evaluaciÓn preliminar del potencial de …
TRANSCRIPT
1
EVALUACIÓN PRELIMINAR DEL POTENCIAL DE
DEGRADACIÓN DE FENOL POR PARTE DE UN CONSORCIO
MICROALGA-BACTERIA
Daniela Alejandra Mora Salguero
Estudiante de Ingeniería Química, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los
Andes, Bogotá, Colombia.
Estudiante de Microbiología, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes,
Bogotá, Colombia.
Asesor:
Andrés González Barrios
Profesor Asociado, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, Bogotá,
Colombia.
Co-Asesor:
Martha Vives
Profesor Asociado, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes, Bogotá,
Colombia.
RESUMEN
El desarrollo de tecnologías para la reparación ambiental ocasionada por la contaminación de
ecosistemas por hidrocarburos ha permitido la implementación de tratamientos como la
biorremediación, que emplean la diversidad biológica y características metabólicas de ciertos
microrganismos. Se ha encontrado que el consorcio microalga-bacteria puede llegar a ser una
alternativa eficiente en cuanto a la desintoxicación de contaminantes orgánicos e inorgánicos,
y la remoción de compuestos tóxicos. Este proyecto realiza una evaluación preliminar del
potencial de degradación de fenol de un consorcio microbiano que emplea tres cepas
bacterianas resistentes al fenol, aisladas de la bahía de Cartagena, Colombia
(Stenotrophomonas maltóphilia (C2), Microbacterium paraoxydans (C7A) y Paenibacillus lactis
(C7B)) y la microalga (Chlamydomonas reinhardtii). Se evaluaron tres medios de cultivo: TAP,
MMS y Medio marino. Fue seleccionado el medio TAP para el desarrollo de los diferentes
consorcios. Se observó un crecimiento aproximadamente dos veces más rápido de los
microorganismos en consorcio que en los cultivos puros, adicionalmente se encontró que la
relación de pre-inóculo 2:1 (bacteria-microalga) es la más apropiada en cuanto a la
estimulación del crecimiento de ambos microorganimos. Se obtuvo que los consorcios
construidos presentan un mejor desempeño a bajas concentraciones del contaminante (50
ppm), resultando el consorcio con la cepa C7A el más efectivo, alcanzando un porcentaje de
remoción de fenol del 49.89%.
Palabras clave: Biorremediación, microalga-bacteria, consorcio, potencial,
degradación, fenol.
2
1. INTRODUCCIÓN Una de las principales problemáticas actuales es el
requerimiento y uso deliberado de grandes
cantidades de energía en el mundo. Durante el siglo
XX se ha incrementado aproximadamente unas diez
veces el consumo energético mundial [1]. La Agencia
Internacional de la Energía (AIE) afirma que este
crecimiento se comporta de manera exponencial
incrementando anualmente un 1.6%, por lo que hoy
en día se consume un 70% más de energía que hace
treinta años y para el 2030 se estima un incremento
de otro 50% [1]. El petróleo como fuente de energía
primaria se comienza a utilizar en el último tercio
del siglo XIX y su constante crecimiento se debe a las
múltiples aplicaciones de este y sus subproductos
[2]. Para inicios del siglo XXI se estimó un aporte
aproximado del 80% por parte de combustibles
fósiles para satisfacer el consumo mundial de
energía primaria [1]. Posteriormente, el manejo
inadecuado de estos materiales y sus residuos ha
generado un problema grave a escala mundial dada
la contaminación de suelos y aguas con petróleo
crudo y productos derivados de este [3].
La variedad de entornos que pueden llegar a estar
contaminados con hidrocarburos es amplia. Al
contaminar el suelo, los hidrocarburos impiden el
intercambio gaseoso con la atmosfera ocasionando
cambios físico-químicos en los que se encuentran la
evaporación y penetración [4]. Así mismo, las
condiciones de temperatura, pH, humedad, entre
otros, intervienen en que el proceso de toxicidad sea
más acelerado, originando finalmente daños que
llegan a ser irreversibles para los ecosistemas
afectados. Estos compuestos cambian drásticamente
las condiciones de salinidad, lo que causa
destrucción de la estructura terciaria de las
proteínas, desnaturaliza enzimas y deshidrata las
células, lo cual es letal para muchos organismos [4].
Cuando la contaminación es en agua, ocurre que se
genera una mancha por los hidrocarburos vertidos
que flota dada la diferencia de densidades, lo que
impide la entrada de luz y de igual forma el
intercambio gaseoso, posteriormente se genera la
solubilización de compuestos hidrosolubles, lo que
afecta directamente a los nichos y ecosistemas
presentes [4].
Debido a la alta toxicidad de los compuestos
fenólicos, la Agencia de Protección del Medio
Ambiente de los Estados Unidos y la Unión Europea,
los ubican en la lista de contaminantes peligrosos
principalmente de aguas [5]. La presencia de fenoles
en el medio ambiente plantea un importante riesgo
para la biota acuática, incluso a bajas
concentraciones, se acumulan en los sedimentos o
en diferentes niveles de la cadena trófica [6]. Otras
fuentes de generación de desechos fenólicos son las
industrias farmacéuticas durante el proceso de
fabricación del ácido acetilsalicílico (aspirina) y en la
manufactura de resinas fenólicas, nylon y otras
fibras sintéticas [7]. De igual forma en la
agroindustria, en la producción de plaguicidas y
productos químicos desinfectantes [8].
Dada la problemática anteriormente mencionada es
necesario establecer y desarrollar tecnologías de
solución para las necesidades de reparación
ambiental que hoy en día se presentan en torno a
esto. La mayoría de los compuestos tóxicos pueden
ser removidos del medio ambiente y de efluentes
industriales por métodos fisicoquímicos. En los que
se encuentran: la ozonización, adsorción con carbón
activado, oxidación química, uso de reactivo de
Fenton, UV y el peróxido de hidrógeno [4]. Lo
limitado de estos tratamientos es que son complejos,
costosos, y producen subproductos igualmente
peligrosos [6]. Por estas razones, surge el interés en
el uso de la diversidad biológica, naciendo así la
biorremediación como método de tratamiento,
siendo una alternativa saludable, que consiste en el
uso de algunos microorganismos que dadas sus
características metabólicas pueden desempeñarse
en múltiples ambientes (incluyendo hábitats
extremos) neutralizando las sustancias tóxicas o
convirtiéndolas en inocuas para el ambiente o la
salud humana [4].
Los metabolitos microbianos son de enorme
potencial biotecnológico y se pueden implementar
3
para la desintoxicación ambiental, siendo mediada
por gran variedad de microorganismos empleados
en el tratamiento de aguas y suelos contaminados.
En un consorcio los microorganismos involucrados
resultan beneficiados, de ahí que probablemente
existan en la naturaleza una variedad de tales
consorcios, formados por diferentes organismos
fotótrofos y quimiótrofos [9]. El componente
fotótrofo, denominado epibionte, está unido
físicamente a la célula no fototrófica [9]. Hay
reportes en los que Chlorella vulgaris se ha visto
beneficiada en varios consorcios, se logra mejorar y
aumentar el crecimiento microalgal, cambia el
tamaño celular y el pigmento de la microalga
incrementa [10]. Se ha encontrado que el consorcio
microalga-bacteria puede llegar a ser una alternativa
más eficiente (hasta cinco veces más eficiente) [11]
en cuanto a la desintoxicación de contaminantes
orgánicos e inorgánicos, y la remoción de
compuestos tóxicos [10]. La capacidad fotosintética
de la microalga proporciona oxígeno, siendo
primordial puesto que actúa como aceptor de
electrones para las bacterias en el proceso de
degradación de contaminantes. De forma recíproca,
las bacterias contribuyen a la microalga puesto que
proporcionan el dióxido de carbono para completar
el ciclo fotosintético [10].
Las interacciones entre algas autótrofas y bacterias
heterótrofas pueden ser cooperativas o
competitivas. Ciertas bacterias acompañan a
microalgas incluso bajo la condiciones de
laboratorio en cultivos de una sola alga (unialgales)
[10]. El contacto estrecho y directo entre bacterias
aerobias y microalgas ha sido reportado
anteriormente (Chlorella sp. y Pseudomonas sp.) [10],
de igual forma (Chlorella sp. y Stenotrophomonas
maltophilia) [12], donde se ha observado un
estímulo de crecimiento de ambos microorganismos
e incluso los compuestos producidos por el alga
apoyan a un mejor crecimiento de la bacteria [10].
Las microalgas producen unas vainas o tejidos
compuestos por carbohidratos, proteínas y cationes
metálicos que están relacionados con la formación
de agregados celulares en el que las bacterias están
asociadas con la adherencia indirecta como
simbiontes bacterianos en la vaina y con la adhesión
directa sobre la superficie de las células de las algas;
de tal forma se reduce la distancia de difusión y se
permite un intercambio rápido y eficiente de los
sustratos [10]. Aunque muchas algas fotosintéticas
son consideradas completamente autótrofas,
requieren vitaminas como biotina, tiamina y
cobalamina como principales factores de
crecimiento. Se ha reportado que la co-inoculación
de cepas bacterianas aisladas de cultivos de algas,
proporcionan un mejor crecimiento a estas que las
algas al cultivarse solas, lo cual permite afirmar que
el intercambio de compuestos entre ambos
microorganismos proporciona un crecimiento más
adecuado [10]. La cercana proximidad, quimiotaxis,
movilidad y adhesión, son importantes para la
asociación alga-bacteria. En primer lugar los
organismos heterótrofos aerobios utilizan los
compuestos de carbono producidos
fotosintéticamente [12]. La fotosíntesis es un
conjunto de reacciones reversibles inhibidas por el
exceso de oxígeno disuelto, por lo cual el consumo
de oxígeno por parte de la bacteria disminuye la
tensión de este en el microambiente celular de las
algas, dando lugar a condiciones más favorables
para el crecimiento de estas [10]. Por otro lado, el
alga puede usar el dióxido de carbono para realizar
la fotosíntesis, producido por la mineralización
bacteriana [13].
Para asegurar una estrecha proximidad física entre
la microalga y la bacteria, los dos microorganismos
necesitan estar inmovilizados en una matriz
transparente que debe cumplir con ciertos
requisitos: permitir la entrada de luz necesaria para
que la microalga lleve a cabo sus procesos
fotosintéticos y ser suficientemente pequeña para
permitir la difusión de oxígeno y nutrientes; al
mismo tiempo deberá ser suficientemente grande y
pesada para evitar la flotación y asegurar completo
sumergimiento en el medio de crecimiento [14].
Se debe tener en cuenta la dinámica de interacción
entre poblaciones en cultivos mixtos, existen gran
variedad de tipos de interacciones binarias entre
4
organismos, desde relaciones negativas donde los
organismos involucrados se ven afectados por la
presencia del otro, como lo son competencia,
antagonismo, amensalismo, parasitismo y predación
[15]. Los efectos negativos son causados por: La
remoción de recursos, producción de toxinas o
inhibidores, agentes líticos, competencia por el
espacio y sustrato, entre otros [15]. De igual forma
se pueden presentar relaciones con efecto positivo,
donde se encuentran el mutualismo, simbiosis,
protocooperación y comensalismo [15]. Los efectos
positivos se pueden presentar por: La presencia
necesaria de ambos organismos para el crecimiento
de los mismos, por el contacto físico e interacciones
altamente específicas que estimulan el crecimiento,
por cooperación entre ambos organismos generando
estímulos en el crecimiento (no es necesaria la
presencia de ambas poblaciones para que se genere
crecimiento) y finalmente para el caso del
comensalismo el efecto positivo se presenta en uno
de los organismos, para el otro organismo
involucrado el efecto es nulo [15].
Este proyecto busca realizar una asociación
microalga-bacteria (Chlamydomonas reinhardtii-
Stenotrophomonas maltophilia, Microbacterium
paraoxydans y Paenibacillus lactis). Logrando
determinar las condiciones más apropiadas donde
se observe un crecimiento conveniente por separado
de ambos tipos de microorganismos.
Posteriormente, se determinará la relación de pre-
inóculo (microalga/bacteria) adecuada donde se
garantice que el crecimiento de alguno de los
microorganismos no se vea afectado por la presencia
del otro. Finalmente se desarrollará el consorcio
microbiano, donde se realizará el respectivo
monitoreo de los cultivos en cuanto al potencial de
degradación de fenol. Contribuyendo así a estudios
realizados en biotecnología respecto a estos temas
relacionados con la biorremediación, empleando
cepas bacterianas que en trabajos anteriores, han
demostrado resistencia a concentraciones de fenol
hasta 100 ppm y han presentado crecimiento en
medios con alta concentración de sales [16], así
mismo de las cepas bacterianas empleadas
Stenotrophomonas maltophilia ha reportado
crecimiento en cultivos mixtos y consorcios con
Chlorella vulgaris [12], igualmente se han
desarrollado estudios de evaluación de crecimiento
de la microalga Chlamydomonas reinhardtii [17].
Finalmente se evaluará la utilización del fenol como
fuente de carbono y por lo cual la desintoxicación
del medio, contrastando el desempeño en
crecimiento individual y el desempeño en consorcio.
Modelos matemáticos: Descripción
crecimiento consorcio
La mayoría de estudios realizados en cuanto al
comportamiento cinético de interacciones entre
microorganimos han descrito principalmente
cultivos de bacterias. Siendo estos fundamentales
para el entendimiento y posterior realización de
aproximaciones que describen el crecimiento de los
distintos consorcios microalga-bacteria construidos.
Considerando algunos de los tipos de interacciones
que se pueden presentar en los consorcios
construidos, se describen tres modelos cinéticos de
crecimiento en cultivo mixto que posiblemente
lograrían ajustarse a los resultados obtenidos
experimentalmente. La nomenclatura empleada en
los modelos planteados es: y
.
Modelo 1: Competencia por sustrato limitante.
La competencia de dos organismos por el mismo
sustrato es común además de ser un factor limitante
en la velocidad de crecimiento, es posible
determinar cuando ambos microorganismos podrán
coexistir establemente si se considera que siguen el
modelo de cinética de Monod [15]. Este modelo
puede describir el comportamiento en cultivos
mixtos. Al emplearse en los consorcios construidos
se logra tener en cuenta que las tasas de crecimiento
de la bacteria y la microalga en el consorcio están
limitadas por una tasa de crecimiento máxima y por
la cantidad de sustrato en el medio [15].
Modelo de cincética de Monod [15]:
5
(1)
Condición inicial es para . Donde x es la
concentración de biomasa, t es el tiempo, S es la
concentración del sustrato limitante, es la tasa de
crecimiento específica, es la tasa de
crecimiento máxima y es la constante de Monod o
constante de saturación definida como S cuando
.
El modelo describe el comportamiento del
crecimiento respecto a la concentración de sustrato.
Cuando la concentración de sustrato es alta la tasa
de crecimiento incrementa hasta un máximo, de
igual forma, al disminuir la concentración de
sustrato la tasa de crecimiento también desciende
[15].
A partir de lo anterior, se incluye el término de
muerte celular o tasa de defunción, quedando
expresado de la siguiente forma para la microalga y
la bacteria respectivamente [15]:
(2)
(3)
Así mismo se debe tener en cuenta que el
crecimiento celular y el consumo de sustrato están
relacionados linealmente por el coeficiente de
rendimiento, de la siguiente forma [15]:
(4)
Donde,
(5)
Dado que la concentración de sustrato no se afecta
por la muerte de los microorganismos, la ecuación
[4] queda de la siguiente forma:
(6)
Las ecuaciones cinéticas de Monod para la microalga
y las bacterias quedan expresadas de la siguiente
forma:
(7)
(8)
En trabajos anteriores, fue estudiada la cinética de
biodegradación de fenol por parte de un consorcio
Chlorella vulgaris – Pseudomonas aeruginosa, con el
modelo anteriormente planteado, encontrando que
dicho consorcio funciona mejor como sistema
biológico para la remoción de fenol que
Pseudomonas aeruginosa por si sola [18].
Obteniendo un porcentaje de 59.7% de remoción
por parte del consorcio y de 13% por parte de la
cepa de Pseudomonas aeruginosa. Finalmente
observando una notable diferencia en cuanto a la
eficiencia de desintoxicación de este contaminante
tóxico [11].
Modelo 2: Crecimiento mutualista.
Para la respectiva descripción de este modelo se
plantea que al tener dos especies a y b, donde a
produce como producto de crecimiento y b
produce . Los organismos se relacionan dado que
b requiere para crecer, mientras que a requiere
. De igual forma el medio de cultivo contiene todos
los nutrientes esenciales excepto y , por lo cual
a y b están obligadas a interactuar, primero por
competencia de sustrato limitante y posteriormente
por intercambio recíproco de nutrientes.
Partiendo del modelo 1 anteriormente descrito, las
ecuaciones (2) y (3) describen de igual forma el
comportamiento de la concentración de biomasa
respecto al tiempo para microalga y bacteria
respectivamente. Así mismo, para este caso la
ecuación (6) queda expresada de la misma forma.
Sin embargo es necesario plantear dos ecuaciones
6
adicionales que describen el cambio de la
concentración de los productos y en el tiempo
respectivamente, quedando expresadas de la
siguiente forma:
Donde
es el rendimiento de biomasa de b
usando como substrato, respectivamente
es el
rendimiento de biomasa de A usando como
substrato. De igual forma es la cantidad de
producido por unidad de masa de a, así como es
la cantidad de producido por unidad de masa de
b.
Para que exista el estado de coexistencia se deben
cumplir las siguientes condiciones:
De acuerdo a la interacción reportada entre
microalgas y bacterias [13], se considera entonces
que los productos y son oxígeno y dióxido de
carbono respectivamente.
Modelo 3: Crecimiento mixotrófico en la microalga
[19].
El crecimiento de microalgas se ve fuertemente
afectado por condiciones ambientales, tales como
nutrientes, fuentes de energía, carbono y luz [19]. Se
han desarrollado modelos matemáticos que tienen la
capacidad de predecir la dinámica de cultivos que
contienen microalgas y que se encuentran bajo
diferentes condiciones de crecimiento, dichos
modelos han ayudado a optimizar el rendimiento del
proceso, condiciones de operación y escalonamiento
de sistemas de cultivo [19]. De igual forma los
modelos cinéticos de Droop y Monod han sido
utilizados tradicionalmente para predecir el
crecimiento de microalgas en respuesta a la
concentración de sustrato [19]. Así mismo varias
investigaciones se han enfocado principalmente en
el efecto de la intensidad de luz para la fotosíntesis,
crecimiento, acumulación de moléculas e
incremento bajo condiciones de fotoautotrofía o
heterotrofía [19].
En un estudio realizado sobre el modelamiento
cinético del crecimiento de la microalga Chlorella
vulgaris, los autores plantean lo siguiente [19]:
Emplean el modelo de Droop el cual supone que el
crecimiento de biomasa depende de la cantidad de
nutrientes intracelulares en lugar de la
concentración externa de nutrientes en el medio de
cultivo [19]. Así mismo, dadas las características de
los cultivos se plantea que siguen un crecimiento
mixotrófico, es decir crecimiento debido a
fotosíntesis y crecimiento heterótrofo [19].
Por lo cual el modelo queda expresado de la
siguiente forma [19]:
Donde es la tasa de crecimiento mixotrófico,
correspondiente a la suma de tasas de crecimiento
fotosintético y heterotrófico.
Dado que la fotosíntesis se considera como uno de
los factores primordiales, es necesario describir la
síntesis de clorofila, puesto juega un importante rol
en las reacciones fotosintéticas. Por lo cual la
concentración de clorofila respecto al tiempo se
expresa de la siguiente forma [19]:
7
Donde B representa la concentración de clorofila,
es la cantidad mínima de carbono en el medio para
que exista crecimiento, es la tasa fotosintética y
es la tasa de consumo de carbono. Así mismo se
expresa la concentración extracelular de carbono,
con la tasa de consumo del mismo de la siguiente
forma [19]:
El carbono presente dentro de la célula es empleado
en actividades metabólicas, generación de energía,
intermediarios metabólicos, crecimiento, entre
otros. Así mismo es dependiente de la cantidad de
carbono consumido del medio y que es fijado por
fotosíntesis. Puede ser expresado de la siguiente
forma [19]:
Donde es el carbono presente dentro de la
célula y es una tasa de respiración que puede ser
expresada como un porcentaje de la tasa
fotosintética, varios autores la asumen como 10%
para cultivos batch [19].
Finalmente se deben tener en cuenta la intensidad
de luz, dado que es el factor más importante que
afecta la fotosíntesis. La ley de Beer-Lambert se
emplea como aproximación para estimar la luz que
pasa a través de un cultivo relativamente denso de
microalgas. Expresada de la siguiente forma [19]:
Donde es la intensidad de luz incidente, es el
coeficiente de absorción de las microalgas
normalizado a la densidad de la clorofila, es la
densidad de la clorofila y es la trayectoria de la luz.
Finalmente la tasa fotosintética se formula en base al
modelo Poisson-single-hit, usado en el estudio de
fitoplancton [19]. La fotosíntesis se describe como
una función incidente de la intensidad de luz y su
ecuación empírica toma la forma [19]:
[ (
)]
Donde es la tasa fotosintética independiente de
la intensidad de luz, es la eficiencia cuántica,
es la región de luz limitada donde la tasa de
fotosíntesis es función lineal de la intensidad de la
luz a bajos niveles.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Microorganismos
Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas empleadas
(Stenotrophomonas maltóphilia (C2),
Microbacterium paraoxydans (C7A) y Paenibacillus
lactis (C7B)) fueron aisladas de la bahía de
Cartagena, Colombia. Caracterizadas, preservadas y
en proceso de secuenciación de todo el genoma por
parte del Departamento de Ingeniería Ambiental de
la Universidad de los Andes.
Fueron sembradas por aislamiento en agar LB,
incubadas a 30°C durante 48 horas, con el fin de
garantizar cultivos puros y observar la morfología
de las colonias. Así mismo se realizan siembras
periódicas para mantener cultivos jóvenes. Fueron
crio-preservadas a -80°C en el cepario del
Departamento de Ingeniería Química de la
Universidad de los Andes.
Microalga
La microalga Chlamydomonas reinhardtii fue
proporcionada por el laboratorio de biotecnología
del Departamento de Ingeniería Química de la
Universidad de los Andes.
2.2. Preparación medios de cultivo
Fueron evaluados tres medios de cultivo (Ver
especificaciones Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3). Se
evaluó el crecimiento de cada microorganismo por
separado, con el fin de seleccionar el medio de
8
cultivo más apropiado, en el que se viera favorecido
el crecimiento de ambos microorganismos.
Tabla 1. Composición por litro medio de cultivo
caldo marino [20].
Compuesto químico Cantidad [g]
NaCl 19.45
MgCl2 8.8
Peptona 5
Na2SO3 3.24
CaCl₂ 1.8
Extracto de levadura 1
Citrato de sodio 0.1
KBr 0.08
H3BO3 0.02
Na2SiO3 4
NaF 2.4
CaNO3 1.6
Tabla 2 Composición por litro del medio de cultivo
TAP [21].
Solución Cantidad
Compuesto
químico Concentración
Solución
fosfato 1 ml
K₂HPO₄ 28.8 [g/100 ml]
KH₂PO₄ 14.4 [g/100 ml]
Sales 25 ml
NH₄Cl 15 [g/L]
MgSO₄ 7H₂O 4 [g/L]
CaCl₂ 2H₂O 2 [g/L]
Solución
elemento
s traza
1 ml
H₃BO₃ 1.14 [g/100 ml]
ZnSO₄ 7H₂O 2.2 [g/100 ml]
MnCl₂ 4H₂O 0.5 [g/100 ml]
FeSO₄ 7H₂O 0.5 [g/100 ml]
CoCl₂ 6H₂O 0.16 [g/100 ml]
CuSO₄ 5H₂O 0.16 [g/100 ml]
(NH₄)6Mo7O₂₄
4H₂O 0.11 [g/100 ml]
EDTA 5 [g/100 ml]
Ácido
acético 1 ml - -
Tris 2.42 g - -
Tabla 3. Composición por litro medio de cultivo
MMS [22].
Compuesto químico Cantidad [g]
K₂HPO₄ 12.8
KH₂PO₄ 3
NaCl 0.5
MgSO₄ 7H₂O 0.49
FeSO₄ 7H₂O 0,03
CaCl2 0.01
Glucosa 4
2.3. Cultivos en medio seleccionado
De acuerdo al crecimiento observado se seleccionó
el medio TAP. Cada cepa bacteriana fue cultivada por
duplicado en agar TAP e incubadas a 30°C durante
72 horas. De igual forma la microalga fue cultivada
por duplicado en agar TAP e incubadas durante una
semana a 27°C con luz. Para todas las siembras se
verificó la pureza de los cultivos observando la
morfología de las colonias presentes, así mismo se
realizaron pases periódicos con el fin de mantener
cultivos jóvenes.
2.4. Monitoreo del crecimiento y
desarrollo del consorcio
Curvas de crecimiento individual
Para monitorear el crecimiento de los
microorganismos evaluados y posterior desarrollo
de los consorcios, es necesario realizar curvas de
crecimiento individual en medio TAP. Esto permitirá
definir parámetros y etapas de crecimiento (fase de
latencia, exponencial y estacionaria).
Las curvas de crecimiento se realizaron tomando
mediciones a diferentes tiempos de la densidad
óptica. Los cultivos se monitorean durante
aproximadamente 150 horas. En las primeras 8
horas se monitorearon cada 2 horas, posteriormente
cada 8 horas. Dicho procedimiento se realiza
midiendo la densidad óptica en un
espectrofotómetro UV-vis (Agilent, CA, USA) a una
longitud de onda de 620nm para las bacterias y para
el caso de las microalgas a 685nm. Adicionalmente
se realizó conteo celular en la cámara de Neubauer a
los cultivos que contengan la microalga [23].
9
Relación de pre-inóculo construcción consorcios:
Dado el crecimiento individual observado de los
microorganismos, se decidió establecer las
siguientes relaciones de pre-inóculo: 1:1, 2:1 y 1:2
(de microalga y bacteria respectivamente). Dichas
relaciones se establecen con el fin de favorecer el
crecimiento de ambos microorganismos.
Monitoreo consorcios
Se monitorearon por microscopía los diferentes
consorcios realizados con cada una de las relaciones
de pre-inóculo con el fin de verificar la simbiosis
entre la microalga y la bacteria. Posteriormente se
realizaron las respectivas curvas de crecimiento de
los consorcios de relación 2:1 (bacteria-microalga).
2.5. Adición y evaluación del potencial de
degradación de fenol
Se realiza la aclimatación de los microorganismos al
fenol, para posteriormente evaluar el potencial de
degradación de este compuesto. La Tabla 4 presenta
las concentraciones de fenol en las cuales se
evaluará el consorcio, se decide establecer un rango
superior e inferior de acuerdo a la resistencia
evidenciada hasta 100 ppm de las bacterias hacia el
fenol [16]. De igual forma a los cultivos puros de los
microorganismos se les adicionó fenol, con el fin de
cuantificar el porcentaje de remoción de este
compuesto y compararlo con el que se obtenga en
los consorcios.
Tabla 4 Concentraciones de fenol a evaluar
CONCENTRACIÓN
DE FENOL [ppm]
50
100
150
La evaluación del potencial de degradación de fenol
se realizará por medio de cromatografía líquida
HPLC. Posteriormente se compararon las
concentraciones de fenol respecto a los estándares.
2.6. Ajuste a modelo matemático de los
resultados experimentales
Con el fin de describir el comportamiento cinético de
los consorcios construidos, se realiza ajuste de los
resultados experimentales en cuanto al crecimiento
de los consorcios de relación 2:1 (bacteria-
microalga) y a la degradación de fenol de los mismos
a 50 ppm. El sistema de ecuaciones diferenciales fue
solucionado por minimización del error cuadrado en
Matlab®, obteniendo los respectivos parámetros
cinéticos del modelo. Posteriormente se calculó el
con el fin de la verificar si la aproximación realizada
es válida.
3. RESULTADOS
Lo resultados son presentados de acuerdo al orden
de ejecución.
3.1. Evaluación medios de cultivo
En trabajos previos las cepas bacterianas estudiadas
presentaron crecimiento en un medio salino [16],
por lo cual se decide evaluar el crecimiento de la
microalga en dicho medio (Ver especificaciones
Tabla 1). Adicionalmente se evalúa el crecimiento
de las cepas bacterianas en un medio recomendado
para cultivo de la microalga Chlamydomonas
reinhardtii Tris-Acetato-Fosfato (TAP) (Ver
especificaciones Tabla 2) [21], dicho medio presenta
una alta concentración de sales que favorecen el
crecimiento de las microalgas. Finalmente se evaluó
un tercer medio, que es normalmente empleado
para cultivo de cepas bacterianas ambientales y que
en trabajos previos ha sido utilizado para desarrollo
de consorcios microbianos entre microalgas y
bacterias [23].
Posterior a la respectiva siembra de los
microorganismos en los distintos medios de cultivo
evaluados, se obtuvieron los resultados presentes en
la Tabla 5, observando presencia de crecimiento de
todos los microrganismos en el medio TAP, ausencia
de crecimiento de todas las cepas bacterianas en el
medio MMS y ausencia de crecimiento del alga en el
medio marino.
10
Tabla 5. Crecimiento microorganismos en medios
de cultivo evaluados.
Microorganismo
Presencia de crecimiento en
medio de cultivo
Marino MMS TAP
Stenotrophomonas
maltophilia (C2) x
x
Microbacterium
paraoxydans (C7A) x
x
Paenibacillus lactis (C7B) x
x
Chlamydomonas
reinhardtii
x x
Se selecciona el medio TAP como medio para el
desarrollo del consorcio debido a que todos los
microorganismos de interés crecieron en dicho
medio.
3.2. Crecimiento en medio de cultivo
seleccionado
Las cepas bacterianas evaluadas presentaron
crecimiento uniforme después de 4 días de
incubación a 30°C y de igual forma la microalga
Chlamydomonas reinhardtii presentó crecimiento
uniforme después de 6 días de incubación a 27°C.
Posteriormente se realizó microscopia y la
respectiva tinción (si aplica) para identificar la
morfología de los microorganismos estudiados, las
fotografías tomadas de algunos de los
microorganismos se presentan en la Ilustraciones 1,
2 y 3.
Ilustración 1. Stenotrophomonas maltophilia -
Bacilo Gram (-) (100X).
Ilustración 2 Microbacterium paraoxydans - Bacilo
Gram (+) (100X).
Ilustración 3. Chlamydomonas reinhardtii (100X).
3.3. Monitoreo del crecimiento y
desarrollo del consorcio
Curvas de crecimiento
Una vez seleccionado el medio de cultivo, se debe
monitorear el crecimiento de los microorganismos,
por lo cual se realizan las respectivas curvas de
crecimiento. Los microorganismos fueron cultivados
por separado en medio líquido TAP y las curvas se
11
desarrollaron de acuerdo a lo planteado en la
metodología.
La Gráfica 1 y Gráfica 2 presentan las curvas de
crecimiento de los microorganismos estudiados,
fueron obtenidas tras el monitoreo de la densidad
óptica durante un tiempo aproximado a una semana.
Gráfica 1. Curva de crecimiento microalga
Chlamydomonas reinhardtii en medio TAP.
Gráfica 2. Curvas de crecimiento de las cepas
bacterianas en medio TAP.
El comportamiento de ambos tipos de
microorganimos es muy similar en cuanto a los
tiempos en cada una de las fases de crecimiento. Se
observa que la fase de latencia tanto para la
microalga como para la cepas bacterianas es de
aproximadamente 50 horas, periodo
correspondiente a la adaptación de los
microorganismos al medio, las células se encuentran
en un estado aparente de reposo, aunque no
registren un crecimiento del número de células se
encuentran sintetizando material enzimático.
Posterior a las 50 horas inicia la fase exponencial,
etapa en la que los microorganismos ya se han
adaptado al medio, el rápido crecimiento se debe a
que la velocidad de crecimiento es máxima.
Finalmente se observa la fase estacionaria, para el
caso de la microalga esta tiene lugar a partir de las
100 horas de crecimiento, en las bacterias dicha fase
se observa desde aproximadamente las 75 horas.
Esta etapa ocurre debido al agotamiento de
nutrientes o espacio, cambios en el medio de cultivo
o acumulación de elementos tóxicos, la velocidad de
crecimiento empieza a decrecer hasta volverse nula.
Relación de pre-inóculo y monitoreo consorcios
De acuerdo a la microscopía de las relaciones de pre-
inóculo evaluadas, se decide realizar las curvas de
crecimiento correspondientes a la relación 2:1 de
bacteria-alga, puesto se observa mayor uniformidad
en los cultivos, adicionalmente hay mayor contacto
físico entre los microorganismos, lo que permite
afirmar la existencia de simbiosis y por lo cual el
éxito de la construcción del consorcio, es importante
aclarar que en las demás relaciones de pre-inóculo
evaluadas de igual forma se observó la estrecha
cercanía entre la microalga y las bacterias, sin
embargo en la relación 2:1 (bacteria-microalga) se
observaron mayor cantidad de agregaciones
celulares.
La Gráfica 3 y Gráfica 4 presentan las curvas de
crecimiento de la microalga Chlamydomonas
reinhardtii y de las cepas bacterianas evaluadas
respectivamente, en consorcio de relación 2:1
bacteria-microalga.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 50 100 150
O.D
. ( 6
85
nm
)
Tiempo [horas]
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 50 100 150
O.D
. ( 6
20
nm
)
Tiempo [horas] C2 C7A C7B
12
Gráfica 3. Curvas de crecimiento de la microalga
Chlamydomonas reinhardtii en consorcios de
relación 2:1 (bacteria-microalga) en medio TAP.
Gráfica 4. Curvas de crecimiento de las cepas
bacterianas evaluadas en consorcio de relación 2:1
(bacteria-microalga) en medio TAP.
De acuerdo a las longitudes de onda de máxima
absorción registradas para la microalga y las
bacterias, se considera que en los consorcios no
existe interferencia en la absorción de la microalga a
620nm ni de las bacterias a 685nm, puesto para la
microalga los máximos picos de absorción se
registran desde 685nm hasta 750nm siendo el
mayor pico a 685nm, para el caso de las bacterias los
máximos picos de absorción se registran desde
600nm hasta 650nm siendo el mayor pico a 620nm.
En los consorcios se observa un crecimiento mucho
más rápido de los microorganismos con respecto a
los cultivos puros. Es notable la disminución en el
tiempo de crecimiento, puesto la fase de latencia
toma alrededor de 10 horas, lo que representa una
reducción en el tiempo de aproximadamente un
80% en esta fase, así mismo se alcanza la fase
estacionaria en un tiempo cercano a las 55 horas,
correspondiendo a la mitad del tiempo que se toman
los cultivos puros en llegar a dicha fase.
Adicionalmente en los cultivos que contenían la
microalga se realizaron conteos celulares en cámara
de Neubauer con el fin de determinar la
concentración celular. Así mismo este
procedimiento permitió verificar la simbiosis entre
microalga y bacteria en los consorcios construidos.
La Ilustración 4 presenta la microscopía realizada en
cámara de Neubauer del cultivo de la microalga en
medio TAP. En contraste la Ilustración 5 e
Ilustración 6 muestran las microscopías también en
cámara de Neubauer de los consorcios entre la cepa
C7A y la microalga en las relaciones 1:1 y 2:1
(bacteria-microalga) respectivamente.
Ilustración 4. Microscopía en cámara de Neubauer
del cultivo puro de la microalga Chlamydiomonas
reinhardtii (40X) en medio TAP.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 20 40 60 80
O.D
. [6
85
nm
]
Tiempo [horas] C2 C7A C7B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 20 40 60 80
O.D
. [6
20
nm
]
Tiempo [horas] C2 C7A C7B
13
Ilustración 5. Microscopia en cámara de Neubauer
del consorcio en relación 1:1 de bacteria (cepa C7A)-
microalga (40X) en medio TAP.
Ilustración 6. Microscopia en cámara de Neubauer
del consorcio en relación 2:1 de bacteria (cepa C7A)-
microalga (40X) en medio TAP.
Se observa la diferencia entre las agregaciones
celulares de los consorcios con respecto a las que se
forman en los cultivos puros. Este comportamiento
permite afirmar la existencia del contacto estrecho
entre los microorganismos estimula su crecimiento,
por lo cual el éxito en la formación de consorcio. Sin
embargo podría considerarse que las agregaciones
celulares se deben a mecanismos de defensa en
respuesta a la presencia de otros microorganismos
en el mismo medio, este planteamiento será
considerado más adelante en la discusión, con
respecto a estudios realizados por otros autores
sobre consorcios microalga-bacteria.
La Ilustración 7 presenta los distintos consorcios
construidos: Cada una de las cepas bacterianas con
la microalga. Se observa como las bacterias se
ubican sobre la superficie celular de la microalga, se
empiezan a formar las agregaciones celulares y por
lo tanto los consorcios microbianos.
Ilustración 7. Microscopía de los consorcios en
relación 2:1 (bacteria-microalga) (100X): A.
Consorcio C2-microalga, B. Consorcio C7B-
microagla, C y D. Consorcio C7A-microalga.
Con el fin de observar en más detalle la ubicación de
las bacterias sobre la superficie celular de la
microalga, se decide teñir las muestras para
microscopía con fuscina. La Ilustración 8 presenta el
consocio C7A-microalga, se puede observar de una
forma más clara como se empiezan a ubicar las
bacterias alrededor de las células de la microalga.
Ilustración 8. Microscopía consorcio C7A-
microalga, muestras teñidas con fuscina (100X): A.
Relación 2:1, B. Relación 1:1.
14
Al realizar el conteo celular en cámara de Neubauer
se obtuvo que la microalga después de una semana
de crecimiento presentó una concentración celular
de en cultivo puro y en los
consorcios de relación 2:1 (bacteria-microalga)
presentó un promedio de .
Dada la diferencia entre las concentraciones
celulares de los cultivos puros y de los consorcios, es
posible afirmar que la mayor cantidad de células en
los consorcios se debe a un estímulo sobre el
crecimiento debido a la relación simbiótica entre
ambos microorganismos.
Para describir el crecimiento de los cultivos puros
en términos de biomasa se emplea el modelo de
cinética de Monod descrito anteriormente [15].
Obteniendo los parámetros cinéticos de tasa de
crecimiento presentados en la Tabla 6.
Tabla 6. Parámetro cinético de tasa de crecimiento en los cultivos puros.
Microorganismos μb [1/h]
C2 0.082
C7A 0.0853
C7B 0.0724
3.4. Adición y evaluación de potencial de
degradación de fenol
Una vez verificada la formación de los distintos
consorcios y estudiada la cinética de crecimiento de
los mismos en el medio seleccionado, se realiza la
evaluación del potencial de degradación de fenol.
Primero se estudia el desempeño de los
microorganismos en cultivo puro y finalmente en
consorcio, con el fin de comparar y determinar si los
consorcios son efectivos en cuanto a la degradación
del fenol.
Los consorcios se construyeron de acuerdo a las
relaciones de pre-inóculo establecidas (1:1, 2:1 y 1:2
microalga-bacteria) y conforme a lo descrito en la
metodología, se evaluaron tres concentraciones de
fenol.
Se realizaron dos mediciones de degradación de
fenol por cromatografía líquida HPLC, la primera a
las 48 horas de crecimiento y la segunda a las 96
horas. Para un mejor análisis y mayor simplicidad
sobre los resultados obtenidos, la Gráfica 5, Gráfica 6
y Gráfica 7 presentan la evaluación del potencial de
degradación de fenol en cada uno de los cultivos
estudiados a las concentraciones de 50, 100 y 150
ppm respectivamente en el monitoreo final
realizado a las 96 horas de crecimiento.
Adicionalmente la Tabla 7, Tabla 8 y
Tabla 9 presentan los porcentajes de remoción de
fenol en orden decreciente alcanzados por cada
cultivo en las respectivas concentraciones
evaluadas. La nomenclatura empleada C2-A, C7A-A y
C7B-A corresponden a los distintos consorcios
(bacteria-microalga), seguido de 1:1, 1:2 o 2:1 que
corresponden a las diferentes relaciones de pre-
inóculo evaluadas. Así mismo se tiene en cuenta que
las condiciones abióticas pueden influir en la
disminución de la concentración de fenol en el
medio, por lo cual las respectivas gráficas presentan
la concentración del control, permitiendo así la
correcta comparación de los cultivos evaluados, de
igual forma los porcentajes de remoción fueron
calculados respecto al control.
15
Gráfica 5. Evaluación del potencial de degradación
de fenol a 50 ppm: Concentración de fenol a las 96
horas de crecimiento.
Tabla 7. Porcentajes de remoción de fenol a 50
ppm.
Cultivo % Remoción
C7A-A, 2:1 49,89%
C7A-A, 1:2 40,73%
C2-A, 1:2 31,95%
C2-A, 2:1 28,31%
C2-A, 1:1 27,78%
C7B 21,82%
C7A 20,32%
C7A-A, 1:1 8,53%
A 3,22%
C2 3,00%
C7B-A, 1:1 1,41%
C7B-A, 1:2 0,17%
C7B-A, 2:1 0,12%
Para la concentración de 50 ppm se observa que los
mayores porcentajes de remoción son alcanzados
por el consorcio con la cepa C7A a una relación de
pre-inóculo de 2:1 y 1:2 (bacteria-microalga)
respectivamente. Adicionalmente se observa que los
consorcios con la cepa C7B no tienen efecto
significativo sobre la degradación o remoción del
contaminante, sin embargo la cepa C7B en cultivo
puro si presenta remoción. Caso contrario ocurre
con la cepa C2, el desempeño en la remoción del
fenol por parte de los consorcios con esta cepa es
mucho mejor con respecto a su cultivo puro.
Gráfica 6. Evaluación del potencial de degradación
de fenol a 100 ppm: Concentración de fenol a las 96
horas de crecimiento.
Tabla 8. Porcentajes de remoción de fenol a 100
ppm.
Cultivo % Remoción
C7B 35,41%
C2 33,46%
C7A 29,42%
A 25,60%
C7B-A, 1:1 17,28%
C7A-A, 1:2 16,64%
C7B-A, 1:2 15,58%
C7A-A, 1:1 12,81%
C7B-A, 2:1 11,32%
C2-A, 1:1 9,33%
C7A-A, 2:1 7,48%
C2-A, 2:1 4,04%
C2-A, 1:2 0,26%
Los resultados de la evaluación a 100 ppm muestran
que existe mejor desempeño en cuanto a la
degradación del fenol en los cultivos puros de todos
los microorganismos estudiados que en sus
respetivos consorcios.
16
Gráfica 7. Evaluación del potencial de degradación
de fenol a 150 ppm: Concentración de fenol a las 96
horas de crecimiento.
Tabla 9. Porcentajes de remoción de fenol a 150
ppm.
Cultivo % Remoción
C7A-A, 1:1 20,30%
C7B-A, 2:1 18,98%
C7B-A, 1:2 16,47%
C7A-A, 2:1 15,05%
C7A-A, 1:2 12,61%
C7B 12,13%
A 12,12%
C7A 6,91%
C2-A, 1:2 3,88%
C2-A, 2:1 3,16%
C2 1,36%
C2-A, 1:1 0,54%
C7B-A, 1:1 0,14%
Finalmente para la concentración de 150 ppm se
observa un bajo desempeño en cuanto a la remoción
del fenol con respecto a los porcentajes alcanzados a
50 y 100 ppm. Adicionalmente el comportamiento
sobre la degradación es muy similar tanto en los
consorcios como en los cultivos puros, por lo cual se
dificulta determinar si a dicha concentración los
consorcios llegan a ser más o menos efectivos en
cuanto a la remoción del fenol.
Se busca determinar el efecto de la variación de la
relación de pre-inóculo y de las concentraciones de
fenol evaluadas sobre la remoción de fenol. El
comportamiento promedio de los consorcios
respecto a las relaciones de pre-inóculo se presenta
en la Gráfica 8.
Gráfica 8. Efecto de la relación de pre-inóculo sobre el porcentaje de remoción de fenol.
Se corrobora lo anteriormente mencionado respecto
a la selección de la relación de pre-inóculo más
apropiada para la construcción de los diferentes
consorcios. Es decir, la relación 2:1 (bacteria-
microalga) es la más efectiva en cuanto al potencial
de degradación de fenol. De igual forma se observa
que el consorcio con la cepa C7A en todas las
relaciones de pre-inóculo evaluadas alcanza los
valores promedio más altos de remoción.
De igual forma la Gráfica 9 presenta el efecto de las
distintas concentraciones evaluadas sobre el
porcentaje de remoción de fenol.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
1:1 1:2 2:1
% R
emo
ció
n fe
no
l
Relación pre-inóculo
C2-A
C7A-A
C7B-A
17
Gráfica 9. Efecto de la concentración evaluada sobre el porcentaje de remoción de fenol.
Se observa que los consorcios con C2 y C7A son más
eficientes en cuanto a la remoción de fenol a bajas
concentraciones del contaminante, siendo más
eficiente el consorcio con la cepa C7A. Igualmente se
observa que la cepa C7B empieza a reportar
remoción de fenol a partir de 100 ppm.
Como procedimiento adicional, se decide evaluar el
crecimiento de los microorganismos en un medio
que contenga como única fuente de carbono el fenol,
por lo cual se implementó el mismo medio TAP pero
sin ácido acético, se le adicionó fenol de tal forma
que el medio presentara una concentración de 100
ppm de este compuesto. Lo que se observó es que
ninguna de las bacterias presento crecimiento en
este medio modificado, sin embargo la microalga
después de dos semanas de incubación a 27°C con
luz si presentó crecimiento. Se evidenciaron
diferencias en los cultivos respecto a la coloración
del medio, la Ilustración 9 presenta los cultivos de la
microalga a tres de incubación en el medio TAP
modificado y sin modificar, se observa la tonalidad
del medio y las formaciones celulares, la fotografía
fue tomada de lo observado en la parte inferior de
los erlenmeyers donde fue cultivada.
Ilustración 9. Coloración cultivos de la microalga
Chlamydomonas reinhardtii a tres semanas de
incubación: A. Medio TAP sin modificar, B. Medio
TAP modificado (sin ácido acético con fenol 100
ppm).
3.5. Ajuste a modelo matemático de
crecimiento en consorcio de los
resultados experimentales
Modelo 1
Al realizar la respectiva solución de las ecuaciones
diferenciales del modelo, implementando los
resultados experimentales. El ajuste se realizó a los
resultados de los consorcios construidos en relación
2:1 (microalga-bacteria) a 50 ppm, debido al mejor
comportamiento observado en crecimiento y en
potencial de degradación. La Gráfica 10, Gráfica 11 y
Gráfica 12 presentan los ajustes a los consorcios C2-
A, C7A-A y C7B-A respectivamente.
Gráfica 10. Ajuste de datos experimentales al modelo 1 del consorcio C2-A en relación de pre-inóculo 2:1 (bacteria-microalga) a 50 ppm. C2:
0%
10%
20%
30%
40%
50 100 150
% R
emo
ció
n fe
no
l
Concentración ppm
C2
C7A
C7B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-2
0
2
4
6x 10
7
Mic
roagla
[C
élu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
5
10
15x 10
8
C2 [
Célu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-1000
-500
0
500
Fenol [p
pm
]
Tiempo [horas]
Ajuste
Experimental
18
Concentración celular de la cepa C2 [células/ml] en el cultivo mixto, Microalga: Concentración celular de la microalga [células/ml] en el cultivo mixto, Fenol: Concentración de fenol en el medio [ppm].
Gráfica 11. Ajuste de datos experimentales al modelo 1 del consorcio C7A-A en relación de pre-inóculo 2:1 (bacteria-microalga) a 50 ppm. C7A: Concentración celular de la cepa C7A [células/ml] en el cultivo mixto, Microalga: Concentración celular de la microalga [células/ml] en el cultivo mixto, Fenol: Concentración de fenol en el medio [ppm].
Gráfica 12. Ajuste de datos experimentales al modelo 1 del consorcio C7B-A en relación de pre-inóculo 2:1 (bacteria-microalga) a 50 ppm. C7B: Concentración celular de la cepa C7B [células/ml] en el cultivo mixto, Microalga: Concentración celular de la microalga [células/ml] en el cultivo mixto, Fenol: Concentración de fenol en el medio [ppm].
De igual forma para los ajustes realizados a los distintos consorcios se calculó el coeficiente de determinación con el fin de validar si el ajuste al modelo es o no apropiado. La Tabla 10 presenta los valores de para los ajustes de concentración celular de bacterias, microalga y concentración de fenol en los distintos consorcios. Tabla 10. Valores de para el ajuste al modelo 1.
C2-A C7A-A C7B-A
Microalga 99,9995 99,9984 99,9817
Bacteria 99,9791 99,9827 99,9867
Fenol - 60,8162 - La gráficas de ajuste y los valores de permiten afirmar que el modelo es apropiado para describir el crecimiento de los microorganismos en cultivo mixto, puesto para todos los casos el coeficiente de determinación toma valores muy cercanos al 100%. Sin embargo el ajuste para la concentración de fenol no es apropiado, este comportamiento se debe posiblemente a que en las pruebas experimentales realizadas dicho compuesto no es la única fuente de carbono del medio, por lo cual la concentración del contaminante en el medio no disminuirá rápidamente ni en la misma magnitud a la que crecen los microorganismos. Existen otros estadísticos que permiten validar un ajuste, como la prueba de bondad de ajuste (goodness of fit), la prueba de falta de ajuste (lack-of-fit), entre otros. Sin embargo para aplicarlas es necesario que existan réplicas [24], por lo cual la implementación de otros estadísticos no es apropiada debido a la ausencia de repeticiones. Tras la solución de las ecuaciones diferenciales y el ajuste de los datos, se obtienen los respectivos parámetros cinéticos del modelo presentados en la Tabla 11 correspondientes a los consorcios de relación 2:1 (bacteria-microalga) a 50 ppm. Tabla 11. Parámetros cinéticos modelo 1 consorcios en relación de pre-inóculo 2:1 a 50 ppm.
Parámetro C2-A C7A-A C7B-A Unidades
umax a 27,8164 19,090704 19,412414 1/h
umax b 0,085773 0,14773 0,092223 1/h
Ks a 7901,3166 5259,6679 10249,376 ppm
Ks b 0,002194 17,22269 0 ppm
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
1
2
3
4x 10
7
Mic
roalg
a [
Célu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
2
4
6x 10
7
C7A
[C
élu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
20
40
60
Fenol [p
pm
]
Tiempo [horas]
Ajuste
Experimental
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
5x 10
7
Mic
roalg
a [
Célu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000
2
4x 10
9
C7B
[C
élu
las/m
l]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-2000
0
2000
Fenol [p
pm
}
Tiempo [horas]
Ajuste
Experimental
19
Da 0,005701 0 0 1/h
Db 0 0,000001 0 1/h
Ya 7928270,7 9228759,9 4,05E+11 células/ug
Yb 1088304,6 1228751,4 4,12E+10 células/ug
Modelo 2
Para realizar el ajuste al modelo 2, era necesario
medir las concentraciones de y de del medio,
datos correspondientes a las variables y del
modelo. Dichas mediciones no fueron desarrolladas
por lo cual el ajuste de los datos experimentales para
este modelo no fue posible realizarlo.
Modelo 3
Este modelo fue construido con el fin de describir el
crecimiento de microalgas a distintas condiciones
ambientales, tales como nutrientes, fuentes de
energía, carbono y luz [19]. Para realizar el ajuste a
este modelo era necesario realizar mediciones de la
concentración celular de clorofila, intensidad de la
luz incidente y trayecoria de la misma, así mismo la
medición de la concentración intracelular de
carbono. Dichas mediciones no fueron realizadas,
por lo cual el respectivo ajuste a dicho modelo no es
posible realizarlo. Sin embargo el planteamiento de
este modelo es de gran importancia debido a que
son muy pocos los modelos que describen el
crecimiento de microalgas, así mismo que tienen en
cuenta la concentración celular de clorofila, puesto
esta es un factor importante para el proceso
fotosintético y el que incrementa la absorbancia en
los cultivos que contienen la microalga, por lo cual
su concentración estaría directamente relacionada
con el crecimiento celular.
4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
En primera medida fue posible seleccionar un medio
de cultivo apropiado para el desarrollo de los
distintos consorcios, puesto el crecimiento tanto de
las bacterias como de la microalga se vio favorecido
presentando un periodo de crecimiento similar
entre los microorganismos estudiados. La ausencia
de crecimiento de las bacterias en MMS y de las
microalgas en caldo marino, se debe posiblemente a
que las concentraciones de sales y nutrientes de
dichos medios no son las encontradas en el
ambiente natural del que fueron aisladas o no son
las adecuadas para el tipo de microorganismos.
En los consorcios se observa un crecimiento mucho
más rápido de los microorganismos con respecto a
los cultivos puros, lo que permite afirmar que en los
consorcios se presenta estimulación en el
crecimiento de ambos microorganismos. De igual
forma las microscopías realizadas permitieron
evidenciar las agregaciones celulares debidas al
contacto estrecho entre la microalga y las distintas
bacterias, verificado así la simbiosis y por lo cual el
éxito de la formación de los diferentes consorcios
construidos. Se plantea la posibilidad que la
formación de las agregaciones celulares ocurra por
la activación de mecanismos de defensa dada la
presencia de otros microorganismos en el mismo
medio, sin embargo estudios previos sobre
asociaciones microalga-bacteria han mostrado que
en cultivos axénicos (una sola especie) se presentan
agregaciones celulares pequeñas con respecto a las
formaciones que ocurren en cultivos xénicos (varias
especies - consorcios) y que dichas formaciones
celulares que llaman flóculos tienen lugar debido a
la estimulación en el crecimiento que genera la
interacción entre los distintos microorganismos
[25]. Así mimo las tasas de crecimiento de los
microorganismos en consorcio son superiores a las
obtenidas en los cultivos puros. Por lo cual, según los
resultados obtenidos es posible afirmar que la
diferencia entre las concentraciones celulares de los
cultivos puros y de los consorcios se deben a un
estímulo sobre el crecimiento debido a la relación
simbiótica entre ambos microorganismos. Lo
anteriormente mencionado se corrobora con los
parámetros de cinética obtenidos, en los que se
observa incremento en las tasas de crecimiento de
los consorcios con respecto a las obtenidas en los
cultivos puros de bacterias. El consorcio que logra
ajustarse de mejor forma al modelo finalmente
evaluado es el C7A-A puesto es el único que muestra
fases estacionarias de crecimiento en ambos
microorganismos, muy similares a lo obtenido en las
20
curvas experimentales y las tasas de crecimiento
máximas incrementan aproximadamente el doble.
En cuanto al potencial de degradación de fenol, se
podría inferir que los consorcios construidos
presentan un mejor desempeño a bajas
concentraciones del contaminante, siendo este un
aporte importante puesto entre las grandes
complicaciones ambientales actuales se encuentran
la eliminación de contaminantes en bajas
concentraciones [7]. Los resultados de degradación
de fenol y microscopía realizada permiten afirmar
que la relación de pre-inóculo más apropiada para el
desarrollo de los consorcios es de 2:1 (bacteria-
microalga), así mismo se encuentra que el consorcio
más eficiente en cuanto a la remoción del fenol a
50pmm es el desarrollado con la cepa C7A el cual
logra un porcentaje de remoción de
aproximadamente un 50% en 96 horas. Es posible
que el mismo comportamiento de remoción por
parte de los consorcios no se haya podido evidenciar
en las demás concentraciones evaluadas, puesto
como se había mencionado anteriormente las cepas
bacterianas estudiadas reportaron resistencia hasta
100 ppm en trabajos anteriores, lo que permite
inferir que el bajo efecto de remoción se debe a que
posiblemente la maquinaría celular se concentra en
activar mecanismos de resistencia al contaminante y
no en su degradación, al evaluarse las
concentraciones de 100 ppm y 150 ppm.
Se realizó solo una evaluación general del potencial
de degradación de fenol con el fin de tener una
visión global del comportamiento de los
microorganismos a las distintas condiciones
establecidas. Debido a la elevada cantidad de
cultivos evaluados: Microalga, cepas bacterianas, sus
respectivas combinaciones en consorcios a las
diferentes relaciones de pre-inóculo y a las distintas
concentraciones de fenol evaluadas. Sin embargo se
concluye que sería apropiado realizar réplicas con el
fin de validar estadísticamente los resultados
obtenidos. Así mismo de acuerdo a lo observado se
podría evaluar la degradación de fenol a tiempos
superiores a las 96 horas de crecimiento, siendo
posible determinar si habrá remoción del 100% del
fenol.
Finalmente, de acuerdo al crecimiento observado de
la microalga en el medio TAP modificado se puede
inferir en primera medida que la microalga es el
microorganismo que lidera el proceso de
degradación del contaminante.
Como continuación al trabajo desarrollado, sería
pertinente y completamente necesario realizar
réplicas a las pruebas realizadas, con el fin de validar
estadísticamente los resultados obtenidos. Así
mismo se podría complementar con estudios
moleculares de las secuencias genéticas de las
bacterias y la microalga, con el fin de ubicar las
regiones codificantes para la resistencia y
degradación del fenol y/o contaminantes orgánicos
e identificando rutas metabólicas implementadas.
Logrando así contribuir de forma significativa a
estudios de biotecnología realizados respecto a la
remediación de ambientes contaminados.
REFERENCIAS
[1] M. Esteve y A. Urbina, «Energía y ecología: energía, claves ambientales en el uso y futuro de la,» It, p. 22, 2008.
[2] B. Azcárate Luxán y A. Mingorance Jiménez, «Energías no renovables,» de Energías e impacto ambiental, Madrid, Equipo Sirus, 2007, p. 37.
[3] D. Wolicka, A. Suszek, A. Borkowwski y B. Aleksandra, «Application of aerobic microorganisms in bioremediation in situ of soil contaminated by petroleum products,» Elsevier, 2009.
[4] J. Benavides, G. Quintero, A. Guevara, C. Jaimes, S. Guitierrez y J. Miranda, «Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petróleo,» Nova, 2006.
[5] P.-P. Zhang, Z.-G. Shi y Y.-Q. Feng, «Determination of phenols in environmental water samples by two-step
21
liquid-phase microextraction coupled with high performance liquid chromatography,» Elsevier, 2011.
[6] K. lika y I. Papadakis, «Modeling the biodegradation of phenolic compounds by microalgae,» Elsevier , 2009.
[7] Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, «Fenoles,» Registro Estatal de Emisiones y Fuentes Contaminantes , 2012.
[8] Ministerio del Medio Ambiente, Gobierno de Chile, «Registro de Emisiones y Transferencias de Contaminantes,» 2009.
[9] M. Madigan, J. Martinko, P. Dunlap y D. Clark, de Brock. Biología de los Microorganismos, Pearson, 2009, p. 525.
[10] S. Subashchandrabose, B. Ramakrishnan y M. Megharaj, «Consortia of cyanobacteria/microalgae and bacteria: Biotechnological potential,» Elsevier, 2011.
[11] V. Castro y V. Garzón, «Estudio de la capacidad de degradación de fenol del consorcio microalga/bacteria y obtención de la cinética de crecimiento y consumo de sustrato.,» Proyecto de grado, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, 2013.
[12] M. De Jesús y R. Santos, «Chlorella vulgaris as Soil Amendment: Influence of Encapsulation and Enrichment with Rhizobacteria,» International Journal of Agriculture & Biology, 2011.
[13] K. K. E. Th Safonova. I.A. Dmitrieva, «The interaction of algae with alcanotrophic bacteria in black oil decomposition,» Tesources, Conservation and Recycling, vol. 27, nº 2, pp. 193-201, 1999.
[14] L. de-Bashan y Y. Bashan, «Bacterias promotoras de crecimiento de microalgas:una nueva aproximación en el tratamiento de aguas residuales,» REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA, vol. 2, 2003.
[15] M. Shuler, Bioprocess Engineering Basics concepts, Prentice Hall, 1992.
[16] D. Mora, «Crecimiento en fase líquida de cepas bacterianas resistentes al fenol para desarrollo de consorcio Microalga-Bacteria,» Proyecto especial, Departamento de Ingeniería Química, Universidad de los Andes, 2014.
[17] M. Muñoz, J. Ramírez, A. Otero, V. Medina y Y. Velasco, «Efecto del medio de cultivo sobre el crecimiento y el contenido proteico de Chlorella vulgaris,» Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, 2012.
[18] D. Bejarano, «Cinética de biodegradación de fenol, a partir de un cultivo de Pseudomonas aeruginosa aislada mediante selección, en consorcio con Chlorella vulgaris como matriz de inmovilización.,» Proyecto de grado - Universidad de los Andes, 2013.
[19] V. Adesanya, M. Davey, S. Scott y A. Smith, «Kinetic modelling of growth and storage molecule production in microalgae under mixotrophic and autotrophic conditions,» Elsevier: Bioresource Technology, 2013.
[20] Handbook of microbiological media, Marine broth, Washington DC: CRC Press, 2010.
[21] Culture Collection of Cryophilic Algae, «TAP - Medium (Tris-Acetate-Phosphate),» 2014.
[22] ATCC, «Minimal Medium Salts M9,» ATCC.
[23] Á. Quiroga, «Evaluación del potencial de degradación de fenol y tolueno a partir del consorcio microalga-bacteria,» 2013.
[24] A. Maydeu-Olivares y C. Garcia-Forero, «Goodness-of-Fit Testing,» Elsevier, 2010.
[25] J. Lee, D.-H. Cho, R. Ramanan, B.-H. Kim, H.-M. Oh y H.-S. Kim, «Microalgae-associated bacteria play a key role in the flocculation of Chlorella vulgaris,» Bioresource Technology, 2012.
[26] R. Margesin y F. Schinner, «Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme enviroments,» Springer, 2001.
[27] ATCC, «MSDS FOR MICROBIAL CULTURES (Biosafety Level 1 or 2 or 3),» ATCC.
22
[28] A. Hamitouche, Z. Bendjama, A. Amrane, F. Kaouah y D. Hamane, «Relevance of the Loung model to describe the biodegradation of phenol by mixed culture in a batch reactor,» Ann Microbiol, 2011.
[29] ATCC, «Product sheet: Microbacterium paraoxydans. ATCC 9027,» ATCC.
[30] ATCC, «Product Sheet: Chlorella vulgaris. (ATCC 9765),» ATCC.
[31] ATCC, «Product Sheet: Chlamydomonas reinhardtii. (ATCC 18798),» ATCC.
[32] ATCC, «Product Sheet: Paenibacillus lactis. (ATCC 39564),» ATCC.
[33] ATCC, «Product Sheet: Stenotrophomonas maltophilia. (ATCC 31559),» ATCC.
[34] K. Laffineur, V. Avesani, G. Cornu, J. Charlier, M. Janssens, G. Wauters y M. Delmée, «Bacteremia Due to a Novel Microbacterium Species in a Patient with Leukemia and Description of Microbacterium paraoxydans sp. nov.,» Microbiology Unit, Faculty of Medicine, University of Louvain., 2003.
[35] C. Gutiérrez, E. Reyes y F. Corona, «Stenotrophomona maltophilia, una bacteria multirresistente,» Revista de la Asociación Mexicana de Medicina crítica y terapia intensiva, vol. XXI, nº 2, pp. 91-94, 2007.
[36] S. Luna, A. Albanesi y C. López, «Caracterización de la variabilidad de cepas de Paenibacillus larvae subsp. larvae (White) Heyndrickx et al. en la Argentina,» Agriscientia, 2002.
[37] A. S. A. B. A. B. Dorota Wolicka, «Application of aerobic microorganism in bioremediation in situ of soil contamined by petroleum produts,» Science Direct, pp. 3221-3227, 2009.
[38] G. Q. A. G. D. J. S. G. J. M. Joaquín Benavides, Biorremedación de suelos containados con hidrocarburos derivados del petróleo., Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, 2006.
[39] B. R. M. M. K. V. R. N. Suresh Subashchandrabose, «Consortia of cyanobacteria/microalgae and bacteria: Biotechnological potential,» Science Direct, Biotechnology Advances, pp. 896-907, 2011.
[40] De Jesús, M. & Santos, R., «Chlorella vulgaris as Soil Amendment: Influence of Encapsulation and Enrichment with Rhizobacteria,» International Journal of Agriculture & Biology, p. Wiley, 2011.
[41] F. C. Rodriguez, Biotecnología Ambiental, Madrid: Tébar, 2005.
[42] D. Baquero, «Presentación de clase: Análisis de curvas de crecimiento,» Interacciones microbianas laboratorio - 2014-2, 2014.