evaluación de la respuesta inmune de vacunas oleosas
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle
Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias
2006
Evaluación de la respuesta inmune de vacunas oleosas Evaluación de la respuesta inmune de vacunas oleosas
formuladas con Clostridium chauvoei cultivado en medios a base formuladas con Clostridium chauvoei cultivado en medios a base
de peptonas vegetales de peptonas vegetales
Fabian Bedoya Cruz Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Bedoya Cruz, F. (2006). Evaluación de la respuesta inmune de vacunas oleosas formuladas con Clostridium chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/medicina_veterinaria/153
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EVALUACION DE LA RESPUESTA INMUNE DE VACUNAS OLEOSAS FORMULADAS CON Clostridium chauvoei CULTIVADO EN MEDIOS A
BASE DE PEPTONAS VEGETALES.
FABIAN BEDOYA CRUZ
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTÁ D.C. 2006
EVALUACION DE LA RESPUESTA INMUNE DE VACUNAS OLEOSAS FORMULADAS CON Clostridium chauvoei CULTIVADO EN MEDIOS A
BASE DE PEPTONAS VEGETALES.
FABIAN BEDOYA CRUZ Cod. 14001009
Trabajo de grado como requisito para optar el titulo de Medico Veterinario
Director Daniel Arturo Martinez Acosta
Co - Director Jorge Ossa Aristizabal
UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTÁ D.C. 2006
DIRECTIVOS
RECTOR Hno. Fabio Gallego Arias. VICERECTOR Hno. Carlos Gabriel Gomez. VICERRECTOR DE PROMOCION Hno. Edgar Figueroa Abrajim. Y DESARROLLO HUMANO VICEREECTOR ADMINISTRATIVO Dr Mauricio Fernández Fernández DECANO DE LA FACULTAD Dr. Pedro Pablo Martínez Méndez. SECRETARIO ACADEMICO Dra María Teresa Uribe Mallarino. DIRECTOR CLINICA VETERINARIA Dr. Humberto Vásquez Romero.
APROBACIÓN
DIRECTOR ____________________________ Dr. Daniel Arturo Martínez Acosta CO-DIRECTOR ___________________________ Dr. Jorge Ossa JURADO ____________________________ Dra. Ruth Miryam Valbuena S. JURADO ____________________________
Dr. Germán Rodríguez Martínez SECRETARIO ACADÉMICO ____________________________ Dra. Maria Teresa Uribe Mallarino.
A Dios, el Señor Todopoderoso.
A mis Padres, Mercedes y Fabio, mi hermana Carolina.
A mi tía por su paciencia, consideración y apoyo.
A mi Novia Natalia por ser cómplice de mis sueños y de este inmenso amor.
A Japoll, Coco y pecoso que me han regalado lealtad y cariño.
Al Dr Daniel y al Dr Jorge, por estar siempre dispuestos a colaborarme, sus
consejos guiaron esta investigación a su final.
A todos en Vecol S.A, siempre me brindaron conocimientos invaluables.
A todos los que este trabajo pueda dejar algo de conocimientos y recuerden
que el futuro pertenece a quienes creen en la belleza de sus sueños.
FABIAN BEDOYA CRUZ
COMPROMISO
Los trabajos de grado, no deben contener ideas que sean contrarias a la
doctrina de la iglesia católica, en asuntos de dogma y moral.
Ni la Universidad, ni el asesor, ni el jurado, son responsables de las ideas
expuestas por el graduado.
TABLA DE CONTENIDO
Pág Nº.
INTRODUCCIÓN 1
1. OBJETIVOS 2
1.1 GENERAL 2
1.2 ESPECIFICOS 2
2. MARCO TEORICO 3
2.1 Morfología e identificación del género Clostridium 4
2.2 Características de crecimiento 4
2.3 Clostridium chauvoei 4
2.3.1 Características morfológicas y cultivo 5
2.3.2 Características serológicas 6
2.3.3 Patogenia 6
2.4 CARBUNCO SINTOMÁTICO 7
2.4.1 Epidemiología 7
2.5 ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA (EEB)
7
2.5.1 Causas 8
2.6 PEPTONAS 8
2.7 INMUNIDAD Y PREVENCIÓN DEL CARBUNCO SINTOMATICO
9
2.7.1 Inmunización activa 10
2.7.2 Adyuvantes 10
2.7.3 Esquema de vacunación 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS 13
3.1 Marco Geográfico 13
3.2 Marco Demográfico 13
3.3 Variables 13
3.4 Análisis Estadístico 14
3.5 Métodos y procedimientos 14
3.5.1 Cepa bacteriana y mantenimiento 14
3.5.2 Elaboración del semillero de trabajo de C. chauvoei
14
3.5.3 Preparación de medios y realización de cultivos de C. chauvoei en los medios a base de peptonas vegetales
15
3.5.3.1 Prueba de esterilidad 17
3.5.4 Determinación de la producción de biomasa en los medios de cultivo a base de peptonas vegetales mediante espectofotometría (Micalizzi y Guzmán 1995)
17
3.5.5 Prueba de Letalidad de los cultivos de C. chauvoei 18
3.5.6 Formulación de Vacunas contra C. chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales
18
3.5.7 Prueba de Potencia de las vacunas formuladas en cobayos
21
3.5.7.1 Vacunación 21
3.5.7.2 Prueba de inocuidad o Reto 21
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25
4.1 Prueba de esterilidad 25
4.2 Determinación de la producción de biomasa de C. chauvoei mediante espectrofotometría
25
4.3 Dosis Letal Cincuenta (DL50) 28
4.4 Prueba de Potencia en cobayos de las vacunas formuladas
30
5. CONCLUSIONES 34
6. RECOMENDACIONES 35
7. BIBLIOGRAFIA
8. ANEXOS
INDICE DE FIGURAS
Pág Nº.
1. Instalaciones de la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios, VECOL S. A.
13
2. Preparación de medios de cultivo a base de peptonas vegetales y cultivo de C. chauvoei en fermentador a 37º C por 48 horas
16
3. Prueba de esterilidad de los cultivos de C. chauvoei. 17
4. Formulación de vacunas con el antígeno inactivado de C. chauvoei, saponina y adyuvante oleoso
20
5. Vacunación de cobayos 22
6. Desafío o reto de las vacunas formuladas contra C. chauvoei en cobayos
23
7. Diagrama de actividades desarrolladas para evaluar la respuesta inmune de una vacuna oleosa contra Clostridium chauvoei cultivado en un medio a base de peptonas vegetales
24
8. Coloración Gram. para C. chauvoei 26
9. Aislamiento de C. chauvoei en agar sangre bajo condiciones anaeróbicas
26
10. Comparación de los porcentajes de transmitancia entre los diferentes cultivos con peptonas vegetales para la cepa de C. chauvoei
28
11. Comparación de los porcentajes de sobrevivencia de los cobayos vacunados con las cuatro vacunas formuladas a base de peptonas vegetales contra el antígeno de C. chauvoei
32
INDICE DE TABLAS
Pág Nº.
1. Determinación de la producción de biomasa en porcentaje de transmitancia, % T, a cuatro cultivos de Clostridium Chauvoei a base de peptonas vegetales a las 48 horas
27
2. Test de Tukey para la biomasa generada (%T) de C. chauvoei en cultivos con cada peptona vegetal ensayada
27
3. Dosis letal cincuenta de los cultivos de C. chauvoei 29
4. Resultados de la prueba de potencia de las vacunas formuladas a base de peptonas vegetales contra el antígeno C. chauvoei
31
5. Test de Tukey para la prueba de potencia (% sobrevivencia) de las vacunas formuladas con cada peptona vegetal ensayada contra C. chauvoei
31
INDICE DE ANEXOS
1. Composición de cada medio de cultivo a base de cuatro peptonas vegetales
1.1 Medio a base de peptona vegetal Freetone A-1
1.2 Medio a base de peptona vegetal Martone K-1
1.3 Medio a base de peptona vegetal Martone L-1
1.4 Medio a base de peptona vegetal Select Soytone
2. Coloración de Gram.
3. Análisis de Varianza de los resultados de acuerdo al Programa STATISTIX
3.1 ANOVA para cultivos a base de peptonas vegetales contra la biomasa generada por C. chauvoei (%T)
3.2 ANOVA para las vacunas formuladas (% de Sobrevivencia) a base de peptonas vegetales contra C. chauvoei
4. Composición química de algunas peptonas vegetales empleadas en este trabajo
4.1 Composición de MARTONE K-1
4.2 Composición de MARTONE L-1
4.3 Composición de FREETONE A-1
4.4 Composición de SELECT SOYTONE
RESUMEN
Con este proyecto se utilizaron peptonas Vegetales como alternativa profiláctica a la vacuna oleosa tradicional en peptona animal. Se comprobó la eficacia de los medios de cultivo en la primera etapa del proyecto, para esto se trabajó con Clostridium chauvoei cepa Vecol, ya que es una bacteria ampliamente reconocida. En la segunda etapa se realizaron vacunas oleosas con el Clostridium cultivado en este medio con el objetivo de demostrar la capacidad inmune de estas vacunas usando peptonas vegetales y su disminución de riesgo de la encefalopatía espongiforme bovina por el uso de derivados proteicos vacunos.
ABSTRACT
This project investigation developed oily vaccines based on vegetables protein stem as prophylactic alternative to the oily traditional vaccine in animal protein stem. There was verified the efficiency of the means of Biol Farm in the first stage of the project, for this there was worked with Clostrídium chauvoei strain Vecol, since it is a widly recognized bacterium In the second stage oily vaccines were realized with the Clostridium cultivated in this way with the objetive to demonstrate the immune capacity of these vaccines and its prevention in the transmission of bovine spongiform encephalopathy (BSE) for the use of multifaceted bovine cattle derivatives.
INTRODUCCION
La Biotecnología, en términos generales se puede definir como la aplicación de
organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de bienes y
servicios. Esto significa que desde hace miles de años, la humanidad ha venido
realizando biotecnología “abanderada” por países industrializados, estos
esquemas de producción en el área inmunológica se han aplicado en nuestro país
con buenos resultados pero con la introducción de nuevas patologías a los
sistemas de producción, por eso es necesario crear estrategias. Es así como la
producción de vacunas se utiliza tradicionalmente a base de peptonas animales
(comprimidos de carne) importadas de Europa o de Estados unidos, países con
índices significativos de Encefalopatía Espongiforme Bovina (vaca Loca); por esto
es necesario crear alternativas en la producción de vacunas mediante la
investigación de medios a base de peptonas de origen vegetal para determinar si
favorece a la producción de biomasa de microorganismos como el C. chauvoei y
patogenicidad de la misma, con el fin de formular vacunas que sean capaces de
estimular el sistema inmune previniendo el Carbunco Sintomático y disminuyendo
los riesgos de transmisión de la Encelopatía Espongiforme Bovina en Colombia.
1. OBJETIVOS 1.1 GENERAL Evaluar la respuesta inmune de vacunas oleosas formuladas con Clostidium
chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales.
1.2 ESPECIFICOS
• Formular vacunas oleosas con Clostridium chauvoei y con cada peptona
vegetal seleccionada.
• Determinar la actividad de las vacunas formuladas con peptonas vegetales
mediante la prueba de potencia en cobayos.
• Demostrar la capacidad de las peptonas vegetales como componentes de
medios que favorecen el crecimiento del Clostridium chauvoei.
• Cuantificar la capacidad de crecimiento de C. chauvoei en los medios a
base de peptonas vegetales a través de mediciones espectrofotometricas.
• Determinar la capacidad patogénica de los cultivos de C. chauvoei a través
de la prueba de letalidad DL50.
2
2. MARCO TEORICO
Los clostridios son bacilos grandes, gram positivos, esporógenos, fermentativos,
anaerobios, catalasa negativos (–), generalmente móviles, muchos descomponen
proteínas, producen toxinas; forman esporas de forma oval o esférica cuya
posición varía con la especie. Pueden vivir en medio oxigenado en su forma
esporulada. Así tienen la facilidad de permanecer en forma de vida latente por
largos períodos. Las esporas son ingeridas, permaneciendo en el cuerpo de los
animales hasta que encuentran las condiciones apropiadas para desarrollarse en
su estado vegetativo, reproduciéndose activamente y produciendo toxinas
causantes de las diferentes patologías.
Para que los animales se enfermen se necesita que se rompa el equilibrio tisular,
mediante una alteración (una herida, un golpe, un acto quirúrgico) que permita
obtener las condiciones de anaerobiosis necesarias para una multiplicación activa.
La mayoría de los microorganismos del género Clostridium son anaerobios
obligados, pero algunos (Clostridium histolyticum, Clostridium carnis,
Clostridium tertium) son aerotolorantes y crecen en caldo y en la superficie de
cajas de agar incubadas aeróbicamente (Smith, L.1968). Las especies patógenas
producen una o más exotoxinas que explican su patogenicidad.1
Los clostridios patógenos pueden dividirse en cuatro grandes grupos de acuerdo
con los tipos de enfermedades que producen:
1. Los clostridios histotóxicos típicamente causan una variedad de infecciones
tisulares, en general luego de heridas u otros tipos de lesiones traumáticas
abiertas.
1 SMITH, L.D.S. and HOLDEMAN, L.N. 1968. Clostridium chauvoei. In the Pathogenic Anaerobic
Bacteria. Pg. 361-373.
3
2. Los clostridios enterotoxigénicos producen intoxicación alimentaria y formas más
severas de enfermedad gastrointestinal.
3. El Clostridium tetani, el agente causal del tétanos, produce la enfermedad por
medio de una potente exotoxina que es elaborada durante la proliferación limitada
en los tejidos.
4. El Clostridium botulinum es el agente etiológico del botulismo, que es el
resultado de la ingestión de una poderosa exotoxina formada previamente por el
microorganismo en los alimentos contaminados.
2.1 Morfología e identificación del género Clostridium
Los clostridios miden de 0.2 a 4 μm de ancho por 20 μm de largo. En cada una
de las especies, la posición y la forma de las endosporas son constantes. Son
Gram positivos en los cultivos jóvenes, pero se decoloran fácilmente en los
envejecidos. La mayoría de las especies tienen flagelos peritrícos. De las
especies patógenas, únicamente C. perfringens posee cápsula (Biberstein 1990 y
Merchant 1975).
2.2 Características de crecimiento Los Clostridium crecen solamente en condiciones de anaerobiosis, mediante
medios líquidos en tubos de ensayo con tejidos de animales (carne picada). La
mayor parte crecen bien en agar sangre, en medios con carne cocida y en caldo –
tioglicolato, en atmósfera exenta de oxígeno. En el cultivo de las bacterias
anaerobias están implicados dos principios fundamentales: La reducción de la
tensión de oxígeno y el mantenimiento de esta tensión reducida, el cual es un
modo natural de preparar las condiciones óptimas de cultivo de las bacterias
anaerobias, puesto que crecen en presencia de especies aerobias o tejidos que
absorben oxígeno. Las exigencias anaeróbicas son distintas en cada una de las
especies de clostridios y se puede expresar como potencial de óxido-reducción.
4
Los indicadores de potencial redox (por ejemplo, el azul de metileno, la
resazurina) son medidas apropiadas de las condiciones de cultivo de los
anaerobios patógenos. Los clostridios prefieren una atmósfera con un 2 – 10% de
CO2. Estas condiciones se pueden producir en un frasco en el que el oxígeno es
reducido catalíticamente por hidrógeno generado junto con dióxido de carbono
(Bergey`s 1984).
2.3 Clostridium chauvoei
Clostridium chauvoei (Bacillus chauvoei, Bacillus gangraenae
emphysematosae, C. feseri) ha sido conocido desde 1887, cuando se demostró
que éste es el causante del carbunco sintomático, morriña negra, gangrena
enfisematosa o pierna negra en ganado vacuno por Arloing, Cornevin y Thomas,
quienes realizaron aportaciones interesentes sobre la enfermedad (Merchant
1975, Hatheway 1990).
2.3.1 Características morfológicas y cultivo Las colonias tienen de 1 a 3 mm de diámetro, son redondas o ligeramente
irregulares, algo elevadas, de aspecto granular, y transparentes o traslúcidas con
bordes ligeramente deshilachados. C. chauvoei se encuentra como bacilos, de 3
a 9.7 micras de longitud y de 0.5 a 1,7 micras de ancho. Es usualmente
encontrado como células sencillas, algunas veces en pares y raramente en
cadenas cortas. Raramente colorea uniformemente, excepto en cultivos muy
jóvenes.
Los cultivos bacterianos en caldo PYG (peptona, levadura y glucosa) se aprecian
como bacilos Gram positivos, usualmente móviles y con flagelos peritrícos, ellos
pueden ser completamente pleomórficos. Las esporas son ovales, centrales o
subterminales. La esporulación ocurre en medio líquido y sólido; las paredes
celulares contienen lisina. La superficie de las colonias en agar sangre son β-
5
hemolíticas, 0.5 – 3 mm de diámetro, circulares, escasamente convexas o en
relieve, translúcidas a opacas, granulares, brillantes o mate y lisas. Los cultivos en
caldo PYG son turbios con un sedimento liso y con un pH final de 5.0 – 5.4
después de la incubación por 4 días. La temperatura óptima de crecimiento es 37º
C. Hay crecimiento pobre a 25º C y 30º C, no crecen a 45º C; el crecimiento es
estimulado por carbohidratos fermentables, inhibido por NaCl al 6.5%, bilis al 20%
o a un pH de 8.5. Abundante gas es formado en cultivos en profundidad con agar
PYG. El rojo neutro es reducido, la reducción de resazurina es variable. Los
productos en caldo PYG son ácido acético, butírico y fórmico; butanol, CO2 y H2.
Pequeñas cantidades de ácido láctico, succínico y pirúvico pueden ser detectadas.
El piruvato es convertido a acetato y butirato; ni lactato ni treonina son utilizados
(Bergey`s 1984).
Todas las cepas probadas son susceptibles a cloramfenicol, clindamicina,
eritromicina, penicilina G y tetraciclina.
Los sobrenadantes de un cultivo no son tóxicos a ratones. Las cepas son
patogénicas a través de invasión tisular en ratones, cobayos y hámsteres.
Experimentalmente el Cloruro de Calcio (CaCl2) puede ser inyectado para proveer
algo de destrucción tisular antes de que ocurra la infección por el microorganismo.
Vacas, ovejas, cabras, cerdos, ciervos, visones, peces de agua dulce, ballenas y
ranas son susceptibles; No se ha documentado cepas de C. chauvoei que hayan
sido aisladas de humanos. El organismo es mejor conocido como la causa de
pierna negra en ganado vacuno y ovino. Los sustratos más favorables son
glucosa y glicerina. En todos los medios hay activa formación de gas y un fétido
olor agrio debido al ácido butírico; el bacilo crece igualmente bien en medio
ligeramente ácido o ligeramente alcalino. C. chauvoei fermenta glucosa, maltosa,
lactosa y sucrosa con la producción de ácido y gas. No fermenta manitol o
salicina. Indol no es producido (Shone 1989).
6
2.3.2 Características serológicas La estructura antigénica de C. chauvoei ha sido estudiada más extensamente por
Moussa (1959). El investigó antígenos de la espora, somáticos y flagelares e ideó
una fórmula antigénica para el grupo C. chauvoei – C. septicum en la cual letras
mayúsculas romanas representan antígenos de la espora, números arábigos
representan antígenos somáticos estables al calor y letras romanas minúsculas
representan antígenos flagelares. La gran mayoría de cepas de C. chauvoei
exhiben antígenos flagelares, somáticos y de la espora; tienen la fórmula
antigénica (A: 3: f); unas pocas cepas tienen un antígeno flagelar diferente y la
fórmula antigénica es (A: 3: g). El antígeno de la espora, A, es compartido con
C. septicum y, aparentemente, es el responsable de la aglutinación cruzada entre
estas dos especies. Tal aglutinación cruzada ocurre solamente cuando
relativamente los cultivos son viejos, en la fase de esporulación y es usada para la
preparación de antisuero y para suspensiones para pruebas de aglutinación. Las
pruebas de aglutinación con C. chauvoei son a menudo dificiles. La mayor parte
de las cepas de este organismo tienden a autoaglutinarse. C. chauvoei puede ser
crecido en medio suficientemente bien tamponado para prevenir la
autoaglutinación durante el cultivo. Si la autoaglutinación ocurre durante el
crecimiento, es por lo general imposible hacer una satisfactoria suspensión del
organismo, incluso con posterior lavado y ajuste de la concentración de iones
hidrógeno. La concentración de sal de la suspensión bacteriana y de diluciones
del suero pueden ser bajadas a 0.4 – 0.5%, y esto es por lo general ventajoso
para usar 0.1% de Na3PO4 ajustando el pH de 6.8 – 7.2 (Smith y Holdeman 1968).
2.3.3 Patogenia Las toxinas, en especial la toxina alfa (α) necrosante, pero posiblemente también
el factor de edema, la hialuronidasa gamma (γ), la DNAasa beta (β), la hemolisina
oxígeno-lábil delta (δ) y la neuraminidasa, son responsables de las lesiones
iniciales. Es posible que contribuya a producirlas el metabolismo bacteriano, que
7
produce gas por fermentación. En los bovinos, la enfermedad probablemente va
precedida de la siembra de los tejidos, especialmente de los músculos
esqueléticos, con esporas procedentes del intestino. Los factores que favorecen
la germinación de las esporas, la multiplicación de las bacterias y la producción de
toxinas, provocan la formación de lesiones que se caracterizan por edema,
hemorragia y necrosis de las miofibrillas. La parte central de las lesiones se seca,
se oscurece y se convierte en enfisematosa como consecuencia de la
fermentación bacteriana, mientras que su periferia es edematosa y hemorrágica.
Microscópicamente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras
musculares rotas por el edema, enfisema y hemorragia. Clínicamente, existe
fiebre, anorexia y abatimiento (Ballen 2003).
2.4 CARBUNCO SINTOMÁTICO 2.4.1 Epidemiología El carbunco sintomático es un edema gaseoso agudo casi siempre mortal, de 1-3
días de duración, infeccioso pero no contagioso; de presentación enzoótica o
epizoótica, como en zonas de inundación.
El C. chauvoei habita en el intestino, en el hígado de perros y bovinos
aparentemente sanos y en otros tejidos normales de las distintas especies en el
animal adulto, tanto sensibles como resistentes.
El carbunco sintomático es una infección transmitida por el suelo, si bien todavía
se debate la puerta de entrada por la que penetra la bacteria al organismo. Es
muy probable que las vacunas no inactivadas o inactivadas de manera deficiente,
produzcan grados suficientes de lesión en los tejidos para proliferar en el
organismo las esporas viables. Se han observado casos especiales en fetos
ovinos. Las ovejas preñadas, en las que se observó distensión del abdomen,
8
debilidad y tendencia a echarse debido al edema y a la formación de gases en el
feto, del cual se ha aislado C. chauvoei (Valder 2002).
2.5 ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA (EEB) Esta enfermedad es relevante para la investigación por tener como forma de
transmisión las proteínas animales. Es una enfermedad degenerativa del sistema
nervioso que afecta al ganado vacuno, conocida popularmente como la
enfermedad de las vacas locas. Fue identificada por primera vez en el Reino
Unido en noviembre de 1986. Desde entonces hasta finales del año 2002 se
registraron más de 182.000 casos en ese país. También se ha detectado la
enfermedad en otros países europeos y americanos.
Esta enfermedad, pertenece al grupo de Encefalopatías Espongiformes
transmisibles, en el cual se incluyen enfermedades que afectan al hombre como la
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el Síndrome de Gerstmann-Sträussler-
Scheinker (SGS) y el kuru. Su nombre se debe al aspecto esponjoso de los
tejidos cerebrales debido a la aparición de vacuolas microscópicas.
2.5.1 Causas La enfermedad es causada por unas partículas proteínicas infecciosas que reciben
el nombre de priones o proteinaceus infectious particle (= partícula proteíca
infecciosa), es infecciosa y se conocen varios priones responsables de un grupo
de enfermedades, conocidas como encefalopatías espongiformes transmisibles,
que cursan con la degeneración del sistema nervioso (Tiwana 1999). Tienen una
forma extracelular definida, pero que parece estar constituida solamente por
proteína. Se ha descubierto que la célula hospedadora contiene en uno de sus
cromosomas un gen que codifica una proteína muy similar a la proteína de los
priones. Esta proteína se produce en condiciones normales y se encuentra
mayoritariamente en las neuronas. En apariencia la llegada del prión modifica
esta proteína del hospedador durante su síntesis o posteriormente. Por
9
consiguiente, los priones no sólo alteran la función de las enzimas del hospedador,
sino que de alguna manera provocan que un gen normal de la célula produzca
más copias de la proteína patogénica. La proteína presenta una forma normal
(PrPC) y otra anormal o infecciosa (PrPSC), con distinta configuración, que es la
que origina la patología (Beauvais 2001).
2.6 PEPTONAS Las peptonas se definen como proteínas hidrolizadas obtenidas de la digestión
parcial de carne, caseina, soya, gelatina, queratina, semillas de cacahuete, harina
de soja, semillas de algodón, semillas de girasol y otras fuentes proteicas. Estas
sirven como fuente de carbono, energía y nitrógeno, importantes para la
fabricación de material celular y estas peptonas contienen una mezcla de
aminoácidos libres, péptidos y proteosas que se mantienen en la solución después
de calentarlas a 100º C. Estos microorganismos son capaces de sintetizar estos
aminoácidos, tomando su esqueleto carbonado o incorporando el grupo amino
(Madigan et. al 2000). Estos compuestos proteínicos son fundamentales en la
elaboración de vacunas, y en esta investigación se quiere comprobar la
efectividad (en producción de Inmunógenos) de peptonas de origen vegetal para
disminuir el posible riesgo de transmisión de priones. Las proteínas, son
moléculas esenciales en la estructura y función de todos los organismos vivos,
están conformadas por cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
Las proteínas pueden escindirse en aminoácidos y péptidos mediante hidrólisis
ácida o enzimática. Estas proteínas hidrolizadas son llamadas peptonas. El
termino “peptona” aparece primero en trabajos publicados en 1880 y 1882 por
Nageli, que se asume fue el primer bacteriólogo que describió que los organismos
quimio-organotrofos se desarrollaban mejor en medios de cultivo que contenían
proteínas parcialmente digeridas (OXOID 1995).
La presencia de metales alcalinos o fosfatos puede causar la precipitación de la
peptona a un pH neutral. Por ésta razón las peptonas producidas a un pH neutro
10
se deben de utilizar para las fórmulas de los medios. Existe una gran variedad de
peptonas dependiendo de los requisitos de crecimiento de los organismos para
ciertos aminoácidos y péptidos. En general las proteínas empleadas en la
producción de peptonas son de dos tipos, proteínas animales (caseína, gelatina,
carne) y proteínas vegetales (soya). Las peptonas se obtienen a través de varios
tipos de procesos de digestión como ácido, alcalino y enzimático. La hidrólisis
rompe todas las proteínas y péptidos y produce sólo aminoácidos libres. Al mismo
tiempo destruye algunos aminoácidos importantes como triptófano. Las peptonas
pueden ser usadas por las bacterias como fuente de energía permitiendo la
producción de proteínas de H2S (sulfuro de hidrógeno), indol, aminos, etc. En la
preparación de medios de cultivo se utilizan peptonas que proporcionan las
características adecuadas para la prueba. Por ejemplo en la prueba de indol se
debe emplear una peptona rica en triptonal (peptona de caseína). Es importante
recordar que aparte de los aminoácidos presentes las peptonas contienen otros
constituyentes que pueden estimular el crecimiento de ácidos nucleicos,
minerales, vitaminas y ocasionalmente carbohidratos como es el caso de la
peptona de soya (Isaza 2006).
Por 30 años las peptonas han sido usadas como suplemento nutricional en varios
medios de cultivo celular. Las peptonas son más versátiles y menos costosas que
los productos a base de sueros y han demostrado un buen desempeño. Algunas
peptonas nos favorecen una mejor producción de anticuerpos debido a
características tales como propiedades anti-apoptóticas. La alta variedad de
peptonas disponibles pueden ayudar a conocer los requerimientos nutricionales de
las células, generando la posibilidad de mejorar cada paso de los procesos
fermentativos (Becton Dickinson 1998, Isaza 2006).
2.7 INMUNIDAD Y PREVENCIÓN DEL CARBUNCO SINTOMATICO Los animales que han mejorado a la enfermedad quedan inmunes para el resto de
su vida. El ganado bovino muy joven o muy viejo, tiene una considerable
11
inmunidad natural. La razón no se comprende bien. Probablemente sea de
naturaleza opsónica en los animales jóvenes, mientras que en los más viejos
existe siempre la posibilidad de que hayan padecido una infección subclínica. Por
lo tanto, el éxito de una buena inmunización contra la clostridiosis depende no sólo
de la elección de una vacuna eficaz e inocua sino también de un programa de
vacunación implantado en los bovinos. Una de las principales fallas observadas
en el campo es la aplicación de una única dosis en los animales vacunados por
primera vez (Tizard 2002 y Ballen 2003).
2.7.1 Inmunización activa Este tipo de inmunización se emplea ampliamente para la prevención del carbunco
sintomático. Esta hace referencia a el periodo prolongado de protección y la
posibilidad de recordar y reestimular dicha respuesta protectora mediante
inoculaciones repetidas del antígeno o mediante la exposición a la infección. Al
brindar esta fuerte inmunidad, la vacuna no debe causar efectos secundarios
desfavorables. La vacuna ideal debe ser económica, estable y adaptable a la
vacunación de grandes cantidades de animales, e idealmente, debe estimular una
respuesta inmunitaria que pueda distinguirse de la causada por la infección
natural. Además de los requisitos mencionados se deben tener en cuenta las
siguientes propiedades: En primer término, las células presentadoras de antígeno
deben ser estimuladas para que procesen el antígeno de manera eficiente y
liberen las citocinas apropiadas. En segundo lugar, deben estimularse tanto
linfocitos B como T para que generen gran número de células de memoria. En
tercer lugar, deben generarse linfocitos T de ayuda y efectores contra varios
epitopos en la vacuna, a efecto de que se superen las variaciones del
polimorfismo del MHC clase ll y las propiedades de los epitopos. Por último, el
antígeno debe persistir en los sitios apropiados de los tejidos linfoides, para que se
generen células productoras de anticuerpo y para que la protección persista
durante el periodo más largo posible (Tizard 2002).
12
Entre las vacunas empleadas para la prevención del carbunco sintomático, se
hallan la inserción de trozos pequeños del músculo afectado bajo la piel del animal
a inmunizar; músculo seco pulverizado atenuado con calor; líquido muscular
recogido y filtrado; líquido de cultivos en caldo-carne, filtrado para eliminar
microorganismos (Merchant 1975). Sin embargo, la mayor eficacia la exhiben las
vacunas preparadas con cultivos completos de varias cepas de C. chauvoei con
diversos antígenos flagelares, desactivadas con formaldehído y a las que se
añade Hidróxido de aluminio, aceite o alumbre (Valder 2002).
2.7.2 Adyuvantes Para que las vacunas con microorganismos muertos sean eficaces, suele ser
necesario administrar un adyuvante con el antígeno. Ellos pueden ser adaptados
de acuerdo a diferentes criterios como la especie blanco, el antígeno, el tipo de
respuesta inmune, la vía de inoculación o la duración de la inmunidad para
obtener un buen balance entre seguridad e inmunogenicidad (Aucouturier 2002).
Los adyuvantes son sustancias que aceleran, prolongan o potencian la respuesta
inmune específica contra los antígenos inoculados. Entre las ventajas del uso de
adyuvantes se hallan: Su capacidad de potenciar la inmunogenicidad de antígenos
con un grado de pureza elevado o recombinantes; la reducción de la cantidad de
antígeno y del número de reinmunizaciones requeridas para proveer una
inmunidad protectora; favorecen la inmunogenicidad porque capturan antígenos
en sitios donde éstos permanecen accesibles a los linfocitos reactivos e inducen a
las células presentadoras de antígenos a expresar moléculas coestimuladoras,
como CD80. Entre los factores involucrados en la selección de un adyuvante se
encuentran: el tipo de respuesta deseada o que se quiere evitar, la especie
vacunada, la ruta de administración y los efectos colaterales inducidos por el
adyuvante. De forma ideal, los adyuvantes deben ser materiales de bajo costo,
no tóxicos y poco inmunogénicos. Además, deben ser estables, y preferiblemente,
deben promover inmunidad tanto humoral como mediada por células, en
13
dependencia del requerimiento de protección contra el patógeno (Ballen 2003,
Tizard 2002).
Los tipos de adyuvantes que se tienen son los siguientes: En primer lugar,
tenemos aquellos que son formadores de depósitos, tales como las sales de
aluminio, como hidróxido y fosfato, y el sulfato de aluminio y potasio (alumbre),
estos influyen sólo en al inmunoreacción primaria y tienen poco efecto en la
secundaria, es decir que no estimulan respuestas de células T citotóxicas.
Aunque los efectos colaterales son relativamente pocos, se ha observado la
formación de más granulomas en el sitio de inyección por vía subcutánea o
intradérmica que por la vía intramuscular. También se encuentra como adyuvante
el aceite mineral ligero (adyuvante incompleto de Freund), el cual estimula una
reacción inflamatoria crónica de tipo local, donde el antígeno es liberado
lentamente de la fase acuosa de la emulsión (Cox 1997, Tizard 2002).
Existe adyuvantes procedentes del extracto acuoso de la corteza de Quillaja
saponaria Molina, los cuales se conocen como saponinas, estos son glicósidos
tensoactivos que contienen un núcleo hidrofóbico de estructura triterpenoide, y
cadenas de carbohidratos enlazadas al triterpeno que conforman regiones
hidrofílicas. Entre las propiedades asociadas a las saponinas se incluyen: un
excelente efecto adyuvante para antígenos tanto T-dependientes como T-
independientes, y la estimulación de isotipos asociados a respuestas de células T
auxiliadoras de tipo 1 (Th1). Esta clase de adyuvantes induce, además,
respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, propiedad asociada usualmente
con vectores virales (Ballen 2003, San Martin 2000, Cox 1997).
Por último se encuentra la familia de adyuvantes oleosos, que han demostrado ser
potentes en numerosas vacunas experimentales en ratones, ratas, gatos, perros y
cerdos, tanto con péptidos sintéticos como con antígenos virales. Entre estos
cabe destacar, las emulsiones acuoso/oleoso/acuoso (W/O/W), las cuales tienen
una baja viscosidad y la habilidad para inducir respuestas inmune a corto y largo
14
plazo. Generalmente inducen una respuesta inmune humoral. El antígeno en la
fase externa acuosa es inmediatamente disponible al sistema inmunológico como
formulaciones acuosas y el antígeno en la fase interna acuosa, es lentamente
liberado como en emulsiones acuoso/oleoso (W/O). Ellas son generalmente mejor
toleradas que emulsiones W/O. Las emulsiones oleoso/acuoso (O/W) son muy
fluidas, bien toleradas e inducen una respuesta inmune fuerte y a corto plazo
(Seppic 2003, Ballen 2003).
2.7.3 Esquema de vacunación Para realizar un buen programa del control de la enfermedad, no se puede dejar
de revacunar anualmente todo los animales. Aquí se piensa que las clostridiosis
afectan solamente animales jóvenes de 6 meses hasta 2 años, como ocurre en la
mayoría de los casos de Carbunco Sintomático. No es verdad; las otras
clostridiosis, como por ejemplo las Enterotoxemias y la Gangrena gaseosa,
pueden provocar perjuicios considerables en animales de todas las edades. La
vacunación o la revacunación, según sean las circunstancias, se debe realizar
normalmente antes del período del año en que existe mayor riesgo de que
aparezca la clostridiosis.
Cuando la clostridiosis afecta principalmente a los animales recién nacidos, como
sucede con algunas Enterotoxemias, las hembras en gestación deben ser
revacunadas anualmente con una dosis de 2 a 6 semanas antes del parto (Ballen
2003).
La aplicación de la segunda dosis en animales primovacunados, es fundamental
para obtener niveles óptimos de protección. La protección dada por una única
dosis de vacuna es pequeña y de corta duración, particularmente en presencia de
anticuerpos maternos. La segunda dosis de antígeno va a estimular las células
de memoria de los animales primovacunados que permite que se de rápidamente
una respuesta inmunitaria mayor y de larga duración (Ballen 2003).
15
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Marco Geográfico El proyecto se llevó a cabo en el Departamento de Cundinamarca, Ciudad Bogotá,
en los Laboratorios del Departamento de Investigación y Desarrollo de la Empresa
Colombiana de Productos Veterinarios, Vecol S.A. (Figura 1).
3.2 Marco Demográfico La población de estudio fueron las vacunas oleosas formuladas con el antígeno
C. chauvoei en medios a base de peptonas vegetales, probadas en cobayos
machos de raza Hartley albino, son de colores simples claros, oscuros o
combinados. Con peso de 350 – 450 g.
La muestra fue la vacuna oleosa formulada con C. chauvoei en un medio de
cultivo a base de peptonas vegetales, que al ser inoculada a un grupo
determinado de cobayos da lugar a una respuesta inmune.
Figura 1. Instalaciones de la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios, VECOL S. A.
3.3 Variables
16
Las variables a tener en cuenta fueron; una respuesta inmune específica generada
en los cobayos inoculados con vacunas oleosas a base de C. chauvoei en medios
con peptona vegetal y la cantidad de biomasa celular producida en los medios de
cultivo formulados con cuatro peptonas vegetales. Para la evaluación de la
respuesta inmune, se tuvo en cuenta el número de cobayos sobrevivientes en la
prueba de potencia, gracias a la respuesta inmune generada contra el antígeno
C. chauvoei. Otra variable importante fue la cantidad de biomasa, para ello se
tuvo en cuenta el porcentaje de transmitancia. Estas variables permitieron
comparar la cantidad de biomasa obtenida y la respuesta inmune generada en los
cobayos, con el fin de evaluar la respuesta inmune de vacunas oleosas formuladas
con Clostridium chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales.
3.4 Análisis Estadístico Se realizó el análisis de los datos obtenidos de cinco (5) réplicas de ensayos
independientes; completamente al azar, para la biomasa generada en los medios
con cada una de las peptonas vegetales y para los ensayos de potencia; mediante
una estadística descriptiva con análisis de varianza (ANOVA) y test de Tukey. El
programa estadístico empleado fue STATISTIX 1.0 proceso descriptivo AOV.
3.5 Métodos y procedimientos Para evaluar la respuesta inmune de vacunas oleosas formuladas con
C. chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales; inicialmente se
tuvo en cuenta una primera etapa fermentativa relacionada con la producción de
biomasa del microorganismo, determinada por el porcentaje de transmitancia, y
una segunda etapa de ensayos de potencia, para evaluar la respuesta inmune de
las vacunas formuladas, determinado por el número de animales de
experimentación (cobayos) sobrevivientes a la misma.
17
3.5.1 Cepa bacteriana y mantenimiento En este trabajo de investigación se empleó la cepa de Clostridium chauvoei, la
cual se obtuvo del cepario de microorganismos existentes en la Empresa de
Productos Veterinarios, VECOL S. A. Las cepas se mantiene en críostato a – 70º
C, en estado de criopreservación.
3.5.2 Elaboración del semillero de trabajo de C. chauvoei
A partir de las semillas matrices conservadas en el criostato a -70º C, se elaboró
un semillero de trabajo. Para esto la cepa de C. chauvoei fue reactivada
previamente a 37º C por cinco minutos. Se preparó 1l de Medio Clostridium
Modificado con Peptona Vegetal a pH 8.0; el medio fue adicionado junto con 100
ml de cepa a un fermentador estéril. Este cultivo se trabajó a una concentración
del 10% v/v de semilla. Al fermentador se le realizó una inyección de gases
especiales para proporcionar condiciones anaerobias. El cultivo se incubó a 37º C
por 48 horas. Al cabo de este tiempo, se verificó la pureza del cultivo mediante
una prueba de esterilidad.
3.5.3 Preparación de medios y realización de cultivos de C. chauvoei en los medios a base de peptonas vegetales Se prepararon los medios de cultivo con cuatro peptonas vegetales, de acuerdo a
la formulación planteada por Isaza 2006 (Anexo 1). Para ello los componentes de
los medios, previamente pesados, se disolvieron en 500 ml de agua destilada con
agitación constante excepto la L-cistina. Aparte en un tubo de ensayo se disolvió la
L-cistina en presencia de hidróxido de sodio al 1 N previamente preparado. Se
ajustó el pH de los medios a 8.0.
Los medios fueron esterilizados mediante filtración con un filtro 0.22 μm, debido a
que la glucosa, cuando se esteriliza al autoclave con las sales de fosfato, pueden
dar lugar a sustancias inhibitorias y precipitados. Finalmente, se realizó un control
18
de esterilidad, dejando los medios de cultivo en la incubadora a 37º C por 24
horas.
Al cabo de este tiempo, se procedió a la realización de los cultivos en fermentador
estéril; adicionando 450 ml del medio de cultivo a base de peptona vegetal y 50 ml
de cepa clostridial, nuevamente se realizó la inyección de gases especiales y se
llevó a incubar por 48 h a 37º C (Figura 2).
Después de las 48 horas de incubación a 37º C, se tomó una muestra de
aproximadamente 10 ml de cada cultivo con el propósito de efectuar pruebas de
esterilidad y para determinar la producción de biomasa.
Tanto los medios como las siembras se realizaron cinco veces, con el fin de
verificar la producción de biomasa en cada uno de los medios, teniendo en cuenta
que la bacteria se requiere como antígeno para la formulación de vacunas. Todos
los cultivos se sembraron al 10% v/v de semilla.
19
Figura 2. Preparación de medios de cultivo a base de peptonas vegetales y cultivo de C. chauvoei en fermentador a 37º C por 48 horas.
Componentes del medio
Peptona vegetal
L-cistina
Pesaje de los componentes
Filtración del
medio
Semilla de C. chauvoei
(10% v/v) Medio de cultivo
Inyección de Gases
Incubación 37º C por 48 horas
Cultivo de C. chauvoei
Prueba de esterilidad y
espectrofotometría
Control de esterilidad a 37º C por 24h del medio
20
3.5.3.1 Prueba de esterilidad A partir de la muestra recolectada, se procedió a realizar siembra en Agar Saboreau,
Agar sangre, Caldo Casoy y Tioglicolato. Todos los medios se trabajaron en
aerobisis, pero el agar sangre también se empleo en anaerobiosis. Los medios
Casoy y Saboreau se incubaron a temperatura ambiente (22 º C), los medios Sangre
y tioglicolato se incubaron a 37º C (Figura 3). El tiempo de incubación fue de 24 h.
Al término de este tiempo se realizó coloración Gram (Anexo 2).
Figura 3. Prueba de esterilidad de los cultivos de C. chauvoei.
3.5.4 Determinación de la producción de biomasa en los medios de cultivo a base de peptonas vegetales mediante espectofotometría (Micalizzi y Guzmán 1995) La biomasa es la masa celular obtenida del crecimiento del microorganismo. El
método a emplear para la evaluación de la biomasa de C. chauvoei es el
turbidimétrico, el cual consiste en hacer pasar un haz de luz a través de una
suspensión de células cuyo medio de suspensión o blanco es el medio de cultivo.
El instrumento de medida es el espectrofotómetro y las unidades de medición son
Absorbancia (cantidad de luz retenida por las células, proporcional al número de
Incubar a 37 y 22º C por
24h
Muestra del Cultivo de
C. chauvoei
Siembra en Agar Sangre, Saboreau,
Caldo Casoy y Tioglicolato
21
ellas) o Porcentaje de Transmitancia (luz que las células dejan pasar, sus valores
son inversos a la cantidad de células presentes). Estas unidades se pueden
relacionar por medio de la ecuación:
Absorbancia = 2 – log (%T)
Donde T es transmitancia
De acuerdo con lo anterior se estableció el % de Transmitancia de los diferentes
medios de cultivos formulados a una longitud de onda de 540 nm.
3.5.5 Prueba de Letalidad de los cultivos de C. chauvoei Para verificar la capacidad patogénica de la biomasa producida en los cultivos
desarrollados en este estudio, se realizó la prueba de patogenicidad en cobayos,
de 350 – 450 g de peso (grupos de cuatro cobayos por dilución), a los cuales se
les inoculó 0.5 ml por vía intramuscular de cada una de las diluciones en base 10
(10-3 a 10-6) preparadas a partir de 1 ml del cultivo de C. chauvoei en los medios a
base de peptonas vegetales y 9 ml de CaCl2 5% a 4º C estéril.
Los cobayos se observaron durante 72 horas y se registró a diario la supervivencia
o mortalidad de los mismos, para determinar la dosis letal cincuenta (DL50). Los
cálculos se realizaron por el método estadístico Reed-Muench.
La Dosis Letal Cincuenta (DL50). Es aquella dilución que al ser inoculada en los
cobayos produce mortalidad en el 50% de una población de animales inoculados.
Para determinar en cuál dilución muere el 50% de los cobayos, se inocularon 4
cobayos por vía intramuscular con 0.5 ml de cada una de las diluciones
anteriormente mencionadas, y otro grupo de 4 cobayos control inoculados con el
medio de cultivo y CaCl2 5% estéril a 4º C con el fin de descartar posibles efectos
tóxicos en los cobayos, ocasionados por el medio de cultivo, por el CaCl2 estéril o
muerte por traumatismo.
22
3.5.6 Formulación de Vacunas contra C. chauvoei cultivado en medios a base de peptonas vegetales La formulación de las vacunas se llevó a cabo teniendo en cuenta la cantidad de
biomasa de C. chauvoei y la patogenicidad de la misma, por lo tanto se procedió
a determinar si las vacunas con un antígeno cultivado en medios a base de
peptonas vegetales producen una respuesta inmune.
La inactivación se realizó para cada uno de los cultivos de C. chauvoei y se llevó
acabo por un periodo de 10 días. Sin embargo antes de llevar a cabo este
procedimiento se determinó la cantidad de biomasa de los cultivos. Por lo tanto,
por cada 100 ml de semilla se adicionó el 0.6% de hidróxido de sodio (NaOH) al
20%, 0,6% de glicocola y un disolvente acuoso de formaldehído al 37%,
posteriormente se incubó a 37º C en agitación constante.
En la formulación de vacunas, inicialmente se preparó por separado en un frasco
schott la fase acuosa mezclando: gramos de antígeno y mg de saponina.
Posteriormente se colocó en otro frasco schott el adyuvante oleoso con una barra
magnética estéril. Para la adición de la fase acuosa sobre la oleosa, se procedió a
colocar el frasco schott con el adyuvante en un agitador magnético y lentamente
se adicionó la fase acuosa hasta completar la mezcla. Las vacunas fueron
finalmente conservadas en nevera a 4º C (Figura 4).
Se formularon 4 vacunas, correspondientes a los medios a base de peptonas
vegetales empleados. Dentro de cada grupo de vacunas aprobadas con la prueba
de potencia en cobayos se repitieron cinco veces cada una.
23
Figura 4. Formulación de vacunas con el antígeno inactivado de C. chauvoei, saponina y adyuvante oleoso.
Adyuvante oleoso
Cultivo de C. chauvoei en
medio a base de peptonas vegetales Mezcla de saponina,
antígeno y adyuvante oleoso
Adición de la fase acuosa sobre la
oleosa
Nevera 4 º C
24
3.5.7 Prueba de Potencia de las vacunas formuladas en cobayos Esta prueba se realizó con el fin de verificar el poder inmunógeno de los cultivos
de C. chauvoei en medios a base de peptonas vegetales, para ello se emplearon
cobayos machos mantenidos en jaulas, los cuales se sometieron a adaptación en
el bioterio por un periodo de 2-5 días antes de iniciar la prueba. Los cobayos se
alimentaron con concentrado y se suplementaron con pasto fresco y suministro de
agua fresca permanente. Al finalizar la prueba los cobayos se sacrificaron e
incineraron (Estatuto Nacional de Protección de los animales es la ley 84 del 27 de
Diciembre de 1.989, Resolución Nº 008430 de 1.993, “Normas científicas, técnicas
y administrativas para la investigación en salud”).
3.5.7.1 Vacunación
Para la inmunización de los cobayos se utilizaron las vacunas formuladas con los
cultivos de C. chauvoei inactivados. El producto se mezcló vigorosamente y se
aplicó usando jeringas de 5-10 ml con aguja calibre 23. Se inocularon 0.5 ml de las
vacunas de prueba, intramuscularmente a un grupo de 8 cobayos por cada vacuna a
evaluar y un igual número de cobayos sin vacunar sirvieron de control para cada una
de las mismas. Posteriormente se llevó a acabo la revacunación a los 21 días de la
primera dosis (Figura 5).
3.5.7.2 Prueba de inocuidad o Reto Los animales empleados en la prueba, se inocularon con 100 DL50 de
C. chauvoei vía intramuscular (0.5 ml), a los 15 días después de la segunda
vacunación. El inóculo fue una suspensión de un cultivo de C. chauvoei en
solución de Cloruro de Calcio estéril al 5% que se preparó el día del desafío y se
conservó refrigerada en hielo hasta su uso. Para determinar el título de la cepa
desafío se realizaron diluciones logarítmicas de acuerdo al título esperado del
microorganismo. De acuerdo con el título de la cepa de desafío, se hicieron
diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 (Figura 6).
25
Figura 5. Vacunación de cobayos.
Vacunación de cobayos
Vacuna formulada
contra C. chauvoei
Cobayos adaptados al
bioterio
26
Figura 6. Desafío o reto de las vacunas formuladas contra C. chauvoei en cobayos.
Antígeno C. chauvoei
Inoculación de Cobayos
Dilución del antígeno en
solución de CaCl2 estéril al 5%
27
Figura 7. Diagrama de actividades desarrolladas para evaluar la respuesta inmune vacunas oleosas formuladas con Clostridium chauvoei cultivado en
medios a base de peptonas vegetales.
Elaborar semillero de trabajo de C. chauvoei
Preparar
Cultivos de C. chauvoei en los medios a base de peptonas vegetales
Cultivar
C. chauvoei en los medios preparados
Realizar
Prueba de esterilidad
Determinar
La producción de biomasa en los medios de cultivo a base de peptonas vegetales mediante espectrofotometría
Determinar
Letalidad de los cultivos de C. chauvoei (DL50)
Formular
Vacunas contra C. chauvoei
Realizar
Prueba de Potencia de las vacunas formuladas en cobayos
28
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se evaluó la respuesta inmune de vacunas oleosas formuladas con C. chauvoei
cultivado en medios a base de peptonas vegetales. Para ello se realizaron
cultivos con cuatro peptonas vegetales, teniendo en cuenta la producción de
biomasa de C. chauvoei, y se formularon cuatro vacunas a base de estas
peptonas.
4.1 Prueba de esterilidad Al semillero de trabajo y a los cultivos a base de peptonas vegetales, se les
confirmó, mediante la observación microscópica de los frotis coloreados con
Gram., la morfología de C. chauvoei, bacilos Gram. positivos pleomórficos,
algunos esporulados, con desigual coloración (Figura 8).
A las muestras de los cultivos sembrados en agar sangre bajo condiciones
anaeróbicas (en campana), se observó el crecimiento del microorganismo con
colonias pequeñas, transparentes u opacas, de bordes irregulares con actividad β
hemolítica, típicas del género Clostridium sp. (Figura 9). En los demás medios
de cultivo empleados para esta prueba, no se observó morfología diferente a
Clostridium chauvoei; por lo tanto se asumió la pureza de la cepa en todos los
cultivos realizados.
4.2 Determinación de la producción de biomasa de C. chauvoei mediante espectrofotometría A los cultivos en fermentador con cada peptona vegetal; Freetone A-1, Martone K-
1, Martone L-1 y Select Soytone; se les determinó la cantidad de biomasa
generada de cada ensayo, mediante el porcentaje de transmitancia, % T. Se
29
relacionaron los datos entre si para definir los mejores cultivos con respecto a la
mayor cantidad de biomasa producida por los mismos.
Figura 8. Coloración Gram. para C. chauvoei.
Figura 9. Aislamiento de C. chauvoei en agar sangre bajo condiciones anaeróbicas.
De acuerdo con los datos de la tabla 1 y Anexo 3, no existen diferencias
estadísticamente significativas entre los porcentajes de transmitancia de los
medios evaluados con peptonas vegetales (p>0.05) para la cepa de C. chauvoei.
30
Por lo tanto se procedió a realizar la prueba de tukey, con el fin de comparar las
medias de los subconjuntos homogéneos, pertenecientes a los cultivos realizados
con cada una de las peptonas vegetales, los cuales son similares entre si (Tabla
2). Sin embargo, en la figura 10 se observa que los medios con las peptonas
Martone K-1 y Freetone A1, produjeron los mejores datos en porcentaje de
transmitancia para la biomasa celular de C. chauvoei.
Tabla 1. Determinación de la producción de biomasa en porcentaje de transmitancia, % T, a cuatro cultivos a base de peptonas vegetales a las 48
horas.
Nº
Ensayos Cultivos con Pept. vegetales
I II lll IV
V
1 Freetone A1 2 1.6 2.6 1.4 1.4
2 Martone K1 1.5 2.1 1.3 1.4 1.4
3 Martone L1 3.3 2 2.3 1.5 1.5
4 Select soytone 1.4 1.9 4.1 1.3 1.3
31
Tabla 2. Test de Tukey para la biomasa generada (%T) de C. chauvoei en cultivos con cada peptona vegetal ensayada.
Nº
Ensayos Cultivos con Pep. Vegetales
Significación Grupos
Homogeneos
2 Martone K1 1.5400 I
1 Freetone A1 1.8000 I
4 Select soytone 2.0000 I
3 Martone L1 2.1200 I
ERROR ESTANDAR POR COMPARACIÓN: 0.4853
0
0,5
1
1,5
2
2,5
TRA
NSM
ITA
NC
IA
Freetone A1 Martone K1 Martone L1 Selectsoytone
PEPTONA
MASA CELULAR
Figura 10. Comparación de los porcentajes de transmitancia entre los diferentes cultivos con peptonas vegetales para la cepa de C. chauvoei. 4.3 Dosis Letal Cincuenta (DL50) Después de analizar los porcentajes de transmitancia para cada peptona vegetal y
determinar que estas favorecen una buena producción de biomasa del antígeno.
Se verificó su actividad letal en cobayos. De igual forma se ratificó que los
32
componentes del medio de cultivo empleado y la solución de cloruro de calcio
estéril no fueron la causa de la muerte de los cobayos.
Por lo tanto, se observó letalidad de la cepa de C. chauvoei entre las diluciones
108 y 109 de los medios de cultivo con cada una de las peptonas vegetales
ensayadas (Martone L-1, Martone K-1, Select Soytone y Freetone A-1) (Tabla 3).
Tabla 3. Dosis letal cincuenta de los cultivos de C. chauvoei.
CULTIVO CON PEPTONA VEGETAL
DL50
Martone L-1 108.7
Martone K-1 108.5
Select Soytone 108.3
Freetone A-1 108.0
De acuerdo a los resultados de determinación de la cantidad de biomasa y DL50,
se discutió inicialmente que los medios peptona, extracto de levadura, glucosa
(PYG), son recomendados para cultivar especies de Clostridium (Shone 1989,
Micallizi 1995, Qari et al. 1990), por lo tanto las formulaciones de los medios
(Anexo 1) se pueden considerar como medios complejos que favorecen el
crecimiento de C. chauvoei, debido a que estos se caracterizan por poseer
componentes como peptona, extracto de levadura, glucosa y fosfato ácido de
potasio; que influyen positivamente en la producción de biomasa, esporulación y
producción de toxinas; en comparación con los componentes de otros medios
(González 1998).
33
Las peptonas vegetales empleadas en los diferentes medios con sus cantidades
propuestas en la formulación, se destacó por estimular el crecimiento abundante
de C. chauvoei, gracias a que estas posiblemente aportaron carbono, nitrógeno
(proteosas), sales inorgánicas como los fosfatos y algunos micronutrientes como
Ca, Zn, Fe y Cu, componentes esenciales requeridos en un medio microbiológico
para el crecimiento de los microorganismos (Gaudreau et al. 2002; Kurbanoglu
2004).
Shone (1989) afirma que las sales, elementos trazas y solución de vitaminas
deben ser usados para preparar medios complejos, pero los requerimientos de
bases purinas y pirimidinas, y aminoácidos pueden variar significativamente; esto
es totalmente importante, ya que son precursores para proteínas o como sustratos
productores de energía. Por lo tanto, las peptonas vegetales son fuentes de
nitrógeno orgánico fundamentales que poseen la capacidad de promover un
profuso crecimiento en medios de cultivo complejos para microorganismos con
alta demanda en requerimientos nutricionales como los Clostridium spp.
Por otro lado, la temperatura de cultivo fue la adecuada, debido a que este
microorganismo crece óptimamente a una temperatura entre 30 y 37º C (Shone
1989). Así mismo esta especie de Clostridium spp fue capaz de reproducirse bajo
condiciones alcalinas, disminuyendo posiblemente el pH entre 5,1-6,1, lo que
indica un activo crecimiento (Choman 1969). En cuanto a la producción de toxina,
posiblemente ésta se encuentra relacionada con la producción de biomasa
generada en los medios de cultivo con peptonas vegetales, en los cuales se
observaron altos títulos de DL50, debido a la presencia de sustancias tales como la
glucosa y las sales de fosfato en los medios, que tienen la capacidad de estimular
la producción de toxinas y el crecimiento de los microorganismos, de tal manera
que la cantidad de toxina incrementa en los cultivos así como la población
bacteriana incrementa hasta alcanzar su máximo valor de crecimiento (Bernheimer
1944).
34
Por lo tanto, no hubo factores que afectaran la producción de biomasa ni toxinas
en los cultivos de C. chauvoei, de tal manera que lo hace un antígeno propicio
para la formulación de vacunas.
4.4 Prueba de Potencia en cobayos de las vacunas formuladas Para determinar el poder inmunógeno de la cepa en los medios de cultivo evaluados
se formularon cuatro vacunas, realizándose cinco replicas por cada una; para ello se
tuvieron en cuenta los resultados de porcentaje de transmitancia (producción de
biomasa) y la DL50. La prueba se validó tomando en cuenta el porcentaje de
animales sobrevivientes al desafío, el cual debe ser de mínimo el 80% de los
cobayos vacunados.
Con respecto a los datos de la tabla 4 y Anexo 3, no existen diferencias
estadísticamente significativas entre los porcentajes de sobrevivencia de las
vacunas evaluadas (p>0.05) contra la cepa C. chauvoei. Por lo tanto se procedió
a realizar la prueba de túkey, con el fin de comparar las medias de los
subconjuntos homogéneos, pertenecientes a las vacunas realizadas con cada una
de las peptonas vegetales, las cuales son similares entre si (Tabla 5). Sin
embargo, en la figura 11 se observa que las peptonas vegetales Martone L-1 y
Freetone A-1 produjeron los mejores datos de la prueba de potencia; por otro lado
las peptonas vegetales Martone K-1 y Select Soytone presentaron datos cercanos
a las anteriores, pero entre ambas existe igualdad en los resultados. Por lo tanto,
estas vacunas generaron una respuesta inmune en los cobayos vacunados. Con
respecto, al grupo control se obtuvo el 100% en su mortalidad o 0% de
sobrevivencia.
35
Tabla 4. Resultados de la prueba de potencia de las vacunas formuladas a base de peptonas vegetales contra el antígeno C. chauvoei.
Pept. Vegetal
Replicas de Vacunas y sus Resultados
Freeton
e A1
Martone K1
Martone L1
Select soytone
Control
1. Sobrevivencia Mortalidad
100% 0 %
62,5% 37,50%
100% 0%
50% 50%
0% 100%
2. Sobrevivencia Mortalidad
100%0%
100% 0%
100% 0%
87.5% 12.5%
0% 100%
3. Sobrevivencia Mortalidad
100% 0%
75% 25%
100% 0%
100% 0%
0% 100%
4. Sobrevivencia Mortalidad
87.5% 12.5%
100% 0%
100% 0%
100% 0%
0% 100%
5. Sobrevivencia Mortalidad
100% 0%
100% 0%
100% 0%
100% 0%
0% 100%
36
Tabla 5. Test de Tukey para la prueba de potencia (% sobrevivencia) de las vacunas formuladas con cada peptona vegetal ensayada contra
C. chauvoei.
Nº
Ensayos Cultivos con Pep. Vegetales
Significación Grupos
Homogeneos
3 Martone L1 100.00 I
1 Freetone A1 97.500 I
2 Martone K1 87.500 I
4 Select Soytone 87.500 I
5 Control 0.0000 …I
ERROR ESTANDAR POR COMPARACIÓN: 8.0623 VALOR CRITICO POR COMPARACIÓN: 24.127
37
Free
tone
A1
Mar
tone
K1
Mar
tone
L1
S. S
oyto
ne
Con
trol
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
Porcentaje
Peptonas vegetales
Figura 11. Comparación de los porcentajes de sobrevivencia de los cobayos vacunados con las cuatro vacunas formuladas a base de peptonas
vegetales contra el antígeno de C. chauvoei.
Los antígenos celulares y extracelulares son importantes en la inmunogenicidad
de las vacunas contra el carbunco sintomático (Guzmán 1986). Estas vacunas
dieron lugar a una buena y total respuesta inmune en los cobayos vacunados que
sobrevivieron por más de cinco días; coincidiendo con lo establecido por Chandler
(1970), quien consideró que los animales vacunados (cobayos) que sobrevivían
por más de cinco días habían logrado una total protección. Esta respuesta,
posiblemente, se debió gracias a las condiciones de cultivo del antígeno, las
cuales generaron una fase estacionaria donde se obtuvieron inmunógenos
38
capaces de producir una alta protección y altos títulos de IgG en los animales
vacunados (Mattar 2002).
En los ensayos no se observó altas tasas de mortalidad, ya que el poder
inmunogénico de las células se encuentra influenciado por la limitación de la
fuente de carbono, según Cortiñas 1994; este aspecto no influyó de ninguna
manera en nuestro caso, y lo contrario, a lo publicado por Cortiñas, se observó en
los resultados de cada vacuna.
Por lo tanto, se dió lugar a un antígeno celular, somático y flagelar, que produjo
posiblemente una cantidad variable de toxinas, que de acuerdo con Kerry (1967) y
Crichton et al. (1990) existen pocas evidencias que aseguren que estas realmente
sean inmunológicamente importantes; sin embargo para otros autores (Cavalieri et
al. 1984 y Chakraborty et al. 1987) estas son consideradas como factores de
virulencia, capaces de invadir y multiplicarse en los tejidos del huésped, que para
este caso son los cobayos. La inmunidad de los animales vacunados se debió a
la estimulación del sistema inmune gracias a la acción de este conjunto de
factores de virulencia y moléculas antigénicas celulares propias de C. chauvoei; y
a la posible acción del adyuvante empleado, este se caracteriza por poseer una
conformación molecular (agua/aceite/agua), lo cual dió lugar a una baja viscosidad
y liberación del antígeno de manera lenta y prolongada, generando posiblemente
una inmunogenicidad perdurable y una estabilidad del antígeno en las
formulaciones realizadas (Bomford 1985, Dalsgaard 1987 y Audibert et. al. 1993).
Sin embargo hay que tener en cuenta, que los antígenos de C. chauvoei son
usualmente obtenidos bajo condiciones de cultivo de 24 horas el periodo de
incubación reportado por otros autores donde se ubica aproximadamente la fase
de crecimiento, en la cual se expresan la mayoría de proteínas celulares,
extracelulares y polisacáridos capsulares (Tanaka et al. 1987 y Macheak 1972).
39
5. CONCLUSIONES
Con respecto a los resultados obtenidos en este trabajo experimental se logró
concluir lo siguiente:
Las vacunas oleosas formuladas a partir de un antígeno cultivado en medios a
base de peptonas vegetales indujeron respuesta inmune en los cobayos
vacunados, con un porcentaje de sobrevivencia del 100% para los cultivos con
la peptona vegetal Martone L-1; del 97.5% para los cultivos con la peptona
Freetone A-1, y un porcentaje de sobrevivencia del 87.5 % para las peptonas
vegetales Martone K-1 y Select soytone.
Las peptonas vegetales empleadas en la formulación de medios de cultivo para
C. chauvoei favorecieron una buena producción de biomasa, determinado por
el porcentaje de transmitancia, para tal caso los cultivos con la peptona vegetal
Martone K-1 produjeron 1.54% en biomasa; la peptona Freetone A1 produjó
1.8% en biomasa; la peptona Select soytone produjó el 2% en biomasa y la
peptona Martone L1 produjó el 2.1% en biomasa, respectivamente. Esto fue
posible gracias al aporte de carbono, nitrógeno (proteosas), sales inorgánicas y
algunos micronutrientes; brindados por el medio y por la peptona vegetal
principalmente.
Los cultivos de C. chauvoei realizados en medios a base de peptonas
vegetales también favorecieron la producción de toxinas, donde se observó
letalidad de la cepa entre las diluciones 108 y 109 para todas las peptonas
vegetales, sin embargo se destacaron la peptona vegetal Martone L-1 con una
DL50 de 108.7 y la peptona vegetal Martone K1 con una DL50 de 108.5.
40
Al realizar vacunas a base de cultivos de C. chauvoei en peptonas vegetales,
se brindaron las mejores condiciones de cultivo y formulación de vacunas, y se
obtuvo un antígeno celular, somático y flagelar, capaz de estimular el sistema
inmune de los animales vacunados; el cual también fue potencializado por la
acción del adyuvante oleoso empleado.
Estos resultados favorables demuestran la capacidad de las peptonas
vegetales para elaborar vacunas al mantener microorganismos como el C.
chauvoei y se abren las puertas para investigaciones con otros organismos
patógenos, además de crear herramientas profilácticas para que nuestro país
sea altamente competitivo contra la Encefalopatía Espongiforme Bovina.
41
6. RECOMENDACIONES
Elaborar un diseño experimental que logre el escalamiento a nivel de la
producción industrial del presente trabajo, para llegar a definir cambios en la
misma.
Efectuar cinéticas de crecimiento de C. chauvoei, para establecer el
comportamiento de este microorganismo en las diferentes fases (adaptativa,
crecimiento, estacionaria y muerte), a las mismas condiciones de cultivo.
Evaluar otros parámetros que no fueron tenidos en cuenta en este trabajo, a
través de una cinética de crecimiento, como potencial redox, pH, consumo de
glucosa, producción de metabolitos primarios y secundarios; con el fin de
determinar la hora de inactivación del cultivo, la fase de producción de toxinas y el
momento de adaptación del microorganismo a los medios de cultivo a base de
peptonas vegetales.
Implementar la prueba de ELISA en los ensayos de potencia de las vacunas, la
cual posee ventajas como la reducción significativa en el número de cobayos
empleados en estos ensayos y la estimación de los resultados de una forma
cuantitativa con un mayor margen de seguridad.
Realizar pruebas que tengan que ver con la determinación de proteínas, tales
como Electroforesis o Western Blot, con el fin de establecer que proteínas hacen
parte del antígeno y se encuentran implicadas en la respuesta inmunoprotectiva.
42
6. BIBLIOGRAFIA
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Anexo 1
Composición de cada medio de cultivo a base de cuatro peptonas vegetales.
1.1 Medio a base de peptona vegetal Freetone A-1
Tabla 6. Composición
COMPUESTO CONCENTRACION (gramos/500 ml)
Freetone A-1 11,0
Extracto de Levadura 2.5
Fosfato dipotásico 2.5 Glucosa 2.5
L – Cistina 0,375 1.2 Medio a base de peptona vegetal Martone K-1
Tabla 7. Composición
COMPUESTO CONCENTRACION (gramos/500 ml)
Martone K-1 15,0
Extracto de Levadura 2.5
Fosfato dipotásico 2.5 Glucosa 2.5
L – Cistina 0,375 1.3 Medio a base de peptona vegetal Martone L-1
Tabla 8. Composición
COMPUESTO CONCENTRACION (gramos/500 ml)
Martone L-1 12,5
Extracto de Levadura 2.5
Fosfato dipotásico 2.5 Glucosa 2.5
L – Cistina 0,375 1.4 Medio a base de peptona vegetal Select Soytone
Tabla 9. Composición
COMPUESTO CONCENTRACION (gramos/500 ml)
Select Soytone 15.5
Extracto de Levadura 2.5
Fosfato dipotásico 2.5 Glucosa 2.5
L – Cistina 0,375
Anexo 2 Coloración de Gram.
La tinción de Gram. fue descrita en 1884, por el histólogo Danés Chrístian
Gram. Esta tinción esta clasificada como compuesta y diferencial, debido a que
en el proceso se utilizan dos colorantes: el cristal violeta y la fucsina básica, y
dependiendo del colorante que toma la pared, las bacterias se diferencian y
agrupan en dos grandes categorías denominadas; Gram. positivas las que
tiñen con el cristal violeta y Gram. negativas las que toman el color de la
fucsina básica.
En frotis seco y fijo
Adicionar
Cristal violeta y se deja actuar durante 1 minuto (colorante primario).
Lavar
Con agua Aplicar
Lugol y se deja actuar durante 1 minuto
Lavar
Con agua
Aplicar
Alcohol-acetona y se deja actuar durante 1 minuto (decolorante).
Lavar
Con agua
Adicionar
Fucsina básica y se deja actuar durante 1 minuto (colorante de contraste).
Lavar
Con agua
Observar
Bacterias Gram. negativas Bacterias Gram. positivas
Anexo 3
Análisis de Varianza de los resultados de acuerdo al Programa STATISTIX 3.1 ANOVA para cultivos a base de peptonas vegetales contra la biomasa generada por C. chauvoei (%T).
Tabla 10. ONE-WAY AOV para los tratamientos (medio con peptona vegetal) contra transmitancia.
SOURCE DF SS MS F P
BETWEEN 3 0.96550 0.32183 0.55 0.6575
WITHIN 16 9.42000 0.58875 ---- -----
TOTAL 19 10.3855 ------- ---- ----
Componente de varianza entre grupos: -0.05338
Tratamiento/ Peptona vegetal
SignificaciónTamañoMuestral
Desviación estándardel grupo
Freetone A1 1.8000 5 0.5099
Martone K1 1.5400 5 0.3209
Martone L1 2.1200 5 0.7430
Select soytone 2.0000 5 1.2000
3.2 ANOVA para las vacunas formuladas (% de Sobrevivencia) a base de peptonas vegetales contra C. chauvoei.
Tabla 11. ONE-WAY AOV para los tratamientos (medio con peptona vegetal) contra transmitancia.
SOURCE DF SS MS F P
BETWEEN 4 35337.5 8834.38 54.37 0.0000
WITHIN 20 3250.00 162.500 ---- -----
TOTAL 24 38587.5 ------- ---- ----
En al menos un grupo, la varianza es próxima a cero. Componente de varianza entre grupos: 1734.38
Tratamiento/ Peptona vegetal
SignificaciónTamañoMuestral
Desviación estándardel grupo
Freetone A1 97.500 5 5.5902
Martone K1 87.500 5 17.678
Martone L1 100.00 5 0.0000
Select soytone 87.500 5 21.651
Anexo 4
Composición química de algunas peptonas vegetales empleadas en este trabajo.
4.1 Composición de MARTONE K-1 Análisis General
Nitrógeno total (NT) 9.6%
Nitrógeno amino (NA) 3.0%
NA/NT x 100% 31.3%
Ash 10%
pH (5% de solución) 6.5%
Solubilidad clarificar
Ensayo de Aminoácidos Totales mg/g
Alanina 49
Arginina 23
Ácido Aspartico 50
Cistina 10
Acido glutámico 119
Glicina 23
Histidina 11
Isoleucina 28
Leucina 67
Lisina 29
Metionina 13
Fenilalanina 27
Prolina 35
Serina 30
Treonina 27
Triptofano 3
Tirosina 21
Valina 33
Análisis Microbiológico
Recuento en Agar plate Count 3.000/g
Salmonella Negativo
Coliformes <10/g
4.2 Composición de MARTONE L-1 Análisis General
Nitrógeno total (NT) 11.6%
Nitrógeno amino (NA) 2.3%
NA/NT x 100% 20%
Ash 10%
pH (5% de solución) 6.7%
Solubilidad clarificar
Ensayo de Aminoácidos Totales mg/g
Alanina 32
Arginina 26
Ácido Aspartico 41
Cistina 13
Acido glutámico 236
Glicina 30
Histidina 14
Isoleucina 29
Leucina 49
Lisina 28
Metionina 11
Fenilalanina 37
Prolina 74
Serina 35
Treonina 26
Triptofano 5
Tirosina 18
Valina 34
Análisis Microbiológico
Recuento en Agar plate Count 3.000/g
Salmonella Negativo
Coliformes <10/g
4.3 Composición de FREETONE A-1 Análisis General
Nitrógeno total (NT) 12.7%
Nitrógeno amino (NA) 2.8%
NA/NT x 100% 24%
Ash 7%
pH (5% de solución) 7%
Perdida en el secado 5%
Ensayo de Aminoácidos Totales mg/g
Alanina 30
Arginina 43
Ácido Aspártico 60
Cistina 8
Acido glutámico 161
Glicina 27
Histidina 13
Isoleucina 37
Leucina 54
Lisina 38
Metionina 8
Fenilalanina 34
Prolina 45
Serina 32
Treonina 23
Triptófano 4
Tirosina 16
Valina 37
Análisis Microbiológico
Recuento en Agar plate Count 4.000/g máx.
Salmonella Negativo
Coliformes Negativo
4.4 Composición de SELECT SOYTONE Análisis General
Nitrógeno total (NT) 9.2%
Nitrógeno amino (NA) 3.7%
NA/NT x 100% 0.40%
Ash 10.7%
pH (2% de solución) 7%
Perdida en el secado 3.5%
Ensayo de Aminoácidos Totales %
Alanina 3.6
Arginina 2.1
Ácido Aspártico 6.2
Cistina
Acido glutámico 6.9
Glicina 2.2
Histidina 1.3
Isoleucina 2.6
Leucina 3.9
Lisina 3.4
Metionina 0.3
Fenilalanina 2.4
Prolina 2.6
Serina 1.2
Treonina 1.0
Triptófano (Libre) 0.1
Tirosina 0.8
Valina 2.8
