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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DEL EXTRACTO TOTAL Y SUS FRACCIONES
OBTENIDAS DE LA ESPECIE VEGETAL Senna reticulata
PAULA CATALINA MORALES CASAS
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de
Microbióloga
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS- PROGRAMA DE PREGRADO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA- GRUPO DE INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA
(GIFUJ)
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
2017
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE A PARTIR DEL EXTRACTO TOTAL Y SUS FRACCIONES
OBTENIDAS DE LA ESPECIE VEGETAL Senna reticulata
PAULA CATALINA MORALES CASAS
_________________________
Dra. Concepción Puerta, PhD
Decana académica
Facultad de Ciencias
_________________________
Dra. Marcela Franco Correa, PhD
Directora de Carrera
Carrera Microbiología Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ D.C
2017
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DEL EXTRACTO TOTAL Y SUS FRACCIONES
OBTENIDAS DE LA ESPECIE VEGETAL Senna reticulata
_________________________
Luis Gonzalo Sequeda, MsC, cPhD
Director trabajo
Facultad de Ciencias
_________________________
Gloria Carolina Numpaque, MsC
Codirector
Facultad de Ciencias
_________________________
Jorge Robles, PhD
Par Evaluador
Facultad de Ciencias
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Junio de 1946
"La universidad no se hace responsable de los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus proyectos de grado. Sólo velará porque no se publique nada contrario al
dogma y la moral católica y porque los trabajos no contengan ataques o polémicas
puramente personales. Antes bien, que se vea en ellos el anhelo de buscar la
verdad y la justicia".
Reglamento de la Pontificia Universidad Javeriana
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por regalarme la fortaleza para culminar mis estudios. A mis padres por
brindarme su apoyo incondicional, guiarme en el camino, por su amor incondicional
y sus enseñanzas.
A mis amigas Lorena Romero y Gabriela Toro que me han apoyado y colaborado
durante todo este proceso.
A todas las personas que indirectamente hicieron parte de este proceso.
Al grupo de investigación de fitoquímica y al centro de investigaciones odontológicas
de la Pontificia Universidad Javeriana por abrir sus puertas y permitir la realización
de este estudio.
A mi director de trabajo de grado Luis Gonzalo Sequeda Castañeda y a mi
Codirectora Gloria Carolina Numpaque por sus enseñanzas, su paciencia y su
apoyo en esta investigación.
A Camila Muñoz Realpe por su amistad, por su colaboración, por lo vivido juntas y
por las enseñanzas.
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TABLA DE CONTENIDO
Pág
RESUMEN………………………………………………………………………………..12
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………..13
2. PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN…………………………………………………..15
3. MARCOTEÓRICO…………………………………………………………………..17
3.1 PLANTAS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA………………………..……17
3.1.1 PLANTAS DE LA FAMILIA Fabaceae…………………………………………..17
3.1.2 Especie Senna reticulata…………………………………………………………18
3.2 RESISTENCIA ANTIMICROBIANA……………………………………………….18
3.3 PREPARACIÓN DE LAS CEPAS A EVALUAR………………………………….18
3.3.1 Escherichia coli……………………………………………………………………19
3.3.2 Bacillus cereus……………………………………………………………………19
3.3.3 Pseudomonas aeruginosa……………………………………………………….19
3.3.4 Staphylococcus aureus…………………………………………………………..20
3.3.5 Streptococcus mutans……………………………………………………………20
3.3.6 Lactobacillus spp………………………………………………………………….20
3.4 POLARIDAD DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS……………………….21
3.5 MÉTODO MODIFICADO DE POZO Y AGAR……………………………………21
3.6 ANTIMICROBIANOS………………………………………………………………..21
3.7 METABOLITOS CON CAPACIDAD ANTIMICROBIANA……………………….22
3.7.1 ALCALOIDES……………………………………………………………………...22
3.7.2 TANINOS…………………………………………………………………………..22
3.7.3 SAPONINAS……………………………………………………………………….22
3.7.4 CUMARINAS………………………………………………………………………23
3.7.5 FLAVONAS Y FLAVONOIDES………………………………………………….23
3.7.6 FENOLES………………………………………………………………………….23
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7
3.7.7 QUINONAS……………………………………………………………………….23
3.7.8 CAROTENOIDES………………………………………………………………..23
3.7.9 ESTEROIDES Y TRITERPENOS………………………………………………24
3.8 ESTRÉS OXIDATIVO………………………………………………………………24
3.9 ANTIOXIDANTES…………………………………………………………………..24
3.10 MÉTODOS USADOS PARA CUANTIFICAR ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE…………………………………………………………………………24
3.10.1 MÉTODO DECOLORACIÓN DEL CATIÓN ABTS…………………………..24
3.10.2 MÉTODOS POR DPPH…………………………………………………………25
3.10.3 MÉTODO DE ORAC…………………………………………………………….25
4. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...26
4.1 OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………26
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………………………………………….26
5. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………..27
5.1 MATERIALES………………………………………………………………………..27
5.2 MÉTODOS…………………………………………………………………………...29
5.2.1 RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL………………………………….29
5.2.2 REMOJO DE MUESTRA…………………………………………………………29
5.2.3 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO TOTAL………………………………………..30
5.2.4 MÉTODO DE EXTRACCIÓN POR ULTRASONIDO…………………………30
5.2.5 OBTENCIÓN DE LAS FRACCIONES………………………………………….31
5.2.6 ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR………………………………………32
5.2.7 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS…………………………………………………………………………….32
5.2.8 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA………………………………………………..34
5.2.9 PREPARACIÓN DEL INÓCULO………………………………………………..34
5.2.10 SIEMBRA
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8
5.2.11 CONTROLES Y CONSERVACIÓN DE CEPAS……………………………..34
5.2.12 LECTURA DE RESULTADOS…………………………………………………34
5.2.13 ESTADÍSTICA Y ANÁLISIS DE RESULTADOS……………………………..35
5.2.14 EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE POR
MÉTODOS ABTS, DPPH Y ORAC…………………………………………………….36
5.2.15 CUANTIFICACIÓN DE FENOLES Y FLAVONOIDES………………………36
6. RESULTADOS………………………………………………………………………..37
6.1 FRACCIONAMIENTO DE EXTRACTOS…………………………………………37
6.2 MARCHA FOTOQUÍMICA………………………………………………………….37
6.3 MÉTODO DECOLORACIÓN DEL RADICAL ABTS Y DPPH………………….38
6.4 PORCENTAJE DE PROTECCIÓN DE LA FLUORESCEÍNA POR EL
MÉTODO DE ORAC…………………………………………………………………….41
6.5 MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE FENOLES Y FLAVONOIDES…………47
6.6 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA…………………………………………………..48
7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………51
8. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….60
9. RECOMENDACIONES………………………………………………………………61
10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..61
11. ANEXOS…………………………………………………………………………… 72
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9
ÍNDICE FIGURAS Pag
Figura 1 Material vegetal seco (1 kg) pulverizado usado para hacer Extracción-fraccionamiento…………………………………………………………..29
Figura 2. Remojo de muestras y concentración de las fracciones…………..… 30
Figura 3. Fraccionamiento con los solventes de diferentes polaridades…….....31
Figura 4. Diagrama de proceso de obtención de fracciones…………………….32
Figura 5. Metodología y procedimiento a realizar marcha fitoquímica………....33
Figura 6. Placas con los tratamientos y su método de Cuantificación
de antioxidantes ABTS+● /DPPH● respectivamente………………………………35
Figura 7. Comportamiento de los datos obtenidos por el método ABTS+●
respectivamente para la fracción AcOEt……………………………………………39
Figura 8. Comportamiento de los datos obtenidos por el método DPPH●
respectivamente para la fracción AcOEt……………………………………………39
Figura 9. Grafica el promedio del porcentaje de actividad antioxidante del
método ABTS vs la concentración en pozo de cada uno de los tratamientos
evaluados………………………………………………………………………………..41
Figura 10. Concentración eficaz para captar radicales libres al 50% de los tratamientos en relación al control positivo (Trolox y Vitamina C)……………44 Figura 11. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos antioxidantes ABTS+● y DPPH● …………………………………………..45 Figura 12. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos antioxidantes ABTS y ORAC……………………………………………….46 Figura 13. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos antioxidantes ORAC y DPPH…………………………….....……………..47 Figura 14. El porcentaje de inhibición relativa para cada uno de los tratamientos frente a E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. cereus y S. mutans por el método por pozos a la máxima concentración de 100 mg/mL………… ….49
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10
ÍNDICE TABLAS Pag
Tabla 1. En la siguiente tabla se observan los resultados obtenidos de cada uno de los rendimientos obtenidos de las fracciones en relación al extracto total inicial…………………………………………………………………………….....37
Tabla 2. Análisis fitoquímico preliminar para Senna reticulata……………………37
Tabla 3. Determinación del porcentaje de actividad antioxidante (AOX) de las réplicas seleccionadas de cada tratamiento, a continuación se encuentra una tabla a partir de las concentraciones del extracto total……………………….40 Tabla 4. Valores del CE50 (ppm) a partir de la ecuación por interpolación y del programa Probit de cada tratamiento y por los métodos de cuantificación de antioxidantes………………………………………………………………………..42
Tabla 5. Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre ABTS y DPPH……45
Tabla 6 .Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre ABTS y ORAC…...46.
Tabla 7. Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre DPPH y ORAC…..47
Tabla 8. Concentración de Fenoles y Flavonoides presentes en el extracto total, y sus respectivas fracciones…………………………………………………..48 Tabla 9 Halos de inhibición en mm de los controles positivos del método en pozo (antibióticos) y los tratamientos con las respectivas concentraciones evaluadas para cada una de las bacterias…………………………………………48 Tabla 10. Halos de inhibición (mm) de los controles positivos evaluados mediante antibiograma………………………………………………………………..49
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ABREVIATURAS
AOX Actividad Antioxidante
ABTS+● 2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
AcOEt Acetato de etilo
C Cloranfenicol
CE50 Concentración eficaz para captar radicales libres al 50%
CE90 Concentración eficaz para inhibir al 90%
C.V Coeficiente de variación
C1 Concentración uno
C2 Concentración dos
GEN Gentamicina
D.S Desviación estándar
DCM Diclorometano
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH● 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
E Eritromicina
EAG Ácido Gálico
EtOH Etanol
AMP Ampicilina
AMK Amikacina
mm Milímetros
mta Muestra
P Penicilina
QE Quercetina
VA Vancomicina
V1 Volumen uno
V2 Volumen dos
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RESUMEN
El presente trabajo de investigación se basó en un análisis de metabolitos
secundarios, actividad antimicrobiana y capacidad antioxidante a partir de (hojas,
flores y tallos) de Senna reticulata. Se realizó el fraccionamiento de los extractos
usando solventes con diferentes polaridades: éter de petróleo, diclorometano y
acetato de etilo. Posteriormente se identificaron los metabolitos secundarios por
medio de una marcha fitoquímica, tales como taninos, cumarinas, alcaloides,
flavonoides entre otros del extracto total y sus fracciones respectivamente. La
evaluación de la actividad antimicrobiana de esta especie vegetal se realizó por el
método de difusión en agar usando pozos. Además se realizó la cuantificación de
fenoles y flavonoides obteniendo concentraciones de 119,0 mg de Ácido gálico
(EAG/ g muestra) y 44,4 mg de Quercetina (QE/g muestra) respectivamente para la
fracción de DCM con mayor contenido. Por otro lado la capacidad antioxidante
medido por los métodos ABTS+●, DPPH● y ORAC mostró mejor actividad con la
fracción DCM comparado con los patrones Trolox y Vitamina C por el método de
ABTS+●, determinando una concentración eficaz para captar radicales libres al 50%
(CE50) de 95,95 y 7,58 para ABTS+●, 31,42 y 59,20 para DPPH● y 122,09 para el
método de ORAC por interpolación de ecuaciones y la herramienta Probit
respectivamente. Por su parte el mejor método para bacterias, fue la fracción DCM
y la fracción AcOEt con un porcentaje de inhibición altos, especialmente las
bacterias Gram positivas (S.aureus, S.mutans, L.casei y L.acidophilus) . Esto nos
permite determinar que el extracto analizado y sus fracciones pueden ser usados
como agentes antimicrobianos frente a bacterias Gram positivas.
Palabras clave: ABTS+●, DPPH●, ORAC, éter de petróleo, diclorometano, acetato
de etilo, CE50, S.aureus, S.mutans, L.casei y L.acidophilus-
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1. INTRODUCCIÓN
Los antibióticos en la práctica clínica han supuesto una revolución en la medicina,
ayudando a combatir infecciones bacterianas. Sin embargo, una amenaza creciente
deteriora la eficacia de estos fármacos: la resistencia bacteriana a los antibióticos,
la cual se refiere a la capacidad de una bacteria para sobrevivir en concentraciones
de antibiótico que inhibe a otras de la misma especie (Alos, J. 2015). Esta
resistencia a los antibióticos ha sido reconocida como un problema importante
durante décadas, debido a los efectos adversos asociados en el aumento de la
mortalidad y la morbilidad de los pacientes. Esto trae como consecuencia el retraso
de los tratamientos, la prolongación en la estancia de los hospitales y el aumento
de los costos económicos hospitalarios y en ocasiones la muerte (Gonzales, L et al.
2014).
Una alternativa para reducir estos efectos causados por la resistencia a los
antibióticos son los fármacos de origen natural. Por esta razón, se han hecho
esfuerzos para mejorar las propiedades de estos medicamentos o buscar
actividades biológicas potenciales de compuestos químicos aislados a partir de
fuentes naturales, para tener una mejor optimización de los mismos. (Saldívar-
González, F et al. 2017). Con este fin de conseguir nuevos compuestos con la
capacidad de ser utilizados en la elaboración de medicamentos, en la actualidad se
han buscado alternativas de agentes con propiedades antibacterianas obtenidos a
partir de sustancias naturales provenientes de especies vegetales (Maddulur, K et
al; 2013)
Las plantas en la medicina tradicional han sido utilizadas desde la antigüedad en
preparaciones alimenticias y son particularmente conocidas dentro de sus
tradiciones por su potencial terapéutico. En particular, han sido utilizadas por
comunidades indígenas en el tratamiento de enfermedades en la selva tropical del
Amazonas (Lizcano, L et al. 2010). La selva amazónica es la más extensa y
representa la mayor biodiversidad de plantas y animales en el mundo, con
aproximadamente el 25% de todas las especies terrestres. Además representa un
complejo cultural, con tradiciones de valores, creencias y actitudes que han
permitido que las generaciones tengan conocimiento de los beneficios obtenidos a
partir de los recursos naturales (Bieski, I et al. 2015).
En los últimos años se han realizado estudios de diversas plantas con propiedades
terapéuticas. Una de ellas es la especie vegetal Senna reticulata, comúnmente
utilizada por la comunidad indígena, debido a sus efectos terapéuticos. Gracias a
estudios realizados sobre esta planta, se ha determinado que puede solucionar
algunos de los problemas más frecuentes en las personas, tales como
enfermedades hipoglucémicas, reumáticas y contra enfermedades tópicas, tales
[Escriba aquí]
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como infecciones por hongos, sarna, erupciones cutáneas y verrugas (Ramírez, A
et al 2013). Esto demuestra que la planta Senna reticulata, tiene una importancia
significativa en la medicina tradicional, con cualidades de interés a nivel terapéutico
y farmacológico.
La especie Senna reticulata se encuentra distribuida a lo largo de todo el territorio
Colombiano. La mayor concentración está ubicada en los departamentos de Tolima
y Cundinamarca (Peláez, J et al. 2017). Dentro de sus componentes químicos se
han identificado flavonoides, alcaloides, taninos, saponinas y glucósidos, a los
cuales se les ha estudiado la acción biológica en antioxidantes y antimicrobianos
(Ramírez, A et al, 2013).Estos compuestos se les ha atribuido la capacidad
antioxidante, debido a que evitan la oxidación de moléculas, inhibiendo la formación
de radicales libres o interrumpiendo su propagación mediante algunos mecanismos.
Esto permite mejorar las etapas crónicas del estrés oxidativo que aceleran los
procesos de envejecimiento y provocan daño neuronal asociado a procesos
degenerativos (López, G et al. 2015).
Además de tener propiedades antioxidantes también se le atribuyen propiedades
con actividad antimicrobiana. Los antimicrobianos tienen el poder de inhibición del
crecimiento de un determinado microorganismo, se clasifica según su sitio de acción
en el microorganismo, entre antimicrobianos de inhibición de síntesis de pared,
inhibición de síntesis de membrana citoplasmática e inhibición sobre la síntesis de
ARN y ADN (Zaouali et al. 2010), y que son utilizados en la elaboración de fármacos.
Estos desarrollan un papel importante en el tratamiento de enfermedades,
prevención, higiene y limpieza. Debido al aumento de la resistencia a los antibióticos
por parte de las bacterias, estos antimicrobianos permiten una alternativa en tratar
enfermedades importantes causadas por algunos microorganismos patógenos
comensales, tales como infecciones en el aparato excretor, vías urinarias, cistitis,
mastitis, septicemia y neumonía. Para bacterias Gram negativa se encuentran
enfermedades como el síndrome de la piel escaldada, intoxicación alimentaria, para
bacterias Gram positivas se conoce la enfermedad del síndrome del shock tóxico
(Tortora G, et al; 2007). Otras enfermedades provocadas son las enfermedades
cariogénicas, que están directamente relacionadas con la formación de la placa
dental, así como la descomposición del diente por parte de algunas bacterias
anaerobias (Kawada-Matsuo, M et al. 2016).
Teniendo en cuenta que existen pocos estudios de la especie Senna reticulata, el
objetivo del presente estudio es evidenciar las cualidades que presenta la planta en
la evaluación de su actividad antibacteriana frente a las bacterias E.coli,
P.aeruginosa, B.cereus, S.aureus, S.mutans, L.casei y L.acidophilus; Así como su
capacidad antioxidante por medio de los métodos ORAC, ABTS y DPPH con el fin
de determinar sus usos para tratamientos terapéuticos.
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2. JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA
Las enfermedades infecciosas causadas por bacterias son enfermedades comunes.
Las bacterias patógenas pueden causar diarrea grave o infecciones debilitantes. A
lo largo de los años la implementación de antibióticos ha permitido el tratamiento de
estas enfermedades. No obstante, el manejo indiscriminado de estos por parte de
la población, ha generado que las bacterias adquieran mecanismos de resistencia
a los antibióticos aumentando la ineficiencia de los tratamientos y la prolongación
de las enfermedades (Organización Mundial de la Salud, 2016).
La farmacoterapia se ha convertido en un arma terapéutica accesible y rápida,
siendo una de las formas más comunes de terapia en nuestra sociedad y una de las
actividades del proceso asistencial que condicionan en mayor medida el resultado
del mismo (Torner, M et al. 2003). Sin embargo, cuando los medicamentos se
utilizan de manera inapropiada se convierten en una amenaza para la salud
individual y colectiva, como el uso de forma inadecuado de un medicamento en la
administración de las dosis y períodos que se requieren para asegurar la efectividad
en el tratamiento, generando resistencia en bacterias causante de enfermedades
infecciosas.
Esta farmacorresistencia se conoce cuando una cepa bacteriana es resistente o
tiene ausencia de sensibilidad a un antibiótico determinado (Blandon, A et al. 2014).
La presencia de resistencia en una bacteria causante de infección disminuye las
posibilidades de obtener un tratamiento clínico correcto y la erradicación
bacteriológica; incrementando los costos de tratamiento, la morbilidad y la
mortalidad (Rodríguez, E et al. 2014). Esta problemática tiene mayor impacto en
hospitales de alta complejidad por el gran número de pacientes críticamente
enfermos, de huéspedes inmunocomprometidos y el uso frecuente de dispositivos
invasivos. Además una de las principales razones de la diseminación de bacterias
multirresistentes está en el uso inapropiado de antibióticos y en la aplicación
ineficiente de medidas de control (Pacheco, R et al. 2014).
Por ende, la búsqueda de metabolitos secundarios a partir de especies vegetales
ha sido de gran interés ya que las plantas pueden ser una excelente fuente de
antioxidantes naturales que presentan propiedades antimicrobianas. Estos han sido
utilizados como un remedio para el tratamiento de algunas enfermedades causadas
por bacterias en el ser humano. De esta manera se minimiza la implementación de
antibióticos sintéticos que logran tener un efecto secundario a largo plazo en las
personas, y simultáneamente, logran disminuir la resistencia a los antibióticos por
parte de los microorganismos patógenos (Mak, Y et al. 2013)
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Estudios realizados demuestran que la población mundial hace uso de la fitoterapia
como medida de atención primaria en el manejo de enfermedades dado que estos
tienen la capacidad de tener metabolitos secundarios que pueden favorecer la
actividad antimicrobiana en algunas bacterias y proporcionar actividad antioxidante
en las reacciones oxidativas que se lleva a cabo en el cuerpo humano (Ramírez, A
et al. 2013). Algunas bacterias oportunistas causantes de enfermedades en américa
latina, son Staphylococcus aureus que causa bacteriemia como la endocarditis
infecciosa, siendo una infección grave y frecuente (Gudiol, F et al 2015). Las
bacterias como E.coli y B.cereus que se encuentran asociadas con problemas
gastrointestinales en la población mundial. Pseudomonas aeruginosa, uno de los
patógenos oportunistas más importantes implicado en las infecciones nosocomiales
en todo el mundo (Andueza, F et al. 2015). Finalmente, bacterias anaerobias que
son capaces de causar afecciones en la salud oral. Una de las más comunes suele
ser la enfermedad cariogénica, relacionadas con malos hábitos higiénicos. La caries
dental, junto con la enfermedad periodontal, constituye el mayor porcentaje de
morbilidad dentaria durante toda la vida. Afecta a personas de cualquier edad, sexo
y raza; teniendo una mayor presencia en sujetos de bajo nivel socioeconómico y
con una dieta alimenticia rica en sacarosa en sus hábitos alimenticios (Rodríguez,
M et al. 2013).
Por tal motivo, el estudio de plantas que tienen propiedades antibacterianas para
ser utilizados farmacológicamente en la elaboración de medicamentos resulta ser
necesario (Maddulur, K et al. 2013). De tal manera, una alternativa natural en el
proceso de evaluación de la especie Senna reticulata, es evidenciar las cualidades
que presenta la planta en la evaluación de su actividad antibacteriana frente a las
bacterias E.coli, P.aeruginosa, B.cereus, S.aureus, S.mutans, L.casei y
L.acidophilus; Así como su capacidad antioxidante por medio de los métodos
ORAC, ABTS y DPPH con el fin de determinar sus usos para tratamientos
terapéuticos.
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3. MARCO TEÓRICO
3.1 Plantas con actividad antimicrobiana
Las enfermedades infecciosas son consideradas una de las principales causas de
mortalidad a nivel mundial. La resistencia microbiana a los antibióticos se ha
convertido en un problema de salud pública de creciente magnitud. Por lo tanto, el
descubrimiento y el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos a base de
productos naturales han venido en aumento para abordar esta problemática. Los
fitoquímicos con potencial de actividad antimicrobiana están siendo ampliamente
explorados como aplicación terapéutica para combatir estas infecciones
(Aumeeruddy-Elalfi, Z et al. 2016).
Se ha encontrado que a partir de algunos extractos vegetales que contienen
compuestos eficaces con un efecto bacteriostático o bactericida frente algunas
bacterias patógenas, pueden llegar a ser una alternativa para mejorar los efectos
secundarios y los peligros para el medio ambiente causado por los compuestos
químicos sintéticos (Mwitari, P et al.2013). Según la OMS, define como planta
medicinal “Cualquier especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser
empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos principios activos sirven de
precursores para sintetizar fármacos” (Oliveira M, et al; 2005).
Siendo un país con una alta biodiversidad en su ecosistema y la variedad de
especies naturales. Existe una diversidad de géneros de plantas con actividad
antimicrobiana que lleve a varias plantas incluyendo entre ellas plantas
Colombianas, como Alternathera williamsii, plantas de la familia Anacardiaceae,
Onagraceae, Urticaceae, Solanaceae. Otras plantas como Senna reticulata y
Solanum dolichosepalum (Ramírez A, et al; 2013).
3.1.1 Plantas de la familia Fabaceae
La familia Fabaceae o leguminosa es la tercera más numerosa de las plantas con
flores (Ferrufino, L et al 2016). La mayoría de las especies son angiospermas con
un hábito arbóreo o herbáceo. Estas especies son nativas o introducidas (Chirinos-
Arias, C et al 2015).
Entre otra característica, se encuentra un estudio realizado por Araya-Cloutier, C.
et al (2016) se encontró en que su estructura anfifílica les permite alterar la
permeabilidad de la membrana de los microorganismos. Por otro lado, también se
le ha visto asociado en disminuir las tasas de morbilidad en las enfermedades
cardiovasculares relacionadas con la edad y la osteoporosis, por sus metabolitos
secundarios, principalmente los fitoestrógenos (Visnevschi-Necrasov, T et al. 2015).
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3.1.2 Especie Senna reticulata
La planta Senna reticulata es un árbol de 2 a 8 m de alto, ramificado a baja altura;
su inflorescencia es racimosa, terminal y con flores amarillas. Se considera una
planta pionera la cual tiene la capacidad de colonizar en zonas abiertas y presenta
una alta asimilación fotosintética con un rápido crecimiento, que se producen
principalmente cerca de los ríos y pastos; Además de la eficiente habilidad para
rebrotar después de un periodo de condiciones desfavorables (De Lima, A. 2015)
De igual manera, esta especie se caracteriza por tener un importante valor medicinal para la región, en el tratamiento de la obstrucción del hígado, como antirreumático, infecciones en la piel tales como erupciones cutáneas e infección por hongos y problemas de artritis, Contienen sustancias de interés para la industria de alimentos, farmacéutica, tintes y cosméticos (Ramírez, A. et al. 2013). 3.2 Resistencia antimicrobiana La resistencia a los antibióticos es una expresión natural de la evolución y genética bacteriana, ciertos factores también contribuyen al aumento de la expresión y diseminación de esta característica inherente. El incremento en el uso de antibióticos y la respectiva presión selectiva que ejercen, es el factor más importante que contribuye a la aparición de diversas clases de resistencia (Maortua, H et a.l 2009). La resistencia puede ser una propiedad natural de un organismo (intrínseca) o conseguida por mutación o adquisición de plásmidos (autorreplicación, ADN extracromosómico) o transposones (cromosomal o integrado en plásmidos, cassettes de ADN transmisibles) (Cabrera, C et al. 2013). Los mecanismos de resistencia bacteriana a formaldehído y a bactericidas industriales pueden ser codificados por plásmidos. Las alteraciones en las proteínas de la membrana externa y la formaldehído-dehidrogenasa se consideran responsables. También se ha documentado la participación de las bombas de flujo en la adquisición de esta resistencia. La activación de estas bombas es mediada por plásmidos y es un importante mecanismo de resistencia a antibióticos, metales, desinfectantes y antisépticos catiónicos (Cabrera, C et al. 2013). 3.3 Preparación de las cepas a evaluar
Para cumplir con adecuado control de calidad, las cepas son de la ATCC y se
someten a patrones de sensibilidad conocidos para que el resultado de la prueba
se encuentre dentro de los límites establecidos. Por otro lado se deben realizar
conservaciones de las bacterias a corto plazo, haciendo repiques en medios de
cultivos nuevos y se incuban a 37°C para las bacterias aerobias y para las
anaerobias se utilizan sobres de anaerobiosis.
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3.3.1 Escherichia coli
Es un bacilo Gram negativo, aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima
de crecimiento es de 37°C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama
bastante amplia de temperaturas; el pH favorable es de 7 y algunas cepas producen
hemolisina (Peñaranda, L et al. 2003).
Las beta lactamasas de espectro extendido (BLEE) son enzimas que le confieren
resistencia frente a todos los antibióticos beta-lactámicos, de esta manera, se
conoce que E. coli es uno de los productores de BLEE más comunes a nivel mundial
(Diego, A. 2016), por ende es un microorganismo que tiene una alta tasa
hospitalaria.
3.3.2 Bacillus cereus
Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobia facultativa, formadora de
esporas, ampliamente distribuida en el medio ambientalmente y con una estrecha
relación fenotípica y genética (16S rRNA) con varias otras especies de Bacillus,
especialmente B. anthracis (Bottone, J. 2010).
Según Bottone, J. (2010) en la acción patógena de B. cereus se encuentran cuatro
hemolisinas, las cuales afecta el tracto gastrointestinal (intestino delgado). En donde
las células vegetativas ingeridas como células viables o esporas, producen y
secretan una proteína enterotoxica e inducen un síndrome diarreico, mientras que
la toxina emética se produce en productos alimenticios, en las que induce un
síndrome de vómito, ya que se sintetiza en el producto alimenticio contaminado.
3.3.3 Pseudomonas aeruginosa
Este microorganismo es altamente versátil, ya que puede tolerar condiciones bajas
de oxígeno, y sobrevivir con bajos niveles de nutrientes; además de crecer a
temperaturas de 4 a 42°C. Estas condiciones le permiten adherirse y sobrevivir en
diferentes ambientes. La resistencia a diversos antibióticos y sustancias
antimicrobianas ha sido asociada a la formación de biopelículas bacterianas y su
resistencia a carbapénicos, β-lactamasas de amplio espectro, entre otros (Ochoa S,
et al; 2013)
Es un bacilo Gram negativo aerobio, considerado un patógeno oportunista, que
tiene la capacidad de sintetizar pigmentos hidrosolubles, entre los cuales se incluye
el compuesto fluorescente pioverdina, esta se combina con el pigmento fenazina
azul piocianina, creando un color verde brillante característico de P. aeruginosa,
bacteria que también puede producir otros pigmentos hidrosolubles, como la
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piorrubina (rojo) y la piomelanina (marrón), que se ven favorecidas cuando la
temperatura de incubación es de (35-37°C) y presencia de Hierro en medio Müeller-
Hinton (Merino L;2007).
3.3.4 Staphylococcus aureus
Son cocos Gram positivos de 0,5 – 1 µm de diámetro, inmóviles, aerobios o
anaerobios facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo.
Crecen a una temperatura óptima de 37°C y se desarrolla mejor en un pH
ligeramente alcalino de 7,6 la adición de glucosa favorece el crecimiento
(Peñaranda, L et al. 2003).
Es un microorganismo oportunista que coloniza la piel, las fosas nasales, las axilas, la faringe y el tracto urogenital en aproximadamente el 20% de personas sanas (Galarzo, S. et al 2015). Por otro lado Según Herrera, M et al (2016) se han venido identificando cepas S.aureus con resistencia a los antibióticos betalactámicos, tales como la penicilina y la meticilina, principalmente causantes de infecciones en hospitales, esto las hace responsables de enfermedades graves como la sepsis y la neumonía necrosante. Para pacientes inmunosuprimidos que se hayan contagiado mediante el contacto directo, los hace de tener mayor riesgo de colonización bacteriana. 3.3.5 Streptococcus mutans Este microorganismo es causal de enfermedades periodontales, como la caries, y
para poder aplicar un control microbiológico sobre la cavidad oral, es prevenir la
caries dental. Una alta dificultad que se presenta es la persistente infección en los
humanos de S. mutans desde edades tempranas (Gamboa F, et al; 2004).
Los estreptococos se presentan en forma de coco, en parejas o cadenas, no tienen
movimiento, no forman esporas y son Gram positivos. Es catalasa negativo y
productor de ácido láctico con capacidad de cambiar el medio de pH 7 a pH 4.2 en
24 horas. Este ha sido el microorganismo que se ha aislado en lesiones cariosas
humanas, y es el primero en colonizar el diente después de la erupción. Su nombre
obedece a que puede cambiar de forma coco a forma bacilar (Duque J, et al; 2006).
3.3.6 Lactobacillus sp La formación de caries constituye una enfermedad infecciosa multifactorial que se caracteriza por la desmineralización de las porciones orgánicas del diente y el deterioro posterior de sus partes orgánicas. Este proceso destructivo surge de las acciones de algunos microorganismos de la placa dentobacteriana sobre los carbohidratos fermentables que generan la producción de ácidos, principalmente
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lácticos, como parte del metabolismo de las bacterias. El progreso de la lesión cariosa requiere, además de los factores anteriormente citados, un diente susceptible y un tiempo suficiente de exposición que permita no sólo la producción de ácidos por parte de las bacterias de la placa, sino también la desmineralización del tejido duro del diente (Molina, N et al. 2015) 3.4 Polaridad de los metabolitos secundarios
La polaridad de los diferentes metabolitos depende de su solubilidad en diferentes
solventes, clasificándolos en no polares o polares. Los flavonoides que tienen un
gran número de grupos hidroxilo o azúcares son solubles en solventes polares
(Reyes, S et al. 2015). Por otro lado los alcaloides que se encuentren de base o de
sal son solubles en compuestos polares y no polares respectivamente (Rojas L, et
al. 2009). Además los taninos son solubles en agua, alcohol y acetona pero son
insolubles en solventes apolares. Los cardiotónicos son solubles en agua y alcohol,
las agliconas son solubles en solventes apolares y las cumarinas son solubles en
varios solventes de diferente polaridad (Arango G; 2010).
3.5 Método modificado de pozos de agar Se inocula a partir de la suspensión en el medio Mueller Huilton con cada una de las cepas estipuladas. Posteriormente, se hicieron los pozos sobre la superficie de los agares con ayuda de una pipeta pasteur de 6 mm de diámetro, y en cada uno de ellos se vertieron 30 uL de cada uno de los extractos, estándares y los blancos, todo esto por triplicado. Se dejó reposar por 30 minutos. Posteriormente, se incubaron a 37”C (Castillo, A et al. 2017). 3.6 Antimicrobianos
Los antimicrobianos son compuestos naturales o de síntesis química que tienen la
capacidad de provocar una acción bacteriostática inhibiendo el crecimiento celular
dado que los agentes bacteriostáticos se unen a los ribosomas e inhiben la síntesis
de las proteínas, pero esta es una unión débil ya que al disminuir la concentración
del agente se liberan los ribosomas e inicia el crecimiento microbiano. También tiene
efecto bactericida causando la muerte microbiana y efecto bacteriolítico matando a
la bacteria a causa de la lisis celular. (Montoya H; 2008)
Los antimicrobianos deben cumplir con diferentes condiciones óptimas para su total
efectividad, una de ellas es tener la toxicidad selectiva actuando solo sobre el
microorganismo de interés, ser de fácil obtención, alta eficiencia, degradarse
lentamente, no causar efectos secundarios, no generar resistencia antimicrobiana y
tener amplio espectro sin alterar la microbiota normal (Negroni M; 2009).
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Por otro lado el término antibiótico se refiere a un producto metabólico que es
perjudicial o inhibitorio sobre los microorganismos en pequeñas cantidades; estos
se pueden clasificar en: microbicidas, que matan las formas vegetativas de los
microorganismos, denominados como bactericidas y fungicidas. Entre estos se
encuentran microbiostáticos, es decir que inhiben el crecimiento de
microorganismos y se denominan bacteriostáticos o fungistáticos, según se refiera.
(Barreto J; 1997).
3.7 Metabolitos con capacidad antimicrobiana
Las plantas producen y almacenan una gran cantidad de compuestos o metabolitos
primarios y secundarios. Los metabolitos secundarios son la fuente de compuestos
biológicamente activos, estos son acumulados en las plantas, en el suelo o en
medios de cultivos ya que su composición química, su concentración y localización
varía de acuerdo a la especie (Anaya A, et al; 2001)
3.7.1 Alcaloides
Reciben esta denominación los compuestos nitrogenados heterocíclicos.
Pertenecen a este grupo, sustancias como la morfina, la heroína y la cocaína. El
mecanismo de acción de los alcaloides parece ser mediante intercalación entre la
pared celular y el ADN de los microorganismos (Torres, C 2004).
3.7.2 Taninos
Son un grupo de sustancias fenólicas poliméricas de alto peso molecular que están
divididas en hidrolizados y condensados. Su principal característica es su capacidad
antioxidante, debido al elevado número de grupos hidroxilo que posee y su actividad
se debe a la interacción de los compuestos sobre las adhesinas, algunas proteínas
de la pared celular y su capacidad de unirse a los polisacáridos (Díaz J, et al 2008).
3.7.3 Saponinas
Las saponinas son productos naturales derivados de distintas especies vegetales.
Estas moléculas están clasificadas, por su estructura, como glucósidos esteroidales
o triterpénicos,los cuales se caracterizan por las propiedades semejantes a las del
jabón: cada molécula está constituida por una parte lipofílica y otra hidrofílica
(Guzmán, B et al. 2015). Además Según un estudio realizado por Calsamiglia S, et
al (2005) las saponinas se unen al colesterol y esterol de la membrana celular en
algunos protozoos, ocasionando lisis celular.
3.7.4 Cumarinas
Son compuestos derivados de la benzo-α-pirona, como la cumarina, la esculetina,
[Escriba aquí]
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la umbeliferona y la escopoletina. Están presentes en las margaritas y tienen
propiedades antiinflamatorias, antitrombóticas y vasodilatadoras. Parece que su
mecanismo de acción antimicrobiano es mediante interacción con el ADN eucariota,
lo que explica también su actividad antiviral (López, M et al. 2003).
3.7.5 Flavonas y flavonoides
Son estructuras fenólicas de bajo peso molecular que contienen un solo grupo
carbonilo. Componen la familia más grande de fenoles naturales (Vargas, R et al.
2013). Su actividad antimicrobiana se da debido a que provocan la inhibición de
ácidos nucleicos y la degradación de la membrana citoplasmática. (López, M et al.
2003).
3.7.6 Fenoles Son los compuestos más simples y consisten en un anillo fenólico sustituido. En este grupo podemos encontrar el ácido cafeico y el cinámico, los cuales tienen acción antimicrobiana, antiviral y antifúngica; además se encuentran los fenoles simples y ácidos fenólicos, catecoles y eugenoles, conocidos por su poder bacteriostático (Díaz, J et al. 2008) 3.7.7 Quinonas Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son ubicuas en la naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas cuando son dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los aminoácidos hidrofílicos de las proteínas, la mayoria de las veces inactivando la proteína y anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este grupo es amplio (López, M et al. 2003). 3.7.8 Carotenoides Son un grupo de compuestos solubles en lípidos, están formados por 8 unidades de isopreno con una serie de dobles enlaces conjugados que constituyen el grupo cromóforo característico. Se encuentra especialmente en una gran variedad de plantas donde cumple funciones en la fotosíntesis y en la coloración de flores y frutos. (Primo, E. 2007) Los carotenoides tienen propiedades antioxidantes y existen indicios que estos compuestos presentan actividad antimicrobiana. (Sigifredo B, et al. 2014). 3.7.9 Esteroides y triterpenos
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Los esteroides son compuestos orgánicos que alteran determinados procesos metabólicos vitales en la célula bacteriana. Por su parte los triterpenos actúan dependiendo de su naturaleza química, donde podemos encontrar los de naturaleza hidrocarbùrica, los cuales tienen la capacidad de alterar la selectividad de la membrana citoplasmática afectando el intercambio de sustancias a causa de la acción depresora sobre la tensión superficial que se genera en el entorno de la célula bacteriana; por su parte los de naturaleza alcohólica provocan la muerte celular debido a que alteran la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula. (Lizcano A, et al; 2008)
3.8 Estrés oxidativo
El estrés oxidativo está implicado en la patogénesis de numerosas enfermedades
como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes mellitus, la enfermedad de
Alzheimer, las enfermedades inflamatorias, la carcinogénesis, las enfermedades
neurodegenerativas, las enfermedades pulmonares y hematológicas ( Nicolai, M et
al 2016)
Según Sequeda, L (2008) el daño o estrés oxidativo es la exposición de la materia
viva a diversas fuentes que causan una ruptura del equilibrio entre las sustancias y
los mecanismos antioxidantes encargados de eliminar dichas sustancias químicas,
causando alteraciones en la relación estructura-función de cualquier organismo.
3.9 Antioxidantes
Los antioxidantes son compuestos que reaccionan con los radicales libres,
neutralizándolos y con ello previniendo o reduciendo sus efectos dañinos sobre el
cuerpo, estos pueden ser de origen sintético o natural. El estrés oxidativo resultante,
incluyen radicales libres que se forman como resultado de varias reacciones
metabólicas que ocurren en el cuerpo humano, bajo el control de antioxidantes
naturales enzimáticos y no enzimáticos (Nicolai, M et al 2016).
3.10 Métodos usados para cuantificar la capacidad antioxidante
Existen varios métodos para cuantificar la actividad antioxidante de compuestos
vegetales, entre ellos los siguientes que fueron seleccionados para evaluar en el
presente trabajo:
3.10.1 Método de decoloración del catión radical ABTS+●
El método de ABTS utiliza el compuesto cromógeno 2,2-azinobis-3-
etilbenzotiazolino-6-sulfonato (ABTS), en donde este catión radical permite el
análisis de compuestos tanto de naturaleza lipofílica como hidrofílica, además de
tener ventajas sobre su espectro de absorción máximos a 414, 654, 754 y 818 nm
en medio alcohólico (Sucupira, N et al. 2015). La solución ABTS+● pierde su color
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25
verde-azulado cuando se mezcla con un compuesto antioxidante, diminuyendo la
absorbancia de cada solución, que se expresa como porcentaje de actividad
antioxidante, para este ensayo se usa la curva de calibración de Trolox como
estándar bajo las mismas condiciones. (Sequeda L; 2008).
3.10.2 Método por DPPH
El método de DPPH se realiza usando el radical cromógeno 2,2-Difenil-1-
picrilhidrazil (2,2 difenil-1-(2,4,6-trinitrofenil) hidrazil), consistiendo en la
estabilización de un electrón desapareado que en presencia de una sustancia
antioxidante de naturaleza apolar se decolora hacia amarillo pálido por la óxido-
reducción entre la sustancia y el compuesto inestable (Klancnik , A et al 2009). Este
sólo puede disolverse en medio orgánico y este presenta un máximo de absorbancia
de 515 – 520 nm (Sucupira, N et al. 2015).
3.10.3 Método ORAC
El método de Capacidad de Absorción de Radicales Oxígeno (ORAC) que
determina en forma directa la capacidad antioxidante hidrofílica frente a una fuente
radicalaria. Los estudios realizados por Avello, M et al (2005), utilizan una proteína
fluorescente como sustrato oxidable y 2,2’- azobis(2-amidinopropano) (AAPH) como
generador de radicales peroxilo. En donde el radical peroxilo reacciona con una
sonda fluorescente para formar un producto no fluorescente (Prior, R et al 2005).
Este es el único método que registra la acción de la especie radicalaria hasta el final
y usa el área bajo la curva (ABC) de decaimiento de fluorescencia para realizar la
cuantificación de la capacidad antioxidante (Avello, M et al 2005).
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4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antibacteriana y la capacidad antioxidante a partir del extracto total y las tres fracciones obtenidas de la especie vegetal Senna reticulata como alternativa para minimizar el uso de antibióticos.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4.2.1 Evaluar el rendimiento de la obtención del extracto total mediante el uso de la
técnica de maceración asistida por ultrasonido y su fraccionamiento empleando
solventes de polaridades diferentes.
4.2.2 Determinar la capacidad antioxidante del extracto total y las fracciones
obtenidas mediante el método ORAC, ABTS y DPPH.
4.2.3 Determinar el contenido de cuantificación de fenoles y flavonoides presentes
en los extractos y fracciones evaluadas.
4.2.4 Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos y fracciones obtenidas por
medio de las técnicas de difusión en pozo frente a las bacterias Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus , Streptococcus
mutans , Lactobacillus casei y lactobacillus acidophillus.
[Escriba aquí]
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5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Materiales
5.1.1 Solventes, reactivos, materiales y equipos
Para los diferentes procedimientos que se realizaron en este proyecto de
investigación se usaron diferentes solventes y reactivos que se mencionan a
continuación:
Etanol al 96%, éter de petróleo, diclorometano, acetato de etilo y DMSO fueron
usados en los procesos de extracción total y fraccionamiento, al igual que la
implementación del método antioxidante.
Para realizar la marcha fitoquímica pertinente se usaron reactivos como Mayer,
Wagner, Dragendorff, Gelatina-Sal, Cloruro férrico, Roseinher, Shinoda, Vainilla
ácido-o-fosfórico, Libermann-buchard, Rosenthaler, Baljet, Molisch, Hidroxamato
férrico, Erlich, Salkowiski, HCL, preparados con anterioridad por el grupo de
investigación GIFUJ.
Materiales como:
· Beakers de (50 mL, 250mL, 25mL)
· Erlenmeyers (250 mL, 500 mL, 1000 mL, 100 mL)
· Cajas de Petri (25mL y 5mL)
· Pinzas metálicas
· Puntas de plástico eppendorf (0,5-10 µL, 20-200 µL, 10-100 µL y 100-
1000 µL)
· Pipetas pasteur de vidrio
· Rastrillos
· Probetas (50mL, 100 mL y 1000 mL)
· Tubos 16x150 mm
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· Placas de 96 pozos
· Tubos eppendorf 1.5mL
· Tubos falcon (15mL, 50mL)
· Pinzas para tubos de ensayo
· Tubos de ensayo
· Gradillas metálicas y plásticas
· Gradillas para tubos falcon (15 mL, 50 mL)
· Gradillas para tubos eppendorf de 1,5mL
· Canastas metálicas grandes, medianas, y pequeñas
· Papel filtro 1F electro de paper novablot (#80-1106-19) PKG1500
· Medio de cultivo Mueller-Hinton (500g)
· Embudos de vidrio
· Embudo de decantación 500 mL y 1000 mL
· Cajas de Petri 25 mL plásticas estériles.
Equipos como:
· Micropipetas de (0,5-10 µL, 20-200 µL, 10-100 µL y 100-1000 µL)
eppendorf
· Plancha de calentamiento Cimares 2 (Thermolyne)
· Plancha de calentamiento SciloGEX MS-H280-Pro
· Rotaevaporador BUCHI Waterbatch B-480
· Incubadora Jovan EB115 (Ref 411)
· Vortex VI plus BOECO
· Nevera – Cuarto frío (CIO)
· Vortex MS1 Minicishaker
· Ultrasonido Model 50D VWR
· Cabina de bioseguridad Clase II B3 Magnehellic
· Balanza analítica OHAUS Pionner
[Escriba aquí]
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· Incubadora Lab line model 103.
5.2 Métodos
5.2.1 Recolección del material vegetal
La recolección del material vegetal a partir de hojas frescas en buen estado de la planta Senna reticulata se realizó en el municipio de Viotá en la vereda Brasil a una temperatura media de 25°C. Se recolectó 1 Kg de material y se colocó a secar a temperatura de 40 °C por 48 horas, además se realiza el volteo del material vegetal para que el secado fuera uniforme y de garantizar el bajo contenido de humedad en las muestras y evitar así contaminaciones microbianas por hongos y/o bacterias. Posteriormente se va molienda hasta obtener un polvo fino, como se muestra en la Figura 1.
Figura 1. Material vegetal seco (1 Kilogramo) y pulverizado usado para hacer extracción-fraccionamiento (Autor; 2017)
Se realizó la clasificación taxonómica de la planta a partir de una muestra
representativa de la especie que incluye hojas, flores y frutos, fue llevada al Herbario
de la Universidad Nacional de Colombia.
5.2.2 Remojo de muestras
El material vegetal usado, se tomó del extracto recolectado en el municipio de Viotá
[Escriba aquí]
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Cundinamarca. Se realizó una maceración en frío, tomando 100 g de muestra seca
de material vegetal, que fueron adicionados a 1000mL de EtOH al 96% relación
1:10, dejando la mezcla por 24 horas en oscuridad. Este proceso se realizó tres
veces.
Figura 2. Remojo de muestras y concentración de las fracciones (Autor; 2017)
5.2.3 Obtención de extracto total
Posteriormente se sometió la muestra al equipo Ultrasonido Model 50, utilizando 20
wats como potencia por 10, 20 y 30 min, con el fin de permitir que el solvente
arrastrara los metabolitos afines a su polaridad.
Se filtró el extracto con el fin de retirarle el etanol saturado para su almacenamiento,
y nuevamente el material vegetal se sometió a maceración cambiando el solvente
saturado y se repitió el procedimiento por triplicado para continuar extrayendo los
metabolitos remanentes de la muestra. Obteniendo así un extracto total en etanol
de 3,585 L.
5.2.4 Método de extracción por ultrasonido
La extracción asistida por ultrasonido utiliza sonidos de alta frecuencia, con el fin de
desprender el compuesto buscado en el material vegetal. Las partículas sólidas y
liquidas vibran y se aceleran ante la acción ultrasónica, como resultado el soluto
pasa rápidamente de la fase solida al solvente. Al reducir el tamaño de las partículas
del material vegetal se aumenta el área de exposición al solvente y a la cavitación
producida (Azuola, R et al. 2007).
[Escriba aquí]
31
5.2.5 Obtención de las fracciones
Posterior a la concentración se obtuvo 580 mL de extracto total, dejando 500 mL
para el fraccionamiento y 80 mL se llevaron a sequedad en una cámara de vacío.
Para el debido fraccionamiento líquido-líquido se realizó una prueba de miscibilidad
en tubo con el fin de conocer en qué solventes la muestra no era soluble, se
seleccionaron tres solventes para el fraccionamiento: el primero fue éter de petróleo
el cual es apolar, después se utilizó un solvente con mediana apolaridad como el
diclorometano y finalmente se utilizó acetato de etilo como un solvente altamente
polar, como se observa en la figura 3.
Figura 3. Fraccionamiento con DCM (Autor; 2017)
[Escriba aquí]
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Figura 4. Diagrama de proceso de obtención de fracciones (Autor; 2017)
Después de obtenidas las fracciones se rotavaporaron y se colocaron en cámara de
vacío para concentrar las muestras. Finalmente se pesó (g) el total de cada
tratamiento obtenido.
5.2.6 Análisis fitoquímico preliminar (Prueba cualitativa en tubo)
Para realizar la prueba preliminar cualitativa en tubo, se tomó como base la
metodología realizada por (Prieto J; N.D) de la Universidad Nacional usando
extracto etanolico (50 mg de extracto total/ 50 mL de EtOH al 96%) como se muestra
a continuación en la figura 4.
Sonicador 15’ (Con intervalos
de 5 minutos)
Sonicador 15’ (Con intervalos
de 5 minutos)
[Escriba aquí]
33
Figura 5. Metodología y procedimiento a realizar marcha fitoquímica (Prieto J; ND)
5.2.7 Evaluación de actividad antimicrobiana de los extractos
Se realizó la metodología de recuento en superficie para verificar la ausencia o
presencia de microorganismos que pudieran interferir en la calidad del producto,
tomando 100 µL de cada tratamiento de una concentración de 100 mg/mL de las
fracciones y se sembró en superficie en medio Müeller-Hinton incubando a 37°C por
24 horas para bacterias y en medio Sabouraud incubando a 28°C por 8 días para
hongos- levaduras, cada tratamiento se realizó por duplicado.
[Escriba aquí]
34
5.2.8 Actividad antimicrobiana
Se seleccionaron 7 cepas de referencia: Bacterias Gran negativas causales de
enfermedades en vías urinarias, septicemia, neumonía e intoxicación alimentaria
(Tortora, G et al. 2007) como son Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027, Bacterias Gram positivas asociadas al síndrome de shock
toxico (Tortora, G et al. 2007) como son Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacterias de interés por la descomposición del diente
en enfermedades dentales como son Streptococcus mutans CMPUJ 327,
Lactobacillus acidophilys y Lactobacillus casei.
5.2.9 Preparación del inóculo
Se preparó un pre-inóculo para evaluar los métodos tomando 1-2 colonias
morfológicamente iguales en solución salina 0,85% para preparar el patrón de
turbidez 0,5 de McFarland (1,5 x108 UFC/mL) (Maddulur S, et al; 2013).
5.2.10 Siembra
Se prepararon diferentes concentraciones del extracto total y de las fracciones de
(10, 20, 40,80 y 100 mg/mL), utilizando como diluyente dimetilsulfoxido al 0.1%. Se
utilizó como máxima concentración 100 mg/mL ya que según Cecchini, C (2012)
sobrepasar esta concentración puede causar citotoxicidad. A partir de la suspensión
de cada microorganismo mencionada anteriormente, para el método en pozo se
adicionaron 100 µL a 25 mL de medio Müeller-Hinton homogeneizando y dejando
solidificar. Posteriormente se realizaron pozos de aproximadamente 0,7 mm
usando pipetas de vidrio pasteur invertidas; e inoculando en cada pozo como control
positivo el antibiótico y como negativo dimetilsulfoxido, además de 30 µL de cada
muestra; este procedimiento se realizó por triplicado. Se Incubaron los medios a
37°C y para las bacterias anaerobias se utilizaron sobres de anaerobiosis por 24
horas.
5.2.11 Controles y conservación de las cepas
Se realizaron antibiogramas usando agar Müeller-Hinton, para identificar el
antibiótico de mayor sensibilidad por pozo; seleccionando como controles positivos
los antibióticos de Vancomicina (150 µg/mL) para bacterias Gram positivas y
Gentamicina (50 µg/mL) para Gram negativas. Por otro lado se utilizó como control
negativo Dimetilsulfóxido (DMSO) ya que no se evidencia ningún efecto inhibitorio
sobre las bacterias evaluadas para cada uno de los extractos.
La conservación de las bacterias a corto plazo de las 7 cepas a evaluar se realizó
en agar Müeller-Hinton, haciendo repiques o pases cada 8 días de los
microorganismos (Floccari M; 2014).
[Escriba aquí]
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5.2.12 Lectura de resultados
Posterior a la incubación se realizó la lectura de cada caja y se midieron los
diámetros de los halos de inhibición formados. Los resultados se expresaron como
mm de halo de inhibición.
5.2.13 Evaluación de la capacidad antioxidante por métodos (ABTS, DPPH y
ORAC)
Para cuantificar el potencial antioxidante del extracto total y las fracciones se
prepararon concentraciones de trabajo de 100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 ppm
usando como solvente EtOH a partir de una solución stock de 3200 ppm. Para
realizar el método ABTS+● propuesto por (Re R, et al; 1999) la solución stock de
ABTS+● fue preparada solubilizando 20 mg de ABTS+● [2,2’-azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-sulfonico ácido) en 10 mL de agua desionizada, leyendo las
diferentes concentraciones a una longitud de onda de 740 nm (Sequeda L; 2008).
Este mismo procedimiento se realizó para el método DPPH● propuesto por (Williams
B, et al; 1995) donde 20 mg de radical DPPH● (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) fueron
solubilizados en 10 mL de EtOH de las mismas concentraciones a una longitud de
onda de 520nm, usando placas de 96 pozos CORNING COSTAR para poder
introducirlas al lector de placa FluorStar ÓPTIMA MBR (BMG LABTECH GMBH.,
Orlenberg, Alemania), con intervalos de 5 minutos por 1 hora. Cada método se
realizó por triplicado con las concentraciones evaluadas. (Sequeda L; 2008).
Por otro lado el procedimiento para la realización del método de ORAC propuesto
por (Thaipong, K et al. 2006), donde se preparó un Buffer fosfato acido de sodio de
pH estable de 7,4. El radical peróxilo se generó usando 2, 2 '- azobis (2-amidino-
propano) y como sustrato se utilizó fluoresceína. Las concentraciones preparadas
a partir del extracto total y las fracciones fueron de 100, 200, 400, 800, 1600, 3200
y 5000 ppm usando como solvente el buffer a pH 7.4 a partir de una solución stock
de 5000 ppm (Dudonne,S et al. 2009)
[Escriba aquí]
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Figura 6. Placas con los tratamientos y su método de cuantificación de
antioxidantes ABTS+● / DPPH● respectivamente (Fuente: Autor; 2016)
5.2.14 Cuantificación de Fenoles y Flavonoides
La cuantificación de fenoles libres y flavonoides se realizó a los extractos y las
fracciones obtenidas utilizando un espectrofotómetro UV-visible CARY 100. La
solución stock inicial se preparó a 3200 ppm, ya que a partir de concentraciones de
100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 ppm se cuantificaron los fenoles libres, por el
método propuesto de (Singleton & Rossi; 1965) con 50 µL de muestra (extracto o
fracción), 800 µL de agua y 100 µL de reactivo Folin-Ciocalteu (grado analítico,
Merck). Se agitó y se adicionaron 50 µL de Na2CO3 al 20%. Después de 1 hora en
la oscuridad se leyó la absorbancia a 760 nm. Los valores se presentan como la
media de los análisis realizados por triplicado ± desviación estándar.
Por otro lado los flavonoides libres se cuantificaron siguiendo el método propuesto
por (Kumazawa, et al; 2004). Se toman 0,5 mL de muestra y 0,5 mL de solución
etanólica de AlCl3 al 2%, se incubó durante una hora temperatura ambiente, la
absorbancia fue medida a 420 nm. Los valores presentados corresponden a la
media ± desviación estándar.
5.2.15 Estadística y análisis de resultados
Se realizó estadística descriptiva para los resultados de actividad antimicrobiana y capacidad antioxidante. Utilizando el programa SPSS v.19, en especial la herramienta Probit con la que se calculó la concentración eficaz para captar el 50% de radicales libres (CE50) de cada tratamiento. Se realizó correlaciones de Pearson para cada una de variables empleadas en las actividades biológicas. El análisis de la capacidad antioxidante se basó en el diseño experimental. Para relacionar los métodos entre sí, se implementó la correlación de Pearson (p<0,05; r2≈0,9).
[Escriba aquí]
37
6. RESULTADOS
6.1 Fraccionamiento de Extractos Finalizado el proceso de extracción líquido-líquido usando ultrasonido. Estas
extracciones se realizaron en diferentes fechas, en donde a partir de los extractos
obtenidos del extracto total y de los tres solventes con diferente polaridad se calculó
el rendimiento utilizando la siguiente fórmula:
Porcentaje de rendimiento (%Y): 𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔) 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑓𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎
𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔)𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙*100
Tabla 1. En la siguiente tabla se observan los resultados obtenidos de cada uno de
los rendimientos obtenidos de las fracciones en relación al extracto total inicial.
Tratamientos Porcentaje del rendimiento
( %Y) Promedio D.S C.V Replica 1 Replica 2 Replica 3
Extracto Total 1,99 2,3 2,04 2,11 0,17 7,89
Fracción etérea 1,35 1,44 1,21 1,33 0,12 8,69
Fracción DCM 1,96 2,11 1,95 2,01 0,09 4,47
Fracción AcOEt 0,97 1,04 0,95 0,99 0,05 4,79
6.2 Marcha fitoquímica
Después de realizada la marcha fitoquímica se pudo verificar la presencia de
diferentes metabolitos presentes en las plantas de Senna reticulata, los cuales
pueden tener relación con la actividad antimicrobiana y la capacidad antioxidante.
Tabla 2. Análisis fitoquímico preliminar para Senna reticulata
Interpretación de pruebas preliminares
Positivo (+), Negativo (-), No determinado (ND)
Metabolito Secundario Prueba Extracto total Eter DCM AcOEt
Alcaloides
Dragendorff + + + +
Mayer + - - +
Wagner + - + +
Terpenos y Esteroides Libermann- Buchard - + + +
[Escriba aquí]
38
Vainilla- ácido-o-fosfórico
- - + -
Flavonoides
Shinoda - - + +
Rosenhein + + + +
Leucoantocianidinas
- - - -
Taninos
Cloruro férrico + + + +
Gelatina-Sal + + + +
Saponinas
Espuma + + + +
Rosenthaler - - - -
Lactonas sesquiterpénicas
Hidroxamato Férrico - - - -
Cumarinas Erlich + + + +
Fluorescencia - - - -
Cardiotónicos
Baljet - - + -
Molish + + + +
Continuación Tabla 2.
6.3 Método de decoloración del catión radical ABTS+● y del radical DPPH●
Para poder determinar la concentración eficaz para captar el 50% de radicales libres
(CE50) (Sousa, C et al; 2007) de cada tratamiento, se determinó la fase estacionaria
de cada tratamiento con los diferentes métodos utilizando, seleccionando la
absorbancia en el minuto 15 ya que no había una variación mayor del 10% a través
del tiempo, como se muestra a continuación. Se utilizaron las concentraciones de
trabajo 100, 200, 400, 800, 1600 y 3200 ppm, en las que se calcularon para cada
una de ellas las concentraciones en pozo 4, 8, 16, 32, 64 y 128 ppm
respectivamente, En este ensayo se realizaron los análisis con las concentraciones
en pozo, por medio de la siguiente fórmula:
C1 x V1= C2 x V2
[Escriba aquí]
39
Figura 7. Comportamiento de los datos obtenidos por el método ABTS+●
respectivamente para la fracción AcOEt
Figura 8. Comportamiento de los datos obtenidos por el método DPPH●
respectivamente para la fracción AcOEt
La concentración que neutraliza al 50% de los radicales libres (CE50), se obtiene a
partir de la recta obtenida al graficar el porcentaje de actividad antioxidante versus
la concentración de la muestra. Se calculó con la siguiente fórmula:
[Escriba aquí]
40
Porcentaje de captación de radicales libres: 𝐴𝑏𝑠.𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝐴𝑏𝑠.𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎−𝐴𝑏𝑠.𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜)
𝐴𝑏𝑠.𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙*100
En la Tabla 3 se demuestra un ejemplo de la obtención del porcentaje de actividad
antioxidante a partir del extracto total.
Tabla 3. Determinación del porcentaje de actividad antioxidante (AOX) de las
réplicas seleccionadas de cada tratamiento, a continuación se encuentra una tabla
a partir de las concentraciones del extracto total.
Tratamiento Método Replica Concentración de trabajo (ppm)
Concentración en pozo (ppm)
Prom AOX
EXTR
AC
TO T
OTA
L
A
BTS
1
100 2 8,72 ± 1,32 200 8 10,49 ±1,72 400 16 15,97± 0,68 800 32 26,48 ±3,41
1600 64 44,58 ±3,61 3200 128 75,42± 2,55
2
100 2 5,94 ±0,53 200 8 9,90 ±1,85 400 16 16,02± 1,72 800 32 29,53± 4,34
1600 64 49,21 ±4,72 3200 128 78,27± 1,76
[Escriba aquí]
41
Figura 9. Grafica el promedio del porcentaje de actividad antioxidante del método
ABTS vs la concentración en pozo de cada uno de los tratamientos evaluados.
6.4 Porcentaje de protección de la fluorescencia por el método de ORAC
Para poder determinar la concentración efectiva al 50% de radicales libres (CE50)
(Sousa, C et al; 2007) de cada tratamiento. Se determinó primero el porcentaje de
protección de la fluoresceína por parte de cada tratamiento con cada concentración
en pozo ensayado.
Por otro lado, con las ecuaciones de cada gráfica y los datos AOX se determinó el
valor de CE50 usando el programa SPSS, utilizando la herramienta Probit, como se
muestra a continuación en la Tabla 4 de los promedios por interpolación (ecuación)
y usando el programa Probit, incluyendo los patrones Trolox y Vitamina C.
Tabla 4. Valores del CE50 (ppm) a partir de la ecuación por interpolación y del
programa Probit de cada tratamiento y por los métodos de cuantificación de
antioxidantes.
Tratamientos Método Prom CE 50 (ppm) PROM CE 50(Probit)
Extracto Total
ABTS 76,14 76,79
DPPH 223,90 173,29
ORAC 95,010 95,01
Fracción etérea
ABTS 96,52 97,22
DPPH 264,75 190,62
ORAC 789,97 799,48
ABTS 9,34 7,58
y = 0,5418x + 7,5182R² = 0,996
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
0 20 40 60 80 100 120 140% C
apta
cio
n d
e ra
dic
ales
lib
res
Concentración (ppm)
ABTS-Extracto total 1
[Escriba aquí]
42
Fracción DCM DPPH 31,42 59,20
ORAC 122,09 122, 092
Fracción AcOEt
ABTS 22,01 38,79
DPPH 56,25 76,26
ORAC 88,11 87,50
Trolox
ABTS 12,97 8,53
DPPH 14,00 4,70
ORAC 6,88 6,88
Vitamina C
ABTS 12,97 5,91
DPPH 14,00 6,35
ORAC 6,88 6,88
DCM: Diclorometano AcOEt: Acetato de etilo
Figura 10. Concentración eficaz para captar radicales libres al 50% de los
tratamientos en relación al control positivo (Trolox y Vitamina C).
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
700,00
800,00
ABTS ORAC DPPH ABTS ORAC DPPH ABTS ORAC DPPH ABTS ORAC DPPH ABTS ORAC DPPH ABTS ORAC DPPH
Extracto Total Fracción etérea Fracción DCM Fracción Acetato Trolox Viamina C
CE5
0
Tratamientos
PROM Interpolacion (ppm)
PROM (Probit)
[Escriba aquí]
43
La capacidad antioxidante total del extracto etanólico, las fracciones de éter de
petróleo, DCM y AcOEt fueron medidos por los métodos DPPH●, ABTS+● y ORAC.
Para establecer el grado de covariación entre los diferentes métodos utilizados
relacionados linealmente se utilizó la correlación de Pearson
Tabla 5. Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre ABTS y DPPH.
[Escriba aquí]
44
Figura 11. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos
antioxidantes ABTS+● y DPPH● .
Para establecer el grado de variación entre los diferentes métodos utilizados relacionados linealmente se utilizó la correlación de Pearson Tabla 6 .Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre ABTS y ORAC.
[Escriba aquí]
45
Figura 12. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos
antioxidantes ABTS+● y ORAC● .
Por otra parte también se estableció el análisis de interacción de DPPH● y ORAC,
utilizando la correlación de Pearson.
Tabla 7. Coeficiente de correlación lineal de Pearson entre DPPH y ORAC.
[Escriba aquí]
46
Figura 13. Gráfico correspondiente a la correlación existente entre los métodos
antioxidantes ORAC y DPPH.
6.5 Método de cuantificación de fenoles y flavonoides
Para la cuantificación de fenoles y flavonoides del extracto total y sus fracciones de
Senna reticulata se utilizaron curvas de calibración de Ácido gálico (EAG) y
Quercetina (QE) respectivamente. La tabla muestra el promedio de contenido de
fenoles (mg de EAG/ g de extracto) y flavonoides (mg de QE/ g de extracto) en cada
una de las fracciones y el extracto total.
Tabla 8. Concentración de Fenoles y Flavonoides presentes en el extracto total, y
sus respectivas fracciones.
Tratamientos mg EAG/g muestra mg QE/g muestra
Extracto total 55,56 ± 13,75 50,04 ± 1,22
Fracción etérea 71,43 ± 0,00 50,74 ± 0,00
Fracción DCM 126,98 ± 36,37 93,73 ± 2,44
Fracción AcOEt 55,56 ± 13,75 93,73 ± 3,23
[Escriba aquí]
47
6.6 Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana obtenida de las bacterias fue medida por halos de
inhibición en (mm) de cada uno de los tratamientos evaluados con las
concentraciones (100, 80, 40, 20 y 10 mg/mL) a los cuales se les determinó el (%
de efecto inhibitorio relativo) usando la siguiente fórmula:
%𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟𝑖𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 =𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 ℎ𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100
Figura 14. El porcentaje de inhibición relativa para cada uno de los tratamientos
frente a E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, B. cereus y S. mutans por el método por
pozos a la máxima concentración de 100 mg/mL.
0
20
40
60
80
100
120
E.coli S.aureus B.cereus P.aeruginosa S.mutans L.acido L.casei
% d
e in
hib
icio
n r
elat
iva
Bacterias
% inhibicion relativa a concentracion de 100mg/mL
Extra. Total Eter DMC Acetato Control postivo
[Escriba aquí]
48
La selección del antibiótico o control positivo para los diferentes ensayos muestra
los siguientes resultados: En la Tabla 9 se muestran los halos de inhibición en mm
de los controles positivos del método en pozo (antibióticos) y los tratamientos con
las respectivas concentraciones evaluadas para cada una de las bacterias.
Tabla 9. Promedios de halos de inhibición en (mm) del método por pozos y su %
inhibición relativa con sus controles para la bacteria.
[Escriba aquí]
49
Res
ulta
doR
esul
tado
Res
ulta
doR
esul
tado
Res
ulta
doR
esul
tado
Res
ulta
do
(mm
)(m
m)
(mm
)(m
m)
(mm
)(m
m)
(mm
)
100
10,3
± 0
,670
,59,
3 ±
0,6
60,9
--
12,7
± 0
,662
,3-
-16
,0 ±
1,0
100
13,3
± 0
,690
80-
--
--
-12
,3 ±
0,6
60,7
--
12,0
± 1,
090
12,7
± 1,
586
,4
40-
--
--
-10
,0 ±
1,7
49,2
--
--
11,7
± 0
,679
,5
20-
--
--
--
--
--
--
-
10-
--
--
--
--
--
--
-
Co
ntro
l +
14,7
± 0
,610
015
,3 ±
1,5
100
21,3
± 0
,610
020
,3 ±
0,6
100
14,3
± 0
,610
013
,3 ±
0,6
100
14,7
± 0
,610
0
Co
ntro
l --
--
--
--
--
--
--
-
100
--
--
-14
,3 ±
1,5
70,5
18,3
±0,
610
016
,7 ±
0,6
100
13,3
± 0
,690
,9
80-
--
--
-13
.3 ±
1,5
65,6
--
14,3
± 1,
510
012
,3 ±
0,6
84,1
40-
--
--
-12
,3 ±
1,560
,7-
-13
,7 ±
0,6
100
--
20-
--
--
--
--
-12
,7 ±
0,6
95-
-
10-
--
--
--
--
--
--
-
Co
ntro
l +14
,3 ±
0,6
100
15,3
± 1,
510
021
,3 ±
0,6
100
20,3
± 0
,610
0,0-
14,3
± 0
,610
013
,3 ±
0,6
100
14,7
± 0
,610
0
Co
ntro
l --
--
--
--
.-
--
--
-
100
21,0
± 1,
010
09,
3 ±0
,660
,922
,0 ±
1,7
103
23,7
± 0
,611
619
,3 ±
0,6
134
20,3
± 0
,615
223
,0 ±
1,0
156
80-
--
-19
,0 ±
1,0
89,1
21,0
± 1,
010
312
,7 ±
0,6
88,4
13,3
± 0
,610
014
,3 ±
0,6
97,7
40-
--
-15
,7 ±
0,6
73,4
19,3
± 0
,695
,112
,7 ±
1,2
88,4
13,0
± 1,
097
,512
,7 ±
0,6
86,4
20-
--
-16
,7 ±
0,6
78,4
19,0
± 1,
093
,414
,0 ±
0,0
97,7
13,3
± 0
,610
013
,0 ±
1,0
88,6
10-
--
-12
,3 ±
0,6
57,8
20,0
± 1,
063
,912
,386
12,3
± 0
,692
,513
,0 ±
1,0
88,7
Co
ntro
l +14
,7 ±
0,6
100
15,3
± 1,
510
021
,0 ±
1,0
100
20,3
± 0
,610
014
,3 ±
0,6
100
13,3
± 0
,610
014
,7 ±
0,6
100
Co
ntro
l --
--
--
--
--
--
---
-
100
15,3
± 0
,610
0-
-13
,7 ±
0,6
65,1
15,0
± 1,
073
,8-
-16
,7 ±
0,6
100
--
808,
7 ±
0,6
59,1
--
12,7
± 0
,660
,315
,0 ±
0,0
73,8
--
14,3
± 1,
510
0-
-
40-
--
--
-12
.7 ±
0,6
7,1
--
13,7
± 0
,610
0-
-
20-
--
--
-10
,7 ±
1,5
4,9
--
12,7
± 0
,695
--
10-
--
--
--
--
--
--
-
Co
ntro
l +14
,3 ±
0,6
100
15,3
± 1,
510
021
,0 ±
1,0
100
20,3
± 0
,610
014
,3 ±
0,6
100
13,3
± 0
,610
014
,7 ±
0,6
100
Co
ntro
l --
--
--
--
--
--
--
Ext
ract
o to
tal
Fra
cció
n E
tére
a
Fra
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(30
µL c
/u)
% In
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% In
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% In
hibi
ció
n
rela
tivo
% In
hibi
ció
n
rela
tivo
% In
hibi
ció
n
rela
tivo
% In
hibi
ció
n
rela
tivo
% In
hibi
ció
n
rela
tivo
Es
ch
eri
ch
ia c
oli
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tre
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co
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us
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tan
s
La
cto
ba
cil
lus
ca
se
i
[Escriba aquí]
50
Tabla 10. Halos de inhibición (mm) de los controles positivos evaluados mediante
antibiograma
Seleccionando como se mencionó anteriormente en metodología, Gentamicina
(GEN) para E. coli y P.aeruginosa, Vancomicina (VA) para S. aureus, B. cereus,
L.casei, L.acidophilus y S. mutans
Antibiogramas
Bacteria Antibiótico Concentración Halo (mm)
Escherichia Coli
GEN 50 µg 15
AMK 30 µg 13
AMP 30 µg 12
C 150 µg -
E 15 µg -
Pseudomonas aeruginosa
GEN 50 µg 15
AMK 30 µg 13
AMP 30 µg 12
C 150 µg -
E 15 µg -
Staphylococcus
aureus
C 150 µg 10
GEN 50 µg -
E 315 µg -
VA 150 µg 12
Bacillus cereus
VA 150 µg 16
GEN 50 µg 10
E 15 µg 10
Lactobacillus casei
VA 150 µg 15
E 15 µg 11
GEN 50 µg -
Streptococcus
mutans
VA 150 µg 15
E 15 µg 11
GEN 50 µg -
[Escriba aquí]
51
7. DISCUSIÓN
De la investigación se obtuvo que el mayor rendimiento obtenido corresponde al del
extracto total de la planta con un 2,11% y le siguen en orden descendente la fracción
etérea de 1,51 %, la fracción DCM 2,01 % y la fracción AcOEt 0,99 % (Tabla 1). Se
observa un orden decreciente conforme al orden de extracción de solventes menos
polares (éter) a más polares (Acetato de etilo). González y colaboradores (2014)
realizaron un estudio fitoquímico similar de Senna reticulata vinculado a su actividad
biológica potencial. En este estudio los extractos fueron tratados con solventes de
diferente polaridad como éter metil-terbutilico así como metanol obteniéndose
rendimientos de extractos menos polares que oscilaron entre 1,87% y 2,92%,
mientras que los polifenólicos oscilaron entre 0,51% y 2,43% partiendo de 3 kg. Esto
indica que a pesar de la diferencia en la cantidad de muestra inicial en ambas
investigaciones se obtienen porcentajes bajos de rendimiento. Los rendimientos se
pueden ver afectado por diversos factores, entre los que se encuentran el punto de
colecta, el tipo de materia prima, el tipo de extracción, el tipo de secado, el ataque
de fitopatógeno, entre otros; que podrían estar involucrados o afectar el rendimiento
de extracción (Arroyo, O et al 2014). Sin embargo es importante mencionar que
estos factores no fueron evaluados en este trabajo.
El análisis fitoquímico realizado a la especie Senna reticulata (Tabla 2) evidencio la
presencia de diferentes metabolitos que pueden estar relacionados con la actividad
antimicrobiana y antioxidante de la planta. Los resultados positivos para las pruebas
de Dragendorff, Valser, Mayer y Wagner, determinaron la presencia de compuestos
alcaloides, a los cuales se les atribuye acción antimicrobiana al afectar la pared
microbiana y el ADN del microorganismo (Domingo D, et al; 2003). Se determinó
por medio de la prueba de Rosenhein la presencia de flavonoides los cuales afectan
a los microorganismos al provocar la inhibición de ácidos nucleicos y la degradación
de la membrana citoplasmática (Domingo D, et al; 2003). Con las pruebas de cloruro
férrico y gelatina se estableció la presencia de taninos. Este tipo de metabolitos
secundarios presentes en la planta presenta también acción antimicrobiana dado
que actúan sobre las adhesinas, proteínas de la pared celular y su capacidad de
unirse a los polisacáridos (Díaz J, et al; 2008). Finalmente se determinó la presencia
de compuestos como saponinas, carotenoides y taninos. Un estudio realizado por
Villanueva, J (2016) en la realización de una marcha fitoquímica con Senna
reticulata en la obtención de metabolitos secundarios confirma la presencia de estos
metabolitos ya que se encontraron compuestos tales como flavonoides, alcaloides,
taninos, saponinas y glucósidos.
Los resultados obtenidos en la evaluación de la capacidad antioxidante mediante
DPPH● ABTS+● y ORAC de la planta Senna reticulata se presentan en la Tabla 3 y
Anexos 3. Las capacidades antioxidantes de los extractos de plantas no sólo
[Escriba aquí]
52
dependen de la composición del extracto, sino también de las condiciones de la
prueba utilizada. Existen numerosos métodos publicados que miden la capacidad
antioxidante total, que se pueden clasificar en dos tipos: están basados en la
transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) y ensayos basados en la transferencia
de electrones (ET). Los ensayos basados en HAT, como el ensayo ORAC, aplican
un esquema de reacción competitivo, en el que el antioxidante y el sustrato compiten
por los radicales peroxilo generados térmicamente. Ensayos basados en ET miden
la capacidad de un antioxidante para reducir un oxidante, que cambia de color
cuando se reduce. El grado de cambio de color se correlaciona con la concentración
antioxidante de la muestra. Los ensayos basados en ET incluyen el ensayo de
fenoles totales, DPPH● y ABTS+● (Huang,D et al. 2005).
El porcentaje de captación de radicales libres con el extracto total por la técnica de
ABTS+● corresponde a un 80,43% y DPPH a 30% a la máxima concentración en
pozo evaluada de 128 ppm (Tabla 3, Anexos 3). El tratamiento con la fracción de
DCM a la máxima concentración en pozo de 128 ppm para el método ABTS+●
78,45% y para DPPH● 70,35%. Para la fracción de AcOEt se determinó en una
concentración en pozo de 128 ppm para el método de ABTS+● 80,42% y DPPH
70,35%; estos valores corresponden al análisis con el método probit. Se observó
una relación lineal entre la concentración de trabajo y el porcentaje de captación de
radicales libres en todos los tratamientos evaluados, debido a que a medida que la
concentración de cada uno de los tratamientos ensayados disminuye el porcentaje
de inhibición también lo hace de forma proporcional.
La capacidad antioxidante total del extracto etanólico, las fracciones de éter de
petróleo, DCM y AcOEt fueron medidos por los métodos DPPH●, ABTS+● y ORAC.
Para establecer el grado de covariación entre los diferentes métodos utilizados
relacionados linealmente se utilizó la correlación de Pearson. Durante el trabajo se
analizó la linealidad entre los diferentes métodos, encontrándose una alta
correlación entre en los ensayos DPPH● y ABTS+●, tal como se observó en otras
investigaciones (Babbar, N et al. 2011), el coeficiente de correlación de Pearson
tomó un valor r= 0,962 (p˂0,05); lo que nos indica que existe una asociación lineal
entre los métodos tratados (Tabla 5). Lo cual muestra que los extractos evaluados
tienen actividades comparables por ambos métodos y por tanto que estos son
reproducibles al momento de medir la actividad antioxidante. Se observó también
que mediante el ensayo ABTS+● se obtuvieron porcentajes de actividad antioxidante
mucho más altos que por medio del ensayo DPPH●, lo cual concuerda con datos
reportados por Floegel, (2011). Hay algunas razones por medio de las cuales se
podría dar explicación a este hecho, la primera se basa en la longitud de onda a la
cual se realizaron las medidas para cada ensayo.
[Escriba aquí]
53
Para el ensayo ABTS+● se tomó una longitud de onda de 740 nm, mientras que,
para el ensayo DPPH● se midió a 520 nm (Figura 11). Desde la región del visible
hay interferencias en la medición de compuestos coloreados como antocianinas y
carotenoides que estén presentes en los extractos evaluados a 520 nm (Becerra, F
et al. 2012). Otra razón podría ser el mecanismo de reacción del DPPH● con los
antioxidantes, lo cual está directamente relacionado con la conformación estructural
de los mismos; es decir un antioxidante pequeño con mayor acceso al radical
mostrará mejora actividad antioxidante, teniendo presente que el DPPH● está
impedido estéricamente (Becerra, F et al. 2012)
Por último, esta diferencia podría estar basada en la reacción reversible del radical
DPPH● con fenoles oxigenados, lo cual llevaría a bajas lecturas de actividad
antioxidante (Brand-Williams, W et al. 1995). Además, es necesario mencionar
como una posible explicación que aunque ambos ensayos miden la capacidad de
los antioxidantes presentes en una muestra para capturar el radical libre
preformado, sus condiciones de reacción y cinética son diferentes. El radical libre
DPPH● es estable en su formación por fácil disolución en metanol. En contraste, el
radical catión ABTS+● se crea por reacción entre el ABTS con el oxidante, persulfato
de potasio, lo cual lo hace menos estable y más transitorio. En términos de tiempo
de corrida, los extractos reaccionan más lentamente con el radical DPPH●
necesitando aproximadamente 30 minutos para alcanzar su estado estacionario lo
cual lo pone en desventaja con el radical catión ABTS+●, el cual alcanza su estado
estacionario muy rápidamente cercano a los 5 minutos, por tanto, la estequiometría
de las reacciones y el mecanismo de reacción son muy distintos.
Otra diferencia importante entre ambos ensayos es que el ABTS+● puede ser
disuelto en un medio orgánico u acuoso y en ambos puede medirse su actividad
antioxidante teniendo en cuenta la naturaleza hidrofílica o lipofílica de los
compuestos en la muestra (Wojdylo, A et al. 2007). Contrario a esto, el DPPH● solo
puede medirse en un medio orgánico, lo cual es un limitante para la interpretación
de la capacidad antioxidante de los compuestos hidrofílicos evaluados
(Surveswaran, S et al. 2007) y podría ser una razón para la diferencia presentada
entre el potencial de captura versus actividad antioxidante.
La determinación del CE50 establecido por interpolación para la curvas de
calibración de Trolox por ABTS+● fue de 12,9 y el CE50 de Vitamina C por DPPH●
fue de 14,0 ppm (Tabla 4, Anexo 5). La determinación del CE50 con la herramienta
Probit de Trolox muestra un valor de 8,5 para el método ABTS+● y para Vitamina C
por el método DPPH● un valor de 6,3 que comparando el CE50 por el método de
probit obtuvieron resultados de 7,58 Para la fracción DCM y 38,79 para la fracción
de AcOEt por el método de ABTS+●. Se determina una mejor capacidad
antioxidante por el método ABTS+●. Esto es gracias a que el método de ABTS●· es
[Escriba aquí]
54
soluble en solventes acuosos y orgánicos, lo cual lo hace un método apto para
determinar la capacidad antioxidante hidrofílica y lipofílica de extractos y fluidos
biológicos (Prior, R et al., 2005). Estos valores indican la menor concentración
efectiva que capta el 50% de los radicales libres. Una de las razones por las que el
método de DPPH● fue menor su CE50 en comparación con el método de ABTS+●
con valores de 59,20 para la fracción de DCM y 76,26 para la fracción de AcOEt por
el método de DPPH, debido a que muchos antioxidantes que reaccionan
rápidamente con radicales peroxilo, reaccionan lentamente o son inertes al DPPH●.
Esto se evidencia en el tiempo necesario para determinar el CE50 que van en un
rango de 1.15 min (Ácido ascórbico) a103 min (Tovar del Río, J. 2013). Esto sugiere
que los compuestos de polaridad media-alta están involucrados en la actividad de
esta planta, lográndose encontrar en estos los polifenoles, uno de estos tipos de
polifenoles es la presencia de flavonoides, las cuales se han reportado en la
literatura que flavonoides que no contienen grupos hidroxilo en el anillo B, así como
compuestos que contengan ácidos aromáticos con 1 solo grupo hidroxilo, no
reaccionaría con el radical DPPH, pero sí lo harían con el radical ABTS+●
(Rowinsky,V et al. 2005).
Al relacionar los métodos ABTS+● y ORAC se encontró una baja correlación de
Pearson equivalente a r=0,676 (p>0,05), lo que se infiere que no existe tendencia
lineal entre las variables así como una asociación significativa (Tabla 6). La
diferencia entre métodos puede ser debido a la metodología utilizada. El ensayo
ORAC tiene un tiempo largo de análisis, pero es hasta la fecha el único método que
toma la acción de los radicales libres a la terminación y utiliza las AUC (área bajo la
curva) técnica para la cuantificación. Por lo tanto, combina tanto la inhibición
porcentaje y la longitud de tiempo de inhibición de la radical libre de la acción de los
antioxidantes en una única cantidad, determinando la interacción aditiva, sinérgica
y de potenciación que resulta de la simultánea presencia de compuestos
antioxidantes, dando como resultado un valor que refleja esta actividad (Prior,
2005).
Por otro lado, ciertos compuestos no antioxidantes presentes en extractos
vegetales, pueden actuar como interferencias, proporcionando resultados
sobreestimados en el método ORAC y pequeños cambios de temperatura en los
pozos de la microplaca pueden provocar un decrecimiento en la reproducibilidad del
ensayo (Prior, 2005). Al igual, el ABTS+● termodinámicamente puede ser reducido
por compuestos que tengan un potencial redox inferior a la de ABTS+●, logrando
reaccionar con el radical indicando falsos positivos (Dudonne, 2009). Entre las
ventajas de usar los ensayos ABTS+● y ORAC, se encuentra que ambos utilizan un
sistema de reacción para medir la capacidad antioxidante de compuestos lipófilos e
hidrófilos en el cual ambos métodos mostraron similitudes al determinar TEAC
aunque su mecanismo de reacción difiera (Thaipong, 2006) (Figura 12).
[Escriba aquí]
55
Al analizar la interacción de DPPH● y ORAC (Tabla 7), se establece un índice de
correlación de Pearson r= 0,768 (p>0,05), lo que se infiere que no existe tendencia
lineal entre las variables así como una asociación significativa. Al igual que ABTS+●,
los valores reportados de capacidad antioxidante son elevados en comparación a
DPPH●; este fenómeno puede ser debido al que el DPPH● no guarda similitud con
los radicales peroxilo, altamente reactivos que participan en la peroxidación lipídica.
Muchos antioxidantes que reaccionan rápidamente con radicales peroxilo pueden
reaccionar lentamente e incluso pueden ser inerte para DPPH● debido a su
impedimento estérico mientras que ORAC aplica un mecanismo de reacción, que
mide la inhibición de la oxidación inducida por radicales peroxilo generados
térmicamente (Roy, 2010). Otra explicación posible sería que el DPPH● mide
exclusivamente la capacidad antioxidante de compuestos lipofílicos a diferencia del
ORAC que en su sistema puede detectar antioxidantes hidrofílicos e hidrofóbicos al
alterar la fuente de su radical (Prior, 2005) (Figura 13).
La determinación del CE50 establecido por interpolación para la curvas de
calibración de Trolox para ORAC fue de 6,88 y el CE50 de Vitamina C fue de 6,88
ppm. La determinación del CE50 con la herramienta Probit de Trolox muestra un
valor de 6,88 para el método de ORAC, que comparados con los tratamientos no se
encuentra un valor cercano a este. Los valores de CE50 para ORAC por interpolación
y Probit fueron de 87,49 para la fracción AcOEt , 122,09 en la fracción de DCM,
799,48 la fracción etérea y 95,01 en el extracto total en donde no se encuentra una
relación entre concentración para captar radicales libres al 50% de los tratamientos
y de los controles positivos (Tabla 4, Anexo 5).
Los ensayos DPPH● y ABTS dieron resultados comparables para la actividad
antioxidante en los extractos ensayados. Las correlaciones se encontraron entre
DPPH● y ABTS+●, mientras que las correlaciones más bajas se encontraron entre
el ensayo ORAC y los dos ensayos.
A diferencia de los otros, el ensayo ORAC tiene en cuenta la acción cinética de los
antioxidantes, lo que podría explicar la discrepancia entre los resultados obtenidos
con el ensayo ORAC y los obtenidos con los otros ensayos (Roy, 2010). Además
que este ensayo permite identificar radicales peroxilo que no necesariamente puede
tener la planta pero esto no significa que no tenga radicales con capacidad
antioxidante. También se encontraron correlaciones significativas entre los ensayos
DPPH● y ABTS+● con el contenido fenólico total. Estos resultados indican una
relación entre la concentración de compuestos fenólicos y su capacidad de
captacion de radicales libres. Por lo tanto, la presencia de compuestos fenólicos
presente en los extractos contribuye significativamente a su potencial antioxidante,
como se evidencia en la fracción DCM donde tiene una alta capacidad antioxidante
[Escriba aquí]
56
y tiene 126,98 mgEAG/g de compuestos fenólicos, mientras los compuestos
fenólicos de la fracción de AcOEt es de 55,56 mgEAG/g, para la fracción etérea
71,43 mgEAG/g y el extracto total 55,56 mgEAG/g (Tabla 8, Anexo 8). Las
propiedades antioxidantes de los compuestos fenólicos están directamente
relacionadas con su estructura. De hecho, los fenólicos están compuestos de uno o
varios anillos aromáticos que llevan uno o más grupos hidroxilo y son por lo tanto
potencialmente capaces de estabilizar los radicales libres formando radicales de
fenoxilo ( Dudonne, S et a.l 2009).
El contenido antioxidante de flavonoides está condicionada por su grado de
hidroxilación, pues una actividad antioxidante óptima se relaciona con la presencia
de grupos hidroxilos en las posiciones 3’ y 4’ del anillo, los cuales confieren una
elevada estabilidad al radical formado, siendo también estas formas de anillo
donadores de electrones y neutralizadores eficientes de los radicales libres (Rivas
K, et al; 2015). Para los tratamientos evaluados se evidenció que el extracto total
contiene 50,04 mgQE/g, la fracción etérea de 50,74 mgQE/g, la fracción DCM 93,73
mgQE/g y la fracción de AcOEt 93,73 mgQE/g respectivamente. Esto demuestra
que las fracciones de DCM y AcOEt contienen alto contenido de flavonoides (Tabla
8, Anexo 8).
Como se mencionó anteriormente en los resultados el tratamiento con mayor
contenido de fenoles y flavonoides correspondió a la fracción en DCM. En este caso
se considera que la fracción con mejor potencial antioxidante y con más contenido
de fenoles-flavonoides es la de DCM debido a que se manejan las mismas
concentraciones y su positividad geométrica de las correlaciones son significativas.
Se evidencio que el mejor método antioxidante que arrojó los mejores resultados es
el método de ABTS+●. Se presume que la planta Senna reticulata tiene una actividad
antimicrobiana frente a estas bacterias evaluadas y una capacidad antioxidante
promisoria por la presencia de los fenoles y los flavonoides.
En la evaluación de la actividad antimicrobiana, los resultados obtenidos de los
halos de inhibición de cada bacteria dependen de las concentraciones evaluadas y
del tipo de tratamiento evaluado (Tabla 9). En el caso de las bacterias Gram
negativas, se evidenció en los ensayos que no hay inhibición en las concentraciones
de 10 a 80 mg/mL del extracto total. Sin embargo, si hay inhibición en la
concentración de 100 mg/mL evidenciando un porcentaje de inhibición relativo del
70,5 % para E. coli y 60,9% para P. aeruginosa. Igualmente, en la fracción de DCM
se obtuvo un porcentaje de inhibición relativa de 100,0 % para E. coli y del 60,9 %
para P. aeruginosa. Esto puede ser debido a que las bacterias Gram negativas
además de tener peptidoglicano en su pared, poseen una capa adicional compuesta
por lipopolisacáridos, presentando una bicapa lipídica de polisacáridos y proteínas.
Además, la membrana externa posee porinas que son proteínas que actúan como
[Escriba aquí]
57
canales de entrada y salida de sustancias hidrofílica, que les confiere alta
resistencia al poder bactericida (Doyle M, et al; 1997). De antemano se evidencio
que con la concentración de 100 mg/mL y 80 mg/mL de la fracción de AcOEt inhibió
a la bacteria E.coli con un porcentaje de 100,0% y 59,1% respectivamente, pero no
se observó inhibición para P. aeruginosa con esta fracción, debido a que presenta
diferencias en la composición del lipopolisacárido (LPS) y el contenido de cationes
como el magnesio, que produce enlaces estables entre moléculas de LPS y como
complemento a este mecanismo, esta bacteria presenta porinas pequeñas que
impiden el paso por difusión de ciertas sustancias. Algunas cepas se les ha
encontrado la presencia de un LPS menos ácido en la membrana externa logrando
llegar a ser un factor que contribuye a la resistencia (Cabrera, C et al. 2013). Se
demuestra que los tratamientos con posible actividad frente a estas dos cepas son
el extracto total y la fracción DCM.
Para la bacteria Bacillus cereus se observó un porcentaje de inhibición mayor al
50% en concentraciones de 40 mg/mL a 100 mg/mL en el extracto total y en éter de
petróleo. En las fracciones de DCM y AcOEt en las concentraciones de 20 mg/mL
a 100 mg/mL se obtuvieron porcentajes de inhibición mayores al 50% con respecto
al control positivo (vancomicina). Esta es la bacteria en la que se expresa mejor
actividad antimicrobiana por el método en pozo ya que se encontró actividad para
todas las fracciones de los diferentes solventes. Esto puede explicarse debido a la
sensibilidad de esta bacteria a los tratamientos por la estructura de su pared celular
formada por un 50% de mureína y ácidos teicoicos (Doyle M, et al; 1997) que está
ligada a las proteínas específicas de competencia que incluyen una proteína de
unión al ADN asociada a la membrana, autolisinas de la pared celular y varias
nucleasas (Gutowski Z, et al; 1994).
Por otra parte la bacteria Gram positiva S. aureus presentó un valor de porcentaje
de inhibición relativo mayor al 57,8% a todas las concentraciones evaluadas de la
fracción DCM (100, 80, 40, 20 y 10 mg/mL) respecto al control positivo
(vancomicina).Por el método de pozo tuvo un porcentaje de inhibición relativo de
65,1 y 60,0 % de la fracción AcOEt a una concentración de 100 mg/mL y 80 mg/mL.
Mientras que en por la fracción de éter y el extracto total no se presentó inhibición
a ninguna de las concentraciones evaluadas. Esto puede deberse a que la bacteria
no se ve afectada a la inhibición por algunos mecanismos de resistencia como la
producción de enzimas tales como la coagulasa, la cual contiene fibrina, la cual los
protege de ataques celulares por parte del antimicrobiano. Otras enzimas como las
proteasas, nucleasas, lipasas, entre otras intervienen en los procesos de
despolimerización, bloqueando el intercambio antimicrobiano, donde el
microorganismo tiene la capacidad de bombear hacia afuera las moléculas
antimicrobianas que quieren penetrar la célula (Tavares W; 2000). En este caso se
observó que se presentó actividad por parte de la fracción DCM en las 5
[Escriba aquí]
58
concentraciones y en la fracción AcOEt en solo dos concentración (de 100 mg/mL
y 80 mg/mL).
Por otro lado las bacterias anaerobias como S. mutans presentaron actividad frente
a la fracción DCM con un porcentaje de inhibición relativo del 86,0 % hasta un
100,0% en todas las concentraciones evaluadas. De igual forma se observa que es
el tratamiento con mayor actividad, y en la fracción etérea presenta actividad a una
concentración de 100 mg/mL con un 100,0% de inhibición con relación al control
positivo. Cabe resaltar que no se obtuvo inhibición por parte de la fracción de AcOEt
y extracto total en ninguna de las concentraciones evaluadas. Esto puede deberse
a los componentes bioactivos como taninos, saponinas, flavonoides, alcaloides,
terpenos y esteroides enfatizando que estos últimos se encuentran presentes en las
fracciones de DCM y AcEOt, estos compuestos presentes son los responsables del
efecto antibacteriano. Esto demuestra que la principal acción involucrada es por la
presencia de terpenoides encontrada en estos dos extractos. Una de las razones
por las que no se observó inhibición por parte de la fracción etérea y el extracto total
es debido a que S.mutans posee una cápsula externa a la capa exterior de la
membrana celular, confiriéndole protección de materiales tóxicos o condiciones
adversas (Koneman, E et al 2008)
Los resultados del efecto inhibitorio para Lactobacillus casei con la fracción de DCM
y AcOEt en todas las concentraciones fue mayor al 90% de inhibición relativa,
mientras que para la fracción etérea y el extracto total se determinó inhibición de
90-100 % en concentraciones de 100 mg/mL y 80 mg/mL. En un estudio se observó
el comportamiento de esta bacteria hacia los diferentes extractos empleados por la
presencia de compuestos fenólicos. Los cuales afectan de manera importante al
mecanismo de síntesis de proteínas de las células (Karou,D et al. 2005). Una
investigación enfatiza las acciones farmacológicas de los taninos parecen derivarse
de su capacidad para formar complejos con proteínas y pueden actuar inhibiendo
las enzimas microbianas extracelulares, interfiriendo con la disponibilidad de
sustratos necesarios para el crecimiento bacteriano, lo que sugiere que estos
mecanismos son responsables de sus propiedades bactericidas (Campoverde, P.
et al 2017).
Para Lactobacillus acidophilus se encontró un efecto inhibitorio mayor al 80 % en
todas las concentraciones evaluadas, mientras que para el extracto total el efecto
inhibitorio se obtuvo en las concentraciones de 40 mg/mL a 100 mg/mL. Por otro
lado no se encontró inhibición con la fracción AcOEt y para la fracción etérea es
posible inhibir el crecimiento bacteriano con concentraciones de 80 mg/mL y 100
mg/mL. Estudios han demostrado que dentro del género Lactobacillus se pueden
encontrar diferencias entre especies relacionadas con las propiedades
fisicoquímicas de la superficie celular (Pelletier, C et al., 1997). Tales diferencias
[Escriba aquí]
59
van acompañadas de algunos cambios particulares en la composición química de
la pared celular. Esto puede explicar la diferencia en los resultados de la fracción
AcOEt que se encontró entre Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus.
Se cree que la actividad antimicrobiana sobre las bacterias Gram positivas se debe
a que los metabolitos secundarios contenidos en el extracto se difunden con más
facilidad a través de la pared celular de estas bacterias. Una vez allí, inhiben el
crecimiento bacteriano por interferencia del proceso de biosíntesis de la pared
celular bacteriana (peptidoglucano). El posible mecanismo de acción de estos
metabolitos, puede estar relacionado con la habilidad de inhibir enzima como la
transpeptidasa, responsables de catalizar el enlace entre glicina (Gly) y uno de D-
alanina (D-Ala), con lo que queda interrumpido la síntesis del peptiglicano,
produciéndose así la muerte del microorganismo (Cirilo, D et al., 2003).
El contenido de sustancias como: flavonoides, fenoles, taninos se encuentran en
altas proporciones en los tratamientos. Se ha evidenciado que en la fracción de
DCM se encuentran otros compuestos como los terpenos y esteroides siendo
positiva para las pruebas de Libermann-Buchard y vainillina-orto-fosfórico a estos
diferentes metabolitos como los terpenos alteran la permeabilidad de la membrana
citoplasmática y el intercambio de sustancias generando lisis celular; y los
esteroides pueden afectar diferentes vías sintéticas (Pelczar M, et al; 1992). Se les
atribuye la actividad antimicrobiana de las plantas, interfiriendo en la síntesis de la
pared celular de los microorganismos.
Para esta investigación la fracción de DCM presento una actividad biológica,
evidenciando componentes responsables de la actividad antimicrobiana y la
capacidad antioxidante de la planta. El diclorometano es un solvente comúnmente
conocido por permitir la extracción de alcaloides, aglicones y aceites volátiles. Para
Senna reticulata promete el uso de esta planta en tratamientos terapéuticos y
medicinales (Kabubii, Z. N et al 2015). Además un estudio realizado para extracción
de alcaloides, los cuales están dentro de los grupos más importantes de metabolitos
secundarios se obtuvo estos alcaloides con una eficiencia mayor por el método de
ultrasonido (Azuola, R et al. 2007)
Según el instituto de normas clínicas y de laboratorio NCCLS (2005), la clasificación
de los microorganismos ya sean resistentes intermedios o sensibles depende de la
concentración de antibiótico usado y los mm de halos estándar determinados por
esta organización. En este caso la Gentamicina usada contra E. coli (10 µg/mL) y
en este caso con valores obtenidos de (15-17 mm) se considera de intermedia a
sensible su determinación antibiótica, lo que indica que en este caso el control
positivo fue efectivo frente a esta bacteria. Por otro lado P. aeruginosa usando
Gentamicina (10 µg/mL) por los dos métodos obtuvo resultados de (10-13 mm)
siendo estos comparados con la NCCLS (2005) una bacteria resistente, siendo la
[Escriba aquí]
60
posible respuesta a la poca efectividad de los tratamientos.
En el caso de las bacterias Gram positivas evaluadas con Vancomicina (30 µg/mL)
con valores entre (15-20 mm) para S. aureus se considera que es una bacteria
sensible al tratamiento lo que indica que el control positivo fue efectivo, y que
posiblemente algunos tratamientos hicieran efecto sobre esta. Para B. cereus,
L.casei, L.acidophilus y S. mutans se obtuvieron valores de (15-20 mm), también se
consideran bacterias sensibles y que el control positivo tuvo efectividad (NCCLS;
2005).
8. CONCLUSIONES
● Las fracciones obtenidas mostraron una aceptable actividad antimicrobiana
y capacidad antioxidante en comparación de los controles positivos utilizados
en los métodos en especial la fracción DCM
● El mayor porcentaje de rendimiento obtenido fue 2,11 para el extracto total
● La fracción DCM presentó el mayor porcentaje de captación eficaz de
radicales libres al 50% (CE50) de 7,58 ppm con el método ABTS +● y 59,20
ppm con el método DPPH.
● La fracción de DCM presenta la mayor concentración de fenoles (126,98) y
flavonoides, (93,73) ya que estos metabolitos secundarios están
relacionados con la capacidad antioxidante, siendo una opción como posible
alternativa terapéutica frente al tratamiento del estrés oxidativo.
● Los métodos ABTS +● y DPPH ● se relacionan entre sí proporcionando un
soporte entre ambos métodos evaluados, a comparación con el método
ORAC.
● El extracto total a la máxima concentración evaluada [100 mg/mL]
evidenciaron el mejor porcentaje de efecto inhibitorio por pozo de 90,0%
frente a L.casei.
● La fracción de DCM utilizando todas las concentraciones (10, 20, 40, 80 y
100 mg/mL) evidencio un efecto de porcentaje de inhibición mayor al 50%
frente a las bacterias S.aureus, S.mutans, Lacidophilus y Lcasei.
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9. RECOMENDACIONES
-Se recomienda aislar y purificar los compuestos químicos activos
responsables de la actividad antimicrobiana y antioxidante de la fracción de
DCM.
-Es importante evaluar otro tipo de actividades como los antifúngicos para la
especie vegetal Senna reticulata.
-Evaluar el efecto antioxidante de las fracciones sobre enfermedades
causadas por estrés oxidativo y formación de radicales libres (enfermedades
neurodegenerativas, enfermedades antiinflamatorias, enfermedades
cardiovasculares, carcinogénicas, etc.)
-Realizar pruebas de citotoxicidad en líneas celulares de interés.
-Optimizar la caracterización de los compuestos químicos por métodos como
HPLC o Cromatografía de gases de las fracciones promisorias.
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62
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[Escriba aquí]
72
11. ANEXOS
ANEXO 1. Marcha Fitoquímica del extracto total de Senna reticulata
Metabolito Secundario
Prueba Extracto total Fracción etérea
Fracción DCM
Fracción AcOEt
Respuesta positiva
Alcaloides
Dragendorff
Formación de un
precipitado naranja
Mayer
Formación de un
precipitado blanco
Wagner
Formación de un
Precipitado blanco
[Escriba aquí]
73
Libermann-
Buchard
Observar Cambios de coloración
Vainilla- ácido-o-fosfórico
Observar Coloración azul-violeta
en la interfase
Flavonoides
Shinoda
Observar Coloración
rojiza
Rosenhein
Observar coloración de la fase
amílica
[Escriba aquí]
74
Leucoantocianidin
as
Observar Coloración
Roja
Taninos
Cloruro férrico
Observar Coloración
Azul o verde
Gelatina-Sal
Observar formación de precipitado
Saponinas
Espuma
Observar
formación de espuma
estable de 2cm en
forma de panal
[Escriba aquí]
75
Lactonas sesquiterpén
icas
Hidroxamato
Férrico
Observar coloración
violácea
Cumarinas
Hidroxamato
Férrico
Observar coloración
violácea
Erlich
Observar coloración
naranja
Fluorescencia
Observar fluorescencia
UV
Cardiotónicos
Baljet
Observar coloración naranja-
rojiza
[Escriba aquí]
76
Molish
Observar la coloración
violeta en la interfase
ANEXO 2. Resultados de las réplicas de cada uno de los
métodos de cuantificación de antioxidantes
[Escriba aquí]
77
ANEXO 3. %AOX con las réplicas seleccionadas y curvas de calibración de Trolox
– Vitamina C
[Escriba aquí]
78
ANEXO 4. Determinación del CE50 de fórmula y usando el programa Probit
y = 11,366x + 5,1055R² = 0,9977
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
TROLOX-ABTS-Réplica 3
y = 7,2536x + 5,4548R² = 0,9902
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
VITAMINA C-DPPH-Réplica 2
[Escriba aquí]
79
[Escriba aquí]
80
ANEXO 5. CE50 total de fórmula y CE50 usando Probit por los dos métodos
(ABTS+● DPPH● y ORAC), además de los compuestos estándar TROLOX y
Vitamina C
[Escriba aquí]
81
ANEXO 6. Determinación del CE50 usando PROBIT y su respectiva gráfica del
extracto total – fracciones por los métodos de ABTS+●, DPPH● y ORAC.
(CE50 por el método de probit del extracto total)
[Escriba aquí]
82
Anexo 8. ABSORBANCIAS OBTENIDAS POR TRIPLICADO DE FENOLES Y
FLAVONOIDES POR ESPECTROFOTOMETRÍA UV
[Escriba aquí]
83
ANEXO 9. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Escherichia coli.
[Escriba aquí]
84
ANEXO 10. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Pseudomonas
aeruginosa
[Escriba aquí]
85
Anexo 11. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Staphylococcus
aureus
[Escriba aquí]
86
ANEXO 12. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Bacillus cereus.
[Escriba aquí]
87
Anexo 13. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Lactobacillus casei.
Anexo 14. Resultados actividad antimicrobiana por pozo para Lactobacillus
acidophilus
[Escriba aquí]
88
ANEXO 14. Imágenes de la actividad antimicrobiana