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EVALUACIÓN IN VITRO DE BIORREDUCCIÓN DE CROMO HEXAVALENTE MEDIANTE MICROORGANISMOS MARINOS AISLADOS EN LA BAHÍA DE

CARTAGENA PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES

ANDRES CAMILO ESCORCIA HERRERA YORDAN ANDRES SAEZ PETRO

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA - CARTAGENA FACULTAD DE INGENIERÍAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA X SEMESTRE CARTAGENA DE INDIAS, D. T. Y C.

2019

EVALUACIÓN IN VITRO DE BIORREDUCCION DE CROMO HEXAVALENTE MEDIANTE MICROORGANISMOS MARINOS AISLADOS EN LA BAHIA DE


ANDRES CAMILO ESCORCIA HERRERA YORDAN ANDRES SAEZ PETRO

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Ingeniero Químico

DIRECTORA LAURA RAMIREZ WILCHES

INGENIERA QUIMICA

CO-DIRECTOR GUSTAVO ECHEVERRI

BACTERIÓLOGO. MASTER TECNOLOGÍA QUÍMICA

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA - CARTAGENA FACULTAD DE INGENIERÍAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA QUÍMICA X SEMESTRE CARTAGENA DE INDIAS, D.T. Y C.

2019

NOTA DE ACEPTACION

4.8

TESIS MERITORIA

KATIA PATERNINA PALACIO

PRESIDENTE DEL JURADO

NATALIA TERÁN ACUÑA

JURADO

VICENTE VARGAS C.

JURADO

AGRADECIMIENTOS

Yordan Sáez A Dios por ser mi guía en este largo camino; lleno de obstáculos. A mis padres, Domingo Sáez Padilla y Emelda Petro Villalba por su apoyo en este proceso de formación. Mis hermanos Gabriel Sáez Petro y Liliana Sáez Petro por darme todo su apoyo. Mis tutores Laura Ramírez Wilches y Gustavo Echeverri Jaramillo por sus enseñanzas, además de su comprensión y dedicación ética-profesional para el desarrollo de este trabajo. A la empresa Cyrgo S.A. por su colaboración en la toma de muestras. A la universidad San buenaventura; en especial a Alma Rosa Estrada Pérez, la facultad de ingeniería química, la facultad de Bacteriología, al grupo de investigación GIMA y laboratorios IDIBAM por su gran acogida en el desarrollo de este proyecto. Mis compañeros y amigos por creer en mí. A mi compañero de trabajo Andrés Escorcia Herrera por su apoyo en este proyecto. A Eliana Villarreal Espinosa y Carlos Altamiranda González por su motivación día a día.

Andrés Escorcia A Dios por ser el forjador de mi camino en los momentos de desesperación, y haber derramado de su sabiduría sobre mí para salir adelante. A mis padres Álvaro Escorcia Hormechea y Vilma Herrera Herrera que me han dado todo el apoyo que he necesitado en todo este tiempo, me han brindado su amor y confianza en mí y les dedico esto porque los amo con todas mis fuerzas. Mis hermanos Gabriel Escorcia Herrera y Álvaro Escorcia Herrera por su motivación cada día. Mis tutores Laura Ramírez y Gustavo Echeverri por su entrega, motivación y amparo a lo largo de este proyecto de investigación. A mi novia, Yulis Vega Julio porque he contado con su apoyo en cada etapa de este proceso y porque sus palabras para continuar cada día adelante.

CONTENIDO

Pág.

RESUMEN 12

INTRODUCCION 13

1. PROBLEMA DE INVESTIGACION 15

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 15

1.2 FORMULACION DEL PROBLEMA 16

1.3 JUSTIFICACION 16

1.4 OBJETIVOS 17

1.4.1 Objetivo General 17

1.4.2 Objetivos Específicos 17

2. MARCO REFERENCIAL 19

2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS 19

2.2 MARCO TEORICO 21

2.2.1 Cromo 21

2.2.2 Cromo en la industria 22

2.2.3 El cromo y la influencia del pH 22

2.2.4. El cromo y su impacto en el medio ambiente 23

2.2.1 Biorremediación 24

2.2.1.1 Degradación enzimática 25

2.2.1.2 Remediación microbiana 25

2.2.1.3 Fitorremediación 26

2.3 MARCO LEGAL 31

2.4 MARCO CONCEPTUAL 32

3. DISEÑO METODOLÓGICO 33

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 33

3.1.1 Diseño Adoptado 33

3.1.2 Enfoque Adoptado 33

3.1.3 Población y Muestra 34

3.2 TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN 34

3.2.1 Fuente Primaria 34

3.2.2 Fuentes Secundarias 34

3.3 HIPÓTESIS 34

3.3.1 Hipótesis de investigación 34

3.3.2 Hipótesis Nula 34

3.3.3 Hipótesis Alternativa 35

3.4 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES 35

3.5 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACION 36

3.5.1 Toma de muestra 36

3.5.2 Preparación de Caldos de cultivos 37

3.5.3 Recuperación de microorganismos 38

3.5.4 Enriquecimiento en medios selectivos 39

3.5.5 Selección primaria 40

3.5.6 Preparación de medios sólidos y aislamiento 41

3.5.7 Crecimiento en medio (líquido y Solido) King con 300, 500, 1000 ppm 43

3.5.8 Caracterización fenotípica y conservación de morfotipos puros a 300, 500 y 1000 ppm de Cr (VI) 44

3.5.9 Preparación de la curva de calibración 46

3.5.10 Calibración de curva patrón en caldo King de 0.03-15 ppm 49

3.5.11 Activación y preparación de inóculos con los microorganismos marinos en Caldo King a 300 ppm 49

3.5.12 Bioensayo de los Microorganismo Marinos sobre Caldo King a 300 ppm 51

4. RESULTADOS Y DISCUSION 53

4.1 ANÁLISIS DE RESULTADOS 53

4.2 DISCUSION DE RESULTADOS 57

5. CONCLUSIONES 60

Lista de Figuras

Pág. Figura 1. Especies de Cromo VI dependiendo del pH ........................................... 23

Figura 2. Biotecnología .......................................................................................... 24

Figura 3. Los tres procesos de la Biorremediación ................................................ 25

Figura 4. Procesos sobre la remediación microbiana y detoxificación de metales.27

Figura 5. Mecanismo de interacción entre metales pesados y microorganismos .. 29

Figura 6. Biotransformaciones en el ciclo biogeoquímico del Hg ........................... 29

Figura 7. Ciclo biogeoquímico del cromo en la biosfera ........................................ 30

Figura 8. Barrio el Bosque de la Ciudad de Cartagena.......................................... 36

Figura 9. Muestreo en forma de N ......................................................................... 37

Figura 10. Zona de muestreo con puntos de recolección ...................................... 37

Figura 11. Caldos de Cultivo en 100ml de agua destilada ..................................... 38

Figura 12. Recuperación de Microorganismos Marinos en agua y sedimentos de la Bahía de Cartagena ............................................................................................... 39

Figura 13. Enriquecimiento de Microorganismos Marinos en los medios King, Lee y EG .......................................................................................................................... 40

Figura 14. Selección Primaria con Caldo Nutritivo y King a 50 y 150 ppm de Cromato y Dicromato de Potasio ........................................................................... 41

Figura 15. Preparación de Agar Nutritivo y King .................................................... 42

Figura 16. Preparación de medios Agar Nutritivo y King a 50 y 150 ppm .............. 42

Figura 17. Siembra de las muestras de agua y sedimentos sobre los medios Agar King y Nutritivo a 50 y 150 ppm ............................................................................. 43

Figura 18. Preparación de Caldos y Agares King a 300, 500 y 1000 ppm ............. 44

Figura 19. Tiempos establecidos para los reactivos para la Coloración de GRAM 46

Figura 20. Espectrofotómetro Genesys 10 UV ...................................................... 47

Figura 21. Preparación de volúmenes crecientes con agua destilada ................... 48

Figura 22. Preparación de volúmenes crecientes con diluciones con Caldo King . 49

Figura 23. Activación de microorganismos marinos sobre caldo King a 300ppm .. 50

Figura 24. Inóculos preparados ............................................................................. 50

Figura 25. Diseño experimental del bioensayo ...................................................... 52

Figura 26. Caldo Nutritivo y King con sales de cromato y dicromato de potasio a 50 ppm ........................................................................................................................ 53

Figura 27. Diversidad de Microorganismos en Caldo King .................................... 54

Figura 28. Porcentaje de reducción de Cromo Hexavalente .................................. 56

Figura 29. Concentración final de cromo hexavalente ........................................... 57

Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1. Compuestos de cromo con los usos usuales en diferentes industrias ..... 22

Tabla 2. Leyes y Decretos ..................................................................................... 31

Tabla 3. Operacionalización de variables .............................................................. 35

Tabla 4. Cepas de Microorganismos marinos ........................................................ 45

Tabla 5. Aislamiento selectivo de microorganismos marinos tolerantes a sales de cromo hexavalente para muestras de agua y sedimentos ..................................... 55

Lista de anexos

Pág. 1. Tabla de Concentración vs Absorbancias del MM-001 ...................................... 61

2. Tabla de Concentración vs Absorbancias del MM-005 ...................................... 62



5. Tabla de Concentración vs Absorbancias del MIX ............................................ 65

6. Graficas de las cepas con sus características microscópicas ........................... 66

7. Análisis estadístico con STATGRAPHICS Centurión XVI Versión 16.2.04 ........ 67

RESUMEN Los problemas de contaminación de acuíferos a nivel mundial son causa de preocupación y requieren métodos eficaces de remediación que permitan disminuir el impacto ambiental generado por vertimientos industriales y domésticos. En el presente estudio se aislaron microorganismos de agua y sedimentos marinos adaptados a concentraciones altas de cromo hexavalente hasta 1000ppm con potencial biorreductor en aguas residuales. Los bioensayos de remoción se llevaron a cabo en medio de cultivo King a los cuales se les adiciono dicromato de potasio

(K2Cr2O7). Los microrganismo marinos aislados y adaptados a 300ppm de cromo hexavalente evidenciaron ser reductores de este metal. Se obtuvieron microorganismos con porcentajes de bioreducción ideal. Las cepas pertenecientes a los géneros cocos positivos, cocos negativos, y bacilos negativos, presentaron porcentajes de 92% y por encima del 95% de reducción de cromo hexavalente a 300ppm. El consorcio mixto se consideró óptimo, con un porcentaje de 91% de biorreducción a concentración de 300 ppm de cromo hexavalente. Gracias a la tolerancia y resistencia de estos microorganismos, permiten proponer a estas especies como promisorias o capacitadas para la bioremediacion de sitios contaminados con cromo a escala real.

INTRODUCCION Hay una preocupación a nivel mundial, originada por el aumento en los fuertes contaminantes de las industrias, esto proviene principalmente de los metales pesados como son el Cromo, Cadmio, etc., que caen en las zonas acuosas, causando peligros y riesgos a la salud. Anteriormente mencionado, el Cromo es uno de los más tóxicos y abundantes en la tierra que en su forma hexavalente causa la contaminación de aguas superficiales y subterráneas debido a su habitual aplicación industrial, como la producción de acero, la galvanoplastia, el curtido de pieles, el procesamiento de metales como el cromado, producción de pinturas, colorantes y pigmentos [1]. Horsfall y colaboradores, afirman que: “El Cromo hexavalente, por lo general presente como Cromato (CrO4

-) y Dicromato (Cr2O7-), posee niveles de toxicidad

más elevados confrontado con otros periodos de valencia” [2]. Además, es altamente perjudicial, ya que tiene un alto ciclo de residencia en los acuíferos, lo que supone un riesgo para la salud de los seres humanos y animales. Por otro lado, El Cromo trivalente es menos toxico y se puede separar por el método físico como hidróxido [3]–[5]. De tal manera que, para reducir o eliminar cromo hexavalente, encontrados en residuos sólidos y líquidos, se han llevado a cabo o desarrollado diversos métodos fisicoquímicos como lo son la reducción y precipitación química, adsorción, intercambio iónico, osmosis inversa, electrodiálisis, entre otros pero estos métodos tienen como desventaja altos costos, remoción de metales incompleta, alta demanda energética, y la generación de residuos secundarios [6]. Actualmente, se han comenzado a estudiar como una alternativa, al empleo de métodos biológicos usando microorganismos. Este campo es emergente y se puede tratar aguas residuales con metales, lo cual podrían reducir los costos de los productos químicos, y el consumo de energía [7]. Por consiguiente, la búsqueda y la obtención de microrganismos con elevado potencial de remoción de metales pesados son esencial para desarrollar métodos biológicos eficientes para el tratamiento de aguas residuales. Esta aplicación permite considerar a los microorganismos como una instrumento biotecnológica para el tratamiento de las aguas contaminadas con cromo.

Por lo anterior este estudio se plantea para la obtención de microorganismos con tolerancia o resistencia al Cromo hexavalente aislados de aguas y sedimentos de un área aledaña a zona industrial de Bahía Cartagena para tratamiento de aguas residuales.

EVALUACIÓN IN VITRO DE BIORREDUCCION DE CROMO HEXAVALENTE MEDIANTE MICROORGANISMOS MARINOS AISLADOS EN LA BAHIA DE


1. PROBLEMA DE INVESTIGACION

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Una de las problemáticas ambientales más importantes se refiere a la contaminación por metales pesados. Este tipo de contaminación química es una de las más nocivas tanto para los ecosistemas acuáticos como para los diferentes niveles tróficos, ya que estos organismos bioacumulan una concentración mayor de metales pesados en comparación con la presente en el medio. Debido a esta circunstancia la concentración de metales pesados que se encuentra en los peces es un indicador importante de la contaminación ambiental. Por otra parte, el consumo de peces contaminados se puede convertir en un problema de salud para las poblaciones que se alimentan de este recurso [8]. Como por ejemplo el estado hexavalente del Cromo es tóxico para los humanos, los animales y la vida acuática, ya que tiene la capacidad fácilmente de pasar a través de membranas biológicas, por lo que al ser mutagénico y carcinógeno produce ciertas afecciones como el cáncer de pulmón cuando se inhala y fácilmente produce sensibilización en la piel [9]. Por otra parte, la contaminación costera ha ido incrementando de manera insistente y se debe especialmente a las descargas de aguas residuales a nivel nacional, los vertidos de residuos industriales, aumento de las actividades domésticas, agrícolas, desechos del petróleo y otros combustibles fósiles. Los tipos más comunes de contaminación costera se deben a los metales pesados, elementos inorgánicos y orgánicos [10]. Finalmente, el objetivo del presente trabajo se pretendió evaluar de forma in vitro microorganismos marinos para reducir Cromo hexavalente con aislados de agua y sedimento de un área aledaña a la zona industrial de la Bahía de Cartagena por el método de bioreducción.

1.2 FORMULACION DEL PROBLEMA

¿Mediante el uso de microorganismos marinos, como se puede reducir Cromo hexavalente de forma in vitro por el método de biorreducción para tratar aguas residuales de la bahía de Cartagena?

1.3 JUSTIFICACION

La contaminación por metales pesados es un problemática que ha ido en aumento debido principalmente a actividades antrópicas. Unas de las principales fuentes de contaminación se encuentran la minería, la metalúrgica, la agricultura, los vehículos automotores y el aporte natural en ciertos acuíferos [11]. Ante este problema es necesario implementar una técnica para la reducir los niveles de Cromo hexavalente, que sea económica y de fácil manejo. La reducción de iones metálicos de un estado de valencia superior a uno inferior a través de reacciones enzimáticas o indirectamente con el metabolito producido se conoce como biorreducción, la cual es considerado actualmente como una alternativa económica y una herramienta biotecnológica para el tratamiento de aguas residuales [12]–[16]. En cuanto a los tratamientos convencionales fisicoquímicos para la remediación de metales incluyen: precipitación química, métodos de oxidación y reducción, filtración, tratamiento electroquímico, ósmosis inversa, intercambio iónico, cementación, electro-diálisis, tecnologías de membrana, entre otras; pero estos procesos para remover los metales de efluentes industriales pueden ser inefectivos o extremadamente costosos especialmente cuando se encuentran en solución en un rango de 1-100 mg/L [17], [18]. Por lo tanto, es importante el desarrollo de métodos innovadores que tengan bajo costo y sean amigables con el ambiente para la eliminación de metales tóxicos de las aguas residuales. Por consiguiente, investigar la remoción de cromo de las aguas residuales mediante el método de biorreducción es una tecnología eficiente y eficaz en la eliminación de metales al medio ambiente el cual se puede implementar en un futuro. De igual manera, se pueden realizar aportes a la sociedad, debido a que se disminuirá el efecto toxico que causa esta sustancia en las aguas y sobre el cuerpo humano al ingerirse; Además, ayuda a las empresas a mejorar sus tratamientos de aguas en

cuanto al manejo de metales pesados, la cual este método es económico y factible para aplicarse a escala real o en microcosmos. También, el tema estudiado es coherente con el Proyecto Educativo Bonaventuriano (P.E.B), debido a que la Universidad de San Buenaventura (USB) considera fundamentales en su acción, la búsqueda constante de la verdad; la actividad creadora; el análisis serio y objetivo de la realidad; el rigor científico y el valor intrínseco de la ciencia y de la investigación, el examen crítico de los conocimientos y la aplicación de los mismos al desarrollo de la comunidad. De igual manera, cumple las funciones de docencia, investigación, proyección social y bienestar institucional infundiendo en esas funciones los valores éticos, estéticos, sociales y religiosos, y asume como notas fundamentales del ser universitario: la autonomía del saber, la corporatividad, la investigación, la creación y la transformación de la sociedad por el conocimiento. Asimismo, uno de los objetivos de la USB es desarrollar actividades que promuevan la preservación del medio ambiente y la conservación y fomento del patrimonio cultural del país [19]. Por último, este trabajo de grado es viable debido a que por medio de las investigaciones que se han hecho como se establece en los antecedentes investigativos, se ha podido comprobar la efectividad de los microorganismo para reducir cromo hexavalente en aguas residuales, y se ha verificado que se puede implementar a gran escala, como lo es una industria para un proceso estandarizado, para ayudar al medio ambiente y poder dar una solución a la problemática que se presenta en la actualidad debido a los metales pesados.

1.4 OBJETIVOS

1.4.1 Objetivo General

Evaluar de forma in vitro la biorreducción de cromo hexavalente mediante el uso de microorganismos marinos aislados en la Bahía de Cartagena para tratamiento de aguas residuales.

1.4.2 Objetivos Específicos

Recuperar los microorganismos marinos en Caldo Nutritivo provenientes de una zona contaminada de la Bahía de Cartagena.

Comparar crecimientos de los microrganismos marinos en medios de Caldo King, Caldo Lee y Caldo EG en sales de cromo a concentraciones bajas Analizar el crecimiento de los microorganismos marinos en medios de Agar King y Agar Nutritivo a altas concentraciones de sales de cromo. Aislar los microorganismos marinos con tolerancia a las sales de cromo mediante técnicas de aislamiento y bajo protocolo de manipulación microbiológica. Determinar la eficiencia de los microorganismos marinos a concentraciones de sales de cromo hexavalente sobre caldo King.

2. MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS Dentro de los antecedentes investigativos se encuentran las siguientes investigaciones: En 2007, Núñez-Chávez desarrolló una investigación sobre “Técnicas in vitro para biorremediación de cromo y plomo”, la finalidad de esta investigación fue probar técnicas in vitro para biorremediación de plomo y cromo, para los ensayos se aislaron cepas de microorganismos resistente a altas concentraciones de cromo y plomo, se estimó su potencial biorremediador en un medio líquido sintético contaminado con los metales. En la fase final de esta investigación se definieron dos cepas de hongos filamentosos pertenecientes al género Penicillium sp, identificadas como C1Cr y C1Pb como las más eficientes en la biorreducción de cromo y plomo a altas concentraciones. Se llevaron a cabo técnicas de biorremediación mediante inmovilización en superficies inertes, obteniéndose buenos resultados utilizando esponjas vegetales (paste) y alginato de calcio como medios para la inmovilización [20]. En ese mismo año, se realizó una investigación sobre “Biorremediación de efluentes con cromo (VI) proveniente de plantas metalmecánicas”, dirigida por Panigatti y colaboradores donde el objetivo de esta investigación fue el de estudiar el uso de E. coli en la detoxificación de aguas residuales contaminadas con Cr (VI) perteneciente a una planta metalmecánica. Donde el contaminante se evaluó a diferentes concentraciones a distintos tiempos y condiciones. En estos ensayos se utilizaron diferentes soportes, comparado con otros metales pesados como fueron el Plomo (Pb), Niquel (Ni) y Zinc (Zn). Los resultados obtenidos fueron que se comprobó la adaptación de la cepa hasta concentraciones de 200 ppm. Por otra parte a concentraciones bajas, se logró el 100% de la reducción del metal pesado tanto para procesos con aireación y sin aireación. Finalmente, se lograron mayores velocidades de reducción en los procesos con aireación sobre materia inerte [21]. Tres años después, Rojas y otros coautores, hicieron una investigación sobre “Biotransformación de metales pesados presentes en lodos ribereños de los ríos Bogotá y Tunjuelo”, el propósito fue la biotransformación de metales gracias a la presencia de microorganismos con capacidad de tolerar altas concentraciones de diferentes metales pesados (cromo, plomo y mercurio). Mediante ensayos se

evalúan las cepas por cultivo directo y cultivo selectivo, además ser determina su grado de compromiso en la biotransformación y biodisponibilidad de metales como cromo, plomo y mercurio. La siguiente investigación concluye que La biotransformación de estos metales, tanto en los enriquecimientos con medio de cultivo con lodos como en los que se les adicionó estos metales a los lodos esterilizados, fue casi total, indicando la eficacia de todos los géneros presentes bien sea trasformando los metales directamente o suplementando otros bioelementos para facilitar este proceso [22]. En el año 2015, Revelo y colaboradores trabajaron sobre “Uso de microorganismos nativos en la remoción simultánea de materia orgánica y Cr(VI) en una celda de combustible microbiana de biocátodo (CCM)”, el cual mediante una celda de combustible microbiana de biocátodo, constituida por electrodos de grafito sumergidos en las cámaras anódica y catódica separadas por un puente salino, fue posible reducir cromo hexavalente, degradar materia orgánica y generar electricidad. Se usó como fuente de microorganismos para el cátodo, lodo sulfidogénico o agua del rio Pasto contaminada con residuos de la industria de curtiembres. La mejor condición experimental para remover simultáneamente materia orgánica y cromo se presentó durante el primer ciclo de operación de la celda, utilizando como inóculo agua del rio Pasto contaminada y a la menor concentración de glucosa (0.05 M), lográndose remover 97.9% de materia orgánica, reducir 86.3 % de cromo y alcanzando una eficiencia coulómbica de 0.92%. Este estudio es un aporte para mejorar el desempeño de una celda de biocátodo y proporciona herramientas válidas en los procesos de biorremediación de sistemas contaminados con cromo y materia orgánica [23]. Posteriormente, Rueda y ayudantes en 2017 realizaron una investigación sobre “Remoción de cromo hexavalente de aguas residuales con Microorganismos adaptados a medios ricos en cromo” el objetivo de esta investigación determino

la capacidad que tienen las bacterias y levaduras en la remoción de cromo Cr6+ en concentraciones altas. Los ensayos de remoción se llevaron a cabo en medio de

cultivo BHI y agua residual (AR) con dicromato de potasio (K2Cr2O7). Como resultado los microorganismos (bacterias y levaduras) demostraron ser reductores de este metal. Por otra parte, los aislados bacterianos Raoultella sp, Serratia sp y

Klebsiella sp presentaron mayor reducción de Cr6+ en AR alcanzando el 100% de reducción de cromo en 30 horas, estos tres aislados se destacaron por su capacidad

de reducir Cr6+ tanto en medio de cultivo como en agua residual en todas las concentraciones de K2Cr2O7 evaluadas. Los aislados levaduriformes Candida Tropicalis, Candida Famata y Cryptococus neoformans no presentaron diferencias

significativas con el control en el ensayo de reducción del metal en AR con

diferentes concentraciones de Cr6+. La siguiente investigación concluye que Klebsiella sp, Raoultella sp, y Serratia sp son microorganismos promisorio para la

bioremediacion de sitios contaminados con Cr6+ a escala real [24]. En este mismo año se hizo una investigación sobre “Evaluación in vitro de la taruya (Eichhornia Crassipes) como agente biorremediador en aguas contaminadas con cromo”, dirigida por Cortés y Florez, donde se estableció que usando la Taruya (Eichhornia Crassipes) como agente fitorremediador el presente proyecto pretende evaluar su efectividad en la remoción de cromo en aguas contaminadas. Esta planta que se reproduce libremente en la región del Canal del Dique, del corregimiento de pasacaballos (Cartagena-Bolívar), se usa con el fin de identificar sus propiedades y evaluar su eficacia como agente de biorremediación

en aguas contaminadas con cromo (Cr6+). Para realizar este propósito se analizaron varias muestras de agua intencionalmente contaminadas con trióxido de cromo y se utilizaron 20 plantas en buenas condiciones para descontaminar dichas muestras; se utilizaron 10 recipientes de vidrio con 8 litros de agua potable, adicionando trióxido de Cromo. Durante 17 días, se llevaron a cabo tres fases: adaptación, nutrición e intoxicación con la solución de cromo, monitoreando el pH y la conductividad del agua. Se determinó la concentración de Cromo en cada recipiente verificando su variación. La Eichhornia Crassipes demostró su eficiencia en la remoción del metal pesado, al observar que la necrosis en las hojas durante la fase final confirmó la absorción de Cromo y se cuantificó con un porcentaje promedio de absorción con relación a la concentración inicial [25]. De lo anterior, esta investigación difiere en que se utilizaron microorganismos marinos captados de una zona aledaña a la Bahía de Cartagena aislados de agua y sedimento para así reducir Cromo hexavalente por método de biorreducción

2.2 MARCO TEORICO

2.2.1 Cromo

Es un elemento químico perteneciente al grupo de los metales de transición. Las tres formas principales del cromo son Cr, Cr (III) y Cr (VI). Pequeñas cantidad de Cr (III) son necesarias para mantener buena salud. Se puede encontrar Cromo en el aire, el suelo y el agua después de ser liberado por industrias que usan Cromo, como las relacionadas con galvanoplastia, curtido de cuero, producción de textiles y en la manufactura de productos en base a Cromo [26].

2.2.2 Cromo en la industria

El cromo y sus compuestos tienen varios usos. En la tabla 1 se muestra algunos compuestos de cromo y los usos en las industrias.

Tabla 1. Compuestos de cromo con los usos usuales en diferentes industrias

Fuente: Biorremoción de Cromo (Cromo Total y Cromo VI) en agua sintética por dos inóculos

bacterianos nativos compuestos, a escala de laboratorio [27]

A partir de la tabla anterior los vertimientos con mayor preocupación están en la industria de galvanoplastia que puede descargar Cr (VI). También, la industria de textiles, el curtido de pieles y la industria de pigmentos pueden verter Cromo Trivalente y Hexavalente a los acuíferos.

2.2.3 El cromo y la influencia del pH Los compuestos de Cr (VI) son oxidantes fuertes y altamente solubles, con capacidad de traspasar fácilmente las membranas biológicas, mientras que los compuestos de Cr (III) tienden a dar precipitados inertes a pH cercanos al neutros [20]. Las especies de cromo hexavalente coexisten principalmente dependiendo del pH

en que se encuentre; el ácido crómico (H2CrO

4) se encuentra a pH<1, el ion

hidrógeno cromato (HCrO4-) coexiste a pH entre 1-6 y el ion cromato (Cr𝑂4

2−) a pH>6.

Aunque, el ion dicromato (Cr2O72-

) también se puede formar cuando el pH esta entre 2-6. (Figura 1).

Figura 1. Especies de Cromo VI dependiendo del pH

Fuente: Optimization of Parameters for Cr(VI) Adsorption on Used Black Tea Leaves [28]

2.2.4. El cromo y su impacto en el medio ambiente

Entre los metales pesados, está el cromo, que en su estado trivalente es esencial para las industrias de cerámica, fotografía, cuero, textiles, entre otras. El cromo hexavalente es considerado el causante de agente cancerígeno, y mutagénico en humanos, también provoca alergias y problemas para respirar [29]. El cromo ha sido uno de los metales con más amplia gama para ser empleados en las industrias para recubrimiento de piezas metálicas, porque es resistente a la corrosión [30]. Además, se utiliza en baterías con elevadas temperaturas, como fungicida destruyendo hongos y/o parásitos; también es empleado en la industria de la madera, el cual se logra conservar la madera con altos periodos de tiempo, de igual madera se usa como catalizadores y agentes anticorrosivos, etc [31]. En la actualidad, se puede establecer una unión entre la biorremediación y la biotecnología (Figura 2); por lo que según la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, define a la biotecnología moderna como una conexión entre la ciencia, la tecnología y los organismos vivos [32].

Figura 2. Biotecnología

Fuente: BIOTECNOLOGIA Y BIORREMEDIACION [33]

2.2.1 Biorremediación

La biorremediación surgió como una rama de la biotecnología, a principios del siglo XX el cual se atribuye a las investigaciones de los microorganismos para biodegradar contaminantes. La biodegradación es el proceso natural por el cual los microorganismos tienen el potencial de degradar o alterar las moléculas orgánicas transformándolas en más pequeñas y menos tóxicas. Sin embargo, este proceso es muy lento, pero puede acelerarse implantando determinadas bacterias o plantas en los ambientes contaminados. Esta intromisión se menciona como “biorremediación” y se define como el empleo de organismos vivos para eliminar o neutralizar contaminantes del suelo o a los cuerpos de agua. También, la biorremediación se puede definir como la respuesta biológica al atentado ambiental [34].Esta definición permite distinguirse entre el empleo de microorganismos para recuperar áreas contaminadas y para tratamientos de residuos tanto industriales como domiciliarios [35]–[37].

Fundamentalmente, existen 3 procesos de biorremediación que son: primero, la degradación enzimática; segundo, la remediación microbiana, y por último la fitorremediación [38]. La Figura 3 señala las 3 etapas que se pueden lograr en la biorremediación.

Figura 3. Los tres procesos de la Biorremediación

Fuente: BIOTECNOLOGIA Y BIORREMEDIACION [33]

2.2.1.1 Degradación enzimática

Este mecanismo refleja en el uso de enzimas en el sitio que ha sido contaminado, para degradar los elementos nocivos. Donde estas enzimas provienen de bacterias sometidas a transformaciones genéticas, por medio de compañías de biotecnología dedicadas a esto.

2.2.1.2 Remediación microbiana

En este proceso los microorganismos son agregados o inoculados donde pueden ser ya existentes o pueden proceder de diferentes ambientes aplicándolos sobre la zona contaminada.

Algunos ejemplos son:

Bacterias alteradas genéticamente para degradar sustancias tóxicas que

contienen Cloro.

Bacterias degradadoras petróleo.

Bacterias con capacidad de bioreducir la toxicidad del metal pesado.

Bacterias que transforman metales del suelo.

Microorganismos capaces de degradar el compuesto (TNT).

Cianobacterias que pueden degradar hidrocarburos [39].

2.2.1.3 Fitorremediación

La fitorremediación es mecanismo por el cual se emplean plantas o partes de estas para absorber concentraciones de compuestos como lo son los metales pesados, donde son manejados sobre los suelos o aguas contaminados. Una de las ventajas que brinda este proceso son el bajo costo y la eficacia con que pueden llevarse a cabo los procesos de degradación. Algunos ejemplos de este proceso, son: la acumulación, absorción reducción, captación, alteración y degradación, el cual dependen de la planta y del agente contaminante [39]. Cambiando de tema, en cuanto a los avances tecnológicos, los procesos por los cuales los organismos interactúan con los metales tóxicos son muy diversos, donde en la Figura 4 se señalan algunos procesos que contribuyen a la captación y la detoxificación de metales pesados.

Figura 4. Procesos sobre la remediación microbiana y detoxificación de metales. Fuente: Biosorción de metales pesados mediante el uso de biomasa microbiana [40]

En la práctica constan de tres clases generales de procesos biotecnológicos para el tratamiento de residuos que contienen metales tóxicos: la biosorción, la precipitación extracelular y el atrapamiento a través de biopolímeros purificados y de otras moléculas especiales, derivadas de microorganismos; estos procesos no son diferentes el uno del otro, involucrando fenómenos fisicoquímicos y biológicos. [41]. Los métodos convencionales para el tratamiento de aguas residuales con metales encierran: reducción, intercambio iónico, precipitación, oxidación, tecnologías de membrana, evaporación, tratamiento electroquímico, y filtración resultan costosos e ineficaces, principalmente cuando la concentración de los metales es muy baja. Sin embargo, el empleo de microorganismos para la eliminación de metales pesados a partir de soluciones diluidas tienen el potencial para mejorar el proceso y logrando menores costos [40]. Los métodos químicos resultan costosos debido a que el agente activo no puede ser recobrado para su reutilización. También, el residuo final es un lodo con alta concentraciones de metales lo que limita su eliminación. Los microorganismos y sus productos pueden ser bioacumuladores muy eficientes de metales solubles y particulado, especialmente a partir de concentraciones

externas disueltas, por esto los procesos basados en los microorganismos ofrecen una alternativa a las técnicas convencionales para la eliminación y/o recuperación de metales pesados. Los dos procesos más importantes en el tratamiento biológico de metales pesados, son la adsorción en microorganismos o plantas conocida como bioadsorción y la reducción de iones metálicos de un estado de valencia superior a una inferior llamado biorreducción, el cual se logra a través de reacciones enzimáticas o indirectamente con el metabolito producido [13], [42]–[45]. Las relaciones entre los microorganismos y los metales, junto con otros elementos son unidades fundamentales de los períodos biogeoquímicos. Estas interacciones son experimentadas en la biotecnología ambiental, con el propósito de efectuar métodos de detoxificación o remoción de metales pesados [46]–[49]. Existen dos transformaciones posibles que pueden realizar los microorganismos dependiendo del estado de oxidación que se encuentre el metal y la especie que esté conformándose, una de estas transformaciones se le conoce como lixiviación microbiana atribuyéndose a la movilización del metal, es decir, a la salida de una fase sólida en estado insoluble inicial, en una fase líquida a un estado soluble final. El otro se establece conoce como a la inmovilización del metal, es decir, al cambio de un estado soluble en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida. Uno de los mecanismos de inmovilización de microorganismos es la biotransformación, el cual se involucra un intercambio químico sobre el metal, como por ejemplo en el estado de oxidación o metilación. Por otra parte, la transformación biológica de los metales pesados que resultan tóxicos mediada por enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles en agua o bien compuestos volátiles. En la Figura 5 se verá un microorganismo y como es su interacción un metal pesado con sus diferentes procesos.

Figura 5. Mecanismo de interacción entre metales pesados y microorganismos

Fuente: Microorganismos y metales pesados: una interacción en beneficio del medio ambiente [50]

Uno de los ejemplos más claro es el ciclo del Mercurio (Hg) en la naturaleza, donde

la bacteria Pseudomonas Aeruginosa puede reducir el catión Hg2+

y otros cuerpos

para después hacer el proceso de metilación dando como resultados el CH3Hg+ y (CH3)2Hg, que son más tóxicos (Figura 6).

Figura 6. Biotransformaciones en el ciclo biogeoquímico del Hg

Fuente: Microorganismos y metales pesados: una interacción en beneficio del medio ambiente [50]

Otro ejemplo (Figura 7) es el ciclo del Cromo en la biosfera.

Figura 7. Ciclo biogeoquímico del cromo en la biosfera

Fuente: Recent bioreduction of hexavalent chromium in wastewater treatment: A review [51]

2.3 MARCO LEGAL

Tabla 2. Leyes y Decretos

Fuente: Autores (2019)

2.4 MARCO CONCEPTUAL

BIOLIXIVIACIÓN: Es un método de solubilización, empleado por lo general en la industria de la minería, el cual por medio de la acción microbiana, los metales extraídos de los minerales son separados en fase liquida. BIOSORCIÓN: Este es un proceso aplicado en la biorremediación metales pesados, donde los microorganismos son empleados como biosorbentes, es decir, se aíslan en zonas contaminados inmovilizando los metales pesados en periodos breves de tiempo al entrar en contacto. BIOACUMULACIÓN: Es un mecanismo celular donde interviene un sistema de transporte por medio de membrana que centra al metal pesado en el citoplasma

provocando un consumo de energía que es producido por H+ -ATPasa. El metal es

atrapado por proteínas, que contienen grupos sulfhidrilos conocidas como metalotioneínas. BIOMINERALIZACIÓN: En este proceso se consiguen microorganismos que pueden precipitar metales pesados, donde se liberan radiación (radionúclidos) tanto carbonatos como hidróxidos, y esto es a través de los plásmidos que generan un sistema de resistencia. El mecanismo empleado aparece por el movimiento de una bomba que libera el metal tóxico que se encuentra dentro del citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de hidrogeno (H+) al interior celular. La alcalinización que ocurre dentro del sistema causa la precipitación del metal pesado. QUIMIOSORCIÓN MEDIADA POR MICROORGANISMOS: son reacciones donde los microorganismos biomineralizan un metal, creando un almacenamiento primario. El depósito primario funciona como núcleo de cristalización, donde se deposita el metal de interés, lo que ocasiona una rápida Biomineralización.

3. DISEÑO METODOLÓGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

El presente trabajo es de tipo descriptivo debido a que se emplea cuando se detallan cómo son y cómo se manifiestan fenómenos, situaciones, contextos y eventos. Este tipo de investigación quiere detallar las características significativas de cualquier fenómeno donde se aplique, esto se logra seleccionando, midiendo y recolectando fundamentos necesarios para representar el proceso. Según lo anterior, se puede concluir que con respecto a nuestra investigación, se describen diferentes microorganismos marinos sobre el medio King, para así medir las condiciones idóneas y metodologías para que se logre una buena biorremediación de Cromo hexavalente, a través del comportamiento de las variables establecidas, donde esto se aplica a lo que define Arias en el año 2012 [52].

3.1.1 Diseño Adoptado

El diseño adoptado para el presente proyecto es experimental, debido que se puede establecer un conjunto de situaciones (causa-efecto), que son controladas a través de condiciones determinadas para así aplicarlas al método científico. Para complementar, el diseño experimental es un proceso metódico en la cual el investigador puede controlar las variables y así medirlas y verificar los cambios entre las mismas.

3.1.2 Enfoque Adoptado

El enfoque adoptado para esta investigación es de tipo cuantitativo, debido a que se realizarán diferentes muestreos a la cual se le aplicaran técnicas microbiológicas para así obtener resultados óptimos en la recolección de datos e interpretarlos mediante el uso de tablas, gráficas, cuadros comparativos, mapas conceptuales, etc., y permitiendo un correcto análisis estadístico de la información obtenida [53].

3.1.3 Población y Muestra

La población representa la Bahía de Cartagena con las coordenadas (Latitud 10.3838889 y Longitud -75.5153611111111) .La muestra representativa tomada fue de 30 submuestras de sedimento y un tanque de agua de 5L.

3.2 TÉCNICAS DE RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN

3.2.1 Fuente Primaria

La información de carácter primario que se utilizó para la realización de este trabajo de grado fue recopilado en su totalidad del punto de muestreo ubicado en Latitud Norte 10°23’02.0” y Longitud Sur 75°30’55.3”.

3.2.2 Fuentes Secundarias

La metodología para recolectar la información secundaria se basó en el análisis de documentos, como revistas universitarias del área de ingeniería, consultas bibliográficas en los procesos fisicoquímicos de adsorción. Otras fuentes fueron las Bases de datos como son: Science Direct, Scopus, Dialnet, Ebsco, Redalyc, Scielo.

3.3 HIPÓTESIS

3.3.1 Hipótesis de investigación

Mediante el uso microorganismos marinos es posible reducir Cromo hexavalente por el método de biorreducción para tratar aguas residuales de la Bahía de Cartagena

3.3.2 Hipótesis Nula

Mediante el uso microorganismos marinos no es posible reducir Cromo hexavalente por el método de biorreducción para tratar aguas residuales de la Bahía de Cartagena

3.3.3 Hipótesis Alternativa

Mediante el uso microorganismos marinos es posible reducir otros metales pesados por el método de biorreducción para tratar aguas residuales de la Bahía de Cartagena.

3.4 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES

Tabla 3. Operacionalización de variables

TIPO VARIABLES DEFINICION INDICADORES

Independientes Tiempo de incubación

Tiempo transcurrido

para el crecimiento microbiano

Horas

Dependientes

Ph Indicador de

acidez o basicidad

Escala (0 – 14)

Temperatura

Grado o nivel térmico en

que se encuentra la

muestra

°C

Aislamiento de microorganismos

marinos

Crecimiento en agar

Nutritivo y agar King

Conteo de colonias (UFC/ml)

Coloración de GRAM

Positivo-Negativo

Concentración final del cromo

hexavalente

Cantidad de miligramos

de cromo por litro de

muestra

mg/L


3.5 PROCESAMIENTO DE LA INFORMACION

3.5.1 Toma de muestra

De la zona aledaña a la Bahía de Cartagena en el barrio El Bosque (Figura 8) en la empresa Cyrgo S.A. donde se tomaron muestras de agua y sedimento el cual fue realizada de acuerdo con la metodología propuesta por Hudson (2006) que recomienda un muestreo en zigzag (Figura 9), a una profundidad de 20cm donde se tomó 1 tanque de 5L y 20 muestras de sedimento en un área aproximada de 35 m2 de forma rectangular (15 metros de largo y 2,3 metros aproximadamente de ancho) (Figura 10). Estas últimas se almacenaron en bolsas limpias transparente (Ziploc) con un peso aproximadamente de 3Kg, una vez recolectadas las muestras, se llevaron al laboratorio y almacenadas a 5°C y el tanque de 5L se dejó a temperatura ambiente a 25°.

Figura 8. Barrio el Bosque de la Ciudad de Cartagena

Fuente: Google Maps (2019)

Figura 9. Muestreo en forma de N


Figura 10. Zona de muestreo con puntos de recolección

Fuente: Google Maps

3.5.2 Preparación de Caldos de cultivos

Para la obtención de microorganismos se trabajó con los siguientes medios en 100

ml de agua destilada. (Figura 11)

Caldo Nutritivo: Extracto de levadura – 0.3g; Peptona – 0.5g; Cloruro de sodio

(NaCl) – 2g

Caldo King: Peptona – 2g; Fosfato dipotásico e hidrogeno (K2HPO4) – 0.

15g; Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 -7H2O) – 2g

Caldo Lee: Glucosa – 2.5g; Fosfato dipotásico e hidrogeno (K2HPO4) – 2.5g;

Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 -7H2O) – 2g; Sulfato de amonio

(NH4)2SO4 – 5g; Cloruro de sodio (NaCl) – 5g

Caldo EG: Cloruro de amonio (NH4Cl) – 5mg; Fosfato dipotásico e hidrogeno

(K2HPO4) – 5mg; Fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) – 5mg; Cloruro

de sodio (NaCl) – 1mg; Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 -7H2O)

– 1mg; Acetato de amonio (CH3COONH4) – 200mg; Extracto de levadura –

15mg; Peptona – 50mg.

Figura 11. Caldos de Cultivo en 100ml de agua destilada


3.5.3 Recuperación de microorganismos

Para la recuperación de microorganismos en muestras de agua y sedimento de la

bahía de Cartagena se prepararon muestras compuestas o compositas, donde se

utilizó caldo nutritivo. Se tomó una muestra de agua de 1 mL y se adiciono en 9 mL

de caldo, y se llevó a cabo agitación para homogenizar. La muestra de sedimento

se preparó tomando 2 mg de este en 8 mL de agua, se agito para normalizar, luego

se extrajo 1 mL, agregándose a 9 mL de caldo; las muestras fueron incubadas a

temperatura ambiente (Figura 12).

Figura 12. Recuperación de Microorganismos Marinos en agua y sedimentos de la

Bahía de Cartagena Fuente: Autores (2019)

3.5.4 Enriquecimiento en medios selectivos

Después de 24h, para los ensayos se utilizó caldo nutritivo con suspensión

bacteriana en muestras de agua y sedimentos. Los medios líquidos específicos para

el enriquecimiento fueron: King, Lee y EG; por cada medio se tomaron 9 ml, se les

adiciono 1 ml de caldo nutritivo, se llevó a cabo agitación para homogeneizar y se

llevaron a incubación a temperatura ambiente (Figura 13).

Figura 13. Enriquecimiento de Microorganismos Marinos en los medios King, Lee y

EG Fuente: Autores (2019)

3.5.5 Selección primaria

Teniendo en cuenta el proceso anterior, se escogieron los medios de cultivos que

presentaron mayor turbidez, debido a que se notó una gran cantidad de crecimiento

microbiano. Para esta primera fase de selección se trabajó con caldo Nutritivo y

caldo King, para lo cual se preparó previamente estos medios líquidos; en los

ensayos de laboratorio se tomó 1 ml de caldo nutritivo con suspensión bacteriana

en muestras de sedimento y agua, las cuales fueron adicionadas en tubos de

ensayo con 9 ml de caldo nutritivo y caldo King. A partir de una solución madre con

2000 ppm de cromato y dicromato, extrajeron 250 micro litros equivalentes a 50

ppm, también se tomaron 750 micro litros equivalentes a 150 ppm, estos fueron

agregados a los caldos King y Nutritivo preparados previamente, luego se llevó a

incubación a temperatura ambiente (25°C). Figura 12

Figura 14. Selección Primaria con Caldo Nutritivo y King a 50 y 150 ppm de

Cromato y Dicromato de Potasio Fuente: Autores (2019)

3.5.6 Preparación de medios sólidos y aislamiento

Se prepararon medios solidos de Agar Nutritivo y King con las siguientes

especificaciones para 800ml de agua destilada Figura 15:

Agar Nutritivo: Extracto de levadura – 2.4g; Peptona – 4g; Cloruro de sodio

(NaCl) – 2g; Agar – 9.6g

Agar King: Peptona – 16g; Fosfato dipotásico e hidrogeno (K2HPO4) – 1.2g;

Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) – 1.2g; Agar – 16g

Figura 15. Preparación de Agar Nutritivo y King


Para completar la preparación de medios solidos se extrajeron 3,75 y 11,3 mililitros

equivalentes a 50 y 150 ppm respectivamente. Luego se almacenan en cajas de

Petri y llevadas a refrigeración (Figura 16)

Figura 16. Preparación de medios Agar Nutritivo y King a 50 y 150 ppm


Siguiendo con la experiencia, a cada caja de Petri se le agrego 100µL de los medios

ya seleccionados con muestras de agua y sedimento; el método empleado para el

cultivo fue el de barrido (Figura 17)

Figura 17. Siembra de las muestras de agua y sedimentos sobre los medios Agar

King y Nutritivo a 50 y 150 ppm Fuente: Autores (2019)

3.5.7 Crecimiento en medio (líquido y Solido) King con 300, 500, 1000 ppm

En esta fase se tomó el medio King para seguir con los ensayos, se sembraron en

medios líquidos y sólidos donde se verificó crecimientos a 18, 24, 48 y 72 h, el

aislamiento en placa se llevó a cabo por el método de estrías. (Figura 18)

Figura 18. Preparación de Caldos y Agares King a 300, 500 y 1000 ppm


3.5.8 Caracterización fenotípica y conservación de morfotipos puros a 300, 500 y 1000 ppm de Cr (VI)

Para esta etapa se hizo una Tinción de GRAM a 16 microorganismos marinos con el agar de origen con el tipo de muestra, la sal de cromo hexavalente y donde fue

cultivado (Tabla 3), este es un tipo de método que se empleó para diferenciar microorganismos y morfología celular bacteriana, la cual se consideraron como bacterias Gram positivas aquellas que se visualizaron de color morado y como Gram negativas aquellas que se visualizaron de color rosa para la caracterización morfológica y fenotípica de los microorganismos obtenidos a diferentes concentraciones.

Tabla 4. Cepas de Microorganismos marinos


Para el desarrollo de este método se utilizaron los siguientes reactivos:

Cristal violeta

Lugol

Alcohol acetona y

Fucsina básica

Se tomaron pequeñas muestras de los diferentes tipos de cepas y fueron fijadas en pequeñas placas de vidrio con concentración salina al 2% Ya teniendo las placas de vidrio fijadas con el Microorganismo Marino, se procede a la coloración de Gram, los tiempos utilizados para los reactivos fueron los siguientes:

Cristal violeta: 1 minuto Lugol: 1 minuto Alcohol acetona: 15 segundos Fucsina básica: 30 segundos

Figura 19. Tiempos establecidos para los reactivos para la Coloración de GRAM


Se lavó con agua destilada después de cada reactivo, luego se esperó a que las placas de vidrio se secaran para proceder con la revisión en el microscopio.

3.5.9 Preparación de la curva de calibración

El Método de referencia aplicado es el Método Normalizado para el Análisis de Aguas Potables y Residuales 3500-Cr B del año 2012 [54]. El rango de trabajo va

hasta 15 mg/L de Cr6+. Equipos y materiales:

Espectrofotómetro Genesys 10 UV para trabajar a 540 nm de absorbancia

(Figura 20).

Vidriería: vasos de precipitados, agitadores de vidrio, volumétricos

Figura 20. Espectrofotómetro Genesys 10 UV


Reactivos: Se aplicó el método de [55] modificado, donde la solución de Difenilcarbazida al 0.5% (m/v) debe prepararse al momento de su uso, por lo cual se tendrá en cuenta el volumen necesario. Habitualmente 10 mL son suficientes, lo que implica pesar 50 mg de 1,5-difenilcarbazida (difenilcarbohidrazida) y disolverlos en 10 mL de acetona. De una solución madre de cromo hexavalente se preparó una solución patrón de 1000ppm en 200mL.

En la solución de ácido sulfúrico (H2SO4) se tomaron 100 mL concentrado hasta llevarlo a 200 mL en balón aforado con agua, dando una solución 1:1 o de 50%. Procedimiento:

Las condiciones ambientales no influyen para la realización de este ensayo. 1. Se pipetearon volúmenes crecientes de la solución patrón de cromo hexavalente, utilizando pipetas mecánicas previamente calibradas donde se realizaron diluciones seriadas con concentraciones de 0.9, 1.9, 3.9, 7.8, 15.6, 31.2, 60.5, 250 ppm en tubos de ensayo. 2. De los volúmenes crecientes se tomó 1ml de muestra patrón de cromo donde se le adicionó 0.5 mL de ácido sulfúrico 1:1. El pH debe ser alrededor de 2. 3. Añadir 1.0 mL de solución de Difenilcarbazida, agitar y dejar reposar 5 a 10 minutos para desarrollar color. 4. Leer de 5 a 10 minutos en espectrofotómetro con el blanco (Agua destilada) a 540 nm. (Figura 21)

Figura 21. Preparación de volúmenes crecientes con agua destilada


3.5.10 Calibración de curva patrón en caldo King de 0.03-15 ppm

En este etapa se siguieron los lineamientos del proceso anterior siendo que utilizo 1 mL Caldo King a 300ppm como muestra estandarizada, adicionándole 0.5 mL de ácido sulfúrico 1:1 y 1 mL de Difenilcarbazida; entre los volúmenes crecientes de cromo hexavalente de 0.9, 1.8, 3.6, 7.5, 15, 60, 129 ppm, haciendo diluciones seriadas con Caldo King, luego se esperó de 5 a 10 minutos para leer con el blanco (Caldo King a 300 ppm) a 540 nm (Figura 22).

Figura 22. Preparación de volúmenes crecientes con diluciones con Caldo King


3.5.11 Activación y preparación de inóculos con los microorganismos marinos en Caldo King a 300 ppm

En esta etapa se procedió a activar las 16 cepas de microorganismos marinos; a la cual se hizo una técnica en repique sobre Caldo King a 300 ppm (Figura 23).

Figura 23. Activación de microorganismos marinos sobre caldo King a 300ppm

Por lo anterior se seleccionaron 4 para preparar los inóculos, de esta forma:

Inóculo MM-001-Cr2: Se tomaron 9mLde caldo King a 300 ppm con 1ml de

la Cepa MM-001.


la Cepa MM-005.


la Cepa MM-007.


la Cepa MM-009.

Inóculo MIX-Cr2: Se tomaron 9mLde caldo King a 300 ppm con 0.25ml de

la Cepa MM-001, 0.25ml de la cepa MM-005, 0.25ml de la cepa MM-007 y

0.25ml de la cepa MM-009, para completar el volumen de 1ml (Figura 24).

Figura 24. Inóculos preparados


3.5.12 Bioensayo de los Microorganismo Marinos sobre Caldo King a 300 ppm

Se estimó el potencial de los microorganismos marinos en su capacidad para bioreducir cromo hexavalente. Para los ensayos de laboratorio se partió de una solución madre de 2000 ppm y se extrajo 3.75 mL equivalentes a 300 ppm sobre 25 mL de Caldo King; de la misma forma se preparó el control abiótico utilizando Caldo King a 300 ppm sin inoculo. Además, se le adicionó una concentración de 10% v/v de los inóculos preparados; estos fueron incubados a una temperatura de 25°C desde las 0 hasta 96 horas. Para la estandarización del bioproceso se tomó 2 mL de la muestra; está se centrifugo a 500 rpm por 15 minutos, luego se tomó 1 mL del sobrenadante a la cual se le agrego 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado y 1ml de 1,5-difenilcarbazida; la mezcla se dejó reaccionar en un periodo de 5-10 minutos. La determinación de cromo hexavalente se valoró en medio acido por la formación de un complejo violeta con Difenilcarbazida y por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm (Figura 25) [56].

Figura 25. Diseño experimental del bioensayo


4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 ANÁLISIS DE RESULTADOS

Después de la toma de muestras en la zona aledaña a la Bahía de Cartagena, para la recuperación de los Microorganismos Marinos en muestras de agua y sedimentos donde se empleó Caldo Nutritivo para fortalecimiento de microorganismo, mostrando un crecimiento por turbidez en menos de 24 horas. En cuanto al enriquecimiento de los microorganismos marinos, usando diferentes medios encontrados en la bibliografía, se presentaron mejores resultados en los Caldos Nutritivos y King, usando sales de cromato y dicromato a 50 ppm (Figura 26).

Figura 26. Caldo Nutritivo y King con sales de cromato y dicromato de potasio a 50

ppm Fuente: Autores (2019)

De lo anterior al trasladar a medio agar nutritivo y King con 50 y 150 ppm de estas sales se obtuvo resultados de crecimiento a las 18 h con sedimentos en el caldo King, pero a las 24 horas tanto en agua como en sedimentos. Para los microorganismos marinos con mayor tolerancia al cromo hexavalente, se preparó el medio agar King con concentraciones de cromato y dicromato de potasio a 300, 500 y 1000 ppm, de la cual para la primera concentración se consiguió crecimiento de colonias a las 18 h con sedimentos y sal de dicromato, a las 24 horas para ambos tipos de muestras; para la segunda concentración se obtuvo crecimiento a 24 horas en muestra de sedimento con sales de cromato y dicromato,

y a las 48 horas en ambas muestras, por ultimo para 1000 ppm se notó crecimiento después de 72 horas con ambas muestras y sales. La caracterización morfológica, se observó que para 50 y 150 ppm cocos GRAM positivos, bacilos Gram positivos y negativos para ambas muestras, es decir tanto para agua como en sedimento (Sed) y para cromato (Cr) y dicromato (Cr2); así mismo, los morfotipos de cocos Gram positivos de sedimentos mostraron crecimientos en las concentraciones de 300, 500 y 1000 ppm de cromato y dicromato, respectivamente (Figura 27); Aquí en esta figura en el eje horizontal muestra los diferentes caldos con sus especies de Cromo y en el eje vertical se muestra los porcentajes de especies de morfotipos (Cocos positivos, Bacilos negativos y Bacilos Positivos) a través de rangos, es decir, 1 (0-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) y 4 (76-100).

Figura 27. Diversidad de Microorganismos en Caldo King


Al comparar la diversidad de microorganismos que crecieron en caldo nutritivo y King, se aprecia crecimiento de bacilos negativos en todos, con excepción del caldo

0

1

2

3

4

Tinción de Gram1 = 0-25%. 2 = 26-50%. 3 = 51-75%. 4 = 76-100%

Cocos positivos Bacilos negativos Bacilos positivos

King con muestra de agua, pudiendo determinar mayor carga de microorganismos en sedimentos. El aislamiento selectivo de microorganismos del agua y sedimentos encontrados en la Bahía de Cartagena, probando diferentes caldos para enriquecimiento con mejores resultados en caldo Nutritivo y King, utilizando como fuentes el cromato y dicromato en concentraciones de 50, 150, 300, 500 y 1000 ppm, en donde hubo mayor biomasa y diversidad, como bacilos Gram positivos y negativos, cocos Gram positivos en los sedimentos del caldo King con dicromato, así como un crecimiento más rápido entre 18 a 24h (Tabla 4). Tabla 5. Aislamiento selectivo de microorganismos marinos tolerantes a sales de

cromo hexavalente para muestras de agua y sedimentos

Mirar en el Anexo 6 (Graficas)


A las 16 Cepas se seleccionaron las 4 con más rápido crecimiento, y mayor turbidez en menos de 24h, como son:

MM-001

MM-005

MM-007

MM-009

MIX

Donde a estos microorganismos marinos se le hizo el siguiente análisis estadístico (Anexo 7). Por último se calculó el porcentaje de reducción y la concentración final del cromo hexavalente desde 0 hasta 96h de los microorganismos marinos seleccionados para este bioproceso (Figura 28 y 29).

Figura 28. Porcentaje de reducción de Cromo Hexavalente


0

25

50

75

100

0 24 48 72 96

%R

edu

cció

n C

r(V

I)

Tiempo (h)

%Reducción Cr(VI) Vs Tiempo

MM-001 MM-005 MM-007 MM-009 MIX

Figura 29. Concentración final de cromo hexavalente


4.2 DISCUSION DE RESULTADOS Los resultados obtenidos indican que los microorganismos marinos recuperados en la zona aledaña a la bahía de Cartagena, poseen gran capacidad para reducir Cromo hexavalente, que de acuerdo con lo mencionado anteriormente las muestras de sedimentos se obtuvieron mejores resultados que con las muestras de agua, debido a que en los sedimentos hay mayor acumulación de microorganismos. Además de los diferentes caldos trabajados en esta investigación (Nutritivo, King, Lee y EG), se pueden encontrar otros medios de cultivo que según los antecedentes, el LB (Luria-Bertani) y BHI (Brain Heart Infusion) donde este arroja porcentajes de reducción del 100%, sin embargo, estos resultados son para concentración bajas, respectivamente [57] [24]; en comparación con lo que menciona nuestro grupo de investigación no es similar, debido a que este trabajo se basa en concentración altas como son de 300, 500 y 1000 ppm de Cromo hexavalente, aunque los porcentajes de reducción son cercanos al 100%. Por otra parte, los microorganismos marinos presentaron poca adaptabilidad en concentración de Cromo hexavalente a 50ppm en los medios de cultivo Lee y EG, debido que en el primer medio de cultivo se presentó un precipitado oscuro en el cual se descartó ya que no presentaba turbidez después de 24h, y para el segundo no hubo crecimiento microbiano a lo largo de 48h.

0

5

10

15

20

0 24 48 72 96

[Cr(

VI)

] (p

pm

)

Tiempo (h)

[Cr(VI)]

MM-001 MM-005 MM-007 MM-009 MIX

Los aislados pertenecientes a cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos y bacilos Gram negativos, pudieron adaptarse para así formar un consorcio microbiano aceptable para los ensayos de biorreducción, teniendo porcentajes de biorreducción superiores al 90% con 300ppm de Cr(VI) a 96h a comparación con E. M. Soto y colaboradores (2017) que con cepa ya identificada (Bacillus Cereus B1) tuvieron alto porcentaje de reducción equivalente al 100% en un periodo de 45h y 100 ppm de Cromo hexavalente [24]. Sin embargo, los porcentajes de reducción de

Cr6+ pueden estar condicionados por algunos factores, como por ejemplo, a concentraciones altas de un contaminante específico o a las adaptaciones metabólicas del microorganismo [58]. En base a lo reportado por Garza y Coto (2005), se utiliza el término “resistente” a metales pesados para explicar la capacidad de un microorganismo para sobrevivir al efecto tóxico de dichos elementos, esto es resultado de un mecanismo de desintoxicación generado a partir de la exposición directa al metal, o sea, codificado genéticamente. El término “tolerante” se usa para referirse a aquellos microorganismos que tienen propiedades estructurales y bioquímicas intrínsecas que les permiten sobrevivir en presencia de metales, tales como poseer paredes celulares impermeables, capacidad de excretarlo, o capacidad de producir modificaciones ambientales con efecto sobre la toxicidad del metal. No obstante, en muchas ocasiones la diferencia entre ambos términos resulta difícil de establecer, ya que ambos implican mecanismos biológicos y bioquímicos indirectos y directos, para la supervivencia del microorganismo [59]. Por lo anterior, este trabajo se utilizó el término de tolerancia del Cromo hexavalente a 300 ppm sobre Caldo King. El análisis ANOVA prueba la hipótesis de que las medias de dos o más poblaciones son iguales, teniendo una variable de respuesta continua y al menos un factor categórico, es decir, comparándolo con lo reportado en este trabajo la variable de respuesta es la concentración de cromo hexavalente y el factor categórico serían las absorbancias obtenidas con el espectrofotómetro, lo que indica según el programa estadístico el MM-005 sería una hipótesis alternativa y los MM-001, MM-007, MM-009 y MIX serían una hipótesis nula dado los datos arrojados, dan valores diferentes para el MM-005 en comparación con los otros que son iguales; Estos datos son para R-Cuadrada (Anexo 7):

MM-001 - 99%

MM-005 - 95%

MM-007 - 99%

MM-009 - 99%

MIX - 99%

A partir de los valores arrojados por el programa estadístico se puede notar diferentes líneas de tendencias, el cual las líneas verdes y grises indican predicciones en cuanto a los valores limites que se pueden llegar a obtener de dicha ecuación, por medio del grafico del modelo ajustado a través de una regresión simple.

5. CONCLUSIONES A partir de la evaluación realizada para los microorganismos marinos se puede inferir que el aislamiento selectivo de microorganismos del agua y sedimentos encontrados en la Bahía de Cartagena, probando diferentes caldos para enriquecimiento, mostro mejores resultados en caldo King, utilizando como fuentes el cromato y dicromato en concentraciones de 50, 150, 300, 500 y 1000 ppm, en donde hubo mayor biomasa y diversidad, como bacilos Gram positivos y negativos, cocos Gram positivos en los sedimentos del caldo King con dicromato, así como un crecimiento más rápido entre 18 a 24h. Los microorganismos marinos aislados y tolerantes a cromo hexavalente evidenciaron ser potencialmente reductores de este metal. Los microorganismos marinos con considerable potencial de bioreducción fueron las cepas MM-001 y MM-007 y MM-009 (cocos positivos , bacilos negativos y cocos negativos) con un porcentaje de bioreducción de 92% a una concentración de 300ppm con dicromato de potasio; las cepas MM-005 (cocos positivos) tuvo un porcentaje de bioreducción alto, aproximadamente de 96%. El consorcio mixto elaborado (MIX) fue tolerante a concentración de 300ppm de dicromato de potasio, con un porcentaje de reducción del 91% considerándose un consorcio óptimo. Las 4 cepas escogidas y el consorcio mixto preparado para realizar los bioensayos dieron buenos resultados a concentraciones de 300ppm. Por eso, se puede estimar el uso de estos microorganismos a escala real, como un producto para el tratamiento de aguas residuales donde se maneje cromo hexavalente. Por otro lado, el uso de microorganismos empleados en el proceso de bioreducción es una alternativa para seguir con el desarrollo de la biotecnología ya que traen consigo un beneficio económico y ambiental.

ANEXOS

1. Tabla de Concentración vs Absorbancias del MM-001

MM-001 MM-001-01 0 h 24h 48h 70h 96h

C (ppm) Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom

120 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 1.806 1.81 1.811 1.809

60 ND ND ND ND ND ND ND ND 2.787 2.778 2.775 2.78 1.187 1.189 1.191 1.189

30 2.852 2.843 2.842 2.8456667 2.146 2.147 2.146 2.1463333 1.509 1.51 1.509 1.5093333 0.982 0.991 0.99 0.9876667

15 1.58 1.575 1.573 1.576 1.039 1.039 1.038 1.0386667 0.747 0.747 0.746 0.7466667 0.515 0.513 0.517 0.515 ND

7.5 0.733 0.732 0.731 0.732 0.468 0.467 0.468 0.4676667 0.332 0.331 0.33 0.331 0.228 0.229 0.231 0.2293333

3.75 0.375 0.37 0.369 0.3713333 0.199 0.199 0.199 0.199 0.168 0.167 0.165 0.1666667 0.056 0.06 0.059 0.0583333

1.875 0.189 0.187 0.187 0.1876667 0.09 0.089 0.089 0.0893333 0.137 0.137 0.137 0.137 -0.008 -0.008 -0.008 -0.008

0.9375 0.104 0.102 0.103 0.103 0.052 0.052 0.052 0.052 0.079 0.079 0.079 0.079 -0.054 -0.05 -0.05 -0.0513333

MM-001-02 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.962 2.943 2.943 2.9493333 2.183 2.182 2.184 2.183 1.536 1.534 1.534 1.5346667 0.812 0.819 0.823 0.818

15 1.543 1.539 1.538 1.54 1.034 1.034 1.034 1.034 0.762 0.762 0.761 0.7616667 0.515 0.508 0.509 0.5106667 ND

7.5 0.768 0.756 0.75 0.758 0.491 0.49 0.49 0.4903333 0.373 0.372 0.373 0.3726667 0.274 0.271 0.271 0.272

3.75 0.393 0.378 0.369 0.38 0.225 0.225 0.225 0.225 0.165 0.163 0.163 0.1636667 0.089 0.099 0.096 0.0946667

1.875 0.209 0.196 0.193 0.1993333 0.123 0.123 0.123 0.123 0.1 0.101 0.101 0.1006667 0.009 0.003 0.003 0.005

0.9375 0.109 0.106 0.1 0.105 0.048 0.049 0.048 0.0483333 0.062 0.062 0.062 0.062 -0.062 -0.064 -0.065 -0.0636667

MM-001-03 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.799 2.806 2.801 2.802 2.527 2.52 2.523 2.5233333 1.615 1.614 1.614 1.6143333 0.742 0.747 0.752 0.747

15 1.464 1.461 1.459 1.4613333 1.292 1.291 1.292 1.2916667 0.818 0.818 0.818 0.818 0.389 0.388 0.392 0.3896667 ND

7.5 0.626 0.626 0.624 0.6253333 0.57 0.569 0.568 0.569 0.368 0.368 0.366 0.3673333 0.263 0.258 0.257 0.2593333

3.75 0.307 0.303 0.303 0.3043333 0.238 0.238 0.237 0.2376667 0.204 0.204 0.204 0.204 0.091 0.093 0.086 0.09

1.875 0.152 0.151 0.151 0.1513333 0.107 0.107 0.107 0.107 0.092 0.091 0.092 0.0916667 0.02 0.019 0.018 0.019

0.9375 0.076 0.076 0.076 0.076 0.052 0.052 0.051 0.0516667 0.048 0.049 0.048 0.0483333 -0.025 -0.026 -0.025 -0.0253333


MM-005 MM-005-01 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.925 2.914 2.927 2.922 1.813 1.813 1.816 1.814 1.125 1.124 1.125 1.1246667 0.696 0.707 0.712 0.705

15 1.477 1.477 1.477 1.477 0.823 0.822 0.823 0.8226667 0.537 0.537 0.536 0.5366667 0.361 0.371 0.374 0.3686667 ND

7.5 0.735 0.733 0.731 0.733 0.393 0.392 0.392 0.3923333 0.243 0.243 0.243 0.243 0.198 0.202 0.206 0.202

3.75 0.439 0.436 0.436 0.437 0.158 0.158 0.158 0.158 0.122 0.121 0.121 0.1213333 0.098 0.106 0.09 0.098

1.875 0.358 0.358 0.358 0.358 0.113 0.112 0.113 0.1126667 0.101 0.101 0.101 0.101 0.056 0.057 0.058 0.057

0.9375 0.164 0.159 0.16 0.161 0.038 0.037 0.037 0.0373333 0.043 0.044 0.045 0.044 0.025 0.025 0.025 0.025

MM-005-02 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.966 2.945 2.938 2.9496667 1.776 1.774 1.771 1.7736667 1.249 1.249 1.248 1.2486667 0.669 0.67 0.673 0.6706667

15 1.858 1.858 1.857 1.8576667 0.871 0.871 0.871 0.871 0.627 0.627 0.627 0.627 0.402 0.4 0.401 0.401 ND

7.5 0.884 0.883 0.883 0.8833333 0.246 0.246 0.245 0.2456667 0.35 0.349 0.349 0.3493333 0.172 0.176 0.175 0.1743333

3.75 0.385 0.384 0.382 0.3836667 0.114 0.115 0.115 0.1146667 0.151 0.151 0.151 0.151 0.037 0.033 0.033 0.0343333

1.875 0.214 0.213 0.213 0.2133333 0.045 0.05 0.045 0.0466667 0.068 0.067 0.067 0.0673333 0.0295 0.026 0.0265 0.0273333

0.9375 0.117 0.118 0.118 0.1176667 0.028 0.029 0.028 0.0283333 0.054 0.053 0.053 0.0533333 0.022 0.019 0.02 0.0203333

MM-005-03 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.9455 2.9295 2.9325 2.9358333 1.7945 1.7935 1.7935 1.7938333 1.187 1.1865 1.1865 1.1866667 0.6825 0.6885 0.6925 0.6878333

15 1.6675 1.6675 1.667 1.6673333 0.847 0.8465 0.847 0.8468333 0.582 0.582 0.5815 0.5818333 0.3815 0.3855 0.3875 0.3848333 ND

7.5 0.8095 0.808 0.807 0.8081667 0.3195 0.319 0.3185 0.319 0.2965 0.296 0.296 0.2961667 0.185 0.189 0.1905 0.1881667

3.75 0.412 0.41 0.409 0.4103333 0.136 0.1365 0.1365 0.1363333 0.1365 0.136 0.136 0.1361667 0.0675 0.0695 0.0615 0.0661667

1.875 0.286 0.2855 0.2855 0.2856667 0.079 0.081 0.079 0.0796667 0.0845 0.084 0.084 0.0841667 0.04275 0.0415 0.04225 0.0421667

0.9375 0.1405 0.1385 0.139 0.1393333 0.033 0.033 0.0325 0.0328333 0.0485 0.0485 0.049 0.0486667 0.0235 0.022 0.0225 0.0226667


MM-007 MM-007-01 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.887 2.895 2.9 2.894 2.024 2.022 2.018 2.0213333 1.607 1.595 1.594 1.5986667 0.74 0.759 0.757 0.752

15 1.617 1.616 1.617 1.6166667 0.948 0.947 0.947 0.9473333 0.762 0.762 0.762 0.762 0.337 0.336 0.332 0.335 ND

7.5 0.767 0.766 0.765 0.766 0.424 0.424 0.423 0.4236667 0.338 0.337 0.337 0.3373333 0.206 0.202 0.202 0.2033333

3.75 0.344 0.344 0.343 0.3436667 0.192 0.193 0.193 0.1926667 0.16 0.161 0.161 0.1606667 0.129 0.116 0.117 0.1206667

1.875 0.124 0.173 0.174 0.157 0.098 0.098 0.098 0.098 0.126 0.125 0.127 0.126 0.096 0.097 0.092 0.095

0.9375 0.104 0.103 0.103 0.1033333 0.047 0.047 0.046 0.0466667 0.045 0.044 0.044 0.0443333 0.088 0.091 0.088 0.089

MM-007-02 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.946 2.961 2.979 2.962 2.091 2.092 2.092 2.0916667 1.668 1.669 1.668 1.6683333 0.395 0.399 0.404 0.3993333

15 1.581 1.58 1.579 1.58 0.93 0.93 0.93 0.93 0.759 0.759 0.758 0.7586667 0.276 0.278 0.279 0.2776667 ND

7.5 0.814 0.813 0.81 0.8123333 0.395 0.395 0.394 0.3946667 0.392 0.391 0.391 0.3913333 0.167 0.172 0.172 0.1703333

3.75 0.385 0.385 0.385 0.385 0.193 0.193 0.193 0.193 0.171 0.171 0.171 0.171 0.101 0.102 0.101 0.1013333

1.875 0.193 0.193 0.193 0.193 0.081 0.081 0.08 0.0806667 0.081 0.081 0.081 0.081 0.087 0.087 0.088 0.0873333

0.9375 0.099 0.099 0.099 0.099 0.048 0.048 0.049 0.0483333 0.043 0.043 0.043 0.043 0.08 0.078 0.078 0.0786667

MM-007-03 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.799 2.819 2.808 2.8086667 1.85 1.851 1.849 1.85 1.475 1.476 1.477 1.476 0.555 0.549 0.553 0.5523333

15 1.511 1.511 1.508 1.51 0.855 0.854 0.854 0.8543333 0.702 0.702 0.701 0.7016667 0.315 0.317 0.32 0.3173333 ND

7.5 0.702 0.701 0.699 0.7006667 0.399 0.398 0.398 0.3983333 0.297 0.296 0.296 0.2963333 0.186 0.187 0.188 0.187

3.75 0.39 0.389 0.389 0.3893333 0.17 0.17 0.17 0.17 0.164 0.164 0.164 0.164 0.12 0.121 0.119 0.12

1.875 0.192 0.192 0.191 0.1916667 0.074 0.074 0.073 0.0736667 0.074 0.075 0.075 0.0746667 0.076 0.077 0.076 0.0763333

0.9375 0.116 0.118 0.118 0.1173333 0.046 0.046 0.046 0.046 0.03 0.03 0.03 0.03 0.063 0.061 0.061 0.0616667


MM-009 MM-009-01 0 h 24h 48h 70h 96h

C (ppm) Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom Abs1 Abs2 Abs3 Asb prom 120 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 2.681 2.685 2.704 2.69 0.665 0.667 0.668 0.5956667 60 ND ND ND ND ND ND ND ND 2.998 2.997 2.998 2.9976667 1.831 1.832 1.832 1.8316667 0.459 0.458 0.453 0.4566667 30 2.99 2.984 2.976 2.9833333 2.326 2.324 2.328 2.326 1.805 1.802 1.805 1.804 1.067 1.063 1.062 1.064 0.345 0.355 0.362 0.354 15 1.685 1.656 1.655 1.6653333 1.022 1.021 1.018 1.0203333 0.922 0.921 0.922 0.9216667 0.597 0.519 0.603 0.573 0.222 0.234 0.243 0.233 7.5 0.854 0.854 0.853 0.8536667 0.448 0.448 0.446 0.4473333 0.416 0.416 0.416 0.416 0.266 0.26 0.257 0.261 0.19 0.18 0.176 0.182 3.75 0.436 0.431 0.43 0.4323333 0.205 0.205 0.204 0.2046667 0.232 0.233 0.234 0.233 0.145 0.144 0.145 0.1446667 0.132 0.135 0.137 0.1346667

1.875 0.212 0.211 0.211 0.2113333 0.089 0.089 0.089 0.089 0.202 0.202 0.202 0.202 0.113 0.114 0.116 0.1143333 0.07 0.072 0.075 0.0723333 0.9375 0.169 0.166 0.166 0.167 0.056 0.056 0.056 0.056 0.11 0.112 0.113 0.1116667 0.108 0.107 0.108 0.1076667 0.089 0.088 0.087 0.088

MM-009-02 0 h 24h 48h 70h 96h


1.875 0.165 0.162 0.161 0.1626667 0.1 0.1 0.1 0.1 0.139 0.14 0.143 0.1406667 0.154 0.153 0.153 0.1533333 0.09 0.091 0.09 0.0903333 0.9375 0.074 0.074 0.074 0.074 0.043 0.043 0.043 0.043 0.114 0.114 0.113 0.1136667 0.12 0.12 0.123 0.121 0.038 0.04 0.045 0.041

MM-009-03 0 h 24h 48h 70h 96h


1.875 0.171 0.172 0.171 0.1713333 0.112 0.112 0.112 0.112 0.15 0.149 0.15 0.1496667 0.16 0.157 0.155 0.1573333 0.08 0.0815 0.0825 0.0813333 0.9375 0.085 0.084 0.084 0.0843333 0.047 0.047 0.047 0.047 0.127 0.127 0.128 0.1273333 0.133 0.136 0.135 0.1346667 0.0635 0.064 0.066 0.0645

5. Tabla de Concentración vs Absorbancias del MIX

MIX MIX-01 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.784 2.765 2.773 2.774 1.861 1.863 1.86 1.8613333 1.131 1.134 1.136 1.1336667 0.362 0.357 0.356 0.3583333

15 1.33 1.33 1.33 1.33 0.922 0.923 0.921 0.922 0.587 0.586 0.586 0.5863333 0.36 0.345 0.345 0.35 ND

7.5 0.644 0.641 0.64 0.6416667 0.455 0.455 0.454 0.4546667 0.324 0.324 0.324 0.324 0.227 0.229 0.229 0.2283333

3.75 0.303 0.302 0.302 0.3023333 0.186 0.186 0.186 0.186 0.216 0.215 0.215 0.2153333 0.154 0.142 0.14 0.1453333

1.875 0.155 0.155 0.154 0.1546667 0.087 0.086 0.086 0.0863333 0.202 0.166 0.167 0.1783333 0.149 0.16 0.153 0.154

0.9375 0.086 0.087 0.087 0.0866667 0.051 0.051 0.051 0.051 0.11 0.083 0.083 0.092 0.158 0.159 0.166 0.161

MIX-02 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.835 2.826 2.843 2.8346667 1.894 1.89 1.892 1.892 1.384 1.386 1.388 1.386 0.522 0.521 0.52 0.521

15 1.363 1.361 1.361 1.3616667 0.869 0.868 0.867 0.868 0.731 0.732 0.732 0.7316667 0.387 0.384 0.386 0.3856667 ND

7.5 0.675 0.674 0.673 0.674 0.396 0.396 0.396 0.396 0.418 0.418 0.416 0.4173333 0.251 0.249 0.249 0.2496667

3.75 0.299 0.298 0.298 0.2983333 0.168 0.167 0.167 0.1673333 0.237 0.237 0.237 0.237 0.167 0.15 0.162 0.1596667

1.875 0.139 0.139 0.139 0.139 0.085 0.085 0.086 0.0853333 0.179 0.178 0.179 0.1786667 0.163 0.155 0.161 0.1596667

0.9375 0.082 0.082 0.082 0.082 0.035 0.035 0.035 0.035 0.09 0.091 0.092 0.091 0.16 0.161 0.16 0.1603333

MIX-03 0 h 24h 48h 70h 96h




30 2.998 2.998 2.993 2.9963333 2.527 2.52 2.516 2.521 1.935 1.935 1.938 1.936 1.48 1.483 1.483 1.482

15 1.598 1.596 1.596 1.5966667 1.234 1.234 1.234 1.234 1.035 1.032 1.033 1.0333333 0.928 0.926 0.927 0.927 ND

7.5 0.765 0.764 0.766 0.765 0.553 0.552 0.552 0.5523333 0.503 0.504 0.503 0.5033333 0.557 0.55 0.564 0.557

3.75 0.37 0.367 0.368 0.3683333 0.237 0.237 0.237 0.237 0.306 0.305 0.306 0.3056667 0.329 0.326 0.323 0.326

1.875 0.204 0.203 0.202 0.203 0.109 0.109 0.109 0.109 0.199 0.2 0.2 0.1996667 0.244 0.243 0.243 0.2433333

0.9375 0.108 0.108 0.108 0.108 0.065 0.065 0.065 0.065 0.151 0.152 0.152 0.1516667 0.223 0.223 0.225 0.2236667

6. Graficas de las cepas con sus características microscópicas

7. Análisis estadístico con STATGRAPHICS Centurión XVI Versión 16.2.04

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