PCR en tiempo real para la identificación del alelo presente en el gen MCM6, a partir de las muestras recolectadas de niños atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No.1.

Estimar la frecuencia genotípica homocigota C/C del alelo MCM6-13910 en los niños ecuatorianos atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No.1, para conocer la incidencia de esta afección dentro de la población.

Estimar la frecuencia genotípica heterocigota C/T para el alelo MCM6-13910 en niños ecuatorianos atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No.1, para conocer la incidencia de portadores de esta afección dentro de la población.

Objetivos específicos

Calcular las estimaciones puntuales y por intervalo, de la frecuencia genotípica del homocigoto C/C para el alelo MCM6-13910, en niños ecuatorianos del Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No.1.

Analizar a los sujetos incluidos en el estudio y sus familiares, a partir de los datos obtenidos en la encuesta, estableciéndose una correlación fenotipo-genotipo de estos individuos.

Establecer una posible incidencia de homocigóticos/heterocigóticos para esta afección a través de este estudio, dentro de la población ecuatoriana con fines de diagnóstico preventivo.

Marco teórico – Lactancia y consumo de Lácteos

Lactancia• 96.7% de los casos.• CEPAR, 2012.

Productos lácteos• 3.5 millones de litros diarios.• 75% para consumo humano y de la

industria alimenticia.

Marco teórico – Diferencias entre leche materna y bovina

• Composición:– Varía extensamente.– Cuantitativas.

• Comparación difícil:– Complejidad estructural.– Carbohidratos menores.– 100 mg/L de ac. siálico.

Fuente: Malacarne et al., 2002.

Componente Tipo de Leche

Humana Bovina

Lípidos (g/kg-1) 36,4 36,1

Proteínas (g/kg-1) 14,2 32,5

Lactosa (g/kg-1) 63,7 48,8

Ceniza (g/kg-1) 2,2 7,6

Energía(kcal/kg-1) 677 674

Leche materna:

26% de β-caseína

Leche bovina:

Exceso de sales.

Concentración elevada de

caseínas 77%

αs1-caseína

Marco teórico – Intolerancia a la lactosa

• Primeros indicios– 1958 por Durand– 1963 estimación cuantitativa por Auricchio et al.

Deficiencia congénita a la

lactosa

• Desorden raro.• Mutaciones en el gen

LCT.

Deficiencia primaria de la

lactosa

• Ausencia absoluta o relativa de la enzima.

• Determinada en el gen MCM6.

• 70% de la población mundial la presenta

Deficiencia secundaria de

la lactosa

• Lesiones en la mucosa intestinal

Marco teórico – Función del gen MCM6

• Regiones reguladoras.– Al menos cuatro variantes.– Ubicación.

• Citogenética 2q21.– Molecular.

• 136.597.195 hasta 136.634.046.

• Complejo MCM se identificaron a partir de levaduras.– Mantenimiento del ciclo

celular.

Fuente: Genetics Home Reference, 2012.

Marco teórico – Teoría evolucionista

Mecanismos evolutivos

Otros mamíferos• Ausencia de persistencia

En la población humana• Disminuye la habilidad de metabolizar

Estado ancestral• Fenotipo lactasa no persistentes

Fuentes de agua y electrolitos

Evitar el raquitismo y osteomalacia

Marco teórico – Diagnóstico

• Diagnóstico diferencial– Sintomatología abdominal.

• Métodos diagnósticos– Análisis en heces

• Presencia de cuerpos reductores.• Determinación de pH.• Excreción fecal de carbono 14.

– Test de absorción de lactosa– Biopsia intestinal– Test de tránsito

gastrointestinal– Test de radioisótopo de

dióxido de carbono espirado.– Test de hidrógeno espirado. Fuente: Tocoian, 2006.

Afecciones

1.- Alactasia congénita.

2.- Síndrome de intestino irritable.

3.- Enteritis regional.

4.- Colitis ulcerativa.

5.- Neoplasia intestinal o pólipos intestinales.

6.- Enfermedad diverticular

7.- Iatrogénicas: la ingesta de laxantes o de salvado

8.- Transtornos de movilidad intestinal por endometriosis, adhesiones o masas previas.

9.- Enfermedad celíaca.

10.- Sprue tropical.

11.- Infecciones virales (rota virus), bacterianas y parasitarias (giardia).

Marco teórico – Manejo y tratamiento

Editado de: Montalto et al., 2006

Novedad e impacto científico

• Brindar una herramienta de diagnóstico temprano a los Servicios de Neonatología y Pediatría.

• Evitar un estado crónico e irreversible en los niños y una desnutrición marcada.

Hipótesis de investigación

La frecuencia genotípica del alelo MCM6-13910 en niños atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No1, no difiere significativamente de las calculadas en otros estudios similares para población hispana.

Materiales y métodos

Muestras de 100 niños de 0 a 5 años– 46 del Servicio de Neonatología. – 54 del Servicio de Pediatría.

Extracción de material genómico• High Pure PCR Template

Preparation Kit, Cat. No. 11 768 828 001

Cuantificación• Electroforesis en gel de

agarosa al 4% de grado analítico.

• Quantlader DNA de la compañía LONZA®

• 50 minutos a 120V, 500Å en una cámara horizontal.

PCR en tiempo real• Plataforma LigthCycler

2.0 con el software versión 4.1 Roche®.

• Sondas y primers LightMix® Kit Lactose Intolerance (MCM6 C-13910T) TIB MOLBIOL® Cat. No. 40-0307-32

Resultados y Discusión

IL

•70% en la población mundial.

•Malnutrición.

Incidencia

•18.52% en el HE1.

•7% en el (Loor & Solís, 2010).

•Selección positiva.

•Desarrollo de variaciones polimórficas como mecanismo de evolución adaptativa.

Resultados y Discusión

Fuente: Ingram, 2008.

Relación genotípica con el polimorfismo MCM6-C13910T.

Alta frecuencia de individuos lactasa persistentes. Otras variaciones asociadas con fenotipos persistentes, como el

caso de los alelos -13915*G y -14010*T.

Resultados y Discusión

Técnicas

tradicionales

•Evaluación tardía.

•No es posible realizar diagnóstico preventivo

Test molecular

•Caracterización molecular

•Previo a la implementación del test.

Ecuador

•No se ha reportado caracterización molecular de la IL.

•HE1 se identificó el polimorfismo MCM6-C13910T y no otro.

Resultados y discusión

•56.9% C/C, 41.7% C/T y 1.4% T/T (Mestizos)

•88.3% C/C y 11.7% C/T (Amerindios)

Valor -p

•0.96 (Mestizos)

•0.83 (Amerindios)

Resultados y discusión

•Frecuencia de 88.2% en asiáticos

•Migraciones 12.000 millones de años.

•Conquista 1942.

•Nativos americanos.

•Derivados de asiáticos.

•Estancia en el estrecho de Bering.

•Flujo bidireccional entre Siberia y el ártico norte americano

Fuente: Tamm et al., 2007.

Resultados y discusión

En lugares donde existen más de una variable se tomo en cuenta la de mayor frecuencia. ■LCT-13910C.T; ■LCT-22018G.A/-13910CC; ■LCT-13915T.G; ■LCT-14010G.C; ■LCT-13907C.G

Fuente: Mattar et al., 2012.

Resultados y discusión

No se observa correlación (valor p

0.21).

Cierta correlación (valor p 0.032). Población

amerindia alta incidencia del alelo homocigoto C/C .

Resultados y discusión

G-F

•90% de pacientes con sintomatología

•De 38 pacientes con genotipo C/C 24% con sintomatología.

Edad

etaria

•De los 6 meses al año de edad.

•Seguimiento.

Test de

diagnóstico

•Desviación estándar de los picos de melting (0.16 Tm1 C/C, 0.13 y 0.1 Tm1-2 C/T).

•Sensible, específica y robusta

Resultados y discusión

Infecciones

•62.96% de 54 niños.

•74% con genotipo intolerante C/C.

•18 pacientes con infecciones gastrointestinales.

Mecanismo

•Atrofia crónica de las vellosidades intestinales

•Desnutrición y sistema inmunológico deprimido.

Infancia

•Desarrollo del timo

•Deficiencia de micronutrientes (Zinc)

•Función de Linfocitos T reducido.

•Falta de hierro

Resultados y discusión

Digestivas

• Hospital de Mulago 25.5% (Nyeco et al.,2010).

• HE1 14 niños con infecciones relacionados con genotipo intolerante.

Dérmicas

• Endotoxemia derivada de la malnutrición.

• Respuestas inflamatorias.

• HE1 5 pacientes con irritación dérmica con genotipo intolerante.

Respiratorias y Urinarias

• Patógenos oportunistas.

• 3 niños con infecciones respiratorias y 3 con urinarias de los 38 pacientes con genotipo intolerante.

Resultados y discusión

•Púrpura trombocitopénica trombótica

•Genotipo intolerante C/C

•Mutación en el gen ADAMTS13 ubicado en el cromosoma 9 (9q34.2)

•Proteasa de escisión del factor Willebrand

•Anemia hemolítica

•Fragmentación de eritrocitos, trombocitopenía, difusión neurológica, disminución de función renal y fiebre

Conclusiones

• El estudio evaluó a 46 neonatos del Servicio de Neonatología y a 54 niños del Servicio de Pediatría en los que se determinó la presencia del alelo MCM6-C13910T y no se encontró evidencia de otra variación polimórfica en particular en las posiciones -13915, -13913, -13908 y -13907.

• La frecuencia genotípica homocigota C/C del alelo MCM6-C13910T en los niños atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No. 1 es del 75%.

 • La frecuencia genotípica heterocigota C/T del alelo MCM6-C13910T en los

niños atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No. 1 es del 24%.

Conclusiones

• La frecuencia genotípica homocigota T/T del alelo MCM6-C13910T en los niños atendidos en el Hospital de Especialidades Fuerzas Armadas No. 1 es del 1%.

 • Se estima que en la población hospitalaria la frecuencia genotípica

homocigota C/C del alelo MCM6-C13910T se encuentra entre el 83.99% y el 66.01%.

• La correlación genotipo-fenotipo es del 24% con un rango etario de aparición de 6 meses al año de edad

 • La incidencia de esta afección en la población hospitalaria es de 18.52%.

 • La distribución de frecuencias del alelo MCM6-C13910T no difiere de otros

estudios realizados en poblaciones mestizas ( valor-p0.9657) y amerindias (valor-p0.8294).

Recomendaciones

• Se recomienda realizar un seguimiento de los pacientes de neonatología homocigotos C/C con el fin de determinar la edad de aparición de la sintomatología en el caso de que se presente.

• El test molecular debe ser implementado en todos los hospitales y maternidades del Sistema Nacional de Salud Pública con el fin de prevenir las complicaciones más severas de la intolerancia a la lactosa y conocer la incidencia de la misma.

 • A partir de los datos obtenidos en la Red de Salud Pública determinar la

frecuencia de la intolerancia a la lactosa en la población ecuatoriana.

 • En el caso de identificar un polimorfismo diferente se recomienda

secuenciar el gen y mediante su genealogía determinar el origen del mismo.

Gracias!