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UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIA
ESCUELA PARA GRADUADOS
INSTITUTO DE REPRODUCCIÓN BOVINA CÓRDOBA (IRAC)
ESPECIALIZACIÓN EN REPRODUCCIÓN BOVINA
ESTUDIOS PRELIMINARES DE LOS PARÁMETROS
SEMINALES DE UNA ORCA (ORCINUS ORCA).
Med. Vet. Juan Pablo Loureiro
CÓRDOBA, 2014
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INTRODUCCIÓN
La orca (Orcinus orca) es el delfín más grande de la actualidad, su nombre
científico deriva del latín orca u ork que significa monstruo misterioso de extraño
aspecto e inus que es un sufijo que significa parecido o perteneciente a (Bastida y
Rodríguez, 2003).
Mundialmente se reconoce una única especie cosmopolita, aunque algunos
científicos propusieron dos nuevas especies (Orcinus nanus y Orcinus glacialis)
producto del análisis de ejemplares capturados en la Antártida (Bastida y
Rodríguez, 2003).
La orca es probablemente uno de los cetáceos más fácilmente identificable,
debido a su coloración característica blanca y negra, los machos adultos llegan a
medir hasta 9 metros de longitud, con un peso aproximado de 9 toneladas. Son
animales de ciclo de vida largo que maduran sexualmente una vez pasado los 10
años de edad aproximadamente (Bastida y Rodríguez, 2003)
En Mundo Marino San Clemente del Tuyú, Buenos Aires Argentina se encuentra
un macho de Orca (Orcinus orca) Kshamenk, de 25 años de edad y un peso
aproximado de 6 toneladas, maduro sexualmente.
Este macho ha sido un ejemplar clave para la investigación de la especie en
ambientes controlados, desde estudios de comportamiento hasta el más reciente
de reproducción. También cabe destacar la importancia de difusión a nivel
educacional que cumple.
Estos individuos que se encuentran en ambientes controlados son una esperanza
de vida para la especie ya que frente a la problemática ambiental de sobrepesca,
degradación del hábitat y contaminación, muchas poblaciones hoy están siendo
amenazadas en la naturaleza (Taylor et al., 2013)
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La evaluación de la calidad seminal es de gran importancia para la preservación
de una especie. Muchos test de laboratorios han sido desarrollados para evaluar
la calidad seminal y correlacionarla con la fertilidad futura. Una de las
características de los espermatozoides que ha llamado la atención de los
investigadores durante mucho tiempo es la motilidad, para cuyo estudio
descripción y valoración se han desarrollado varias técnicas (Roberk et al., 2001).
El objetivo del presente trabajo es evaluar la calidad seminal y reproductiva de una
Orca (Orcinus orca) del hemisferio Sur en un ambiente controlado.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Animal y colección de semen.
Mundo Marino cuenta con un único macho de orca (Orcinus orca) (Foto 1) llamado
Kshamenk el cual convive con una hembra de delfín nariz de botella (Tursiops
truncatus) de nombre Floopy ambos animales de 25 años de edad y sexualmente
maduros.
(Foto 1: Ejemplar macho de Orcinus orca)
Mediante estímulos discriminativos se condicionaron los animales para:
1. Kshamenk se relacione de manera tranquila mediante juegos con Floppy.
2. Floppy acepte y colabore con los juegos de Kshamenk.
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3. Diferenciar los juegos de la actividad sexual para reforzar esta última.
4. Condicionar ambos animales para que realicen esta actividad sexual en
presencia de los entrenadores en un momento específico del día, no
durante toda la jornada, por ejemplo no durante los shows.
5. Entrenarle a Kshamenk que se coloque en posición de “roll-over” cerca del
área de manejo para desensibilizar la zona genital.
6. Kshamenk permita que manipulemos el pene para secar el agua salada y
colocar el A.V. (vagina artificial).
7. La obtención y discriminación de las muestras mediante el refuerzo y la
constancia.
8. Floppy colabore en todas las instancias del comportamiento.
Para la colección del semen se designa un grupo de colección de 4 personas
llamado “colection team”. Una persona controla la posición de Floppy durante el
momento de trabajo con el macho y tres personas trabajan con el macho, una que
manipula el pene, otra que seca con toallas el agua salada y la tercera persona o
líder encargada de colocar el AV (vagina artificial) (Fotos. 2, 3, 4). Los horarios
elegidos para realizar el comportamiento fueron por la mañana, en el mismo lugar
del predio y respetando siempre la predisposición de los animales.
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(Foto. 2)
(Foto. 3)
(Foto. 4)
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Análisis del semen.
El análisis de la muestra de semen en el laboratorio se realizó primero en forma
macroscópica donde se observaron distintos parámetros como volumen, color,
densidad, osmolaridad, pH y cuerpos extraños.
Volumen: se observó directamente sobre tubo graduado, teniendo en
cuenta que los eyaculados hasta ahora registrados varían entre 1 ml a 42
ml.
Color: se consideraron normales los colores que van del blanco al
amarillento siendo patológicos los colores rosado, amarronado y verdosos.
Densidad: la densidad del semen varía desde un semen acuoso, lechoso
cremoso, hasta un cremoso, estando directamente relacionada con la
concentración.
Osmolaridad: se evaluó con micro osmómetro (the advance tm Micro
osmometer). La Osmolaridad aceptada para el semen de un cetáceo es
entre 335 a 375 mOsm/kg. (Foto 6).
Ph: se evaluó extrayendo una gota de semen del tubo y colocándola sobre
una tira indicadora de pH. Se considera un pH normal entre 6,8 a 7.
Cuerpo extraño: se evaluó observando el fondo del tubo para detectar la
presencia de algún cuerpo extraño, se considera como negativo o positivo.
Finalizada la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de la
muestra de semen. Aquellos parámetros hasta ahora estudiados son motilidad
progresiva o motilidad individual, motilidad total, velocidad espermática o vigor,
concentración y porcentaje de vivos muertos a través de la coloración vital.
M.P. (Motilidad progresiva) o M.I. (Motilidad individual): para realizar
esta evaluación se colocó una gota de semen sin diluir en un portaobjeto
atemperado de 36° a 37° grados centígrados y se colocó sobre ésta un
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cubreobjeto también a la misma temperatura. Se observó al microscópico
siempre sobre platina térmica a 400 aumentos, se debe observar un campo
y valorar subjetivamente los espermatozoides que se mueven en forma
rectilínea progresiva siendo éstos los que atraviesan el campo de
observación. Los espermatozoides que giran en círculos o avanzan en
forma oscilatoria se consideron que tienen movimientos anormales.
El porcentaje que se indicó es el de los espermatozoides con movimiento
rectilíneo progresivo del total de espermatozoides aceptados.
M.T. (Motilidad total): se evaluó al mismo tiempo que la motilidad
individual y se observó la cantidad de espermatozoides que presentan
movimiento del total de la muestra. El porcentaje que solo se indica es el de
los espermatozoides con movimiento.
Velocidad espermática o Vigor: se evaluó el vigor al mismo tiempo que la
M.I. y la M.T, teniendo en cuenta la velocidad con la que estos
espermatozoides atraviesan el campo. La escala que se utilizó es de 0 a 5
evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 5 los que
avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente.
Dentro de estos parámetros se consideraron los puntos intermedios.
Concentración: para evaluar la concentración, se preparó previamente una
solución salina formolada al 2%. Se colocaron 10 microlitros de semen en 2
ml de solución salina formolada (1/200) y se homogenizó invirtiendo el tubo
varias veces. Una vez homogenizado, se tomó 14 microlitros
aproximadamente y se cargó una cámara de Newbawer por capilaridad, en
ambos retículos, teniendo en cuenta de cargar otros 14 microlitros para el
otro retículo volviendo a homogenizar entre cada una de las cargas.
Nota: para preparar la cámara, se humedecieron los bordes de esta antes
de colocar el cubrecamara y luego se presionó ejerciendo una leve fricción
para que el cubrecamara quede fijo y al invertir la cámara no se caiga. Una
vez cargada la cámara se debe dejar reposar unos minutos para permitir
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que todos los espermatozoides decanten y se ubiquen en el mismo plano
para contarlos.
Luego se procedió a ubicar el retículo de glóbulos rojos a 100 aumentos, y
una vez localizados, se pasó a 400 aumentos para realizar el conteo. Se
contaron todos los espermatozoides que se encuentran en las cuatro
cuadrículas de las puntas y la central (5 en total) teniendo en cuenta de
incluir a los espermatozoides sobre 2 de las triples líneas de cada
cuadricula ya sea la superior derecha o la izquierda inferior.
Se contaron los retículos de ambos lados de la cámara y se sacó un
promedio. Al número de espermatozoides contado se lo multiplicó por
10.000 obteniendo la cantidad de espermatozoides por mililitro cúbico de
semen.
Coloración Vital o porcentaje de vivos muertos: se realizó extrayendo
una gota de aproximadamente 10 microlitros de semen puro y colocándola
sobre la punta de un portaobjeto limpio y desengrasado atemperado a 36° a
37° C sobre una platina térmica. Sobre esta gota se colocó una gota de
aproximadamente 30 microlitros de eosina que debe estar a la misma
temperatura que el semen. Se mezcló suavemente con la punta de la pipeta
por aproximadamente 20 segundos. Se utilizó otro portaobjeto también
atemperado, y se apoyó sobre el borde de la gota para que por capilaridad
se distribuya sobre el porta objeto, se levantó y se desarrolló el extendido
en forma firme. El fundamento de la técnica es el siguiente: el colorante
penetra la membrana de los espermatozoides muertos, dejando sin teñir los
que se encontraban vivos al momento de realizar la tinción. Para sacar el
porcentaje de espermatozoides vivos se procedió a observar el frotis a 400
aumentos contando en guarda griega todo los espermatozoides de cada
campo evaluado, discriminando los que están teñidos como muertos y los
sin teñir como vivos. Se contaron más de 100 células y para obtener el
porcentaje. La valoración de la tinción vital se realizó en el mismo día ya
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que pasado un determinado tiempo todos los espermatozoides comienzan a
teñirse.
(Foto 5: Fotografía microscópica de una
muestra de semen)
(Foto 6: Microsmómetro)
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RESULTADOS
Se colectaron un total de 110 muestras de semen desde el año 2010 hasta el
presente año 2014. En la observación macroscópica de los espermatozoides se
obtuvieron los valores promedios, máximos y mínimos para cada una de los
parámetros evaluados (Tabla 1).
Tabla 1: Evaluación macroscópica de los espermatozoides.
PARÁMETRO
PROMEDIO ±
DESVÍO ESTÁNDAR
VALOR MÁS
ALTO
VALOR MÁS
BAJO
Volumen
8,5 ± 7,2 42 ml 0,4 ml
Color
100% blanco
Densidad Lechoso- cremoso
Osmolaridad
366,5 ± 46,4 687 mOsm 338 mOsm
PH
7,2 ± 0,3 8,4 6,5
Cuerpo extraños
100% negativo
Al igual que la evaluación macroscópica se realizó la evaluación microscópica de
los espermatozoides (Tabla 2)
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Tabla 2: Evaluación microscópica de los espermatozoides.
PARÁMETRO
PROMEDIO ± DESVÍO
ESTÁNDAR
VALOR MÁS
ALTO
VALOR MÁS
BAJO
Motilidad
progresiva
89,0 ± 12,3 98 % 20 %
Motilidad total
88,9 ± 11,1 98% 30%
Velocidad
espermática
4,2± 0,8 5 2
Concentración
1014,3 x 10 6 ± 565,1 x 10 6 2830 x 10 6 60 x 10 6
Porcentaje de
vivos muertos
88± 12,6 % 96% 20%
DISCUSIÓN y CONCLUSIÓN
La colección de semen, a través de condicionamiento operante con refuerzo
positivo, es una técnica no invasiva que ha permitido colectar buena calidad y
cantidad de semen demostrándose también que es bien tolerada en los Mamíferos
Marinos.
El análisis de semen es una forma directa de la evaluación de la condición
reproductiva de un individuo, cuyo conocimiento es importante para la planificación
de la cría y manejo de la población en ambientes controlados.
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La importancia de este trabajo es que sienta base de estudio y además permite
seguir trabajando y investigando sobre las características reproductivas de la
especie orca (Orcinus orca) que en el futuro podrá estar amenazada por el
hombre.
BIBLIOGRAFÍA
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