estudio genético preimplantacional en pacientes portadores de translocación robertsoniana...
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INTRODUCCION
Las translocaciones estructuralescromosómicas son comunes en lapoblación humana (Nielsen and Wohlert,1991). Dentro de las translocacionesestructurales, las más frecuente son lastranslocaciones Robertsonianas, conuna frecuencia de 1 caso cada 1000nacidos (Gardner and Sutherland,1996).Esta proporción se ve aumentada en elcaso de los varones estériles estandoasociadas a casos de oligospermia(Chandley, 1998).
La translocación Robertsonianas fuedescrita en 1916 por W. Robertson yrepresenta la fusión pericéntrica entre 2cromosomas acrocéntricos , es decir,entre los cromosomas 13,14,15,21 y 22.El resultado es un único cromosomaanómalo, generalmente dicéntrico,
conteniendo el brazo largo de loscromosomas implicados con pérdida delos brazos cortos (R.J.M. Gardner, G. R.Sutherland. 2º ed. New Cork; 1996 ). Lascombinaciones más frecuentes son entrelos cromosomas 13 y 14 y entre loscromosomas 14 y 21. La translocación(13;14) es la más frecuente, con unaincidencia de 0.7 cada 1000 nacidos(Nielsen and Wohlert, 1991).
Las translocaciones Robertsonianaspueden ocurrir de novo enaproximadamente el 50% de los casos, oser trasmitida por los progenitores.Como consecuencia de este tipo detranslocaciones se puede ver afectada la fertilidad, observándosedistintos grados de oligo-asteno-teratozoospermias, y/o el desarrollo delembarazo, debido a una posiblealteración de la gametogénesis y/o a la
producción de gametos con unacombinación no balanceada. Un zigotono balanceado puede presentarmonosomía o trisomía.
El uso combinado del análisisespermático por técnica de fluorescenciain situ (FISH) junto al diagnósticogenético preimplantacional (DGP), es degran utilidad en parejas portadoras dedicha translocación.
El análisis espermático por FISH puedeser de gran utilidad para describir laproporción de gametos anormales enhombres portadores de unatranslocación Robertsoniana, así comopara prever la segregación espermática(Estop et al., 1996; Blanco et al., 1998).
El PGD, desarrollado para el tratamientode parejas con riesgo de trasmitir
ESTUDIO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL EN PACIENTESPORTADORES DE TRANSLOCACIÓN ROBERTSONIANA (13;14)PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF ROBERTSONIAN TRASLOCATION CARRIERS
Hebles, M.; Dorado, M.; Migueles, B.; González, M; Aguilera, L.; Núñez, G.; Lara, J.; Rodríguez, A.; Sánchez, F. y Sánchez, P.Clínica Ginemed. C/ Farmacéutico Murillo Herrera, nº 3. 41010 . Sevilla .Correo electrónico: mhebles@ ginemed.es
Junio 2009 Vol. 14 · Nº 17
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RESUMEN
En pacientes portadores de translocaciones Robertsonianas (13;14) se observa una mayor tasa de abortos. El análisiscromosómico de los espermatozoides por FISH en estos pacientes, describe la proporción de espermatozoides normales quenos podemos encontrar en el eyaculado de los mismos. Esta proporción se ajusta al número de pre-embriones normales quese obtienen en estas parejas tras someterlas a un ciclo de Fecundación in Vitro y posterior diagnóstico genéticopreimplantacional.
El objetivo del presente trabajo es establecer la relación entre el análisis cromosómico de los espermatozoides por FISH y latasa de pre-embriones genéticamente normales en pacientes portadores de una traslocación Robertsoniana (13;14).
SUMMARY
There is a higher miscarriage rate in patients with robertsonian translocations. The chromosomal analysis by FISH in thespermatozoa of these patients describes the percentage of normal spermatozoa that we can find in the ejaculate. From therelevant literature it has been shown that this proportion is comparable to the rate of normal embryos that can be found in apreimplantation genetic diagnosis IVF cycle.
The aim of this study is to determine the correlation between the chromosomal analysis of spermatozoa by FISH and thepercentage of chromosomically normal embryos analysed by PGD in an IVF cycle in patients with Robertsonian translocations.
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alteraciones genéticas a susdescendientes, nos permite la selecciónde embriones no afectos, siendo unaalternativa al diagnóstico prenatal.
En el presente trabajo, exponemos laexperiencia en dos ciclo de PGD porvarón portador de una translocaciónRobertsoniana entre los cromosomas 13y 14. La segregación meiótica de loscromosomas 13 y 14 fue analizada en los embriones, y comparada con las anomalías observadas en losespermatozoides.
MATERIAL Y METODOS
El estudio fue realizado a dos parejas queacudieron a la Unidad de Reproducciónde la clínica Ginemed, tras varios añosde esterilidad y abortos repetidos enambos casos.
Tras la anamnesis inicial de la pareja,fueron solicitadas pruebas hormonales,serológicas así como cariotipo a ambosmiembros de la pareja y estudio seminalal varón.
El cariotipo en sangre periférica se realizóen la Unidad de Genética de la ClínicaGinemed mediante cultivo de linfocitos enmedio PB-Max y tinción de bandas G.
El estudio seminal se realizó en laUnidad de Andrología según protocolode la Organización Mundial de la Salud(OMS-99).
La paciente 1 tenía 36 años de edad. Supareja, con 38 años, presentaba uncariotipo con una translocación entre loscromosomas 13 y 14: 45 XY, t (13,14)(q10;q10) . Tras el análisis espermático fuediagnosticado de oligo- teratozoospermiasevera y astenozoospermia moderada.
La paciente 2 presentaba 38 años deedad, y su pareja, con 37 años eraportador de una translocación entre loscromosomas 13 y 14: 45 XY, t(13;14)(q10;q10). En este caso, el varón presentaba un recuento y una motilidad espermática normal con unateratozoospermia severa.
En ambos casos, las mujerespresentaban un cariotipo 46 XX, y era elprimer ciclo de Fecundación in Vitro alque se sometían tras haber sufrido 2
abortos en el primer caso y 3 en lasegunda pareja.
ANALISIS DE FISH EN ESPERMATOZOIDES
El FISH en espermatozoides se realizósegún protocolo estándar (Munné et al,1998), empleando una mezcla dehibridación que contiene un IndicadorLocus Específico (LSI) para elcromosoma 13, visualizándose a la luznaranja, y teloméricas para 14q en elespectro verde.
Las muestras seminales fueron fijadascon la mezcla metanol: acético 3:1.Posteriormente, los portas con lasmuestras fijadas fueron incubados en lasolución dithiothreitol (DDT)/ Triton X-100 al 1%. A continuación se realizó unahibridación con mezcla de sonda paralos cromosomas 13 y 14.
Los portas con las muestras fueronobservados en un microscopio defluorescencia (Nikon E-400) con losfiltros apropiados para la visualizaciónde los cromosomas.
ESTIMULACIÓN OVÁRICA
En ambos casos se realizó unaestimulación ovárica utilizando unprotocolo largo tras un mes de reposoovárico con anticonceptivos. Para lasupresión se ha utilizado análogos de laGnRH (Synarel diario ®) desde la mitadde la fase lútea previa a dosis de 1pulverización cada 12 horas intranasal.Según los niveles séricos de FSH, LH yestradiol y en función de la edad de lapaciente se fijan las dosis deestimulación ovárica con hormonafolículo estimulante (FSH) (Gonal-F ®) YMenotropina (HMG Lepori ®). Laadministración de estos se individualizade acuerdo al control ecográfico delciclo. El criterio para la administraciónde la hormona gonadotrófica humana(1000 UI HCG) (HCG Lepori ®) es lapresencia de al menos dos folículos de 16mm. De diámetro. La administración deaGnRH y FSH se suspende el día de laadministración de la HCG.
Las punciones se realizaron a las 36horas de la administración de la HCG porvía vaginal ecoguiada.
Las muestras usadas para ICSI se
prepararon mediante combinación dedos procedimientos: gradientes dedensidad en capas de 0.3 a 1 ml de 40%y de 0.3 a 1 ml de 80% de Sperm Grad(Vitrolife ®) y Ham F-10 (Gibco) congentamicina, seguido por un swim-upusando como medio final Gamete(Vitrolife ®).
La microinyección se realizó entre las 3 y6 de la captación oocitaria descrita endetalla por Svalander et al. Previamenteel cúmulo fue eliminado con HYASE 10 enG-Mops en microgotas de 25 μL durantesegundos y finalmente pasando repetidasveces por micropipetas de distintodiámetro en G-Mops. La fecundación deevaluó a las 16-20 horas. Alos tres días dela punción se evaluaron los pre-embriones, realizándose la biopsia enaquellos donde estaba indicado.
DIAGNOSTICO GENETICO PREIMPLANTACIONAL
Pareja 1: Se procedió a la biopsia de 4pre-embriones que en día +3 estaban enestadío de ocho células.
Pareja 2: Se biopsiaron un total de 12pre-embriones que en día +3 tenían unnúmero de células mayor de 6.
Una célula por embrión fue biopsiadas yporteriomente fijada según la técnica deTarkoswky(1996) : metanol:acético (3:1).Una vez fijadas las blastómeras, fueronanalizadas por FISH, estudiándose loscromosomas 13, 16, 18, 21, X e Y.
RESULTADOS
Tras la realización del FISH en lasmuestras seminales de ambos pacientesse obtuvieron los siguientes resultados:en la pareja 1 se observó que un 5.62%de los espermatozoides estudiadospresentaban disomía para el cromosoma13 y un 6.78% de los espermatozoideseran disómicos para el cromosoma 14.Para la pareja 2 se observó que un 6.52%de los espermatozoides eran disómicospara el cromosoma 13 y un 7.82% deellos presentaban disomías para elcromosoma 14 (Tabla 1).
Respecto a los pre-embrionesbiopsiados, a la pareja 1 se lebiopsiaron un total de 4 pre-embrionessiendo 3 de ellos equilibrados y 1desequilibrado.
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Hebles, M. et al. Estudio Genético Preimplantacional en pacientes portadores de translocación Robertsoniana (13;14)
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A la pareja 2 se le biopsiaron un total de12 pre-embriones, con 5 de ellosequilibrados y un pre-embriónequilibrado pero no informativo para elcromosoma 16. (Tabla 2).
Las aneploidías para los cromosomasimplicados fueron monosomías para elcromosoma 14 y monosomías/trisomíaspara el cromosoma 13.
Un 75% de los preembriones analizadosen el caso de la paciente 1 y un 66% en elcaso de la paciente 2 no presentabananomalías en los cromosomas implicadosen la translocación. Esto es similar a la anomalías detectadas en losespermatozoides en ambos casos (78.4%en la pareja 1 y 72% en la pareja 2).
En ambos casos se realizó unatransferencia de 2 pre-embriones,criopreservándose los restantes por latécnica de vitrificación , según protocolode Kuwayama M.( Kuwayama M., 2007).
DISCUSIÓN
El análisis espermático por FISH nos dainformación acerca de la proporción deespermatozoides normales en pacientesportadores de anomalías cromosómicas.Mediante este análisis también podemospredecir la proporción de gametos conanomalías que nos vamos a encontrartras la realización de un ciclo defecundación in Vitro y posteriordiagnóstico preimplantacional.
Los pre-embriones resultantes de lafecundación de espermatozoidesportadores de una translocaciónrobertsoniana entre los cromosomas 13y 14 pueden ser portadores decromosomas derivados dicéntricos quese han formados como consecuencia deroturas en los brazos cortos de amboscromosomas ( Han JY, et al). Estos pre-embriones, si no son analizados, puedendar lugar a abortos repetidos.
Mediante la combinación de un ciclo deFecundación in Vitro seguido de undiagnóstico Genético Preimplantacional,se realiza una selección de aquellos pre-embriones “normales” o equilibrados,pudiendo evitar así el aborto que sufrenestas parejas.
En nuestro estudio tras el análisis delPGD se observa que aunque el número degametos equilibrados en ambos casos(75% y 66%) es comparable con laproporción de espermatozoidesnormales en el eyaculado (78.4% y71.66). Otras anomalías de los pre-embriones pueden ser debidas a factoresoocitarios y/o efectos post-meióticos.
Este trabajo muestra que la proporciónde pre-embriones anormales debido a la
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Tabla 1. – Análisis espermático.
Tabla 2. Resultados del PGD
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