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Evaluación de la respuesta biológica a implante óseo heterólogo hecho en Argentina

A M Fernández Peterson1, C A Ara1 y R R Rodríguez1

1Bioparx, Parque Tecnológico Litoral Centro, Santa Fe, Argentina E-mail: [email protected] Resumen. Se ha desarrollado un implante óseo heterólogo para aplicaciones en neurocirugía. Pruebas físico químicas revelaron que el hueso bovino procesado (HBP) posee la pureza buscada y una resistencia a la compresión suficiente, para la aplicación en neurocirugía. Estos resultados permitieron dar inicio a los ensayos en animales con el fin de evaluar su comportamiento en un medio biológico. Cuatro conejos de raza neozelandesa fueron implantados en la tibia con el HBP y como sitio control se dejó el orificio sin implante. Se los observó durante 12 semanas, y se analizaron radiográficamente. Se analizó su sangre en las semanas 7 y 12 postquirúrgicas. En la semana 12 se sacrificaron todos los conejos extrayendo los segmentos de hueso que contenía el implante y el sitio control. Sobre estos sitios se realizaron los cortes histológicos. El comportamiento y cicatrización de los animales fue normal, al igual que los valores en sangre. En las radiografías no se pudo detectar los implantes, debido a una osificación normal e incorporación total de los mismos. En los cortes histológicos se observó un estado avanzado de regeneración sin signos de rechazo. En contrapartida el sitio control mostró signos claros de fibrosis. En conclusión podemos inferir que el implante efectuado se incorporó a la matriz ósea, generando un proceso de osificación regenerativa activa, con evidencia de signos de reabsorción parcial del implante en el período de prueba y sin rechazo local ni signos clínicos adversos. Se ha dado un paso más para homologar un producto de excelentes propiedades, que favorece la regeneración ósea, para aplicaciones de andamiaje en ingeniería de tejidos. Palabras Claves: Hueso bovino procesado, xenoinjerto, Biocompatibilidad, Ensayo in Vivo, Ingeniería de Tejidos.

1. Introducción Existe una necesidad en el campo de la neurocirugía de contar con biomateriales más amigables con los tejidos biológicos, capaces de incorporarse al cuerpo humano de forma biocompatible y con capacidad de reabsorción. Se estima que en los EE.UU. se realizan aproximadamente unas 500.000 intervenciones anuales en las que se precisa algún tipo de injerto o sustituto óseo. Estas cifras, pese al incremento paulatino en las donaciones de hueso, superan con creces el remanente de hueso homólogo disponible. Por otra parte, la limitada disponibilidad y morbilidad asociada a las técnicas de extracción de injerto óseo autólogo, ha hecho que se considere el desarrollo de nuevos materiales que lo suplan y aporten además todas sus ventajas [1, 2]. Existen implantes de materiales que no tienen su origen en seres vivos, como metales, plásticos y cerámicos. Éstos presentan varias desventajas, ya que están sujetos a la fatiga, fractura, toxicidad y desgaste, y no se remodelan con el tiempo. También es común que se presenten problemas de

XVIII Congreso Argentino de Bioingeniería SABI 2011 - VII Jornadas de Ingeniería Clínica Mar del Plata, 28 al 30 de septiembre de 2011

integración del implante con los tejidos adyacentes, puesto que no pueden adherirse a éste de forma correcta y de esta manera se crean deficiencias de tipo mecánico [3, 4]. Para enfrentar estas dificultades nace la Ingeniería de Tejidos como una opción para restaurar, mantener o mejorar la función de un órgano o tejido, a partir de la manipulación de matrices tridimensionales, las células y factores de crecimiento y diferenciación [5]. Sabiendo que es un mercado emergente se decidió utilizar el hueso bovino procesado (HBP) por un nuevo método que permita purificar el mismo y hacerlo biocompatible y poder utilizarlo cómo implante neuroquirúrgico. El hueso animal sin procesamiento ya no se utiliza más en implantología, ya que genera un inadmisible rechazo en el humano. Sin embargo, a partir del hueso animal, se puede obtener un material con propiedades óptimas para el crecimiento óseo si se lo procesa adecuadamente [6, 7]. Este procesamiento de hueso bovino se investigo, diseñó y desarrollo en Bioparx. El HBP sería el material utilizado para elaborar los implantes para neurocirugía. El HBP mostró resultados satisfactorios desde el punto de vista físico-químico. El procesamiento consiste en la purificación, liofilización y esterilización final por radiación. Anteriormente, se han publicado los resultados de los ensayos mecánicos y determinaciones químicas sobre el hueso bovino procesado. Estos resultados mostraron que el hueso bovino luego del procesamiento adecuado, tiene la composición química buscada y mantiene la resistencia mecánica suficiente para la aplicación como espaciador cervical. Esto es, estructura hidrpoxiapatita-colagénica de alta pureza sin presencia de metales pesados y resistencia a la compresión mayor a 16 MPa [8, 9, 10, 11]. A la vista puede inferirse también la pureza del material, como se muestra en la figura 1. Del análisis por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) se comprobó que la estructura del material, porosidad y tamaño de poros es apropiada (figura 2) para la proliferación osteoblástica. [12, 13, 14] Por lo tanto, dados los resultados positivos del proceso, en esta instancia restaba ensayar, entre otras cosas, el comportamiento en seres vivos del material. El ensayo biológico se realizó para evaluar la capacidad del HBP de no provocar rechazo, de generar nuevo hueso y para evaluar la capacidad de reabsorción del implante (esto es, incorporarse armoniosamente en el proceso de remodelación ósea). Este ensayo daría una prueba fehaciente de que la formulación obtenida luego de procesar el hueso bovino, funciona y complementaría los ensayos de seguridad y eficacia del nuevo producto hechos y publicados anteriormente [8, 15]. Con respecto a los requisitos regulatorios para demostrar la seguridad y eficacia del nuevo producto médico debemos aclarar que el ensayo realizado pretendía evaluar primeramente la biocompatibilidad

Figura 1. Material óseo procesado. Figura 2. MEB del Hueso bovino procesado x 20-longitud barra = 1000 µm.


del HBP, más allá de que en el mismo ensayo podríamos evaluar osteoconducción y regeneración ósea. La Biocompatibilidad de un material de uso médico es un término amplio y para evaluarla es necesario realizar una serie de ensayos que están contemplados en la norma ISO 10993-1 que toma en cuenta la superficie de contacto del material, el tejido en cual se implantará y la duración que permanecerá implantado [15, 16]. Estos ensayos muestras si el material produce citotoxicidad, genotóxicidad, mutagénicidad, hemotoxicidad, hipersensibilidad retardada, sensibilización, reacciones locales a la implantación, toxicidad sistémica, reabsorción [16]. No se conocen ensayos sobre implantes de hueso bovino procesado que hayan mostrado algún grado de toxicidad, previo control eficiente del material fuente y de la contaminación durante el proceso. Sin embargo, gran cantidad de veces, hubo problemas de rechazo debido al deficiente procesamiento del material óseo animal (antigenicidad intrínseca del material fuente) [17,18]. Para evaluar ese eventual rechazo, se realizó un ensayo in vivo que contemple la respuesta local a la implantación, la toxicidad sistémica y la reabsorción. La norma ISO 10993-1 permite hacer juntos estos tres ensayos y además permitiría evaluar la capacidad de osteoconducción del hueso. Para armar el protocolo de ensayo se tuvo en cuenta la parte 6, 11 y 9 de la norma ISO 10993 [16, 19, 20, 21]. El objetivo de este trabajo fue evaluar la respuesta biológica In Vivo del HBP de Bioparx, para determinar la biocompatibilidad, neoformación ósea, osteoconducción y reabsorción del material.

2. Métodos El material ensayado es proveniente de un lote de productos prototipos (unidades de hueso sometido al procesamiento de Bioparx). Este procesamiento consiste en etapas de corte, purificación, liofilizado, envasado y finalmente esterilizado en el Centro Atómico Ezeiza. El valor de composición química del lote quedó dentro de los límites establecido y la dosis de esterilización fue validada para este lote. El ensayo en animales se realizó en un laboratorio independiente (Centro de Experimentaciones Biológicas de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Litoral).

2.1 Muestras Se utilizaron muestras de HBP, procesado según protocolo de Bioparx. A partir de los bloques de HBP, se obtuvieron los implantes especímenes con un tamaño máximo de 2 mm de diámetro x 6 mm de largo. Esta preparación de los implantes especímenes se efectuó en una cabina de seguridad biológica a fin de mantener las condiciones de esterilidad del material.

2.2 Protocolo de Ensayo Se utilizaron 4 conejos machos jóvenes de raza Neocelandesa (CLG), con certificación genética, de aproximadamente 2.5 a 3.0 Kg. Los animales fueron alojados en jaulas individuales por 12 semanas y luego sacrificados.

2.3 Procedimiento de implante

2.3.1 Anestesia de los animales Como pre-anestesia se utilizó Meloxicam (0,3mg/kg S.C.) y Tramadol (1mg/kg S.C.) Posteriormente los animales fueron anestesiados mediante una inyección de Ketamina-Xilacina-Acepromazina por vía intramuscular (2,4 mg/kg de Acepromazina; 48 mg/kg de Ketamina y 5 mg/kg de Xilacina). Adicionalmente se administró la misma formulación por vía endovenosa según dosis-respuesta para el mantenimiento del plano anestésico. Como anestesia adicional se efectuó la aplicación de lidocaína por vía epidural.

2.3.2 Procedimiento quirúrgico Los implantes se efectuaron sobre la tibia. Previa inducción con anestesia general, y antisepsia del campo quirúrgico, se realizó una incisión en piel y tejido subcutáneo en la región cráneo-medial de la


tibia a la altura de su tercio medio. A continuación se realizó la divulsión de los planos más profundos hasta lograr exponer el periostio. Se efectuó la preparación de hueso usando un taladro de baja velocidad con un clavo de Steimann y se perforó intermitentemente hasta lograr un orificio de la medida requerida. Se insertaron los implantes por presión manual, realizando una presión justa, sin forzarlos. Una vez colocado cada implante, se procedió a realizar la síntesis de los planos profundos incididos con material de sutura absorbible y piel con sutura permanente, tomando precauciones de mantener condiciones asépticas. Solo se colocó el implante en uno de los miembros posteriores de cada animal. Como control se hizo un orificio de la forma del implante en una de las patas de los conejos y se lo dejo sin implante.

2.4 Observación de los animales El período de observación de los animales fue de 12 semanas. Diariamente se realizó la observación de la zona de implante (inflamación, edema, cambio de color, etc) así como en el estado general del animal (decaimiento, pérdida del apetito, fiebre, etc).

2.5 Muestras de Sangre: Se realizaron dos extracciones de sangre, la primera a los 7 días de colocado el implante y la segunda al finalizar la experiencia a las 12 semanas. Las muestras de sangre fueron tomadas de la vena central o de la arteria marginal de la oreja, utilizándose una jeringa de 3 ml, 5ml o 10ml con aguja de 0,8 x 40mm.

2.6 Evaluación Macroscópica Se examinó cada sitio de implante con ayuda de una lente de baja magnificación (lupa) previo a la extracción de las muestras histológicas.

2.7 Evaluación Histológica Se extrajo cada implante junto con suficiente tejido circundante sano para permitir la evaluación de la respuesta biológica local. Los porciones de tejido con el implante fueron enviadas al departamento de histología como muestra ciega. Se realizó el procesamiento histológico de rutina hasta la obtención de tacos de parafina. El material fijado en formol al 10 % bufferado fue colocado en ácido nítrico al 5% para su descalcificación, durante 24 horas. Una vez descalcificado, se realizó un corte transversal a la altura de la zona afectada, que se encontraba levemente rugosa. Se deshidrató el material en alcoholes 70º, 96º y 100º, con dos horas de permanencia en cada uno. Se realizó aclaramiento con xilol, durante 2 horas. Luego se incluyó en parafina, colocando el cassette en vasos de precipitado con parafina líquida a 58º, por un período de 2 horas máximo. Se confeccionó el taco, se cortó el material con micrótomo manual para obtener secciones de 5 micrones, que se montaron en portaobjetos con albúmina. Los portaobjetos se secaron en la estufa, y luego se colorearon con la técnica de Hematoxilina y Eosina.

3. Resultados

3.1 Evaluación Macroscópica En la inspección ocular de todos los conejos se observo que en el sitio de implante, sobre la tibia, no se evidenciaron lesiones ni rastros de inflamación en los tejidos circundantes. Este mostró buena osificación, con una superficie levemente rugosa a la palpación. En uno de los conejos, además, se pudieron apreciar zonas hiperémicas leves.

3.2 Análisis de sangre


Todos los valores se encontraron dentro de los de referencia correspondientes a animales controles muestreados periódicamente en Bioterio.

3.3 Técnicas Complementarias Se realizaron técnicas complementarias tales como ecografía y radiografía para evaluar la evolución de los implantes a lo largo del tiempo. Se realizó ecografía del área a los 7 días luego de haber colocado los implantes y solo pudo observarse la inflamación de los tejidos producto de la cirugía. Se realizó radiografía en la semana 8 y no fue posible evidenciar el sitio de implante dado que el mismo seguramente ya había sido reemplazado por tejido óseo de densidad normal.

3.4 Cortes Histológicos 3.4.1. Sitios de prueba En todas las muestras con implantes de prueba se evidenció un engrosamiento de la capa interna del periostio, con gran cantidad de células osteogénicas y neoformación de tejido óseo dentro del implante (figura 3 y 4).

Figura 3. Engrosamiento del periostio (P), con gran cantidad de osteoblastos activos (OA).

Figura 4. Crecimiento de hueso nuevo dentro del injerto óseo. Se observa un área de necrosis de coagulación (N) y tejido óseo compacto (OC), con osteocitos.

En el área central de la médula, se ven células hematopoyéticas entre tejido adiposo. También se observaron restos eosinófilos incorporados en la médula ósea, y entre laminillas óseas, con presencia de osteoclastos activos en la periferia, y en los límites del hueso desordenado. Por debajo de la zona del implante, se evidenció hiperemia y células inflamatorias en la médula ósea, con PMN, eosinófilos, macrófagos y algunas células gigantes multinucleadas (figura 5). Se observaron algunos restos de hueso necrótico, y desorden variable en la estructura del hueso compacto, con canales de Havers y laminillas óseas dilatadas (figura 6).

P OC N

OA


Figura 5. Presencia de osteoclastos activos (OA) en la periferia del hueso.

Figura 6. Restos de hueso necrótico (HN), y desorden en la estructura del hueso compacto.

El endostio se mostró engrosado, con gran cantidad de osteoblastos con núcleos grandes y citoplasmas basófilos, con evidencia de neoformación ósea (figura 7 y 8). No se observó fibrosis.

Figura 7. Engrosamiento del periostio y endostio (E).

Figura 8. Tejido óseo compacto de neoformación, con gran cantidad de laminillas óseas (LO) formando canales de Havers, y mayor ordenamiento entre las mismas.

3.4.1. Sitio de control En el sitio control donde se realizó un orificio sin poner ningún implante se observa engrosamiento del periostio, con tejido fibroso abundante (figura 9). Se evidencia hiperemia y gran cantidad de células inflamatorias en la médula ósea subyacente, con PMN, eosinófilos y macrófagos (figura 10).

E LO

OA

OA

OA

HN


Figura 9. Engrosamiento del periostio, con tejido fibroso abundante (periostio fibrosado PF).

Figura 10. Hiperemia y gran cantidad de células inflamatorias (CI).

4. Discusión El material de injerto por excelencia es el autoinjerto, sin embargo, en muchas ocasiones la cantidad es insuficiente y para aplicaciones de soporte peso, inadecuado. La baja disponibilidad y el inherente riesgo asociado a con el uso de aloinjerto óseo ha permitido varios investigaciones estudiar y desarrollar alternativas de sustitutos óseos, tales como cerámicas de fosfatos de calcio e injertos de hueso animal liofilizado. Muchos xenoinjertos han sido desarrollados, y el procesamiento y los métodos de producción han mejorado. En este estudio hemos usado HBP de Bioparx. La evaluación biológica de un producto médico es parte del proceso de gestión y análisis del riesgo. El ensayo debe ser seleccionado de acuerdo al tipo de contacto que el producto tendrá con el huésped (esto es, superficial, externo o implantable), la naturaleza del lugar en cual será aplicado, y la duración del contacto entre el producto y el huésped [15, 16]. El análisis de las propiedades del material es una práctica común cuando se están adoptando nuevos métodos de producción y se considera en el análisis de productos finales. En algunos casos, estos ensayos podrían evitar el uso de otros ensayos biológicos. El ensayo de implantación es útil para evaluar la respuesta local de un biomaterial. Por ser un ensayo in vivo es también útil para ver la respuesta inmunológica a un material externo al cuerpo. Así, si el material está procesado adecuadamente éste no debería producir ningún tipo de rechazo. Por otro lado en este estudio se puede evaluar la capacidad osteoconductora y reabsorción del material. La Norma ISO 10993-6 sistematiza la elaboración de protocolo de ensayo para esta prueba [19]. El ensayo mostró que, el HBP de Bioparx, no causo rechazo y ayudo a la formación de hueso nuevo, en mejor medida que el sitio control, donde se dejo el orificio sin implante. Por otro lado se observó que existe reabsorción osteoclástica del material, indicando la capacidad del material, en ser reabsorbido y remodelado junto con el hueso necrótico. En el sitio de control se formo un tejido fibroso sin que se produzca neoformación ósea. Esto nos da la pauta de que el injerto colaboro para la formación de nuevo hueso en el defecto óseo en comparación al sitio donde el material no ha sido implantado. La ausencia de rechazo tiene su fundamento en los tipos de células presentes en el sitio de ensayo, las cuales en ningún caso fueron células inmunológicas. Los estudios de toxicidad sistémica evalúan el potencial de efectos adversos de los productos médicos sobre otros tejidos y órganos que aquellos causados en el contacto inicial. Estos ensayos evalúan el efecto que cualquier sustancia liberada por el producto implantable podría tener sobre la salud general del huésped, tal como hígado, corazón, riñones o cerebro.

PF CI


Este ensayo es importante ya que puede haber casos en los cuales el implante no cause efecto local pero si liberar alguna sustancia que provoque una reacción en otro órgano o tejido, lo cual no se podría observar en un ensayo de respuesta local, cómo el ensayo de implantación. La norma ISO 10993-11 ha establecido normas de ensayo internacional sistemático que ha incrementado la seguridad de los productos biomédicos. Los protocolos están basados en clásicas evaluaciones toxicológicas de drogas y otras sustancias químicas. Sin embargo, estos protocolos deberían ser modificados para evaluar componentes sólidos en productos médicos [20, 21]. En el ensayo se tuvo en cuenta esta norma para evaluar los efectos sistémicos fuera de la zona de implante. Una de las observaciones a nivel sistémico fueron los análisis de sangre junto con la observación general de los animales, que mostraron normalidad en todos los casos. Por los tanto consideramos que el producto ensayado en este estudio no mostró ninguna reacción sistémica. Quedan aún por hacer algunas evaluaciones in vitro como de citotoxicidad y genotoxicidad, otras in vivo de sensibilidad e irritación. También alguna prueba de funcionalidad que demuestre la eficacia para cada aplicación. Esto último posiblemente en modelos animales grandes y posteriormente en seres humanos.

5. Conclusiones En base a los resultados obtenidos, podemos inferir que el implante efectuado se incorporó en la matriz ósea, generando un proceso de osificación regenerativa activa, con evidencia de signos de reabsorción parcial del implante en el período de prueba de 12 semanas y sin rechazo local ni signos clínicos adversos. En contraste con esto, el sitio control, mostro signos claros de fibrosis. Este ensayo biológico junto con los ensayos mecánicos anteriormente publicados [8], muestran que el HBP podría implantarse en sitios sometidos a carga mecánica. Esto sugiere que el hueso bovino procesado por Bioparx muestra biocompatibilidad, osteoconducción y capacidad de incorporarse al proceso de remodelación ósea con perspectivas de ser una alternativa de injerto con muchos beneficios para aplicaciones en neurocirugía pero también en traumatología y odontología.

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