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EVALUACIÓN DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN DE
PEZONES POST ORDEÑO EN LA REDUCCIÓN DE NUEVAS
INFECCIONES INTRAMAMARIAS BAJO CONDICIONES DE PASTOREO Y
DESAFÍO NATURAL.
PAULO CESAR DUQUE MADRID
DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS
UNIVERSIDAD DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA AGROPECUARIA
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1. Información general
TÍTULO DEL PROYECTO: EVALUACIÓN DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN DE PEZONES POST ORDEÑO EN LA REDUCCIÓN DE NUEVAS INFECCIONES INTRAMAMARIAS BAJO CONDICIONES DE PASTOREO Y DESAFÍO NATURAL.
Nombre de la Convocatoria en la que se presenta el proyecto:
Convocatoria Financiación de Proyectos de Investigación Estudiantes Postgrado de la U de
Caldas 2011
Nombre de los Grupos de Investigación
Nombre del Grupo:
Grupo de Investigación en Biotecnología Agraria
Facultad/Departamento:
Facultad de Ciencias Agropecuarias/ Instituto De Biotecnología Agropecuaria
Clasificación: B
Nombre del Grupo:
Facultad/Departamento:
Clasificación:
Tipo de proyecto: Investigación Aplicada: De extensión:
Área Estrátegica del Plan de Desarrollo
Biotecnología
Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social
Salud
Ambiental
No corresponde a
ninguna de las áreas
estratégicas
INTEGRANTES DEL EQUIPO DE DOCENTES (indicar el Docente Responsable con un
asterisco)
NOMBRE/TIPO DE
VINCULACIÓN EN LA
UNIVERSIDAD DE CALDAS
DEPARTAMENTO/PROGRAMA ÁREA DE
CONOCIMIENTO
ALEJANDRO CEBALLOS
MARQUEZ* (Profesor
asistente)
Departamento de Produccion
Agropecuaria
Agronomía, veterinaria y
afines
Lugar de Ejecución del Proyecto (Municipio(s)/Departamento):
Municipio(s): Varios Departamento: Caldas
Presupuesto
Valor total del proyecto:
$118.992.000
Fuentes de financiación:
Universidad de Caldas
Vicerrectoría de Investigaciones
El proyecto será presentado a otras entidades
Valor solicitado en esta convocatoria:
Duración total (meses): 30 meses
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2. Resumen ejecutivo
La aplicación de las estrategias de control de la mastitis han tenido mucho éxito en la
lucha contra los patógenos causantes de esta y ha llevado a una drástica reducción en su
incidencia y en el recuento de células somáticas en leche (RSC) (Bradley, 2002), siendo la
aplicación de desinfectantes de pezones una práctica fundamental en dicho control, pues
contribuyen a reducir el riesgo de nuevas infecciones intramamarias en el hato. Lo anterior
hace importante la investigación y evaluación de la eficacia de diferentes métodos de
desinfección de pezones post ordeño y su impacto en la prevención de nuevas infecciones
mamarias bajo las condiciones de pastoreo en nuestro país. Además, no hay un adecuado
control de calidad sobre los productos utilizados como desinfectantes de pezones y la
frecuencia de presentación de los patógenos mamarios presentes en nuestro país puede
diferir con respecto a los observados en otros países, por ejemplo Estados Unidos donde la
producción es bajo condiciones de estabulación permanente.
El objetivo de este proyecto es evaluar diferentes tratamientos de desinfección de
pezones post ordeño en la reducción de nuevas infecciones intramamarias bajo
condiciones de pastoreo y desafío natural en ensayos clínico de no inferioridad; Se
tendrán entonces tres ensayos en los cuales se expondrán frente a un producto control
positivo un producto experimental yodado, un producto natural con elaborado con
extractos de plantas y el amamantamiento con ternero post ordeño .
Los estudios serán ensayos de hato dividido y las pautas a seguir son una modificación
de las propuestas por el National Mastitis Council (Nickerson et al., 2004). En cada ensayo
se tendrá un total de 100 vacas seleccionadas en un máximo de 2 hatos pertenecientes a
sistemas productivos de lechería especializada en pastoreo intensivo más suplementación
y en las cuales se tendrán dos tratamientos asignados completamente al azar. El primero
designado como control positivo el cual será un producto con una conocida eficacia en el
control de nuevas infecciones intramamarias y segundo un producto denominado
experimental según sea el caso para cada estudio. Se tomaran 10 muestras de leche de
cada cuarto cada quince días para hacer recuento celular somático (RCS) y dependiendo
de su resultado seleccionar las muestras para cultivo.
La eficacia del producto experimental se medirá mediante la incidencia de infecciones
intramamarias presentes en cada grupo de estudio y la prevalencia de infecciones
intramamarias durante el período de estudio se calculará con el número de infecciones,
dividido por el número de cuartos que fueron muestreados en ese momento específico y
los datos serán analizados mediante modelos de regresión lineal y regresión logística
mixta. Los coeficientes del modelo de regresión seran expresados como Odds Ratio (OR),
que indica la probabilidad de neo infección comparativamente con el producto experimental
(Dohoo et al., 2009).
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3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores o docentes, estudiantes
y otros que participan
Para la ejecución de este proyecto de tesis doctoral se ha conformado un equipo de
asesores con una amplia trayectoria en el área de mastitis bovina y evaluación de
desinfectantes de pezones que comprende trabajo de campo, de laboratorio y extensión en
los último años, donde uno de sus integrantes es el Dr. Mario López quien es zootecnista
de la Universidad de la Salle, Bogotá y PhD en biología molecular de la Universidad de
Lincoln en Nueva Zelanda; el Dr. López es una persona con amplia experiencia en el tema
de desinfección de pezones y pertenece al comité de investigación y desinfección de
pezones de NMC, actualmente es gerente de servicio técnico y ensayos clínicos en el
departamento de investigación y desarrollo en Delaval, Estados Unidos.
El segundo asesor internacional es el Dr Marcos Muños quien es profesor asistente de
la Universidad de Concepción en Chile, en donde es responsable de las cátedras en
producción de leche y tecnología y calidad de leche para estudiantes de pregrado de la
carrera de Medicina Veterinaria. Participa también en la docencia de postgrado en los
programas de Magíster en Ciencias Veterinarias mención inocuidad de alimentos y en el
programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias. El Dr Muñoz es PhD en Animal Science
de la Universidad de Cornell, Estados Unidos y participa además en investigación para la
producción lechera bovina; dentro de sus actividades en Chile se desempeña como
miembro del Directorio de la Sociedad Nacional de Buiatría y en el Consocio Lechero de
Chile como coordinador del grupo de trabajo de salud de rebaños lecheros para FIL/IDF.
En los Estados Unidos de Dr. Muñoz es miembro del National Mastitis Council donde forma
parte del research committee y el intenational advisory board de esta institución.
El Dr. Alejandro Ceballos quien es el tutor de este trabajo doctoral, es profesor
asistente de la Universidad de Caldas, PhD del Atlantic Veterinary College en Canada; el
Dr. Ceballos ha trabajado en los últimos ocho años en el estudio del efecto de la nutrición
sobre la sanidad mamaria, así como en programas de extensión y servicio en calidad de
leche. Durante este período de tiempo ha tenido la oportunidad de implementar planes de
prevención de infecciones intramamarias y reducción del RCS en rebaños lecheros en el
occidente del estado de Nueva York. Planes que sin duda alguna podrán ser adaptados a
los sistemas de producción de leche en el Eje Cafetero.
El investigador principal es Médico Veterinario Zootecnista y esta investigación hace
parte de sus estudios de Doctorado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas.
De esta forma se ha integrado un grupo de trabajo con amplia experiencia en mastitis,
abarcando desde el diagnóstico hasta la implementación de planes de prevención y control
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como la evaluación de desinfectantes de pezones, con lo que se asegura que el proyecto
puede llevarse a cabo sin contratiempos y con una metodología y resultados que pueden
aplicarse a las condiciones de producción de nuestro país.
4. Descripción del proyecto
4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación o de proyección y su
justificación
La calidad de la leche constituye para nuestro país una ventaja competitiva
fundamental para alcanzar y mantener un lugar protagónico en el proceso de producción,
transformación y comercialización de dicho producto y en la búsqueda de satisfacer las
necesidades de los consumidores nacionales y las exigencias de los actuales y futuros
mercados externos (Cubillos et al., 2005).
Al combatir la mastitis y mejorar la calidad de la leche se puede influir favorablemente
sobre las ganancias de las empresas ganaderas al aumentar el precio obtenido por el
producto y disminuir costos de producción (Philpot & Nickerson, 2000). Además, la entrega
de una leche cruda de mayor calidad a la planta, redundará en el beneficio para el
industrial y consumidor final, ya que leches con un menor RCS ayudarán a la obtención de
subproductos de mejor calidad y mayor vida media en góndola.
La aplicación de las estrategias de control de la mastitis, ha tenido éxito en la lucha
contra los patógenos causantes de esta y ha llevado a una drástica reducción en su
incidencia y en el RCS en leche (Bradley, 2002), siendo la aplicación desinfectantes de
pezones una práctica fundamental en dicho control pues reducen el riesgo de nuevas
infecciones intramamarias en el hato (Dodd & Jackson, 1971).
Si bien los primeros intentos de desinfección de pezones se hicieron con extractos
naturales como el aceite de pino (Moak, 1916) hoy día no se reportan ensayos que tengan
principios activos naturales para la desinfección de pezones post ordeño (NMC, 2009) . El
uso de cualquier desinfectante no debe dejar residuos en leche, pero se han establecido
que existen residuos de yodo en las lecherías que utilizan productos yodados (Hemken et
al., 1981; Galton et al., 1986; Rasmussen et al., 1991), por lo cual el desarrollo de
productos totalmente inocuos conversa con la tendencia mundial de reducir la presencia de
cualquier elemento contaminante en los alimentos como puede ser el yodo.
De otra parte, del inventario total de cabezas de ganado en nuestro país se calcula
que un 38% pertenece a sistemas de doble propósito en los cuales la aplicación de
desinfectantes de pezones post ordeño no se da pues las vacas amamantan los terneros
una vez terminado el ordeño. A su vez no se tiene establecido un verdadero efecto del
amamantamiento con ternero al final del ordeño sobre la presencia de nuevas infecciones
intramamarias, si bien si se reportan ensayos en los cuales se evalúa el efecto del recuento
celular somático sobre la composición de la leche, prevalencia de microorganismos
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causantes de mastitis entre otros en hatos bajo el sistema sin desinfección post ordeño
(Malek dos Reis et al., 2011; Malek Dos Reis et al., 2013).
Lo anterior hace importante la investigación y evaluación de la eficacia de diferentes
métodos de desinfección de pezones post ordeño y su impacto en la prevención de nuevas
infecciones mamarias bajo las condiciones de pastoreo en nuestro país. Además, no hay
un adecuado control de calidad sobre los productos utilizados como desinfectantes de
pezones y la frecuencia de presentación de los patógenos mamarios presentes en nuestro
país puede diferir con respecto a los observados en otros países, por ejemplo Estados
Unidos donde la producción es bajo condiciones de estabulación permanente.
4.2 Marco Teórico
Ensayos clínicos
Los ensayos clínicos aleatorios son aceptados como el mejor método para comparar el
efecto de dos terapias Dentro de los ensayos clínicos aleatorios muy a menudo se
pretende demostrar que una terapia es superior a un placebo o control positivo
(Christensen, 2007), siendo este último término el que se refiere a todos los estudios en los
que el tratamiento de control es un producto de eficacia comprobada (Siegel, 2000). Este
tipo de ensayos son llamados de superioridad, pero si con el ensayo deseamos mostrar
que la diferencia entre el control y el tratamiento experimental no difieren demasiado en
cualquier dirección, el ensayo se denomina un ensayo de equivalencia (Djulbegovic B,
2001; Lesaffre, 2008).
De otro lado los llamados ensayos de no inferioridad buscan determinar si un nuevo
tratamiento no es peor que un tratamiento de referencia (Piaggio G, 2012). Estos ensayos
están diseñados para demostrar que la diferencia en el efecto (nueva terapia vs terapia de
control) debe ser inferior. La no inferioridad de la nueva terapia sería entonces demostrada
si el límite inferior de confianza para la diferencia en el efecto entre las terapias resulta
estar por encima del límite de significancia (Christensen, 2007)
Los ensayos de no inferioridad serán muy útiles en casos en los cuales se pretenda
diseñar estudios en los cuales no es practica o éticamente posible hacer un ensayo
controlado con placebo, además en los casos en los cuales el tratamiento experimental no
se espera tenga una mayor eficacia primaria, pero puede ser mejor en efectos secundarios
como seguridad de aplicación, costos, producción o administración (Lesaffre, 2008)
Mastitis Bovina
La mastitis bovina continúa siendo la más costosa y desafiante de las enfermedades en
producción lechera a pesar de los esfuerzos y los recursos que se han destinado al control
y prevención de la misma (Bradley, 2002); esta se define como “la inflamación de la
glándula mamaria” que puede ser de origen infecciosos o no infeccioso y se caracteriza por
daños en el epitelio glandular, seguido por una inflamación clínica o subclínica que se
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pueden presentar con cambios patológicos localizados o generalizados dependiendo de la
magnitud del daño. La etiología infecciosa es la de mayor presentación en la industria
lechera moderna, identificándose 137 diferentes microorganismos que la pueden llegar a
causar (Bradley, 2002); como consecuencias esta produce una disminución en la
producción, ocasiona incremento en los costos por tratamientos y detrimento de la calidad
de la leche entre otros (Miller & Bartlett, 1991).
El riesgo de adquirir la enfermedad puede ser aumentado por factores químicos, físicos
o traumáticos y se puede considerar esta como una enfermedad desencadenada por
múltiples factores que incluye la especie bovina como anfitrión, los microorganismos como
agentes causales y el medio ambiente que afecta tanto a la vaca como al microorganismo
(Oviedo-Boyso et al., 2007).
Tradicionalmente, los patógenos causantes de mastitis se han clasificado como
contagiosos o medio ambientales (Blowey & Edmondson, 2010). Los patógenos
contagiosos pueden ser considerados como organismos adaptados para sobrevivir dentro
del huésped en particular en el glándula mamaria, son capaces de establecer infecciones
subclínicas que normalmente se manifiesta como una elevación en el RCS de la leche del
cuarto afectado y por lo general su propagación se da de cuartos infectados a cuartos
sanos y en el momento del ordeño (Philpot & Nickerson, 2000). Por el contrario, los
patógenos medio ambientales se describen como invasores oportunistas de la glándula
mamaria, no adaptados a la supervivencia dentro del huésped, que invaden, se multiplican
y generan un estado de respuesta inmune del huésped (Bradley, 2002). Los principales
patógenos contagiosos incluyen Streptococcus agalactie, Staphylococcus aureus,
Corynebacterium bovis y Mycoplasma bovis entre otros, y los principales medioambientales
comprenden Streptococcus uberis y dysgalactiae, E coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter aerogenes y Enterococcus faecalis (Philpot & Nickerson, 2000).
La mastitis se puede presentar de forma clínica o subclínica, siendo la forma clínica en
la cual se observan síntomas claros de una inflamación de la ubre, hay temperatura
elevada con dolores e inflamación, la leche esta alterada macroscopicamente y con
frecuencia los animales presentan fiebre; mientras que en la forma subclínica se da como
una inflamación de la ubre sin síntomas externos reconocibles en donde el RCS está
elevado, se puede observar la presencia de patógenos de mastitis y la composición
química de la leche esta alterada.
Mecanismos de defensa contra la mastitis
La glándula mamaria está protegida por una variedad de mecanismos de defensa que
pueden ser clasificados como inmunidad innata e inmunidad específica. La inmunidad
innata es también conocida como respuesta inespecífica y es la defensa predominante
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durante las etapas tempranas de una infección. La respuesta inespecífica está presente o
es rápidamente activada en el sitio de la infección por numerosos estímulos; sin embargo
no se aumenta por exposición repetida al mismo daño. Las respuestas inespecíficas o
innatas de la glándula mamaria están mediadas por la barrera física del extremo del pezón,
macrófagos, neutrófilos y células asesinas naturales y por ciertos factores solubles (Sordillo
et al., 1997).
La ubre de la vaca se compone de dos pares de glándulas mamarias, cada una
drenada por un pezón, estos cuatro cuartos están estructuralmente separados y funciona
de forma independiente (Hibbitt et al., 2004). Histológicamente la ubre lactante es una
glándula exocrina grande y lobulada con alvéolos dilatados que almacenan la leche; los
alvéolos drenan hacia los conductos intralobulares que convergen y se unen a los
conductos principales galactóforos que a su vez se abren en la cisterna de la glándula, la
cual está conectado a la cisterna del pezón y que por ultimo se abre en el canal del mismo
(Hibbitt et al., 2004; Frandson et al., 2009).
El canal del pezón es la primera línea de defensa de la glándula, porque las bacterias
deben penetrar a través de este para causar una infección intramamaria (Oviedo-Boyso et
al., 2007). La función del músculo del esfínter del pezón es mantener el orificio cerrado y
por lo tanto aislar el interior de la glándula mamaria, esto significa que cualquier daño de
esta estructura se relaciona con un aumento de la incidencia de mastitis (Myllys et al.,
1994). El canal del pezón está lleno de queratina, que proporciona una barrera física
adicional en la prevención de la migración bacteriana hacia la cisterna de la glándula
(Philpot & Nickerson, 2000). Además existen algunas sustancias antimicrobianas presentes
en el canal del pezón como ácidos grasos no esterificados y proteínas en la capa de
queratina que pueden unirse a los microorganismos patógenos aumentando su
susceptibilidad a los cambios de osmolaridad (Paulrud, 2005) y mermando su resistencia;
por estas razones el canal del pezón es considerado como una importante barrera contra la
mastitis.
Durante el proceso de producción la ubre es irrigada con grandes cantidades de sangre
a razón de 450 litros por kg de leche producido (Hibbitt et al., 2004). Además de transmitir
los elementos básicos de la leche para el parénquima glandular, el flujo de sangre también
suministra células de defensa, inmunoglobulinas y las proteínas del complemento. Los
tipos de células predominantes son los macrófagos (35-79%), linfocitos T y B (10-24%),
neutrófilos (3-26%) y células epiteliales (2-15%). Esta relación se puede cambiar en los
casos de presencia de bacterias o productos bacterianos pues se estimula la formación de
mediadores de la inflamación endógenos que activan los polimorfonucleares, los cuales
pueden llegar a representar hasta el 100% de todas las células, aumentando el RCS a
millones de células por mililitro (Gruet et al., 2001). Si las bacterias son capaces de superar
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la estructura anatómica del pezón deberá evadir la defensa celular y soluble de la glándula
mamaria con el fin de establecer la enfermedad.
El número total de leucocitos y su actividad en la glándula mamaria juegan un papel
vital en la determinación de la gravedad y la duración de las infecciones intramamarias. Los
neutrófilos son los leucocitos no específicos reclutados activamente hacia la infección y el
principal tipo celular que se encuentran en los tejidos mamarios y secreciones durante la
etapa temprana del proceso inflamatorio asociado con la infección bacteriana (Paape et al.,
2003). Estas células no específicas viajan de la sangre a la glándula mamaria en respuesta
a una variedad de mediadores de la inflamación con el fin de fagocitar y matar a los
patógenos bacterianos. Los neutrófilos tienen efectos bactericidas a través del estallido
respiratorio que produce radicales hidroxilo y de oxígeno, además son una fuente de
pequeños péptidos antibacterianos, que puede matar a una variedad de agentes patógenos
causantes de mastitis (Sordillo, 2005; Oviedo-Boyso et al., 2007).
Los macrófagos representan el tipo celular predominante en la leche y tejidos sanos de
la glándula mamaria. Durante la infección bacteriana, los macrófagos pueden servir para
facilitar la respuesta inmune innata o adquirida; similares a los neutrófilos estos fagocitan
las bacterias y las destruyen con proteasas y especies reactivas de oxígeno y su tasa de
fagocitosis se pueden aumentar dramáticamente en la presencia anticuerpos opsonizantes
de los patógenos específicos (Miller et al., 1988). Los macrófagos sin embargo tienden a
tener un menor número en la glándula mamaria durante la inflamación y poseen menos
receptores Fc, posiblemente disminuyendo su tasa de fagocitosis en comparación con los
neutrófilos (Sordillo, 2005). Así por la capacidad de los macrófagos de secretar sustancias
que facilitan la migración y las actividades bactericida de los neutrófilos se cree que son de
mayor importancia en la defensa no específica de la glándula mamaria que en la
fagocitosis (Oviedo-Boyso et al., 2007).
Importancias de la desinfección de pezones
El control de la mastitis ha sido a través de los años motivo de numerosas
investigaciones y hoy día es bien sabido que la mastitis se puede controlar mediante la
aplicación de plan de cinco puntos consistente en: el tratamiento adecuado de casos
clínicos, la utilización de terapia antimicrobiana intramamaria al secado, la desinfección de
pezones post-ordeño, la eliminación del hato de vacas con infección crónica y el
mantenimiento regular de la máquina de ordeño (Dodd & Jackson, 1971)
Durante el proceso de ordeño es inevitable la transmisión de algunos patógenos de la
mastitis aún bajo las más estrictas condiciones de higiene; el procedimiento más difundido
para poder destruir los microorganismos que han quedado en el pezón y reducir al mínimo
la penetración en el canal es la aplicación de productos desinfectantes post-ordeño este.
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El concepto de desinfección de los pezones después del ordeño se remonta a 1916
cuando el aceite de pino diluido fue usado en un esfuerzo por reducir la propagación del
Streptococcus agalactiae (Moak, 1916). Sin embargo, este tipo de práctica no fue usada
ampliamente sino hasta décadas más tarde cuando los investigadores de la Universidad de
Ontario en Canada demostraron que de la inmersión de los pezones en un desinfectante
después del ordeño llevó a la reducción de la mastitis que causaban las poblaciones de
bacterias en pezoneras; estas observaciones fueron confirmadas más adelante en los
ensayos de campo realizados en el Instituto Nacional para la Investigación en Lechería de
Inglaterra y esto dio lugar a extensas investigaciones en la Universidad de Cornell en New
York, donde el sellado de los pezones se incluyó como un componente de un programa
integral de control de mastitis (Nickerson, 2001).
En la actualidad un gran número de publicaciones referentes a la eficacia de los
productos pre y post sellado están disponibles y documentan la importancia de la
desinfección de los pezones como una herramienta valiosa en la prevención de nuevas
infecciones intramamarias en vacas lecheras (Dodd et al., 1969; Farnsworth et al., 1980;
Pankey et al., 1984; Fang & Pyorala, 1995), como consecuencia, esto se ha traducido en la
aparición de numerosos productos germicidas comercializados como desinfectantes de
pezones y hoy en día la gran mayoría de los productos ofrecidos en el mercado de los
Estados Unidos reducen la taza de nuevas infecciones en más de un 50% cuando se los
emplea adecuadamente con los demás componentes del plan integral de control de
mastitis (Philpot & Nickerson, 2000).
Dentro de la variedad de formulaciones se han probado como desinfectantes de
pezones se encuentran productos químicos como yodo, clorhexidina, amonio cuaternario,
hipoclorito de sodio, ácido sulfónico bencénico lineal, el cloro, el peróxido de hidrógeno,
monolaurato de glicerol, barreras físicas y ácidos grasos (Nickerson, 2001; NATIONAL
MASTITIS COUNCIL, 2009). Estos agentes son capaces de destruir las bacterias a través
de acción química o biológica, como los mecanismos de oxidación-reducción,
desnaturalización y precipitación de las proteínas citoplasmáticas, la inhibición de la
actividad enzimática y la alteración de las membranas celulares entre otros. Sin embargo a
pesar de que los primeros intentos de desinfección de pezones se hicieron con extractos
naturales como el aceite de pino (Moak, 1916) no se reportan actualmente ensayos que
tengan principios activos naturales para la desinfección de pezones post ordeño (NMC,
2009). El uso de cualquier desinfectante no debe dejar residuos en leche, contrasta con
esto el hecho de tener residuos de yodo en leche en las lecherías que utilizan productos
yodados para la desinfección de pezones (Hemken et al., 1981; Galton et al., 1986;
Rasmussen et al., 1991).
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De otra parte no se encuentran reportes de literatura que establezcan un verdadero
efecto del amamantamiento con ternero al final del ordeño sobre la presencia de nuevas
infecciones intramamarias, si bien si se reportan ensayos en los cuales se evalúa el efecto
del recuento celular somático sobre la composición de la leche, prevalencia de
microorganismos causantes de mastitis entre otros en hatos bajo el sistema sin
desinfección post ordeño y con amamantamiento al fin de este (Malek dos Reis et al.,
2011; Malek Dos Reis et al., 2013).
4.3 Objetivos
El objetivo general de este proyecto es evaluar diferentes tratamientos de desinfección
de pezones post ordeño en la reducción de nuevas infecciones intramamarias bajo
condiciones de pastoreo y desafío natural.
Los objetivos específicos son:
• Identificar los microorganismos presentes como causantes de infecciones
intramamarias y establecer la prevalencia e incidencia de estas en las lecherías objeto
del estudio.
• Evaluar un producto natural con extractos de plantas como desinfectante para pezones
post ordeño.
• Establecer el efecto del amamantamiento con ternero al finalizar el ordeño como medio
para reducir las nuevas infecciones intramamarias.
4.4 Metodología Propuesta
Se llevaran a cabo tres ensayos siguiendo la metodología de ensayos clínicos de no
inferioridad así: un primer ensayo que tendrá un desinfectante yodado como control
positivo frente a un yodado experimental; un segundo ensayo en el cual se tendrá un
desinfectante yodado como control positivo frente aun desinfectante hecho con extractos
naturales de plantas; y un tercer ensayo que tendrá un desinfectante yodado como control
positivo frente al amamantamiento con ternero una vez finalizado el ordeño. Los tres
ensayos seguirán la misma metodología que se propone a continuación:
4.4.1 Diseño del estudio
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Los estudios será un ensayo de hato dividido y las pautas a seguir en ellos serán una
modificación de la propuesta del National Mastitis Council (Nickerson et al., 2004). Se
tendrán dos tratamientos los cuales serán asignados completamente al azar a dos grupos,
donde cada uno de ellos recibirá un producto diferente, el primero designado como control
positivo el cual será un producto con una conocida eficacia en el control de nuevas
infecciones intramamarias y el segundo un producto denominado experimental (Ceballos-
Marquez et al., 2011).
Antes de cada ordeño se hará despunte de cada uno de los cuartos y presellado de los
pezones con un producto desinfectante comercial para el grupo control y experimental
dejando actuar por 30 segundos para luego hacer secado de cada uno. Después del
ordeño cada grupo será sellado con el control positivo o con el producto experimental
según corresponda. El material del ensayo será almacenado de manera adecuada
siguiendo las recomendaciones del fabricante y se asignará un color de vaso aplicador
para cada uno de los productos, teniendo en cuenta que en el tercer ensayo el grupo
experimental no será sellado sino que las vacas estarán expuestas al amamantamiento de
sus crías una vez finalizado el ordeño.
Previamente al inicio del estudio, se llevará a cabo una visita a cada uno de los hatos
para informar y capacitar al personal en los procedimientos del estudio a realizar (excepto
que conozcan los productos que se van a utilizar en el ensayo), para revisar
completamente el sistema de ordeño de acuerdo con el procedimiento estándar del
National Mastitis Council (NATIONAL MASTITIS COUNCIL, 2004) y para recopilar
información a través de una encuesta con respecto a los procedimientos y rutina de
ordeño, bioseguridad en el hato, tratamiento de mastitis e higiene general de las vacas y
los pezones.
El personal participante no conocerá el origen de los productos desinfectante y no
habrá detalles sobre el nombre y/o composición del producto asignado a cada animal.
4.4.2 Animales
Los estudios se llevarán a cabo durante 10 semanas en 100 vacas seleccionadas en
un máximo de 2 hatos con sistemas productivos similares y clasificados como lechería
especializada en pastoreo intensivo más suplementación en el departamento de Caldas.
4.4.2.1. Criterios de inclusión en el estudio:
4.4.2.1.1 Criterios para el hato
Un hato será elegible para su inclusión si cumple con los siguientes criterios:
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Adecuada identificación de los animales (orejeras, marca con números, collares
etc.)
Registro de eventos adecuado, en particular fecha de parto, de secado, producción
de leche y casos de mastitis clínica.
Una máquina de ordeño que funcione adecuadamente. El sistema de ordeño será
evaluado al comienzo del estudio y cualquier imperfección durante el estudio será
observado y evaluado por el investigador.
Capacidad y disposición para seguir el protocolo de estudio y cumplir con las
exigencias del mismo.
4.4.2.1.2. Criterios para los animales
Los animales serán elegibles para su inclusión en el estudio si cumplen los siguientes
criterios:
El animal goza de buen estado de salud en el momento de inicio del estudio, con
base en una inspección visual.
Se encuentra en estado de lactancia en el momento en el cual se da inicio al
estudio.
No ha sido tratado con antibióticos o productos anti-inflamatorios en los 30 días
anteriores al inicio del estudio.
Además un animal será retirado del estudio y sus datos no serán tenidos más en
cuenta si:
El animal deja de ser ordeñado en el hato, por razones como descarte,
enfermedad, venta etc.
El animal es tratado con antibióticos y/o antiinflamatorios durante el tiempo que
está en el estudio. Esto incluye además tratamientos para mastitis clínica y
subclínica.
4.4.2.1.3. Criterio de inclusión de los cuartos
Todos los cuartos serán elegibles excepto los cuartos con los pezones que presenten
alguna deformidad debido a lesiones anteriores o que al momento del estudio presenten
alguna lesión como laceraciones, irritación severa de la piel, ampollas, lesiones ulcerosas,
etc. Si algún pezón se llegare a lesionar durante el estudio será excluido del mismo para lo
cual se hará una evaluación quincenal de la integridad de los pezones. No se tendrán en
cuenta cuartos perdidos (que no produzcan leche) al momento de iniciar el estudio o que
se pierdan durante el mismo.
4.4.3 Recolección de muestras y definición de infección intramamaria
14
La eficacia del producto experimental se medirá mediante la cantidad de nuevas
infecciones intramamarias presentes en cada grupo de estudio. Al inicio del ensayo se
tomarán dos muestras de cada uno de los cuartos de forma aséptica para medir el RCS y
realizar cultivo microbiológico de forma tal que se pueda establecer el estado de infección
de cada uno de los cuartos al momento de iniciar el estudio.
Posteriormente, dos muestras de leche serán recolectadas asépticamente y con una
frecuencia quincenal de cada uno de los cuartos durante el tiempo de estudio (días 0, 14,
28, 42, 56, 70). Una de las muestras será enviada al Laboratorio de Análisis de Leche de la
Universidad de Antioquia para la determinación del RCS, usando para ello un contador
automatizado para células somáticas (Foss. Hillerød, Dinamarca), utilizando los resultados
como herramienta para seleccionar las muestra que serán cultivadas. Esto es si: RCS
>100.000 células/mL para las vacas de primera lactación o >200.000 células/mL para las
vacas con dos o más partos (Laevens et al., 1997; Schepers et al., 1997). A continuación,
la segunda muestra será cultivada siguiendo la metodología descrita por el National
Mastitis Council (Oliver et al., 2004). Una alícuota de 0.01 mL será cultivada de todos los
cuartos al tiempo cero y de los elegibles en las muestras quincenales, contando las
colonias cuando sean ≤1/placa (equivalente a ≤100 ufc/mL). La identificación de los
patógenos será así: Staphylococcus aureus será identificado por coloración de Gram y por
la presencia de una doble zona de hemolisis en agar sangre. Staphylococcus cuagulasa
negativo (CNS) será identificado por coloracion de Gram y por la no presencia de
hemolisis en agar sangre, sin embargo, si las colonias son ≥1/placa, la prueba de
coagulasa será realizada para la identificación; Staphylococcus aureus sera confirmado si
hay una reacción positiva, mientras CNS serán confirmados cuando la muestra sea
negativa. Streptococcus seran identificados por coloracion de Gram y prueba de catalasa
negativa. El test de Christie, Atkins, Munch-Petersen (CAMP), esculina y el API 20 Strep
System (bioMérieux SA, Marcy l’Etoile, France) se usara para identificar Streptococcus
uberis. Streptococcus dysgalactiae sera confirmado por la prueba de aglutinación en latex.
Bacilos Gram positivos y catalasa positivos serán considerados como Corynebacterium
spp. o Bacillus spp. Escherichia coli, and Klebsiella spp. seran identificados por coloracion
de Gram, siendo oxidaxa negativo y por su típica apariencia en agar MacConkey.
Además, si en el transcurso del ensayo un cuarto es considerado con mastitis clínica
se tomarán muestras antes del tratamiento para el cultivo bacteriológico de la leche e
identificar el agente causal.
Cada cuarto será la unidad experimental y una infección intramamaria se considerará
como nueva si el cultivo es positivo para la muestra de un cuarto que al iniciar el ensayo
era negativa para el patógeno en cuestión (Ceballos-Marquez et al., 2011). La infección
que se repita en el mismo cuarto con el mismo patógeno no se considerará como una
15
nueva infección. Las muestras de casos clínicos serán tenidas también en cuenta como
infecciones intramamarias. Las muestras que sean positivas a más de dos bacterias serán
consideradas como contaminadas y no serán informativas del estado de infección del
cuarto.
La prevalencia de infecciones intramamarias durante el período de estudio se calculará
con el número de infecciones, dividido por el número de cuartos que fueron muestreados
en ese momento específico y los datos serán analizados mediante modelos de regresión
lineal y regresión logística mixta. Los coeficientes del modelo de regresión seran
expresados como Odds Ratio (OR), que indica la probabilidad de neo infección
comparativamente con el producto experimental (Dohoo et al., 2009)
4.5 Resultados esperados
Objetivo Resultados esperados Indicador
Identificar los microorganismos
presentes como causantes de
infecciones intramamarias y
establecer la prevalencia e
incidencia infecciones en las
lecherías objeto del estudio
Reconocer los agentes
patógenos causantes de
infecciones intramamarias
Conocerla la prevalencia e
incidencia de infecciones
intramamarias en las
lecherías del estudio.
Patógenos
intramamarios
identificados.
Porcentaje de
prevalencia y taza de
incidencia.
Evaluar un producto natural con
extractos de plantas como
desinfectante para pezones post
ordeño.
Obtener un producto
natural con efectividad en
la prevención de nuevas
infecciones intramamarias
Nuevas infecciones
intramamarias en
grupo control y
experimental
Establecer el efecto del
amamantamiento con ternero al
finalizar el ordeño como medio para
reducir las nuevas.
Conocer el efecto del
amamantamiento sobre las
nuevas infecciones
intramamarias
Nuevas infecciones
intramamarias en
grupo control y
experimental
16
4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados
El establecer una metodología validada para determinar la eficacia de los productos
desinfectantes de pezones en condiciones de pastoreo así como el desarrollo de nuevos
productos naturales que no dejen residuos en leche y la determinación del verdadero
efecto del amamantamiento post ordeño, permitirá una efectiva protección contra las
nuevas infecciones intramamarias y permitiendo por lo tanto mejorar la calidad de leche de
los productores reduciendo el RCS en tanque y mayores beneficios económicos al recibir
las bonificaciones por calidad de la misma.
Así mismo las plantas lecheras en Colombia enfrentan a diario problemas con la
calidad de la leche cruda que se recibe debido al elevado RCS, que se origina en la
presencia de vacas con mastitis subclínica o clínica (Schukken et al., 2003). Por lo tanto, la
prevención y control de la mastitis impactará en forma positiva y significativa la calidad de
la leche que se entrega en planta y resultara en ventajas competitivas para la planta al
recibir leches que van a permitir un mayor rendimiento en la elaboración de subproductos,
la obtención de derivados de mejor calidad y de mayor duración en el enfriador, y para el
consumidor final al adquirir productos elaborados con una leche que les dará mayor
durabilidad después de abierto el empaque. Finalmente, esto se traducirá en una reducción
de las quejas por parte de los consumidores con respecto a la calidad de la leche fluida y
derivados lácteos.
17
5. Cronograma de actividades
Año/Mes 2013
Trimestres
2014
Trimestres
2015
Trimestres
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Selección de los predios, contacto con
productores, selección de animales para el
estudio
x x x
Recolección de muestras x x x x x x
Análisis de muestras x x x x x
Procesamiento de la información,
tabulación de datos
x x x
Análisis estadístico x x x
Informe final del proyecto x x
Presentaciones a congresos x x
Publicaciones x x x
18
6. Presupuesto
RUBROS*
FUENTES
TOTAL Universidad de Caldas Externa
Recurrente Solicitud
convocatorias internas
Recurrente Recursos frescos
1. SERVICIOS PERSONALES
1.1 Investigadores 16.832.000 16.832.000
1.2 Auxiliares
1.3 Consultores
1.4 Asesores
2. GASTOS GENERALES
2.1 Servicios técnicos
2.1.1 Recuento de Células somáticas (400 muestras iniciales mas 5 muestreos de 400 muestras cada uno = 2400 muestras/ ensayo) x 3 ensayos = 7200 muestras
14.400.000 28.800.000 43.200.000
2.1.2 Cultivos bacteriológicos (400 cultivos iniciales mas 30% del total muestreado = 600 cultivos/ensayo) x 3 = 3000 cultivos
30.000.000 30.000.000
2.2 Materiales e insumos
2.2.1 Materiales para toma de muestras (tubos, bronopol, alcohol, guantes, etc..)
2.000.000 4.000.000 6.000.000
2.2.2 De oficina (papel, tinta, fotocopias)
300.000 300.000
2.2.3 Desinfectantes de pezones 5.000.000 5.000.000
2.3 Apoyo económico para gastos de viaje y transporte
2.3.1 Salidas de campo 1.500.000 3.000.000 4.500.000
2.3.3 Auxilio para viaje
2.4 Equipos
2.4.1 Alquiler
3. INVERSIÓN
3.1 Equipo requerido
3.1.1 Para comprar
3.1.2 Propio
3.2 Material bibliográfico
3.2.1 Para comprar
3.3 Software
3.3.1 Para comprar
3.3.2 Propio
4. ADMINISTRACIÓN 20% 0 0 13.160.000 13.160.000
TOTAL 16.832.000 23.200.000 78.960.000 118.992.000
19
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