evaluación de la especificidad de sustrato con el complejo
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Evaluación de la Especificidad de Sustrato con el Complejo Enzimático de Pleurotus ostreatus
Proyecto de grado
Por
Paula Camila Manrique González
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Departamento de Ingeniería Química
Diciembre 2017
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Evaluación de la Especificidad de Sustrato con el Complejo Enzimático de Pleurotus
ostreatus
Copyright 2017 Paula Camila Manrique González
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Evaluación de la Especificidad de Sustrato con el Complejo Enzimático de Pleurotus
ostreatus
Proyecto de grado
Por
PAULA CAMILA MANRIQUE GONZÁLEZ
Presentado a la Facultad de Ingeniería de la
Universidad de los Andes
En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de
INGENIERA QUÍMICA
Aprobado por:
Asesora, Rocío Sierra Ramírez, PhD.
Coasesor, Juan Sebastián Chiriví Salomón, MSc.
Coasesor, Carla Stephanny Cárdenas Bustos, BSc.
Jurado, Felipe Muñoz Giraldo, PhD.
Director del departamento, Óscar Álvarez Solano, PhD.
Departamento de Ingeniería Química
Diciembre, 2017
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ABSTRACT
The recent increase in industrial activity production has left several environmental problems.
Irreversible damage has resulted by production or disposal of toxic compounds, such as
phenols and their derivatives. White-rot fungi represent a viable alternative for phenol
reduction due to their enzymatic activity. Thus, this research aimed to evaluate the enzymatic
fraction from Pleurotus ostreatus culture as an alternative for the degradation of phenols.
From a 25-days culture of P. ostreatus in rice husk, the enzymatic fraction was collected with
a maximum laccase activity of 15547.38 U L-1. This fraction was used for substrate
specificity evaluation at standard conditions for each tested compound. The phenol and
toluene concentration profiles showed a maximum component degradation after 10 and 14
hours, respectively, by the enzymatic fraction used. However, no significantly statistic
degradation was seen for toluene. No effect was observed for glycerol. Thus, it can be
concluded that the enzymatic fraction is specific for phenol, and the degradation of toluene
can be upgrade by vary factors that affect laccases’ production. For future studies, it expects
to evaluate another type of phenolic compound and conditions for enzymatic fraction.
Key words: degradation, enzymatic activity, enzymatic fraction, glycerol, polluting, phenol,
toluene.
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RESUMEN
El reciente incremento de la actividad en la producción industrial ha dejado varios problemas
ambientales. Se han producido daños irreversibles como resultado de la producción o la
eliminación de compuestos tóxicos, como fenoles y derivados. Los hongos de podredumbre
blanca representan una buena alternativa para la reducción de fenol debido a su actividad
enzimática. Es por eso que esta investigación tuvo como objetivo evaluar la fracción
enzimática del cultivo Pleurotus ostreatus como una alternativa para la degradación de
fenoles. A partir de un cultivo de 25 días de P. ostreatus en cascarilla de arroz, la fracción
rica en enzimas se utilizó para la evaluación de la especificidad del sustrato en condiciones
estándar para cada compuesto probado. En este punto, se registró una concentración final de
15547.38 U L-1, el cual fue el valor más alto encontrado. Los perfiles de concentración de
fenol y tolueno mostraron una degradación máxima del componente después de 10 y 14
horas, respectivamente, por la fracción enzimática utilizada. Sin embargo, no se observó
degradación estadísticamente significativa para el tolueno. No se observó ningún efecto para
el glicerol. De este modo, se puede concluir que la fracción rica en enzimas es específica para
el fenol y se puede potenciar la degradación de tolueno variando los factores que afectan la
producción de lacasas. Es por ello que, para trabajos futuros se espera evaluar otro tipo de
compuestos fenólicos y condiciones de la fracción enzimática.
Palabras claves: actividad enzimática, contaminantes, degradación, fenol, fracción
enzimática, glicerol, tolueno.
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TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 11
2. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 14
2.1 Pleurotus ostreatus ................................................................................................ 14
2.2 Lacasas ................................................................................................................... 14
2.3 Compuestos contaminantes .................................................................................... 15
3. METODOLOGÍA ......................................................................................................... 16
3.1 Microorganismos ................................................................................................... 16
3.2 Medios de cultivo ................................................................................................... 16
3.2.1 Sabouraud con dextrosa y extracto de levadura (SDY, por sus siglas en
inglés) 16
3.2.2 Medio basal .................................................................................................... 16
3.2.3 Preinóculo Pleurotus ostreatus ....................................................................... 16
3.2.4 Pretratamiento del sustrato lignocelulósico .................................................. 17
3.2.5 Medición de la actividad enzimática de lacasa por 2,2'-azino-bis- (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS, por sus siglas en inglés) .................................. 17
3.2.6 Medición de la actividad de la glucosa .......................................................... 17
3.2.7 Medición del contenido de proteína ............................................................... 18
3.3 Métodos analíticos para fenol, tolueno y glicerol .................................................. 18
3.4 Métodos experimentales ........................................................................................ 18
3.4.1 Degradación de fenol ...................................................................................... 18
3.4.2 Degradación de tolueno .................................................................................. 19
3.4.3 Degradación de glicerol .................................................................................. 19
3.5 Actividad enzimática para la interacción entre la fracción rica en enzimas y fenol
19
3.6 Contenido proteico para la interacción entre la fracción rica en enzimas y fenol . 19
3.7 Análisis estadístico ................................................................................................ 20
4. RESULTADOS ............................................................................................................. 21
4.1 Comportamiento de la actividad enzimática y concentración de la glucosa ......... 21
4.2 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el fenol ........................ 22
4.3 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el tolueno .................... 24
4.4 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el glicerol .................... 25
7
4.5 Estudio de la actividad enzimática durante la interacción entre la fracción rica en
enzimas y el fenol ............................................................................................................. 26
4.6 Estudio del contenido de la proteína durante la interacción entre la fracción rica en
enzimas y el fenol ............................................................................................................. 27
5. DISCUSIÓN.................................................................................................................. 29
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 32
7. TRABAJO FUTURO .................................................................................................... 33
8. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 34
9. ANEXOS ....................................................................................................................... 39
8
TABLA DE FIGURAS
Figura 1. Perfil de la actividad enzimática y glucosa libre en el tiempo. ............................. 21
Figura 2. Perfil de concentración de fenol en el tiempo. ...................................................... 22
Figura 3. Perfil de concentración en el tiempo de la fracción rica en enzimas y tolueno. ... 24
Figura 4. Perfil de concentración en el tiempo para glicerol. ............................................... 25
Figura 5. Actividad enzimática en el tiempo para la interacción entre el compuesto fenólico
y la fracción enzimática. ....................................................................................................... 27
Figura 6. Perfil de contenido proteico para las muestras que contienen fenol. Barras de error
cuentan con 3σ. ..................................................................................................................... 28
Figura 7. Velocidad de reacción de las enzimas en función de la temperatura. Tomado de
(Worthington Biochemical Corporation, 1972). .................................................................. 30
9
NOMENCLATURA
m Pendiente de la curva asociada a la absorbancia de cada
muestra
VT Volumen total de la celda
Vm Volumen de la muestra que contiene las lacasas
𝜀 Coeficiente de extinción molar a 436 nm (29.3 nM-1 cm-1)
t Tiempo en minutos
Fd Factor de dilución
U L-1 Unidades de enzima por litro
ABTS Ácido 2-,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
HBT 1- hidroxibenzotriazol
pH Potencial de hidrógeno
T Temperatura
mM Milimolar
µL Microlitro
L Litro
Nm Nanómetros
ppm Partes por millón
10
Min Minutos
g L-1 Gramos por litro (concentración)
SDY Agar Sabouraud y dextrosa suplementado con extracto
de levadura al 1 % (v/v)
σ Desviación estándar
α Nivel de significancia
EPA Agencia de Protección Ambiental
HAP Hidrocarburos aromáticos policíclicos
ANOVA Análisis de varianza
DAD Detector de matriz de diodos
RID Índice de refracción
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1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años, el crecimiento rápido de industrias químicas y petroleras ha
repercudido en el medio ambiente, trayendo consecuencias desfavorables al ecosistema
y la salud pública (Suárez Tamayo & Molina Esquivel, 2014). Junto a este crecimiento,
se ha incrementado la generación de residuos los cuales cuentan con una gran cantidad
de compuestos orgánicos de alto potencial contaminante (Estrada, 2017). Estos traen un
impacto en la contaminación del aire, agua, energía y suelo. Entonces, al aumentar su
uso, también se ha aumentado el riesgo de dispersión en el medio ambiente que afecta
los tejidos y sistemas de órganos debido a su toxicidad; pues estos son fácilmente
absorbidos por animales y seres humanos a través de la piel y membranas mucosas
(Gilala, 2010). Dentro de los contaminantes más comunes se encuentran los compuestos
fenólicos e hidrocarburos como benceno, tolueno y xileno, entre otros. Los anteriores son
usados principalmente para la síntesis química de plásticos, caucho sintético, pinturas,
pigmentos, pesticidas, detergentes, perfumes, explosivos como el ácido pícrico (también
conocido como trinitrofenol) y fármacos (aspirina, antisépticos y anestésicos locales)
(Gilala, 2010). Los niveles de concentración en los que se considera tóxico el fenol
oscilan entre 10-24 mg L-1 para humanos y entre 9-25 mg L-1 para peces (Kaware &
Kulkarni, 2013). Dadas las características fisicoquímicas de los compuestos y al ser muy
resistentes, no pueden ser degradados por plantas de tratamiento que cuentan con sistemas
convencionales.
12
Teniendo en cuenta lo anterior, se han buscado alternativas que mitiguen y reduzcan
dicho impacto. Entre ellas, se encontraron tratamientos alternativos a los convencionales
como procesos avanzados de oxidación (PAO) que generan grandes cantidades de
radicales hidroxilos para degradar materia orgánica (Bayat, Sohrabi, & Javid Royaee,
2012). Sin embargo, este método es usado para contaminantes con muy baja
concentración. Además, los fenoles pueden ser degradados por reacciones abióticas
(Peng, Yuan, Zeng, & Chen, 2015), como catálisis abióticas (ej., birnessita, minerales de
arcilla (Xu, y otros, 2000)) donde se usa buffer para mantener el pH de la reacción
constante. Otro método con el que se cuenta es la biorremediación. Este proceso consta
de un conjunto de tecnologías que pueden utilizar plantas, microrganismos o enzimas
para degradar contaminantes del medio ambiente (Morelli, Coppotelli, & Del Panno,
2015). Dentro de los otros mecanismos que existen, se encuentra la adsorción de carbón
activado, degradación fotocatalítica y oxidación electroquímica (Bayat, Sohrabi, & Javid
Royaee, 2012).
Hoy en día se cuenta con un proceso de biodegradación donde intervienen un gran
número de enzimas lignolíticas secretadas por diferentes tipos de organismos como
hongos de podredumbre blanca, el cual es el centro de esta investigación. Entre las
mencionadas enzimas se encuentra la lacasa, que es capaz de catalizar la oxidación de
fenoles y polifenoles. Al mismo tiempo, en presencia de mediadores adecuados, la lacasa
es capaz de oxidar hidrocarburos aromáticos (Rubio-Clemente, Chica, & Peñuela, 2014).
Es por ello que, el objetivo de esta investigación es estudiar la aplicación del extracto rico
en enzimas, producto del pretratamiento del hongo Pleurotus ostreatus, en la degradación
13
de distintos compuestos dentro de los que se encuentran contaminantes como algunos
compuestos fenólicos, por ejemplo, el fenol; y compuestos no contaminantes como
alcoholes. Gracias a que las lacasas realizan la oxidación de un solo electrón de sustratos,
como fenoles y aminas alifáticas o aromáticas, a los radicales correspondientes a
expensas del oxígeno molecular (Jeon & Chan, 2013), surge la idea de estudiar no sólo
el fenol, sino compuestos como el tolueno y glicerol.
14
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Pleurotus ostreatus
Pleurotus (Basidiomycota: Agaricales) es un género de hongos saprofíticos que crecen
en el suelo donde colonizan principalmente los horizontes superficiales (Cerniglia, 2007).
Pleurotus ostreatus es el segundo hongo comestible más estudiado y cultivado en todo el
mundo después de Agaricus bisporus, por su facilidad de cultivo y su calidad nutricional
(Pal, Bollag, & Huang, 1994). Los hongos comestibles son capaces de colonizar y
degradar una gran variedad de sustratos lignocelulósicos, gracias a que expresan el
sistema ligninolítico durante su fase de crecimiento. Además, son capaces de secretar
enzimas ligninolíticas implicadas en la biorremediación, esta capacidad de crecer en
suelos contaminados es una de las grandes ventajas de esta especie (WHO: World Health
Organization, 1994). Entonces, los hongos crecen convirtiendo un alto porcentaje del
sustrato en cuerpos fructíferos, aumentando la rentabilidad.
2.2 Lacasas
La lacasa pertenece a la familia de las oxidasas que contienen cobre, es capaz de catalizar
la oxidación de un substrato orgánico o inorgánico como fenoles, polifenoles y anilinas,
que se dispersan en gran medida en plantas, hongos y bacterias superiores (Peng, Yuan,
Zeng, & Chen, 2015). Este tipo de enzimas tienen cuatro cobres por enzima, que
representa tres tipos diferentes, y consecuentemente, cada tipo tiene un papel diferente
en la oxidación de sustratos de lacasa.
El interés de la lacasa ha aumentado en los últimos años debido a su capacidad de oxidar
una variedad de compuestos xenobióticos en presencia de mediadores redox sintéticos o
15
naturales. Gracias a la capacidad de oxidación que tienen estas enzimas, se puede
observar numerosas aplicaciones biotecnológicas que implican la oxidación de
compuestos de lignina no fenólicos y la destoxificación de diversos contaminantes del
medio ambiente (Rodriguez, Nuero, Guillén , Martínez, & Martínez, 2004). Además,
puede ser útil en el diseño de biosensores y nanotecnología (Martens & Zadrazil, 1998).
Así como en la decoloración y desintoxicación de efluentes industriales y en el
tratamiento de aguas residuales (López, Hernández, Suárez, & Borrero, 2008).
Dentro de las aplicaciones de las mismas, en un estudio realizado en Viena, Austria, se
encontró que las lacasas producidas por Ganoderma lucidum, pueden degradar antraceno
completamente con o sin un mediador redox (HBT 2mM). La enzima puede también
degradar benzopireno, flúor, acenafteno, acenaftileno y benzo[a]antraceno en altos (>
80%) y mediamos (> 60%) niveles de degradación cuando el mediador redox está o no
presente (Punnapayak, Prasongsuk, Messner, Danmek, & Lotrakul, 2009).
2.3 Compuestos contaminantes
Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) constituyen una de las clases más
ubicuas de contaminantes aromáticos, se forman por combustión incompleta de materia
orgánica en madera y petróleo. Muchos HAP son mutagénicos, carcinógenos y se
bioconcentran a través de cadenas tróficas (Tavares, Coelho, Agapito, & Coutinho,
2006). Por ejemplo, clorofenoles han sido ampliamente usados en plaguicidas, herbicidas
y conservantes de madera. Han sido considerados como los principales componentes
tóxicos de los efluentes de planta de blanqueo de celulosa (Upadhyay, Shrivastava, &
Agrawal, 2016). Debido al uso a gran escala de estas especies, se ha llegado a una gran
contaminación de ecosistemas terrestres y acuáticos.
16
3. METODOLOGÍA
3.1 Microorganismos
Pleurotus ostreaus fue proporcionado por el laboratorio del Grupo de Diseño de Procesos
y Productos (GDPP) del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los
Andes. La cepa del hongo se mantuvo en un subcultivo en agar extracto de malta (AM)
a 25 °C y se conservó por la técnica de micelio deshidratado en papel filtro.
3.2 Medios de cultivo
3.2.1 Sabouraud con dextrosa y extracto de levadura (SDY, por sus siglas en inglés)
Se agregaron 2 g L-1 de glucosa, 0.5 g L-1 de peptona y 0.5 g L-1 de levadura en un
frasco tapa rosca azul.
3.2.2 Medio basal
Se realizó un medio de sales con la siguiente composición: 0.5 g L-1 de glucosa, 2 g
L-1 KH2PO4, 0.25 g L-1 MgSO47H2O, 0.9 g L-1 (NH4)SO4, 0.1 g L-1 CaCl2, 0.5 g L-1
KCl, 0.5 g L-1 tiamina, 2.1 g L-1 ácido cítrico y 2.94 g L-1 citrato de sodio dihidratado
en 1 L a agitación constante. Se ajustó el pH a 4.5 con hidróxido de sodio (NaOH) o
ácido clorhídrico (HCl). Posteriormente, se esterilizó y se almacenó en una nevera a
4 °C.
3.2.3 Preinóculo Pleurotus ostreatus
En tubos de ensayo, se adicionó 5 mL de SDY estéril y 15 plugs del micelio de la
cepa. Se inocularon por 5 días en oscuridad a 25 °C.
17
3.2.4 Pretratamiento del sustrato lignocelulósico
Se añadió 26.5 g de cascarillas de arroz molida, la cual fue esterilizada con dos ciclos
de autoclave. El primero de 1 h y, el segundo, por media hora para reducir
contaminación en los montajes. Se adicionaron 87.5 mL de medio basal y el
preinóculo de Pleurotus ostreatus. Luego, se incubaron las muestras a 25 °C con
fotoperiocidad de 12 h por 25 días. A los 5 días de incubación se agregó 475 μL de
sulfato de cobre CuSO4 1 M.
3.2.5 Medición de la actividad enzimática de lacasa por 2,2'-azino-bis- (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS, por sus siglas en inglés)
Se tomaron 50 µL de muestra que contiene la enzima, 950 µL de ABTS 1 mM en
buffer acetato 20 mM, con un pH de 4.5 y se realizaron anotaciones de actividad cada
minuto durante 10 minutos, leyendo la absorbancia en un espectrofotómetro UV-VIS
a 436 nm.
La actividad enzimática se obtuvo por medio de la siguiente ecuación:
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 =𝑚 ∗ 𝑉𝑇 ∗ 𝐹𝑑
𝑡 ∗ 𝜀 ∗ 𝜆 ∗ 𝑉𝑚
Ecuación 1. Cálculo de actividad enzimática.
3.2.6 Medición de la actividad de la glucosa
Para determinar la cantidad de glucosa en cada muestra, se utilizó el kit de glucosa
(Spinreact).
Los resultados de la concentración se obtuvieron con la siguiente ecuación:
18
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 [𝑚𝑔/𝑑𝐿] =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛∗ 100
Ecuación 2. Cálculo de concentración de glucosa.
3.2.7 Medición del contenido de proteína
Se utilizó el kit de ensayo de proteínas (Pierce BCA).
3.3 Métodos analíticos para fenol, tolueno y glicerol
Para medir el fenol y glicerol, primero se elaboró una curva de calibración de los
mismos. Para el tolueno, se efectuó una curva de calibración entre la fracción rica en
enzimas y el compuesto (ver Anexo I). Posteriormente, se hizo una solución madre
200 ppm para el respectivo compuesto a analizar y una solución total que cuenta con
6 mL de extracto enzimático y 12 mL de buffer de acetato (20 mM). De la solución
total se tomaron 2 mL y 1.2 mL de la solución madre. Las muestras compuesto-
complejo enzimático fueron filtradas a través de una membrana de 0.22 µm y se
incubaron en un período de 24 h, donde se hicieron mediciones desde el tiempo 0
cada 2 h.
3.4 Métodos experimentales
3.4.1 Degradación de fenol
La cuantificación de la degradación del compuesto fenólico se ejecutó por
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, por sus siglas en inglés) usando la
columna Zorbax Eclipse Plus C18 a una velocidad de flujo de 1 mL min-1 con fase
móvil de acetonitrilo-agua (40:60). Los compuestos de elución se detectaron por un
detector de matriz de diodos UV (DAD, por sus siglas en inglés). La temperatura de
la columna fue de 30 °C con un tiempo de retención para el fenol de 2.20 min. A
pesar de encontrar que a 42 °C, la degradación de los compuestos fenólicos tiene
19
mayor porcentaje de degradación (Estrada, 2017), se encontró que el HPLC observa
a 30 °C el compuesto fenólico de forma óptima (Gilala, 2010).
3.4.2 Degradación de tolueno
Para el análisis de la degradación del tolueno, se usó el método de espectrofotometría.
Las muestras se midieron respecto al blanco (agua). Dichas disoluciones se estudiaron
a una longitud de onda de 360 nm. Como se empleó el blanco como agua, el perfil
observado fue la interacción entre las enzimas y el compuesto estudiado, tolueno.
3.4.3 Degradación de glicerol
La disolución madre de glicerol 200 ppm y disolución total se analizó con un sistema
de cromatografía equipado con un controlador de gradiente, una bomba, un inyector
automático y dos columnas Aminex HPX-87H conectadas en serie (HPLC). La
temperatura de la columna fue de 55 °C. Las muestras se eluyeron con ácido sulfúrico
5 mM a una velocidad de flujo de 0.6 mL min-1. Los compuestos de elución se
detectaron mediante un detector de índice de refracción (RID, por sus siglas en inglés)
a un tiempo de retención de 13.3 min.
3.5 Actividad enzimática para la interacción entre la fracción rica en enzimas y
fenol
Se desarrolló el mismo procedimiento mencionado en la sección 3.2.5, a diferencia
de la muestra. Para este caso, se contó con 13 muestras, las cuales fueron dispuestas
con 2 mL de solución total (buffer acetato-extracto enzimático) y 1.2 mL de solución
madre (fenol 200 ppm) a los distintos tiempos de interacción entre sí.
3.6 Contenido proteico para la interacción entre la fracción rica en enzimas y fenol
Para cuantificar la proteína total de la muestra, se empleó el kit de ensayo de proteínas
Pierce BCA.
20
3.7 Análisis estadístico
Se evaluaron las diferencias estadísticas entre el factor compuesto. Para esto, se contó
con 48 experimentos divididos entre 3 compuestos (fenol, tolueno y glicerol).
Además, se evaluó el factor de tiempo para los mismos compuestos. En este caso, se
hizo toma de datos cada 2 h durante 24 h para un total de 13 tiempos con el fin de
tener el cambio de la concentración del compuesto de interés en función del tiempo.
Pero, para el caso del glicerol, se elaboró la toma de datos para 8 tiempos distintos,
desde 0 a 12 h y 24 h. Cada experimento se hizo por triplicado. Se desarrolló un diseño
ANOVA one way con la ayuda de Minitab donde se evaluó la significancia de la
concentración entre los distintos tiempos. El nivel de significancia estadístico fue
determinado para un valor de p = 5%. Además, en la medición de la actividad
enzimática y glucosa libre, se tuvo 30 mediciones para cada una y para la interacción
entre el fenol y las enzimas. Se construyó el análisis de varianza evaluando las
hipótesis (ver Anexo II). Además, se aseguró que el modelo cumpliera con los
supuestos de homocedasticidad y normalidad (ver hipótesis en Anexo III y Anexo
IV).
21
4. RESULTADOS
4.1 Comportamiento de la actividad enzimática y concentración de la glucosa
Figura 1. Perfil de la actividad enzimática y glucosa libre en el tiempo.
Como se observa en la Figura 1, donde se puede apreciar que la concentración de glucosa
es inversamente proporcional a la actividad enzimática. La va concentración de glucosa
a lo largo del tiempo presenta una disminución progresiva los primeros días, hasta que
logra estabilizarse a un valor de 0.75 ± 0.082 g L-1 y alcanza un mínimo de 0.57 ± 0.016
g L-1. Así pues, la glucosa tiene un descenso cerca del 90 %, dado que Pleurotus ostreatus
la utiliza como fuente de carbono. Asimismo, se observa que en el día 25 se tiene la
máxima actividad enzimática con un valor de 15547.38 U L-1. Este resultado coincide
con la menor concentración de glucosa en las muestras. Para el día 10 se realizó una
dilución de la muestra con un factor de 1:3 (muestra-agua destilada) con el fin de
mantener la absorbancia inferior a 2. Además, se puede decir que la desviación estándar
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
6 10 13 17 21 25
Glu
cosa
lib
re [
g L-1
]
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
[U L
-1]
Tiempo [días]
Actividad enzimas Glucosa
22
de la actividad enzimática es poco significativa si se compara con el perfil de
concentración de glucosa libre, al poseer un error pequeño.
4.2 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el fenol
En un estudio realizado por Peng, y otros se demostró que las lacasas en presencia de
mediadores adecuados son capaces de oxidar una gama considerablemente mayor de
compuestos, tales como los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Dentro de los
mediadores conocidos se encuentran el ABTS y el ácido violúrico (Xu, y otros, 2000).
En este sentido, gracias a la gran actividad enzimática que presentan las muestras con
ABTS al final del tiempo de estudio, se evaluó la capacidad de la lacasa en la degradación
de compuestos fenólicos e hidrocarburos aromáticos como el fenol y tolueno.
Figura 2. Perfil de concentración de fenol en el tiempo.
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 5 10 15 20
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]
Muestra Control negativo
23
En la Figura 2 se aprecia que el control negativo se mantiene, aproximadamente
contante a lo largo del tiempo. Lo anterior implica que no hay un agente externo que
ayude a la disminución en la concentración a lo largo del tiempo. Agente externo tales
como la temperatura, pH o desorción por equilibrio de fases.
Para el caso de las muestras que contienen extracto enzimático-fenol, se observa un
decrecimiento en la concentración de las mismas en el tiempo. Esta disminución de
la curva de las muestras demuestra que las enzimas secretadas por P. ostreatus están
actuando y ayudando a la reducción en la concentración de fenol. Sin embargo,
cuando se estabiliza se observa que la concentración oscila en 50 ± 2.96 ppm.
Una alternativa para observar la degradación del compuesto en el tiempo de forma
cualitativa es comparando el porcentaje de degradación en cada tiempo (ver Anexo
VI). Allí se puede ver que a partir de 14 h el porcentaje no cambia significativamente
(p<0,05). Entonces, se encuentra que el fenol fue degradado en un 73.6%.
En el Anexo III se encuentran los resultados arrojados por Minitab, con los que se
concluye existe evidencia estadística suficiente para rechazar la hipótesis nula y
afirmar que al menos un par de medias son diferentes, puesto que el p-valor es menor
a la significancia (0.05). Ahora bien, se revisa que los supuestos del análisis de
varianza se cumplan con el fin de dar veracidad a lo logrado. En el Anexo IV se tienen
las gráficas de residuo, en la cual se tiene que no existe aleatoriedad en los residuos,
ya que el factor tiempo fue una variable controlada durante la experimentación.
Para los supuestos de homocedasticidad y normalidad, se tiene que los p-valores son
mayores al nivel de significancia, entonces se puede afirmar que no hay suficiente
evidencia estadística para rechazar la hipótesis nula y, por lo tanto, se puede
24
considerar que las varianzas son iguales para la homocedasticidad. Para normalidad,
no hay suficiente evidencia estadística para decir que los residuos no tienen una
distribución normal. De esta forma, se afirma que los supuestos de homocedasticidad
y normalidad se cumplen.
Entonces, resulta útil revisar la prueba de comparación de Fisher con el fin de conocer
cuáles medias no son iguales, una vez se han comprobado los supuestos del sistema.
En esta prueba se tiene que, a 10 h y 12 h no se tiene una diferencia significativa, es
decir, la concentración en esos tiempos pasa de 63 ppm a 62 ppm respectivamente.
Por lo cual, no se tiene un cambio característico de la degradación del fenol luego de
10 h.
4.3 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el tolueno
Figura 3. Perfil de concentración en el tiempo de la fracción rica en enzimas y tolueno.
25
En la Figura 3, se muestra que la concentración de tolueno va disminuyendo en el
tiempo como sucede con el fenol en la sección anterior. Sin embargo, en este caso no
es posible conocer la concentración del compuesto de interés individualmente, puesto
que el blanco no contiene la fracción rica en enzimas para ser restado de los valores
recopilados. A su vez, cualitativamente se observa que la concentración luego de 14 h
de interacción no presenta una diferencia significativa entre sí, al tener una
concentración media de 52.39 ppm. La concentración en el tiempo final (24 h) respecto
a al tiempo inicial (0 h), tiene una disminución cerca del 3 %. Lo anterior también se
puede observar en el Anexo XII. Así pues, se puede afirmar que las lacasas no
contribuyen considerablemente a la reducción del tolueno, pues se esperaba tener una
menor concentración final, a pesar de evaluar la concentración total de la muestra.
4.4 Evaluación del perfil de concentración en el tiempo para el glicerol
Figura 4. Perfil de concentración en el tiempo para glicerol.
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4 6 8 10 12 24
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]
26
Como se observa en la Figura 4, el comportamiento del glicerol en el tiempo no
presenta una reducción de la concentración en el tiempo. A pesar de ello, se puede
apreciar que la disolución fracción enzimática-glicerol presenta un comportamiento
aproximadamente constante en el tiempo, lo cual demuestra que las enzimas están
ayudando a la estabilidad de las mismas muestras. Sin embargo, al no tener el
comportamiento esperado, se puede afirmar que existe un agente externo que altera
la concentración de las mismas. Dentro de los factores que pueden estar alterando la
concentración está la temperatura, pH y propiedades de la especie.
4.5 Estudio de la actividad enzimática durante la interacción entre la fracción
rica en enzimas y el fenol
En la Figura 5 se observa que, una vez se pone a interactuar las enzimas con el
compuesto, la actividad de las mismas no presenta un cambio representativo en el
tiempo, por lo que se puede afirmar que las condiciones de operación del proceso no
afectan a la colonia de dichas moléculas y, el buffer de acetato ayuda a la estabilidad
de la enzima. No obstante, luego de 10 h la actividad comienza a decrecer cerca del
50 % hasta 16 h. El anterior comportamiento se presenta posteriormente para las horas
de 18 h a 22 h. Para el final del tiempo estudiado (24 h), se observa un aumento de
más del 50 % en la actividad entre las enzimas y el compuesto fenólico.
27
Figura 5. Actividad enzimática en el tiempo para la interacción entre el compuesto fenólico
y la fracción enzimática.
Lo anterior se puede explicar porque puede existir una competencia de sustrato por
parte de la lacasa con el fenol y el ABTS, ya que en las Figura 2 y Figura 5 se aprecia
que a medida que se acaba el sustrato (fenol), la actividad de las lacasas se favorece
al estar en presencia del mediador (ABTS).
4.6 Estudio del contenido de la proteína durante la interacción entre la fracción
rica en enzimas y el fenol
Se realizó la curva de calibración propuesta por el kit (ver Anexo XIV). Luego, con
la regresión lineal se encontró la concentración de las muestras en los distintos
tiempos (Anexo XV).
Adicionalmente, se realiza una prueba Q (en inglés, Q-test) con el fin de evaluar
valores atípicos estadísticos en los datos a 14 h y 20 h. Para ello, se utiliza la siguiente
ecuación:
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
-1 4 9 14 19 24
Act
ivid
ad e
nzi
mát
ica
[U L
-1]
Tiempo [h]
28
𝑄𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎 =𝐷𝑖𝑣𝑒𝑟𝑔𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎
𝑅𝑎𝑛𝑔𝑜
Ecuación 3. Cálculo Q-test.
Donde la divergencia es de 507.41 (para ambos tiempos) y el rango de 773.80,
obteniendo un valor de Qcalculada de 0.66. Dado que se tienen 12 observaciones, el
valor de Qtabulada es de 0.38 (ver Anexo XVI). Como Qcalculada>Qtabulada, entonces se
considera que la concentración a 14 h y 20 h son valores atípicos. De esta forma, se
logra el siguiente perfil del contenido proteico en las muestras de fenol.
Figura 6. Perfil de contenido proteico para las muestras que contienen fenol. Barras de
error cuentan con 3σ.
En la Figura 6, se tiene que el contenido proteico no disminuye sustancialmente hasta
12 h. Después de ese tiempo, el contenido de proteína en las muestras oscila entre 0.8
y 1.2. En el tiempo final, la variación de la proteína en la muestra respecto al tiempo
inicial no es representativo, pues hubo una disminución de alrededor 16 %.
1000
1050
1100
1150
1200
1250
1300
1350
0 5 10 15 20
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]
29
5. DISCUSIÓN
Se evidenció que el extracto enzimático es específico para el fenol, y este es
considerado un contaminante de vigilancia prioritaria para países como Estados Unidos
debido a su toxicidad. La Agencia de Protección Ambiental (EPA, por sus siglas en
inglés) lo ha clasificado en el listado U (U188) como un residuo tóxico de vigilancia
ambiental (Environmental Protection Agency (EPA), 2015). En países como Hong
Kong, el Departamento de Protección Ambiental (EPD, por sus siglas en inglés)
estableció para el año 2008 el límite permisible en el alcantarillado de 0.5 a 0.9 µg L-1
(Kueh & Lam, 2008). De manera que, si se potencializa el efecto de las lacasas, en un
efluente industrial que contiene una concentración de 200 ppm se puede poner a
interactuar con las enzimas para así cumplir con la resolución 0631 de 2015 del
ministerio de ambiente en el que el máximo vertimiento puntual a cuerpos de aguas
superficiales es de 0.2 ppm (MINISTERIO DE AMBIENTE Y DESARROLLO
SOSTENIBLE, 2015), lo cual traería beneficios favorables a la industria y el medio
ambiente.
Como los resultados no fueron competentemente congruentes para el caso de tolueno,
al no contar con suficiente porcentaje de degradación, y no se contó con un porcentaje
significativo para el glicerol, se encontró que factores como la temperatura, pH,
mediadores y bioestimulación afectan la actividad de las lacasa (Díaz, y otros, 2011),
lo que conlleva a una menor eficiencia de la degradación de los sustratos. La
temperatura es un factor que afecta la el crecimiento e influye en los cambios
estructurales y químicos de los hidrocarburos (Atlas & Bartha, 2005). Incluso a
30
temperaturas moderadas o congeladas, las enzimas pierden su actividad (Worthington
Biochemical Corporation, 1972).
Figura 7. Velocidad de reacción de las enzimas en función de la temperatura. Tomado de
(Worthington Biochemical Corporation, 1972).
En la Figura 7, se observa cómo varía la velocidad de reacción de las enzimas en
función de la temperatura, por lo que el almacenamiento y la temperatura a la cual se
hacen las muestras es fundamental y va a ser un factor influyente en el perfil de
concentración de los distintos sustratos. Es por ello que, la temperatura a la cual se
estudia la degradación del fenol es a 30 ºC, pues a esta temperatura la penetración del
fenol a la célula es más eficaz (Polymenakou & Stephanou, 2005).
En cuanto al pH, este afecta a los microorganismos y sus enzimas, influyendo en la
disociación como la solubilidad de diversas moléculas y en la disponibilidad de
31
nutrientes (Atlas & Bartha, 2005). Para hidrocarburos como el fenol, se ha reportado
que el rango de degradación óptimo se encuentra cercano a la neutralidad (6.0 – 8.0)
(Luo, Zhang, Wang, & Qian, 2005). En la bioestimulación, es decir, adición de
nutrientes a concentraciones aprovechables estequiométricamente a una relación
adecuada de carbono:nitrógeno:fósforo (C:N:P), se puede generar un aumento en el
crecimiento de diferentes poblaciones microbianas y degradación de diferentes
compuestos (Piskonen, Kapanen, Mansikka, & Rytkonen, 2002). Para la degradación
del fenol se reporta que las relaciones óptimas de C:N:P son 100:10:2 y 100:10:1
(Ahumada & Gómez, 2009).
En la investigación realizada por parte de Rodríguez et al. se demuestra que para
incrementar la degradación de compuestos fenólicos y no fenólicos por parte de
Pleurotus, se debe tener la presencia de mediadores como ABTS o 1-
hidroxibenzotriazol (HBT, por sus siglas en inglés), los cuales ayudan a la degradación
de hasta el 95 % luego de 6 h (López-Rodríguez, Hernández-Corredor, Suárez-Franco,
& Borrero, 2008). Lacasas sin la presencia de mediadores, oxida cerca del 50 % de
fenol y alrededor del 4 % del tolueno. Por lo que, la suplementación de un mediador
redox (ABTS o HBT) a la solución de reacción puede aumentar la degradación de los
compuestos en un 30 %, aproximadamente.
32
6. CONCLUSIONES
Se concluyó que la actividad enzimática de Pleurotus ostreatus es alta a 24 h al lograr
una actividad de 8639.29 U L-1, por lo que se pudo demostrar la degradación de
compuestos contaminantes y tóxicos para el medio ambiente. Asimismo, se afirmó que
la cepa luego de 15 días libera alrededor de 90 % de glucosa del sustrato por lo que no
toda es usada como fuente de carbono.
Asimismo, se pudo concluir que el extracto enzimático producto del cultivo de Pleurotus
ostreatus es específico para el fenol al observarse que el sustrato se degradó en un 70 %,
aproximadamente, en el tiempo realizado hasta 10 h. Luego de este tiempo, no hubo
diferencia considerable de la concentración. Para el sustrato de tolueno, se evidenció
potencial de degradación por parte de las enzimas, ya que se obtuvo un máximo
porcentaje de degradación de 30%. Pero existen factores que pueden ayudar a aumentar
el porcentaje de degradación en el tiempo. Adicionalmente, se demostró que la fracción
rica en enzimas no es específica para el glicerol al no tener degradación significativa en
el tiempo en comparación con el fenol.
Se encontró que hay factores externos que pueden alterar la degradación de los
compuestos tales como temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes, los cuales pueden
aumentar o reducir la actividad de las lacasas y a su vez, la concentración del sustrato en
el tiempo. En la mayoría de los casos, los mediadores tienen grandes beneficios para
promover la degradación. De igual modo, la adición de residuos agroindustriales es una
práctica muy utilizada en estrategias de biorremediación para potenciar el crecimiento de
la cepa y favorecer la degradación de contaminantes en el suelo y desechos industriales.
33
Finalmente, se puede afirmar que las enzimas producidas por Pleurotus ostreatus
contribuyen con la degradación de compuestos que poseen bencenos unidos con radicales
hidroxilo y metilo, como es el caso del fenol y tolueno respectivamente. No obstante, no
favorece la degradación de grupos de hidroxilos como el glicerol. Por lo tanto, se pudo
concluir que la biodegradación con enzimas producto del pretratamiento de Pleurotus
ostreatus es una buena opción para degradar o eliminar contaminantes de una manera
amigable con el medio ambiente.
7. TRABAJO FUTURO
Se propone evaluar otro tipo de compuestos fenólicos, pues se evidenció que con los
compuestos que contienen un benceno, las enzimas de P. ostreatus sí tienen efecto
significativo. Además, resulta interesante conocer si las enzimas descomponen el analito
en monómeros del mismo o se producen otro tipo de compuestos durante la interacción
entre los protagonistas del sistema. Así como evaluar la temperatura y pH de la fracción
rica en enzimas.
34
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39
9. ANEXOS
Anexo I. Curva de calibración para el tolueno por espectrofotometría.
Anexo II. Hipótesis para el análisis de varianza.
Anexo III. Hipótesis para el supuesto de homocedasticidad.
Anexo IV. Hipótesis para el supuesto de normalidad con prueba Anderson Darling.
y = 0,9538x - 1E-04R² = 0,9956
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Ab
sorb
anci
a
Concentración [ppm]
Hipótesis nula
Hipótesis alterna
Hipótesis nula
Hipótesis alterna
Hipótesis nula
Hipótesis alterna
40
Anexo V. Perfil de concentración de fenol en el tiempo por triplicado.
Anexo VI. Porcentaje de degradación de fenol en el tiempo.
Tiempo [h] Degradación
0 45.3%
2 54.6%
4 60.2%
6 63.3%
8 66.1%
10 68.6%
12 70.8%
14 74%
16 74%
18 73%
20 73%
22 74%
24 73.6%
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]
Muestras Control negativo
41
Anexo VII. Resultados estadísticos ANOVA con la ayuda de Minitab.
42
Anexo VIII. Gráfica de residuos y supuestos con la ayuda de Minitab.
Anexo IX. Resultado del supuesto de homocedasticidad con ayuda de Minitab.
43
Anexo X. Prueba de Anderson Darling para el supuesto de normalidad con Minitab.
44
Anexo XI. Resultados estadísticos para la prueba de Fisher con la ayuda de Minitab.
Anexo XII. Porcentaje de degradación de la disolución fracción enzimática y tolueno en el
tiempo.
Tiempo [h] Degradación
0 -
2 1.31%
4 2.47%
6 2.96%
8 3.32%
10 4.27%
12 3.62%
14 3.88%
16 4.16%
18 3.04%
20 3.19%
22 4.50%
24 2.62%
45
Anexo XIII. Perfil de concentración en el tiempo para glicerol por triplicado.
Anexo XIV. Curva de calibración para la cuantificación de proteína.
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]
Muestras Control negativo
y = 1,0273x + 0,0443R² = 0,9924
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,5 1 1,5 2
Ab
sorb
anci
a
Concentración [ppm]
46
Anexo XV. Perfil de contenido proteico para las muestras que contienen fenol.
Anexo XVI. Valores de Q para el rechazo de datos.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 5 10 15 20
Co
nce
ntr
ació
n [
pp
m]
Tiempo [h]