UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

MAGISTER EN HORTICULTURA

OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA

DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME

METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO

TESIS DE GRADO

MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE

TALCA, CHILE

2012

UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE ANTIOXIDANTES PROVENIENTE DE MANZANA

DE PIEL Y FRUTOS PEQUEÑOS DE RALEO DE MANZANA SOBRE SÍNDROME

METABÓLICO EN UN MODELO ANIMAL MURINO

POR

MAURICIO ANDRÉS POBLETE BUSTAMANTE

Presentada a la Universidad de Talca

Como parte de los requisitos para optar

Al grado académico de

MAGISTER EN HORTICULTURA

TALCA, CHILE

2012

COMISIÓN EVALUADORA

Iván Palomo Gonzalez

Tecnólogo Médico, Dr.

Facultad de Ciencias de Salud

Universidad de Chile

Iván Razmilic Bonilla

Químico, Dr.

Instituto de Química de los Recursos Naturales

Universidad de Talca

PROFESOR TUTOR

José Antonio Yuri Salomón

Ingeniero Agrónomo, Dr.

Facultad de Ciencias Agrarias

Universidad de Talca

Agradecimientos

La idea de ingresar al programa era aprender algo nuevo, en lo que estaba trabajando pero sinconocimientos en “el como” funcionaban los organismos vegetales…. Creo que fue unaexperiencia enriquecedora que ayudo a aumentar mis conocimientos en temas en los que no eraespecialista, no fue para nada fácil, pero creo que con esto estoy terminando un largo viaje deaprendizaje.

Es difícil comenzar a pensar y escribir las personas que de alguna u otra manera me ayudaron aterminar este largo proceso que comenzó hace aproximadamente 3 años.

Y para no dejar a nadie fuera, creo que una manera bastante lógica es ordenarlo y dividirlos endos grupos: Uno profesional/educacional y otro personal.

Profesional:

Al primero que debiera agradecer es al profesor José Antonio Yuri por abrirme las puertas de unode los Centro Tecnológicos con más prestigio que cuenta la Universidad de Talca, el Centro dePomáceas. Digo esto porque es un referente nacional en tema de fruticultura y que tuve laoportunidad de trabajar ahí. Al conocer la dinámica interna de este centro me llevo a conocercómo se pueden realizar investigaciones y que tengan un impacto concreto en la industria.

A la Sra. Amalia Neira, me gustaría agradecer su paciencia y ayuda, que durante lasconversaciones que tuvimos, me sirvió en todas las dificultades metodológicas que nos fuepresentando mientras avanzábamos en el desarrollo de la tesis. Y por intermedio de ella a IvettePeña que me fue una tremenda ayuda en las mediciones de fenoles y capacidad antioxidante, ypor intermedio de ella al Centro de Pomaceas que me ayudaron de alguna u otra manera.

A los profesores guías, Dr. Iván Palomo y Dr. Iván Razmilic, por auxiliarme en ámbitos delconocimiento que yo no manejaba.

Al Sr. Reyes que me ayudo en toda la parte de HPLC y química próximal.

A Lisbet, que en el último tiempo me tubo una paciencia extraordinaria.

Al Programa de Capital Humano Avanzado de CONICYT y el Gobierno Regional del Maule,que me apoyaron en los dos primeros años y que sin su ayuda no hubiera podido entrar alPrograma de Magíster en Horticultura.

Personal:

Una de las personas que más me ayudo fue Luis, gracias por facilitarme todas las instalaciones einsumos que podía, no tan solo con la tesis…. Y por la amistad en los años en que estuve en laUniversidad…. Que no fueron pocos….

A Rodrigo por compartir su conocimiento en cómo trabajar con ratones en cautiverio, terminar yprocesar los datos obtenidos… Además que fuiste un gran apoyo cuando la paciencia seagotaba….

A mis padres, que me forjaron como persona y en gran parte a ellos estoy ahora aca terminandomi segundo programa de Magíster….

Según creo, a la persona que más debiera agradecer es a mi Natalia, que durante estos tres años latuve que dejar de lado para dedicarme a estudiar, siendo una gran apoyo en aquellos momentosen los que las fuerzas me abandonaban. Además, de acompañarme a revisar el ensayo con losanimales o cuando me explicaba las formulas inentendibles de cierto ramo…. Gracias por lapaciencia……..

A mi gran compañera Natalia

que sin su ayuda y apoyo

no hubiera sido capaz de terminar

1

I. RESUMEN

Chile, desde finales de 1980, está pasando por un extraordinario momento económico que lo ha

llevado a situarse como líder en Latinoamérica según una gran cantidad de indicadores

(Desarrollo Humano, nivel de pobreza, Producto Interno Bruto, etc.). Es así que nuestro país fue

invitado a formar parte de la Organization Economic Cooperation Development (OECD), grupo

de países con un fuerte desarrollo socio-económico, como Estados Unidos, Japón, Noruega,

Alemania, Corea del Sur entre otros. En temas de fruticultura, el nivel de liderazgo que ha

alcanzado está industria en nuestro país lo sitúa en un nivel de categoría mundial, logrando ser

lideres exportadores del hemisferio sur de fruta fresca en diversas especies como manzana, uva

de mesa, kiwi, cerezas por citar algunos. Y actualmente también tiene una posición de líder de

exportación en fruta procesada con frambuesas y arándanos. Aprovechando las fortalezas de ser

un proveedor confiable de alimentos, entre otras cualidades de nuestro país.

Este periodo de gran brillantez trae consigo nuevos desafíos, los cuales se debe hacer cargo la

sociedad en su conjunto y no tan solo el Estado. Debido a que la globalización y la rapidez de las

investigaciones han transformado al mundo en el que Chile se encuentra inserto y que en la

muchas ocasiones debe competir con países con mayores recursos. Una de las alternativas, que se

han barajado para hacer frente a este nuevo escenario es la utilización de las ventajas

competitivas que presenta nuestro país para el desarrollo de la fruticultura, como es el clima y la

disposición de agua (aunque cada vez sea más escaso este vital elemento). Por otra parte, es

necesario aumentar la competitividad de la industria fruticultura en general, para evitar la entrada

de nuevos competidores que pueden dejar a nuestro país fuera del mercado de exportación de

fruta. Esto se deberá conjugar con las exigencias de los mercados, que cada vez están poniendo

mayores exigencias, pero que puede ser una gran oportunidad de negocios para los productores

nacionales. Una de las demandas crecientes son los alimentos con propiedades biológicas para

evitar enfermedades o suplementos alimenticios de origen natural que signifiquen beneficios para

la salud de las personas, especialmente en la última etapa de la vida.

2

La producción de manzana fresca es uno de los puntales en la fruticultura nacional, siendo

solamente superada en cantidad de producción por la uva de mesa. Para la Región del Maule es la

segunda fuente de ingresos económicos, según la Agencia Regional de Desarrollo Productivo

Maule (Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Con el fin de aumentar la

competitividad de este sector es que el trabajo realizado toma una gran importancia, porque se

está buscando utilizar diversos componentes que no están siendo comercializables en la

producción de manzana, ni tampoco se les ha asignado valor. Lo que traería consigo aumentar la

competitividad de un sector económico que ha sido fuertemente golpeado por la valorización del

peso en desmedro del dólar. Se desea desarrollar un nuevo producto en base de los desechos y/o

subproductos de la industria de la manzana, por lo que se orientaron los esfuerzos en dos puntos

claves:

Agregación de valor en el fruto pequeño (raleo), el cual es descartado en alrededor de un

70%, con el fin de alcanzar mayores calibres y por consiguiente mayores precios de venta

en la fruta fresca.

Por otra parte, utilizar los desechos industriales (piel) que son eliminados en el proceso de

producción industrial de chip de manzana.

Se tomaron en consideración para la extracción de antioxidantes desde estos residuos diferentes

factores que facilitaran el escalamiento desde el laboratorio hacia la industria. El primero fue

descartar distintas metodologías que no son utilizadas por la agroindustria en sus procesos. El

segundo paso fue estudiar si existían diferencias entre los cultivos orgánicos y tradicionales,

especialmente en la extracción desde el fruto pequeño para estudiar la existencia de agroquímicos

utilizados en sus procesos y que podrían estar presentes debido a que no han cumplido el tiempo

de carencia, ya que su presencia sería perjudicial para la salud. Y por último, utilizar los extractos

en un modelo animal para confirmar los posibles efectos benéficos que podrían resultar en su

administración en organismos complejos y descartar efectos nocivos agudos para la salud.

Los resultados del laboratorio demostraron que en el grupo control con dieta grasa se logro

inducir el aumento considerable de peso y valores elevados en los indicadores relacionados al

metabolismo lipídico, debido a la dieta alta en grasa o hipercalórica a la que fueron sometidos.

En cambio en los grupos en estudio que fueron sometidos a los tratamientos con los extractos

3

altos en antioxidantes, proveniente desde el desecho agroindustrial, disminuyeron los valores

hasta niveles del control normal. Concluyendo que el extracto alto en antioxidantes provenientes

de la manzana se encuentra relacionado con la disminución de colesterol total y colesterol LDL y

a su vez un aumento de colesterol HDL.

4

II. CONTENIDO

I. RESUMEN ...............................................................................................................................1

II. CONTENIDO ...........................................................................................................................4

III. INDICE DE FIGURAS.............................................................................................................5

IV. INDICE DE TABLAS ..............................................................................................................9

V. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................11

VI. HIPOTESIS.............................................................................................................................12

6.1 Objetivo General..............................................................................................................12

6.2 Objetivo Específico .........................................................................................................12

VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ..............................................................................................13

VIII. METODOLOGÍA............................................................................................................21

8.1 Recolección Y Extracción ...............................................................................................21

8.2 Preparación De Los Extractos .........................................................................................22

8.3 Caracterización Química .................................................................................................24

8.4 Análisis Estadístico..........................................................................................................25

8.5 Preparación De Las Dietas. .............................................................................................26

8.6 Ensayos Biológicos..........................................................................................................26

8.7 Análisis Bioquímicos.......................................................................................................28

8.8 Análisis De La Dieta........................................................................................................28

IX. RESULTADOS.......................................................................................................................30

9.1 Búsqueda De La Metodología Óptima De Extracción De Compuestos Fenólicos Y

Actividad Antioxidante...............................................................................................................30

5

9.1.1 Evaluación De Concentración De La Mezcla Etanol/H2O.......................................30

9.2 Cuantificación De Los Extractos .....................................................................................38

9.3 Composición De Las Dietas Y Los Extractos .................................................................41

9.4 Ensayos Biológicos..........................................................................................................42

9.4.1 Ensayo De 10 Ml De Extracto / 250 Ml De Volumen Final ....................................42

9.4.2 Ensayo Concentración Constante De 400 Mg / Kg Peso De Raton.........................50

X. CONCLUSIONES ..................................................................................................................57

XI. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................59

III. INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA.

OBTENIDO DESDE MANACH, ET AL 2004. 14

FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON

SEPARADAS A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA

SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE 0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M

NA2HPO4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA

CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES 10 – 40.

TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 – 20, LDL EN FRACCIÓN 21 -27 Y HDL EN

FRACCIÓN 28 – 34. (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL “NORMAL” DE LA

PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1

ELUYE EN LA FRACCIÓN 23 – 27. (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR -/-

Y RATAS APOE –/-. (D) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE OBESAS LDLR -/- Y RATAS APOE –/-.

(KENNEDY ET AL., 2010) 20

FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES

CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 34

6

FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS

EN DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

35

FIGURA 5. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES

CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN) 35

FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS

EN DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE

EXTRACCIÓN) 36

FIGURA 7. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80%

ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37

FIGURA 8. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40%

ETANOL EN DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO. 37

FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL

ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI

TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y

GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL

DIETA GRASA (DG). 42

FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML

DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),

GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH

PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). 43

FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI

TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y

GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL

DIETA GRASA (DG). 44

FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO

EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL 45

FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS

EN ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP). 45

7

FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN

ESTUDIO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY

SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP)

Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E,

F, G VALOR P<0,001. 47

FIGURA 15. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN COMPARACIÓN CON

EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),

CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR

P < 0,05 48

FIGURA 16. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL

(COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG),

TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO). PARA ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO EN 250 ML DE

SOLUCIÓN FINAL 49

FIGURA 17. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN POR GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO

400 MG / KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH

ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI

PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) 50

FIGURA 18. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR CADA GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE

400 MG / KG PESO DE RATON 51

FIGURA 19. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO 400

MG/KG PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH

ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI

PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (CG). * VALOR P < 0,05

Y ** VALOR P < 0,05 52

FIGURA 20. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN

ESTUDIO PARA EL ENSAYO DE 400 MG/ KG DE PESO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJI ORGÁNICO

(FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA

NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).A VALOR P<0,05 . 54

FIGURA 21. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN ENSAYO DE 400

MG/KG DE PESOEN COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI

8

TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y

GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL

DIETA GRASA (DG). A VALOR P < 0,001 Y B VALOR P< 0,05 55

FIGURA 22. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL

(COL T), COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG),

TEJIDO ADIPOSO BLANCO (T ADIPOSO) E HIGADO (HIGADO) EN ENSAYO DE 400 MG / KG PESO

DE RATON 56

9

IV. INDICE DE TABLAS

TABLA 1. ANALISIS ANOVA DE LA CANTIDAD DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS................................ 31

TABLA 2. RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE

FENOLES EN LOS EXTRACTOS .................................................................................................................... 31

TABLA 3. ANALISIS ANOVA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS ....................... 32

TABLA 4. RESULTADOS CON LAS SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN

LOS EXTRACTOS............................................................................................................................................. 33

TABLA 5. RESULTADOS PRIMERA ETAPA DE EXTRACCIÓN. *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON

LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 MATERIAL VEGETAL .... 39

TABLA 6. RESULTADOS SEGUNDA ETAPA DE EXTRACCIÓN *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON

LOS MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL

............................................................................................................................................................................. 40

TABLA 7. RESULTADOS DE LOS EXTRACTOS DEFINITIVOS. (*) LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ES

EL MG DE ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL 40

TABLA 8. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS, DE ACUERDO A LA QUÍMICA PROXIMAL. (*) ELN

ELEMENTO LIBRE DE CARBONO ................................................................................................................ 41

TABLA 9. RESULTADOS DE QUÍMICA PROXIMAL Y CONTENIDO DE FENOLES PARA LOS

DIFERENTES EXTRACTOS ............................................................................................................................ 41

TABLA 10. INGESTAL TOTAL POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DE ALIMENTACIÓN DURANTE EL

ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL ............................................................ 43

TABLA 11. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL

(COL HDL), GLICEMIA (GLI). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),

GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL

(GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS

RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M)............................................... 46

10

TABLA 12. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ORGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT),

COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL

LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY

SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y

FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).......................... 47

TABLA 13. INGESTAL TOTAL DE ALIMENTACIÓN POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL

ENSAYO 400 MG / KG PESO DE RATON FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY

SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP)

Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG) ...................... 51

TABLA 14. RESUMEN DE LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL

(COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL).

PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),

CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS RESULTADOS SE

ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M) ............................................................................... 53

TABLA 15. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ÓRGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT),

COLESTEROL HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL

LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY

SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y

FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). CON EL

RESPECTIVO ERROR DE LA MEDIA (E.M) ................................................................................................. 54

11

V. INTRODUCCIÓN

La pérdida de competitividad del sector frutícola nacional le ha llevado a disminuir los márgenes

de ganancia que tuvieron en el pasado reciente. Una de las razones, es la falta de inversión en la

búsqueda de nuevas formas de “agregar valor” a los productos y solamente han aprovechado las

ventajas competitivas que presenta nuestro país, como son las condiciones edafoclimáticas

idóneas para la producción frutícola, acceso relativamente a fácil a agua para riego, baja

presencia de plagas y enfermedades, entre otros factores. Por otra parte, la adopción de

tecnologías traídas desde el extranjero ha sido un factor común en la agricultura nacional, lo que

crea una alta dependencia a otros países que muchas veces son competidores. Esto ha motivado al

Centro de Pomáceas (CP) a realizar investigaciones que puedan revertir esta situación, buscando

nuevas fuentes de valor en productos no utilizados por la industria frutícola nacional, como son la

fruta de raleo y los desechos de los procesos industriales en los que la materia prima es la

manzana. Una de las características que presenta este fruto es la alta cantidad de antioxidantes de

tipo fenoles presentes en la piel, lo que lo hace atractivo para realizar I + D en la obtención de un

nuevo producto. Además, por investigaciones llevadas a cabo por el CP se conoce que los niveles

de fenoles encontrados entre los 35 y 45 días después de plena flor son altos en comparación con

otros estadios de desarrollo del fruto de la manzana. Lo que sumado, a que es la fecha en la que

se realiza el proceso de raleo, ofrece una gran cantidad de material vegetal disponible y no

aprovechado que puede ser de gran valor para combatir enfermedades crónicas como el cáncer, la

diabetes y problemas cardiovasculares, que han aumentado su prevalencia, principalmente por el

empeoramiento de los estilos de vida de las personas, en países como Chile.

El objetivo de la tesis fue encontrar una metodología de extracción eficiente e inocua de

antioxidantes, para el desarrollo de un extracto que pudiera ser administrado en el modelo animal

de síndrome metabólico like. Con el fin de estudiar su comportamiento y con especial énfasis en

los posibles resultados que se pudieran obtener beneficiosos que se pudieran extrapolar a

personas, como por ejemplo revertir las diferentes manifestaciones de este síndrome, como son

hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, diabetes, obesidad e hipertensión.

12

VI. HIPOTESIS

La cantidad de fenoles y actividad de los antioxidantes proveniente de la piel de manzana y frutos

pequeños de raleo es capaz de producir mejoras en la condición patológica que presenta un

Modelo Murino de Síndrome Metabólico – like.

6.1 OBJETIVO GENERAL

Estudiar diversas variables agronómicas en fruto pequeño y subproductos de manzana que

intervienen en la concentración de antioxidantes y su efecto en un Modelo Murino de Síndrome

Metabólico-like.

6.2 OBJETIVO ESPECÍFICO

Determinar un protocolo eficiente y saludable de extracción de antioxidantes fenólico con énfasis

en quercetinas, sin la utilización de nitrógeno líquido y ultrasonido.

Caracterizar los extractos mediante su capacidad antioxidantes y contenido de fenoles.

Determinar si existe acción benéfica del extracto sobre el modelo animal y si esta es dependiente

de la concentración de los antioxidantes.

13

VII. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Chile ha privilegiado la exportación de recursos naturales como la minería (principalmente

cobre), salmón, productos forestales y la agricultura. A principios de los años noventa este fue

una inyección importante a la economía nacional alcanzando registros de crecimiento nunca antes

visto en la historia nacional, lo que fue ayudado de gran manera por el esfuerzo de los

productores nacionales, el alto valor del dólar y la apertura de Chile hacia el mundo

(Globalización). En los últimos años las diversas circunstancias financieras y económicas del

mundo han incidido en la apreciación del peso local y la disminución del precio del dólar, lo que

se ha traducido en una pérdida en la competitividad de los productos horto – frutícolas

nacionales. Uno de los factores que explican la disminución en la curva de crecimiento del país es

que se está alcanzando el límite de los Factores Productivos, lo que se ha visto reflejado en el

estancamiento en el crecimiento nacional, por lo que es necesario comenzar a buscar nuevas

fuentes de creación de valor aprovechando las bases productivas ya instaladas, es por esto que si

se desea seguir creciendo y mantener el nivel de liderazgo a nivel internacional que se ha

alcanzado hasta el momento, es importante innovar para proporcionar “valor agregado” a sus

productos.

En el contexto de aumentar la cartera de los productos ofrecidos por Chile en el mercado mundial

es necesario innovar para incrementar los retornos de los fruticultores en general, la comunidad

científica nacional ha comenzado a estudiar los atributos que pueden tener diversos alimentos,

por el envejecimiento de la población y los problemas que esto puede causar, principalmente por

el aumento de enfermedades crónicas no transmisibles que esto acarrea y su correspondiente

aumento en los costos de salud que se han experimentado en los últimos años, lo que se ha

traducido en un cambio de enfoque de los consumidores de frutas y hortalizas en países

desarrollados (principales mercado de destino de estos productos) y en nuestro país.

Desde el punto de vista nacional, es prioritario realizar estudios que comprueben características

que demandan los exigentes mercados internacionales en donde se exportan nuestros productos,

por lo que se podrían obtener mejores precios de venta, y por otra parte se pueden identificar y

aislar estos componente a partir de material de desecho (fruta de raleo, fruta con daño o

14

subproductos) para ser comercializado en forma independiente como un nuevo producto. Es por

esto que la tendencia mundial se ha centrado en identificar los componentes biológicamente

activos de los alimentos que puedan disminuir el riesgo de enfermedades (Diplock et al., 2007).

Debido a lo anterior es que el interés de los productores nacionales se conjuga (aumento de

ganancias) con las demandas de los mercados (mejorar calidad de vida en la vejez).

Lo anterior, ha llevado al mercado de preocuparse de ciertas propiedades de los alimentos, es por

esto que la manzana adquiere un importante rol, debido a que es uno de las principales frutos

consumidos a nivel mundial y uno de los más importante frutales cultivados en el país, el cual

representa una significativa fuente laboral y de ingresos, en especial en la región del Maule

llegando a un 5% del PIB Regional, superado exclusivamente por la producción de celulosa(Agencia Regional de Desarrollo Productivo Maule, 2010). Por otra parte, la confirmación por

medio de diferentes reportes encontrados en la literatura demuestran que la manzana posee una

gran cantidad de antioxidantes, en especial fenoles (Huber & Rupasinghe, 2009; Lee, 2003; J.A. Yuri, et al. 2009). Lo anterior, se suma a que es una de las frutas que aporta una cantidad

importante de antioxidantes fenólicos consumidos en la dieta de las personas, según estudios

previos representa el 22% de los fenoles consumidos (Vinson, et al. 2001). Los compuestos

fenólicos no son exclusivos de las manzanas, también existen en una gran cantidad de frutas y

hortalizas (manzanas, arándanos, frutillas, frambuesas, cebollas, ajos, etc.).

Con la finalidad de entender de mejor manera su formación en los organismos vegetales, se

puede realizar una separación de acuerdo a sus características químicas, por lo que se pueden

encontrar tanto como compuestos simples o complejos. Por lo que en organismos vegetales se

pueden encontrar compuestos simples y complejos, como ejemplo de los compuestos simples se

encuentran el ácido cafeico y el ácido clorogénico (Awad & de Jager, 2002). Ver FIGURA 1.

FIGURA 1. COMPOSICIÓN DE DIFERENTES ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE MANZANA. OBTENIDO DESDE

MANACH, ET AL. 2004.

15

El principal fenol complejo que se pueden hallar son los flavonoides, que presentan como

característica común 15 moléculas de carbono en su estructura (Ver FIGURA 1). A partir de los

flavonoides se pueden obtener diversas moléculas derivadas como flavononas, flavonones,

leucoantocianidinas, flavones y antocianidinas. Otras moléculas complejas son los biflavonilos

que tienen un esqueleto de C30, Benzofenonas, betacianinas y los taninos (Vermerris &Nicholson, 2007).

Los principales compuestos fenólicos que se encuentran en las manzanas son Acido clorogénico,

quercitina glucósido, quercetina xilosa, floricidina, procianidina B2, entre otras (Holderbaum, etal. 2010; Huber & Rupasinghe, 2009). La forma en que los organismos vegetales, incluidos las

manzanas, sintetizan estos compuestos es mediante la conversión de fenilalanina, el cual es

convertido a ácido shikimico por la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL), que produce la

deaminación de la fenilalanina resultando en ácido cinámico y posteriormente a ácido p-

cumarico, el que sirve como precursor de las vías metabólicas relacionadas a la formación de los

principales compuestos fenólicos en las manzanas.

La composición fenólica se encuentra determinada por diversos factores, tanto dependiente de la

planta como externos a ella. Dentro de los factores propios la ontogenia de la fruta uno de los

indicadores más importantes que se ha podido corroborar son los niveles de ciertos compuestos

fenólicos, como el ácido clorogénico, que aumentan en etapas tempranas. Algunos factores

fisiológicos involucrados en estos procesos, que podrían explicar este comportamiento y que

además se encuentran relacionados con el proceso de desarrollo de color, queda demostrada en el

experimento desarrollado por Ju en 1995. En donde frutos pequeños al interior de bolsas con

restricción de luz hasta cosecha, resultó en la inhibición de la síntesis de diversos compuestos de

tipo flavonoides. Posteriormente, unas semanas antes de cosecha, se retiró la restricción de luz a

los frutos, consiguiendo aumentar la concentración de la enzima chalcon sintasa (cataliza la

reacción desde ácido cumárico y malonyl-CoA a narigenin chalcona) lo que se tradujo en un

aumento en la síntesis de flavonoides, llegando a niveles normales previo a la restricción de luz

de los frutos.

Otro dato importante es que 40 días después de plena flor se encuentran niveles elevados de

compuestos fenólicos. Esta alza disminuye hasta encontrar los niveles más bajos 120 días

16

después de plena flor, lo que es explicado por un aumento de la actividades biosintética durante la

fase de división celular y una alta actividad enzimática (Treutter, 2001; Mayr, et al. 1995).Otros factores que han sido estudiados y que determinan las cantidades de compuesto fenólicos

en las manzanas, además del cultivar, son una serie de condiciones ambientales, nutricionales,

etc. En condiciones naturales existe mayor presencia de antioxidantes fenólicos en la piel del

fruto en comparación con otros tejidos (Drogoudi 2008). En relación a los cultivares, se ha

determinado que entre ellas muestran distintas cantidades de estos compuestos, como fue

demostrado por J. A. Yuri et al., (2009). Este trabajo muestra que existen diferencias

considerables entre cultivares y regiones agroclimáticas, encontrando mayor diferencia en el

cultivar Baeburn y mayor cantidad de antioxidantes en las regiones más frías. Otro factor que ha

sido estudiado son las condiciones de almacenamiento, Napolitano demostró que existe un

marcado aumento de antioxidantes principalmente catequinas y floricidina, cuando manzanas

sanas son almacenadas en condiciones de frío, los cuales son atribuidos principalmente al

aumento en la actividad de enzima fenilalanina amonio liasa, que es activada en condiciones de

almacenamiento por la hormona etileno, con lo que se acumulan compuestos fenólicos

principalmente en la piel. (Napolitano et al., 2004). Aunque estudios realizado por el Centro de

Pomáceas indica que la ganancia de antioxidantes es solo marginal (Resultados no publicados),

descartando la posibilidad de aumentar de manera controlada la cantidad de antioxidantes

presentes en las manzanas posterior a largos periodos de almacenamiento.

Por otra parte, en forma teórica se ha propuesto que el manejo agronómico también determina

diferencias en la presencia y cantidad de antioxidantes fenólicos, como es el cultivo orgánico y

tradicional (Brandt & Mølgaard, 2001). Esto debido a que los huertos orgánicos se encuentran

expuesto a enfermedades, resultando en que los cultivos deben desarrollar sistemas de defensa y

por consiguiente un aumento en los niveles de compuestos fenólicos. La bibliografía demuestra

que no existen diferencias entre el manejo orgánico y tradicional de diversos huertos con la

concentración de antioxidantes fenólicos en diversos cultivares (Red Delicious-Starking, Golden

Delicious, Granny Smith, Jona Gold and Royal Gala) (Valavanidis, et al, 2009; J. Yuri et al.,2012). Otros manejos agronómicos que han sido estudiados y relacionados con la concentración

de compuestos fenólicos, han determinado que consta una relación entre los niveles de

fertilizantes utilizados y los niveles de antioxidantes, en donde se encuentra una mayor

17

concentración de nitrógeno en los frutos (producto de una alta cantidad de fertilización de

nitrógeno) y una disminución de los compuestos fenólicos en los frutos.(Awad et al, 2002; Wang& Lin, 2003). Esto no ocurre en todas las especies, el efecto negativo de la alta fertilización con

nitrógeno en manzano, por ejemplo en frambuesa se ha demostrado que al aumentar la

fertilización aumentan los niveles de acido elágico, kaempferol glicosidos, cianidina glicosido(Wang & Lin, 2003). Otro factor que altera la producción de compuestos fenólicos es el riego, se

han visto diversas variaciones relacionadas en las concentraciones de antioxidantes presentes en

los frutos (Cohen et al. 1994).La importancia de los antioxidantes y los compuestos fenólicos que se generan en la manzana, es

su efecto en prevenir enfermedades crónicas que afectan a los seres humanos (Palomo et al.2010). El número de publicaciones relacionada a estas investigación se ha incrementado en

forma exponencial en la última década. Las razones son diversas pero se encuentran enfocadas a

afrontar de mejor manera la última etapa de vida, en donde enfermedades crónicas como la

diabetes miellitus, cáncer, patologías coronarias y cerebrovasculares, por citar algunas, están

altamente relacionadas con el estrés oxidativo a los que se encuentran expuestos estos tejidos(Diplock et al., 2007). La literatura muestra que la alimentación y en especial algunos

componentes de las frutas y v nberduras son capaces de disminuir la incidencia de enfermedades

cardiovasculares. (Palomo G et al., 2011)Otra corriente de investigación es el efecto de los polifenoles en enfermedades cardiovasculares.

Este tipo de patologías es una de las principales causas de muerte en las sociedades desarrolladas

y en Chile, son causadas por aumento del consumo de dieta altas en colesterol, vida sedentaria, y

por otro lado una disminución en el consumo de fruta y verduras.

El consumo de polifenoles naturales proveniente de frutas y verduras ha demostrado tener un

efecto benéfico en el sistema cardiovascular, principalmente en diversos tejidos o células como

es el endotelio, el musculo liso vascular y las plaquetas (Perez-Vizcaino & Duarte, 2010). Lo

que se traduce en una disminución de enfermedades relacionadas como son la hipertensión,

ateroesclerosis, isquemia del miocardio y accidentes cerebrovasculares. Las acciones concretas

son (Perez-Vizcaino et al 2006):

18

1) efectos vasodilatadores independientes de endotelio; 2) efecto de protección sobre el NO

(oxido nítrico) y de la función endotelial bajo condiciones de estrés oxidativo; 3) efecto de

antiagregante plaquetario;4) inhibición de la oxidación de LDL; 5) reducción de las moléculas de

adhesión y otros marcadores inflamatorios; 6) prevención de oxidación neuronal y daño

inflamatorio en el sistema nervioso central

Un efecto que no ha sido estudiado en profundidad es la acción de los antioxidantes fenólicos

provenientes de la manzana para contrarrestar el síndrome metabólico, y que ha sido asociado a

un aumento en el riesgo cardiovascular (Eckel et al. 2005). Pero existe evidencia científica

suficiente y en aumento, ha sugerido que los polifenoles provenientes de diversos organismos

vegetales llevan a disminuir los riesgos de desarrollar el Síndrome Metabólico (Cherniack, 2011;Xia & Weng, 2010).

Se denomina Síndrome Metabólico al conjunto de alteraciones metabólicas constituidas por:

obesidad central, disminución de la concentración de lipoproteína HDL, elevación de las

concentraciones de triglicéridos, aumento de la presión arterial e hiperglicemia (Eckel et al.,2005).

La importancia de este síndrome es debido a que es la antesala a diversas patologías más

complejas como son diabetes, accidentes cerebrovasculares e infartos agudos al miocardio,

siendo una de las principales causas de muerte a nivel nacional y mundial. El exceso de ingesta

de energía es en gran parte responsable por este síndrome, llevando a un inadecuado

procesamiento de dos componentes claves en el metabolismo energético del hombre, como son

los lípidos y la glucosa. Esta sobreabundancia de energía se almacena en los adipocitos, los que

en aumentar en número comienzan con la liberación de adipoquinas y citoquinas que afectan al

sistema vascular (Galic, et al. 2010; Kershaw & Flier, 2004). La gran mayoría de estas

moléculas liberan compuestos pro-inflamatorios como son factor de necrosis tumoral α (TNF –

α), interleuquina (IL) 6, 12, proteína C reactiva, proteína quimioatractante de macrófago 1, los

que se traducen en un aumento del stress oxidativo en los tejidos y células relacionados al sistema

vascular, esto sumado al exceso de lípidos que se encuentran en circulación aumentan los factores

para la generación de placas ateroescleróticas. Con todo lo anterior se logra un desbalance

19

energético e inflamatorio que termina en diversas enfermedades crónicas como diabetes y

enfermedades cerebrovasculares (Grundy, 2012).La prevalencia de este síndrome varía, pero según la literatura se encuentra entre 15% y un 40%.

Según la Fundación Internacional de Diabetes cerca de un cuarto de la población de países

desarrollados presenta este síndrome (Cherniack, 2011). En Chile, la Encuesta Nacional de

Salud realizada durante año 2003 por el Ministerio de Salud, en una población de 3.619

individuos mayores de 17 años mostró que la prevalencia de SM fue de 22,6%, para hombres

22,6% y mujeres (23%,), pero siendo dependiente de la edad: 25-44 años (17,9%), 45-64 años

(36,5%) y sobre 65 años (48%) (Ministerio de Salud, 2003).

Los modelos experimentales en animales han sido ampliamente validados en la comunidad

científica por entregar resultados en organismo complejos que pueden ser asimilables a la

realidad que ocurre en humanos. En relación al Síndrome Metabólico, la especie animal más

utilizado son los roedores. Éstos permiten un estudio fácil independiente del tiempo de duración

y de los aspectos a investigar. Lo que sí, aunque permite realizar estudios en cortos periodos de

tiempo y en ambientes controlados, existen diferencias entre el Síndrome Metabólico en ratones

que en humanos, como por ejemplo los perfiles de HDL y LDL siendo diferente en ambos

organismos (Kennedy, et al. 2010).

En general, obesidad e insulina - resistencia coincide en los modelos en ratas. Un estudio

realizado por Moore, se llevó a cabo para probar el efecto de una dieta alta en grasas y una dieta

normal (25% y 4,4% de grasa, respectivamente), durante un período de 40 días, en ratones CF-1,

en dos experimentos separados, para inducir la manifestación del SM, lo cual corresponde al

denominado modelo murino de SM-like. Los parámetros medidos para estos efectos fueron el

peso de los alimentos y agua ingeridos, el peso de los ratones y de sus órganos seleccionados

(tejido adiposo, gastrocnemio, hígado y corazón), a su perfil bioquímico (glicemia, ácido úrico,

nitrógeno ureico, triglicéridos, colesterol, proteínas y albúmina) y el porcentaje de grasa en el

hígado (Moore-Carrasco et al., 2008). En los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en

grasas, pero equilibrado en proteínas (16,9%), se evidenció niveles altos, estadísticamente

significativos, de glicemia, colesterol, triglicéridos y en el peso del tejido adiposo. Estos

20

resultados llevan a la conclusión de que los ratones CF-1 alimentados con una dieta alta en grasas

desarrollan alteraciones metabólicas que corresponden equivalentemente al SM.

FIGURA 2. PERFILES DE LIPOPROTEÍNAS EN DIFERENTE MODELOS. LAS LIPOPROTEÍNAS FUERON SEPARADAS

A PARTIR DEL PLASMA Y FUERON PUESTAS A CORRER 100 UL EN UNA COLUMNA SUPEROSA 6 EN UN FLUJO DE

0,5 ML/MIN EN UN BUFFER QUE CONTENÍA 0,15 M NACL, 0,01 M NA2HPO4 Y 1 MM DE EDTA. CUARENTE

FRACCIONES DE 0,5 ML FUERON RECOLECTADAS Y LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL FUE

CUANTIFICADA ENTRE LAS FRACCIONES 10 – 40. TIPICAMENTE, VLDL ELUYE ENTRE LA FRACCIÓN 15 – 20,

LDL EN FRACCIÓN 21 -27 Y HDL EN FRACCIÓN 28 – 34. (A) PERFIL DE LIPOPROTEÍNAS COMPARANDO EL PERFIL

“NORMAL” DE LA PERSONA CON UN MODELO C57BL/6J. (B) C57BL/6J Y RATÓN LEP R DB/DB. EL PEAK LDL/HDL1

ELUYE EN LA FRACCIÓN 23 – 27. (C) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE RATAS DELGADAS LDLR - / - Y RATAS APOE – / -.

(D) PERFIL DE LIPOPROTEÍNA DE OBESAS LDLR - / - Y RATAS APOE – / -. (KENNEDY ET AL., 2010)

21

VIII. METODOLOGÍA

8.1 RECOLECCIÓN Y EXTRACCIÓN

La recolección del material vegetal se realizó en dos huertos ubicados en la comuna de

Chimbarongo, Provincia de Colchagua, Región de O’Higgins el 11 de noviembre de 2011. Para

la obtención de la fruta con manejo tradicional se realizó en el Huerto propiedad de Orlando

Barra en la localidad de Tingüirica (34º 44’ L.S., 70º 57’ L.O) y para el caso de manejo orgánico

el huerto de propiedad de la empresa Viconto ubicado en la localidad de Codegua (34º 40’ L.S.,

70º 55’ L.O.). En ambos huertos se recolectaron frutos de los cultivares Fuji y Granny Smith

con una madurez de 40 días después de plena flor. Para el caso del huerto orgánico las

características de plantación son un cuartel de de 7 hectáreas: 50% cv Fuji y 50% cv Granny

Smith, con hileras orientadas en sentido oriente – poniente, con un marco de plantación de 4,5 x

2,75 mts (808 plantas/ hectáreas). Para el caso del huerto tradicional, las condiciones de

plantación son similares para la plantación orgánica. Para ambos huertos el sistema de

recolección fue el mismo, de cada árbol se seleccionaron dos frutos, del cuadrante suroeste, se

recolectaron un total de 2 Kg de material vegetal de cada cultivar/manejo.

La piel de manzana fue obtenida a partir de los desechos obtenidos de la empresa SURFRUT,

para los cultivares Granny Smith y Fuji.

Las muestras fueron puestas en cámaras de frío a 1°C hasta el proceso de extracción de los

antioxidantes.

El protocolo de extracción fue definido, de acuerdo a los objetivos propuestos. Para este fin, se

buscaran las diferentes condiciones para extraer la mayor cantidad de compuestos fenólicos a

partir del material vegetal, en especial con un alto contenido de quercetinas. Las condiciones a

modificar son: concentración de etanol, temperatura y tiempo de extracción.

El protocolo inicial para la extracción fue el siguiente:

a) Lavar las manzanas con agua destilada.

b) Se pesarán alrededor de 10 gr de fruta completa (pulpa y piel).

c) Posteriormente se les realizará un corte transversal por el centro de la fruta.

22

d) El material vegetal se colocarán en vaso precipitado a baja temperatura, para ser molida

con máquina trituradora. Luego se determinará la mezcla etanol/agua que permita una

mejor extracción de los compuestos fenólicos desde 0% etanol (100% agua) hasta 80%

etanol (20% agua)

e) Se seleccionará la temperatura óptima de extracción.. desde 0°C hasta 80°C, por un

tiempo que se desea analizar desde las 2 horas, hasta las 24 horas, en agitación constante.

f) Posteriormente, se separará la fase líquida mediante filtración al vacío, para cuantificar en

ella la actividad antioxidante, contenido fenólico total y fenoles específicos por HPLC Se

tomarán dos alícuotas de 2 ml para ser analizadas posteriormente por HPLC y cuantificar

la cantidad de fenoles y actividad antioxidante (DPPDH).

g) A continuación la fase líquida será concentrada mediante evaporador rotario a 55 °C y

150 rpm. El concentrado obtenido será cuantificado, de la forma antes mencionada, y

almacenado a -20°C.

h) Por último, los extractos obtenidos del evaporador rotatorio serán liofizados, para

posteriormente ser cuantificado, al igual que los productos de las etapas anteriores.

i) Para el caso de la piel obtenida de SURFRUT, se aplicara la metodología establecida

utilizando también 50 gramos.

El protocolo descrito anteriormente es la base para la extracción, para determinar el protocolo

definitivo se realizaron modificaciones de acuerdo a la concentración de extracción de

etanol/agua, temperatura y tiempo de extracción. El protocolo definitivo será expuesto en el

capítulo de Resultados.

8.2 PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS

Se prepararon 6 extractos: Orgánico Fuji (FO), Orgánico Granny Smith (GSO), Tradicional Fuji

(FT), Tradicional Granny Smith(GST), Piel Granny Smtih (GSP) y Piel Fuji (FP) (ver capítulo

metodología). En los primeros grupos se realizó el proceso de extracción en el mes de enero del

2011. En los otros dos, el proceso se realizó en el mes de junio. Ambos extractos fueron

almacenados a -80°C, hasta realizar en ensayo en el modelo de Síndrome Metabólico like.

23

El proceso de extracción fue realizado de acuerdo a las condiciones preliminares establecidas. Se

dividió en 3 etapas: extracción, concentración en evaporador rotatorio y liofilización. La

primera, a partir de la fruta se realizó en 3 rondas de aproximadamente 400 gr de material

vegetal, a excepción de la piel de manzana que se realizo en dos etapas

Los volúmenes obtenidos en el proceso de extracción y posterior filtración al vacío fueron

llevados a evaporador rotatorio, con dos objetivos:

a) Recuperación del etanol ocupado en el proceso de extracción

b) Disminuir el volumen de la muestra antes de pasar al proceso de liofilización.

Las condiciones en el evaporador rotatorio fueron las siguientes: 150 rpm. a 50 °C, el tiempo fue

variable para cada extracto, se definió el punto de termino cuando el matraz dedicado a la

acumulación de etanol se mantuvo constante debido a que en el extracto no existen residuos

extraíbles por esta técnica.

A continuación se prosiguió con el proceso de liofilización, siendo ostensiblemente más largo:

Se tuvieron las muestras en ciclos de 10 horas diarias, en promedio 3 semanas. Los extractos

preparados al ser liofilizados disminuyeron su volumen. Teniendo en cuenta que la

administración de los antioxidantes a los animales de experimentación fue por el agua del

bebedero, se decidió disolver las muestras liofilizadas en agua (la disolución en diferentes

soluciones de etanol no fueron un éxito), en un proceso que se detalla a continuación:

a) Los frascos en donde se liofilizaron las muestras fueron pesados previos a realizar el

proceso de liofilización.

b) Cuando las muestras finalizaron el proceso de liofilización, se procedió nuevamente que

ser pesadas y se conoció la cantidad de extracto presente en cada una de las muestras por

diferencia de peso.

c) Posteriormente se agregaron 20 mL de agua en cada una de las muestras para poder

disolver el liofilizado, esta solución fue puesta en agitación constante en agitador orbital

por 3 horas a una velocidad de 50 rpm.

24

d) Por último, fue cuantificado el volumen de cada muestra resuspendida y se obtuvo una

alícuota para la medición de fenoles y capacidad antioxidante para ser finalmente

almacenada a -80°C.

8.3 CARACTERIZACIÓN QUÍMICA

Para determinar el protocolo definitivo de extracción, se apoyara en técnicas colorimétricas de

determinación de antioxidantes y HPLC. Se buscó tener un extracto con alto contenido de

quercetinas glicosiladas o libres:

a) Caracterización y cuantificación de los diferentes extractos mediante el ensayo de Folin –

Ciocalteu. Y por último, capacidad antioxidante mediante técnica basada en la estabilidad

del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)

b) Caracterización y cuantificación de los extractos para observar los diferentes metabólitos

que se persigue obtener mediante HPCL con detector arreglo de diodo.

Los protocolos son los siguientes:

Fenoles: Mediante la técnica de Folin – Ciocalteau, según lo descrito por Coseteng y Lee en.

1987 (Coseteng & Lee, 1987). Se midió absorbancia a 640 nm, el resultado de compuestos

coloreados obtenidos a partir de la reacción entre el reactivo Folin – Ciocalteau en presencia de

Na2CO3, la cual es directamente proporcional a la cantidad de fenoles presente en el medio de

reacción. El protocolo es el siguiente: 100 µL de muestra del extracto, se agrego 2,5 mL de agua

destilada y 0,5 mL de reactivo Folin – Ciocalteau, se agita en vortex y se deja incubar por 5

minutos. Por último, se agrego 0,5 ml de Na2CO3, nuevamente se repitió la agitación y se incubo

por 15 minutos. Finalmente se leyó absorbancia de las muestras a 640 nm. Las muestras se

analizaron por duplicado. Se desarrollo una curva estándar de calibración en base a ácido

clorogénico con concentraciones conocidas entre 0 y 0,125 mg, por lo que se obtendrá una

ecuación de la recta de donde se interpolara las concentraciones de las muestras analizadas.

Determinación de Actividad Antioxidante: La actividad antioxidante será determinada por el

método del DPPH (radical 1,1-difenil-2-picril-hidraxilo), según lo descrito por Von Gadow,

25

Joubert y Hansmann, (von Gadow, et al. 1997). Para todas las muestras se fijara en 8 min el

tiempo de reacción. Se colocaran en el medio de reacción 10 µL de extracto con 2 mL de DPPH 8

x 10-5. Se utilizaron diferentes concentraciones de ácido clorogénico como estándar para la curva

de calibración (entre 2 y 25 µg/ tubo) y la captura del radical libre DPPH fue expresado de

acuerdo a los mg de ácido clorogénico equivalentes a peso fresco-1 (PF) de manzana (fruto de

raleo o piel). Etanol fue utilizado como blanco y todas las muestras se trabajaron en tubos con

duplicado.

Perfil HPLC de las muestras: Se inyectarán 20 µL de cada una de las muestras en instrumento

Merck – Hitachi, compuesto por una bomba LaCrhom -7100, un detector de arreglo de diodos

modelo L – 7455 LaCrhom, y una columna Kromasil 100 – 5C18 de 250 x 4,9 mm con

precolumna de iguales características, termotizadas a 20 °C. Para la identificación de los

compuestos se usaron estándares de distintos antioxidantes (fenoles, quercetinas, etc.) y los

espectros UV – Vis de la biblioteca del equipo. El cromatograma será monitoreado a 4 diferente

longitudes de onda (. Los solvente de la fase móvil serán: a) ácido fòrmico al 1% en agua calidad

HPLC; b) acetonitrilo/H2O (40%) y c) acetonitrilo. La elución se efectúo mediante el siguiente

programa: tiempo 0 – 10 minutos: a (70), b (30), c (0) flujo de 1 mL minuto-1; tiempo 45

minutos: a (25), b (75), c (0) flujo 0,5 mL minuto -1; tiempo 52 minutos: a (0), b (0) y c (100)

flujo de 1 mL minuto-1

8.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para la determinación de la metodología de extracción, se utilizó ANOVA con un post – test de

Tukey en el programa SPSS versión 15. Para el análisis de los resultados obtenido en el modelo

animal se utilizó el programa GraphPad 5.0, con un test estadístico de ANOVA y un post-test de

Newman-Keuls y Bonferroni. P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. Además se

utilizará un análisis multivariable (Colesterol Total, Colesterol LDL, Colesterol HDL,

Trigliceridos, evolución del peso para tejido adiposo blanco), con esto podremos agrupar y

realizar conclusiones para definir si los extractos son capaces de influir en el metabolismo

lipídico de los animales disminuyendo o no los valores de colesterol (total, LDLy HDL), este fue

realizado por el programa estadístico Statgraphics Centurion XV.

26

8.5 PREPARACIÓN DE LAS DIETAS.

Las dietas fueron preparadas una vez por semana. Se utilizó como base el alimento Champion®

para roedores., que es el mismo que fue suministrado al grupo normal. Para conseguir aumentar

las calorías de las dietas estas fueron suplementadas con vitaminas, proteínas (en forma de

peptona), aceite vegetal y grasa animal en la siguiente relación:

Para 630 gramos de alimento normal se utilizo 0,7 gramos de multivitamínico, 3,8 gramos de

peptona, 158 ml de aceite vegetal y 35 gr. de grasa disuelta en horno microondas.

Para ambos ensayos se prepararon 10 kg de esta mezcla.

8.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS

Los experimentos se realizaron con ratones CF-1 machos adquiridos en el Instituto de Salud

Pública (ISP) de Chile. Los animales se mantuvieron estabulados por una semana de

ambientación, separados en 4 grupos de 24 ratones cada uno bajo condiciones ambientales

estándar (22±2 °C y ciclo de iluminación de 12 horas de luz diarias) con libre acceso al alimento

para ratas de laboratorio (Champion®) y agua. Los ratones en esta etapa y en la fase experimental

se mantendrán en el Bioterio de la Universidad de Talca.

Los 6 extractos obtenidos Fuji Orgánico (FO), Granny Smith Orgánico (GSO), Fuji Tradicional

(FT), Granny Smith Tradicional (GST), Granny Smtih Piel (GSP) y Fuji Piel (FP), fueron

incorporados en el agua para beber de los animales según He (He et al., 2011). Los animales

fueron randomizados y divididos en 6 por cada grupo experimental, más los controles Normal

(que tendrá acceso a agua y alimento normal) y el control graso que tendrá alimentación con alto

contenido graso y agua normal.

Los grupos de ratones de laboratorio fueron divididos de acuerdo a la dieta que ellos tendrán:

27

GRUPO DIETA

Grupo normal (control) Normal

Grupo con dieta grasa Peptona, grasa animal, aceite vegetal y vitaminas.

Grupo con dieta grasa más GSO Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana OGS

Grupo con dieta grasa más FO Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana OJ

Grupo con dieta grasa más FT Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana TJ

Grupo con dieta grasa más GST Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana TGS

Grupo con dieta grasa más FP Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana FGS

Grupo con dieta grasa más GSP Peptona, grasa animal, aceite vegeta, vitaminas y

extracto de manzana FGS

Se practicaron dos ensayos:

a) Volumen constante de los extractos 10 mL de extracto final / 250 mL de volumen final o

4 % v/v.

b) Concentración constante de antioxidantes 400 mg/Kg peso animal, de acuerdo a Hogan(Hogan et al., 2010) con sus ensayos realizados en ratones.

La finalidad de realizar ambos ensayos fue comprobar si existe una relación entre la cantidad de

antioxidantes ingeridos por cada grupo experimental (animales en el estudio) y la posible mejoría

en los parámetros bioquímicos. Además, estudiar si la concentración fija de antioxidante (mg de

antioxidante / Kg. de ratón) se podrían obtenían resultados similares (Objetivo específico).

En cada uno de los ensayos (volumen y concentración constante) se repitió el mismo modelo de

alimentación y administración de los extractos. Diariamente el alimento ingerido por los grupos

muestrales fue pesado, al igual que cuantificado el volumen a beber de los animales.

Semanalmente fueron pesados los individuos, con el fin de observar su evolución y descartar la

presencia de cualquier anormalidad. La duración del estudio fue de 40 días, al finalizar este

28

periodo los animales fueron anestesiados con una inyección i.p. en una mezcla de Ketamina 100

al 10% (Richmond, Argentina), acetopromacina (Centrovet, Chile) y xylazina 2%(Centrovet,

Chile) (Moore-Carrasco et al., 2008). La sangre obtenida desde la aorta descendente fue

utilizada para determinar parámetros bioquímicos (Glicemina, Triglicéridos, Colesterol Total,

HDL y LDL). Los ratones anestesiados fueron sacrificados por exanguinación.

8.7 ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

Todos los reactivos de colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicéridos y glicemia

fueron obtenidos desde Roche S.A. (Santiago, Chile), los análisis fueron medidos por un equipo

automatizado Hitachi 717 (Japón).

8.8 ANÁLISIS DE LA DIETA

Una vez finalizados los ensayos biológicos, las dietas y los extractos fueron llevadas al

Laboratorio de Plantas Aromáticas, perteneciente al Instituto de Química de Recursos Naturales

de la Universidad de Talca, donde fueron sometidas al análisis e informe nutricional

correspondiente. Éste será realizado mediante métodos estandarizados por la Official Methods of

Analysis of the Association of Official Analitical Chemist (AOAC). Las determinaciones que se

realizaron corresponden a porcentajes de humedad, cenizas, lípidos o grasas, proteínas, fibra e

hidratos de carbono.

Determinación del porcentaje de agua (humedad):

El método se basa en el secado de una muestra en un horno y su determinación por diferencia de

peso entre el material seco y húmedo.

29

Determinación de lípidos o grasas por el método de soxhlet

En este método, las grasas de la muestra son extraídas con n-hexano y evaluadas como porcentaje

del peso después de evaporar el solvente

Determinación del porcentaje de fibra cruda

Este método permite determinar el contenido de fibra en la muestra, después de ser digerida con

soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de sodio y calcinado el residuo. La diferencia de pesos

después de la calcinación nos indica la cantidad de fibra presente.

Determinación de proteína cruda por el método Kjeldahl

La determinación del contenido de proteínas se efectúa mediante el método de Kjeldahl, mismo

que evalúa el contenido de nitrógeno total en la muestra, después de ser digerida con ácido

sulfúrico en presencia de un catalizador de mercurio o selenio.

Determinación de cenizas

Este método permite determinar el contenido de ceniza en los alimentos o sus ingredientes

mediante la calcinación. Se considera como el contenido de minerales totales o material

inorgánico en la muestra.

Determinación del contenido de elementos libre de Nitrógeno

La determinación del porcentaje de hidratos de carbono es realizado mediante la diferencia entre

todas las mediciones anteriores, la expresión matemática es 100 – Σ de las determinaciones antes

realizadas.

30

IX. RESULTADOS

9.1 BÚSQUEDA DE LA METODOLOGÍA ÓPTIMA DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS

Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

Para lograr el objetivo propuesto se ensayó, primero distintas concentraciones de la mezcla

etanol/H2O y a continuación diferentes temperaturas y tiempos de extracción. Para evaluar cada

uno de los ensayos se cuantificó contenido fenólico total (Coseteng & Lee, 1987) actividad

antioxidantes (von Gadow et al., 1997) y perfil de polifenoles por HPLC (J. Yuri et al., 2012).9.1.1 EVALUACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE LA MEZCLA ETANOL/H2O

Para definir las condiciones eficientes de extracción de antioxidantes desde los tejidos vegetales,

se realizó pruebas con mezclas etanol / agua a diferentes concentraciones 0, 40 y 80 % de etanol,

utilizando el procedimiento base la extracción descrito por Cosetang y Lee (Coseteng y Lee

1987) con modificaciones, lo que implica una molienda en frío (recipiente en donde se encuentra

la muestra a 0°C), extracción alcohólica, sonicación, homogenización y una doble extracción a

100ºC por 10 minutos y 5 minutos.

Uno de los objetivos fue sacar del proceso dos componentes como son el nitrógeno líquido y el

sonicador, debido a que encarecen los procesos industriales, no siendo utilizados. Para esto se

busco probar diferentes temperaturas y tiempos, con el fin de aumentar las probabilidades de

extraer la mayor cantidad de antioxidantes en los tejidos vegetales. Las pruebas realizadas fueron

desde 2, 4, 6, 12 y 24 horas; la temperatura 4°C, 50°C y 80°C; con las concentraciones de etanol

anteriormente descritas. Para tener un control de extracción se realizó el proceso descrito por

Cosetang y Lee con modificaciones en paralelo a los ensayos para la determinación de las

condiciones ideales de extracción de antioxidantes. Las características de este ensayo fueron

similares a las descritas en metodologías (Recolección y extracción), con las siguientes

diferencias:

a) En el proceso de molienda se utilizó nitrógeno líquido

b) Posteriormente las muestras fueron colocadas en un baño de ultrasonido por 30 minutos

31

c) El tiempo de extracción fue de 4 horas a una temperatura de 60 °C y en una solución de

40% de etanol

Los resultados del análisis estadístico ANOVA con test de Tukey con un nivel de confianza de

95%, (realizados en el programa SPSS versión 15), se visualizan en TABLA 1.

TABLA 1. ANALISIS ANOVA DE LA CANTIDAD DE FENOLES EN LOS EXTRACTOS

Según estos resultados, las condiciones óptimas de extracción de fenoles se presentan en la

TABLA 2:

Muestra % Etanol Tiempo de Extracción Temperatura deExtracción

111 40% ETANOL 6 H 50°C

112 80% ETANOL 6H 50°C

12 80% ETANOL 24 H 80°C

115 80% ETANOL 24 H 50° C

CONTROL 1 40 % ETANOL 6 H 50°C

CONTROL 2 80% ETANOL 6 H 50°C

TABLA 2. RESULTADOS CON LAS CONCENTRACIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE FENOLES EN LOS

EXTRACTOS

32

Según la Tabla 2, los controles de extracción son similares a las otras cuatro condiciones

indicadas, alcanzando valores análogos utilizables sin la utilización de nitrógeno líquido y

ultrasónido.

Si bien la cantidad de los fenoles es importante para determinar el protocolo de extracción

definitivo, es necesario determinar la capacidad antioxidante resultante de la solución obtenida.

Para definir cuál es la condición idónea, se realizo la medición del radical libre DPPH. Los

resultados del análisis ANOVA con test estadístico de Tukey con el nivel de confianza de 95%,

realizados en el programa SPSS versión 15, los resultados aparecen en la TABLA 3..

TABLA 3. ANALISIS ANOVA DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS

Según los resultados de este análisis, las condiciones en donde se obtuvo mayor capacidad

antioxidante aparecen en la Tabla N°4.

33

Muestra % Etanol Tiempo de extracción T° de extracción

24 80% ETANOL 6 H 50°C25 40% ETANOL 6 H 80°C

26 80% ETANOL 6H 80°C

27 40% ETANOL 24 H 50° C

28 80% ETANOL 24 H 50° C

29 40% ETANOL 24 H 80° C

30 80% ETANOL 24 H 80°C

Control 1 40 % ETANOL 6 H 50°C

Control 2 80% ETANOL 6 H 50°CTABLA 4. RESULTADOS CON PARA LAS CONDICIONES SIGNIFICATIVAMENTE MAYOR A LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS

En definitiva se obtienen 7 condiciones similares para la extracción de una alta capacidad

antioxidante en esta etapa, las cuales no son las mismas condiciones que definió el análisis

obtenidas en la etapa de concentración de fenoles (ver Tabla 2). Por esta razón y con la finalidad

de tener certeza en las condiciones de extracción se definió utilizar HPLC (High-performance

liquid chromatography) y de acuerdo a Huber y Rupansinghe en 2009), los principales

compuestos fenólicos que se encuentran en las manzanas son ácido clorogénico, quercetina-

glucósido, quercetina-xilosa, floricidina, procianidina B2. Por lo anterior, es que los compuestos

fenólicos a buscar son ácido clorogénico, catequina, procianidina B2, epicatequina, floridicina y

diversas quercetinas glicosildas. Las condiciones de temperatura y tiempo de extracción de

acuerdo a 40% etanol en diversas condiciones de extracción se muestran en la FIGURA 3.

Los resultados que se exhiben en la FIGURA 3 son los elevados valores de ácido clorogénico en

las tres de las cuatro condiciones probadas, la única que disminuyó la cantidad esta molécula fue

en 24 H/ 80°C. El otro compuesto que presenta altas concentraciones fue la Procianidina B2,

siendo más bajas que ácido clorogénico y en las mismas condiciones de extracción. Tanto

catequina, epicatequina y floridicina no superan los 400 µg de compuestos / gr de tejido vegetal

procesado.

Otros metabolitos importantes que se desean extraer en altas cantidades de los frutos pequeños y

piel de desecho son las quercetinas, ya sean libres o glicosiladas. El interés corresponde a que

tienen diversas propiedades benéficas para las personas, incluyendo mayor sobrevida en modelos

34

murino de influenza de H1N1 (He et al., 2011), disfunción endotelial (Gendron et al., 2012) y

cáncer (D’Archivio et al., 2008).

FIGURA 3. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 40%

DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

Debido a lo anterior se cuantificaron las siguientes quercetinas: quercetina rutinosido, quercetina

galactósido, quercetina glúcosido, quercetina xilósido, quercetina arabinósido, quercetina

ramnosido. El resultado se encuentra en la FIGURA 4.

La FIGURA 4 muestra condiciones similares para la extracción en 50 °C para ambos tiempo y

similar para 80° en 6 Hrs. En cambio, la condición de 80°C en 24 horas no presenta una cantidad

significativa de antioxidantes.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

6H 24H 6H 24H

50ºC 80ºC

ug /

g d

e te

jido

AcClorogénico

Catequina

ProcianidinaB2

Epicatequina

Floridicina

35

FIGURA 4. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN

DISTINTAS CONDICIONES DE 40% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

Para las condiciones de extracción de 80% de etanol, los resultados para ácido clorogénico,

catequina, procianidina B2, epicatequina y floridicina en la FIGURA 5.

FIGURA 5. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC EN LAS DIFERENTES CONDICIONES DE 80%

DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

Nuevamente aparecen elevados niveles de ácido clorógenico y procianidina B2, lo que indicaría

que la extracción de estos compuestos es independiente de la concentración de etanol. Siguiendo

la comparación con la FIGURA 3, llama la atención que en la condición de 80°C en 24 hrs.

05

101520253035404550

6H 24H 6H 24H

50ºC 80ºC

ug /

g d

e te

jido

Q. RutinósidoQ. GalactósidoQ. GlucósidoQ. XilósidoQ. ArabinósidoQ. Ramnósido

0200400600800

10001200140016001800

6H 24H 6H 24H

50ºC 80ºC

80% Etanol

ug /

g d

e te

jido Ac Clorogénico

Catequina

Procianidina B2

Epicatequina

Floridicina

36

existe una diferencia significativa entre los metabolitos presentes en la extracción con 40%

etanol, siendo inferior a la encontrada a 80% de etanol, indicando que en esta última condición se

puede obtener mayor presencia de antioxidantes, reflejando mayor eficiencia con este método de

extracción.

También se pueden apreciar concentraciones significativas de epicatequina y floridicina, por

sobre los 600 µg / g de tejido vegetal (manzana), en cambio catequina sigue en bajas

concentraciones. Para la extracción realizada a 80% etanol, los resultados obtenidos para

quercetina rutinosido, quercetina galactósido, quercetina glúcosido, quercetina xilósido,

quercetina arabinósido, quercetina ramnosido, se observan en la FIGURA 6

FIGURA 6. RESULTADOS DE LOS ANALISIS REALIZADO POR HPLC PARA DIFERENTES QERCITINAS EN

DISTINTAS CONDICIONES DE 80% DE ETANOL (50°C Y 80°C; 6 Y 24 HORAS DE EXTRACCIÓN)

En la FIGURA 6 aparecen concentraciones mayores de las distintas quercetinas analizadas,

siendo sumamente menor la Q. rutinosido. Se observa un leve aumento, aunque no significativo

en la condición de 80°C para los dos tiempos de extracción, siendo sumamente mayores a los

niveles detectados con la solución a 40% de etanol (ver FIGURA 4). Con el análisis de los

resultados que se observan en las figuras 5 y 6, se muestra una leve diferencia entre los métodos

de extracción, presentando mayores concentraciones de quercetina cuando el proceso de

0

50

100

150

200

250

6H 24H 6H 24H

50ºC 80ºC

80% Etanol

ug /

g d

e te

jido

Q. Rutinósido

Q. Galactósido

Q. Glucósido

Q. Xilósido

Q. Arabinósido

Q. Ramnósido

37

extracción se realiza con 80% de etanol. Debido a los resultados y la imposibilidad de definir

un protocolo de acuerdo a las mediciones realizadas previas (Cantidad de fenoles, capacidad

antioxidantes, concentración de antioxidantes mediante HPLC) se acordó definir el proceso de

extracción en función de los valores totales de quercetinas glicosiladas. Los resultados de este

análisis se muestran en las FIGURA 7 y FIGURA 8.

FIGURA 7. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 80% ETANOL EN

DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO.

FIGURA 8. CONCENTRACIÓN DE QUERCETINAS POR GRAMOS DE TEJIDO EXTRAÍDO EN 40% ETANOL EN

DIVERSAS CONDICIONES DE TEMPERATURA Y TIEMPO.

0100200300400500600700800

6H 24H 6H 24H

50ºC 80ºC

ug d

e qu

erci

tinas

/ g

r de

tejid

o

0100200300400500600700800

6 H 24H 6 H 24H

50 º C 80ª C

ug d

e qu

erce

tinas

/ g

rde

tejid

o

38

De acuerdo a la concentración de quercetinas que se obtienen en la FIGURA 7 y descartando la

utilización de 24 horas de extracción por el excesivo gasto energético que representa, las

condiciones de extracción que será utilizado es: 80% de etanol, 6 horas y 80°C. Debido a ello el

protocolo de extracción quedó definido de la siguiente forma:

a) Lavar manzanas con agua destilada.

b) Corte transversal a cada fruto por su centro.

c) El material vegetal se coloca en vaso precipitado a baja temperatura (en hielo), para ser

molida con máquina trituradora. Luego se procede a colocar la solución de extracción.

d) Está solución más el material vegetal de manzano es puesta en matraz erlenmeyer en una

relación de 50 g de material vegetal y 500 mL de solución de extracción por un tiempo de

6 horas en agitación constante a 80ºC.

e) A continuación, se procede a filtrar al vacio para realizar la separación entre la fase sólida

y líquida. Se recolecta y cuantifico la fase líquida. Se toma una alicuota de 2 ml para

estudiar la concentración fenoles y capacidad antioxidante.

f) Por último, la fase líquida se concentra por evaporador rotatorio a 55 °C - 150 rpm. El

concentrado obtenido es cuantificado volumétricamente y almacenado a -20°C.

g) Los extractos obtenidos del evaporador rotatorio son liofizados. En esta etapa se tomaron

dos alícuotas de 2 mL para cuantificar la cantidad de fenoles totales y actividad

antioxidante.

h) Posteriormente estos fueron resuspendidos antes de comenzar con la administración al

modelo animal, de acuerdo a lo mencionado en el capítulo de METODOLOGIA.

9.2 CUANTIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS

El proceso de extracción fue realizado de acuerdo a las condiciones establecidas en forma

experimental. Se dividió en 3 etapas: extracción, evaporador rotatorio y liofilización. La primera,

a partir de la fruta se realizó en 3 rondas de aproximadamente 400 gr de material vegetal, a

excepción de la piel de manzana que se realizo en dos etapas. El resumen de las extracciones se

exhibe en la TABLA 5.

39

Los resultados nos muestran una baja concentración tanto de fenoles totales como de actividad

antioxidante en los extractos obtenidos de los desechos provenientes de SURFRUT. Los mayores

valores se obtuvieron en el extracto proveniente de Fuji Orgánico. Las columnas de mg. de

fenol/mg de manzana y actividad antioxidante / g. de manzana fueron colocadas para asegurar

que el peso inicial del material vegetal no fuese una variable que distorsionara el análisis de los

datos.

TABLA 5. RESULTADOS PRIMERA ETAPA DE EXTRACCIÓN. *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE

ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 MATERIAL VEGETAL

En la segunda etapa de extracción, posterior a procesar las muestras por el evaporador rotatorio,

el resumen de los resultados obtenidos se muestra en la TABLA 6. Las muestras al ser

concentradas perdieron actividad antioxidante y fenoles, lo que era predecible de acuerdo a la

extracción de etanol realizada por el evaporador rotatorio. Aquellas muestras que no

disminuyeron sus niveles de capacidad antioxidante y cantidad de fenoles fueron las que

previnieron desde SURFRUT; probablemente ello ocurrió debido a que estos desechos provienen

de fruto maduro lo cual aumenta la cantidad de lípidos que existen en la extracción, lo que de

cierta manera le otorga estabilidad a los antioxidantes e impide la perdida de estos por el proceso

MuestraFecha de

extracciónPeso

manzana (gr)Volumen totalextracción (ml)

Cantidad deFenoles totales

(mg totales)

ActividadAntioxidante

totales*

mg de fenol/gr de

manzana

ActividadAntioxidante/

gr demanzana

GS tradicional 17-01-2011 312,2 2550 3.613,0 3.198 11,573 10,244GS tradicional 18-01-2011 433,7 3370 4.168,1 4.785 9,610 11,033GS tradicional 19-01-2011 436,2 3340 3.865,6 4.376 9,153 10,436TOTAL 1.182,1 9.260,0 11.646,6 30,3Fuji orgánico 20-01-2011 411,4 3350 4.225,5 5.453 11,100 13,254Fuji orgánico 21-01-2011 419,7 3290 5.003,3 5.173 11,921 12,325Fuji orgánico 24-01-2011 414,9 3350 4.609,1 5.025 11,109 12,564TOTAL 1.246,0 9.990,0 13.837,9 34,1GS orgánico 25-01-2011 416,7 3320 5.268,1 3.988 12,642 9,571GS orgánico 26-01-2011 419,9 3300 4.328,3 3.527 11,338 9,213GS orgánico 27-01-2011 422,0 3340 4.669,5 4.479 11,065 9,666TOTAL 1.258,6 9.960,0 14.265,8 35,0Fuji tradicional 28-01-2011 418,7 3280 4.733,2 5.210 11,304 12,442Fuji tradicional 31-01-2011 421,0 3220 4.682,3 4.888 11,122 12,193Fuji tradicional 01-02-2011 416,0 3600 4.314,3 4.450 10,932 12,526TOTAL 1.255,7 10.100,0 13.729,8 33,4Granny piel 02-06-2011 427,2 3220 2.407,9 2.719 5,64 6,365Granny piel 03-06-2011 425,4 3470 2.829,4 3.101 6,65 7,288TOTAL 852,6 6690 5.237,3 12,29Fuji piel 22-08-2011 427,3 3510 1.810,7 2.004 4,24 4,691Fuji piel 23-08-2011 425,5 3400 1.966,6 2.743 4,62 6,447TOTAL 852,8 6910 3.777,3 8,86

40

de extracción. El aumento de los lípidos fue detectado según los resultados de la química

proximal (Tabla 9).

TABLA 6. RESULTADOS SEGUNDA ETAPA DE EXTRACCIÓN *LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE SON LOS MG DE

ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL

La última etapa de la preparación de los extractos consistió en la liofilización de acuerdo a la

metodología propuesta y posterior resuspensión de las muestras en agua destilada, los resultados

se encuentran en la TABLA 7.

Extracto

mg TotalFenoles

presenteen el

Extracto

Masa Total DeExtracto (mgr)

% FenolesDel Total

Peso Inicial dematerial

vegetal en Gr

MgFenol/grMaterialVegetal

ActividadAntioxidantes

Totales (*)

ActividadAntioxidante/

Gr DeManzana

VolumenFinal

FT 7.522,5 23.620 32 1.255 5,99 8.637 7,31 116

FO 6.705,2 22.122 30 1.246 5,38 12.557 10,08 115

GSO 7.433,6 19.400 38 1.258 5,91 10.976 8,72 113

GST 7.375,3 42.080 18 1.182 6,24 10.872 8,66 120

GSP 5.870,3 28.070 21 852 6,89 4.945 5,8 160

FP 4.345,0 104.670 5 852 5,09 5.117 6 195

TABLA 7. RESULTADOS DE LOS EXTRACTOS DEFINITIVOS. (*) LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ES EL MG DE

ÁCIDO CLOROGÉNICO EQUIVALENTES A PESO FRESCO-1 DE MATERIAL VEGETAL

MuestraVolumenrotavapor

CantidadFenoles totales

(mg totales)

ActividadAntioxidante

totales*

mg deFenol/Gr demanzana

Actividadantioxidante/gr de manzana

% Disminuciónde fenoles

% Disminuciónactividad

antioxidante

GS tradicional 235 2.492 2.823 8,0 9,0 31,0 11,7GS tradicional 245 3.437 2.879 8,8 7,5 17,5 39,8GS tradicional 250 2.615 2.935 8,1 7,7 32,3 32,9TOTAL 730 8.544,4 24,8 26,6Fuji orgánico 245 3.953 4.142 9,6 10,1 6,4 24,0Fuji orgánico 210 4.348 4.053 10,4 10,1 13,1 21,6Fuji orgánico 260 3.878 4.362 9,8 10,5 15,9 13,2TOTAL 715 12.179,5 29,7 12,0GS orgánico 240 3.901 3.436 9,4 8,2 26,0 13,8GS orgánico 240 3.918 3.340 9,5 8,7 9,5 5,3GS orgánico 245 4.137 4.200 9,8 10,0 11,4 6,2TOTAL 725 11.955,0 28,7 16,2Fuji tradicional 210 3.698 4.211 10,5 9,8 21,9 19,2Fuji tradicional 220 3.091 4.439 12,1 10,5 34,0 9,2Fuji tradicional 250 4.068 4.222 10,5 10,1 5,7 5,1TOTAL 680 10.857,1 33,1 20,9Granny piel 235 2.796 2.357 6,54 5,52 16,1- 13,3Granny piel 245 2.773 3.017 6,52 7,09 2,0 2,7TOTAL 480 5.569 13,06 6,3-Fuji piel 310 1.873 2.205 4,38 5,16 3,4- 10,0-Fuji piel 340 2.113 2.752 4,97 6,47 7,4- 0,3-TOTAL 650 3.986 9,35 5,5-

41

Los anteriores son los extractos que serán utilizados en el ensayo con el modelo murino de

Síndrome Metabólico like., los cuales tienen una alta cantidad de capacidad antioxidante y

cantidad de fenoles.

9.3 COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS Y LOS EXTRACTOS

Las dietas a las que fueron sometidos los animales estuvieron compuestas por una dieta alta en

calorías, esto se muestra en la TABLA 8. Esta composición es igual para ambos ensayos

realizadas (10 ml de extracto / 250 ml de volumen final y 400 mg /kg de peso de ratón)

%

Agua

%

Proteínas

%

Lípidos

%

Cenizas

%

Fibra

%

ELN (*)

Dieta Normal 10,3 19,8 3 3 1,3 62,6

Dieta Grasa 6,8 16,8 28 5,5 1,9 41

TABLA 8. COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS, DE ACUERDO A LA QUÍMICA PROXIMAL. (*) ELN: ELEMENTO LIBRE

DE NITROGENO

En la Tabla 8 se puede comprobar el aumento de lípidos presente tanto en la dieta normal como

en la dieta grasa que fue suministrada a los animales. Las diferencias radican en el contenido de

lípidos que en la dieta normal alcanza el 3% en comparación con el 28% de la dieta grasa.

Los resultados de los extractos por química proximal y medición de fenoles es el siguiente:

TABLA 9. RESULTADOS DE QUÍMICA PROXIMAL Y CONTENIDO DE FENOLES PARA LOS DIFERENTES

EXTRACTOS. ELN: ELEMENTOS LIBRES DE NITROGENO

FT 2,5 1,2 2,5 3,7 0,3 89,8 23.620 7.523 32FO 1,8 0,6 3,8 4,6 0,54 88,66 22.122 6.705 30GSO 1,9 0,4 1,2 1,8 0,2 94,5 19.400 7.434 38GST 2,3 0,8 2,9 5,7 1,3 87 42.080 7.375 18GSP 2,07 1,1 2,45 6,7 1,32 86,36 28.070 5.870 21FP 1,8 2,6 12,3 11,4 1,1 70,8 104.670 4.345 5

% Proteínasmg Total Fenoles

presente en elExtracto

% Fenoles Total% Agua % Lípidos % Cenizas % Fibra % ELN Masa TotalExtracto (mgr)

42

Cabe hacer notar la baja cantidad de fenoles que se obtuvo desde el extracto proveniente de la

piel de Fuji, en comparación con el resto de los extractos. Además del alto porcentaje de lípidos

que fue encontrado en el mismo extracto, la explicación más fundamentada para esta alza es la

adición de cera por parte de los empresarios frutícolas a los frutos de exportación, para resaltar el

brillo de las manzanas, lo cual es una hipótesis que no pudo ser demostrada por los ensayos

realizados durante el transcurso de la tesis.

9.4 ENSAYOS BIOLÓGICOS

Los resultados obtenidos después de los ensayos con el modelo murino de Síndrome Metabólico-

like se dividirán de acuerdo al ensayo al que correspondan, en primera instancia se mostraran los

resultados correspondiente a ensayo de 10 ml de extracto final / 250 ml de volumen final.

9.4.1 ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL

El ensayo comenzó el 12 de octubre de 2011 y fue dado a término el día 19 de noviembre con el

sacrificio de los animales de acuerdo a las normas de bioéticas que se encuentran vigentes en la

Universidad de Talca.

Ingesta de alimento y evolución del peso

La ingesta diaria de alimentación fue seguida rigurosamente, como lo demuestra la FIGURA 9

FIGURA 9. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN TOTAL DIARIA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 10

ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY

0

20

40

60

80

100

120

gram

os d

iario

s

dia

FP

DG

FO

FT

GSP

GST

GSO

43

SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),

CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).

La ingesta total de alimentos durante el ensayo se muestra en la TABLA 10

GRUPO ESTUDIO INGESTA TOTAL (GRS)DIETA GRASA 1.174FO 1.361FT 1.403GSP 1.298GST 1.069GSO 1.093FP 1.090TABLA 10. INGESTAL TOTAL POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DE ALIMENTACIÓN DURANTE EL ENSAYO 10 ML

DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL

Los pesos de los animales fueron tomados cada 7 días, los resultados son mostrados en la

FIGURA 10. Se observa que en todos los grupos en estudios fueron subiendo de peso de acuerdo

a la ingesta diaria de alimentación, llegando a una estabilización de los pesos al llegar al final del

estudio.

FIGURA 10. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO

/ 250 ML DE VOLUMEN FINAL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA

NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).

31

33

35

37

39

41

43

45

12-o

ct13

-oct

14-o

ct15

-oct

16-o

ct17

-oct

18-o

ct19

-oct

20-o

ct21

-oct

22-o

ct23

-oct

24-o

ct25

-oct

26-o

ct27

-oct

28-o

ct29

-oct

30-o

ct31

-oct

01-n

ov02

-nov

03-n

ov04

-nov

05-n

ov06

-nov

07-n

ov08

-nov

09-n

ov10

-nov

Peso

de

rato

n en

gr.

Días de ensayo

Normal

ControlGrasoFO

FT

GSP

GST

GSO

FP

44

La FIGURA 11, muestra la ganancia de peso que se obtuvieron en cada uno de los grupos

experimentales, observando que la mayor ganancia de peso fue en los grupos de dieta grasa (DG)

y dieta normal (DN). Aunque en los grupos experimentales, el aumento de peso no existió una

ganancia de peso estadísticamente significativa, los resultados sugieren una tendencia en la

disminución en el peso de los grupos que fueron sometidos a los tratamientos con los diferentes

extractos de manzana.

FIGURA 11. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL

(FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y

FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).

Consumo de antioxidantes

En este ensayo las cantidades de antioxidantes fueron evolucionando de distinta forma de acuerdo

a la ingesta diaria de los animales, como se observa en la FIGURA 12. Esto se debió porque se

dejó la libre demanda de la que bebían los animales (en donde estaban incluidos los distintos

extractos). Esto se fue normalizando en el transcurso del ensayo hasta alcanzar rangos bajos de

variabilidad en el consumo de agua y extractos. Para determinar el consumo de antioxidantes, fue

necesario cuantificar diariamente la cantidad de extractos que fueron bebiendo los animales

durante el transcurso del ensayo.

45

FIGURA 12. CONSUMO DE MG DE FENOLES DIARIOS EN CADA UNA DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO EN EL

ENSAYO DE 10 ML DE EXTRACTO / 250 ML DE VOLUMEN FINAL

Según lo que se aprecia en la figura anterior, la cantidad de antioxidantes consumidas durante

todo el ensayo fue variable y va desde los 200 mg de fenoles, para FP, hasta los 600 mg de

fenoles diarios en FO y FT. También permite observar la irregularidad de la administración del

extracto durante la primera semana, esto se debe a que los animales debieron adecuarse a las

nuevas condiciones de alimentación y líquido para beber. El promedio de ingesta de fenoles

diario por Kg de peso de ratón es mostrado en la FIGURA 13

FIGURA 13. INGESTA DE FENOLES PROMEDIO DURANTE EL ENSAYO EN LOS DIFERENTES GRUPOS EN

ESTUDIO.FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST) YGRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP).

0

50

100

150

200

250m

g fen

oles

tot

ales

Dia de ensayo

FP

FT

FO

GSP

GST

GSO

46

Bioquímica del plasma

Los análisis realizados fueron Colesterol total (COL T), colesterol HDL (COL HDL),

triglicéridos (TRIG) y glicemia (GLI). Los resultados se muestran en la siguiente TABLA 11.

COL T COL HDL TRIG COL LDL GLI

FO 117 ± 4,4 78 ± 1,2 112 ± 1,3 61 ± 1,1 310 ± 1,2

FT 113 ± 9,8 71 ± 7,2 85 ± 11,1 59 ± 5,5 261 ± 15,8

GSO 130 ± 9,4 81 ± 6 91 ± 15,4 67 ± 5,8 337 ± 14,5

GST 120 ± 7,5 74 ± 5,3 114 ± 17,2 69 ± 4,1 250 ± 17,2

GSP 155 ± 9,1 88 ± 7,6 124 ± 17 92 ± 3,3 317 ± 20,6

FP 144 ± 13,3 91 ± 6,7 105± 5,6 74 ± 8,2 230 ± 21,3

DN 119 ± 10,3 80 ± 8,8 121 ± 8,8 64 ± 3,1 254 ± 19,5

DG 252 ± 16,6 13 ± 2,8 104 ± 12,7 190 ± 14,9 159 ± 8,3TABLA 11. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL),

GLICEMIA (GLI). PARA LOS GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO

(GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA

NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). LOS RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA

MEDIA (E.M)

En la tabla 11 muestra el resumen de los resultados de parámetros bioquímicos sobre los

diferentes grupos en estudios, los que fueron sometidos a la misma dieta grasa más el aporte de

los diferentes extractos de manzana. El análisis estadístico muestra que el parámetro en donde

muestran diferencia significativa entre la dieta grasa (DG) y los grupos en estudio fue en el

colesterol total (COL T), los resultados se muestran en la FIGURA 14. Los resultados muestran

que los niveles de colesterol de todos los grupos en el estudio disminuyeron a niveles similares al

control con dieta normal (DN) en comparación con el control de dieta grasa (DG).

47

FIGURA 14. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO Y LOS

GRUPOS CONTROL. FUJII ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO),

GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL

(DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A, B, C, D, E, F, G VALOR P<0,001.

Peso de órganos

El resumen del peso de algunos órganos obtenidos después del sacrificio de los animales se

muestra en la TABLA 12

Corazón Hígado Tejido adiposo blanco Riñón Gastrocnemio

FO 0,55 ± 0,03 5,17 ± 0,21 0,90 ± 0,18 1,71 ± 0,07 0,65 ± 0,03

FT 0,20 ± 0,01 4,81 ± 0,09 0,68 ± 0,03 1,65 ± 0,02 0,66 ± 0,01

GSO 0,59 ± 0,05 6,12 ± 0,57 0,57 ± 0,15 2,03 ± 0,17 0,72 ± 0,07

GST 0,62 ± 0,03 5,02 ± 0,2 0,71 ± 0,11 1,74 ± 0,03 0,63 ± 0,02

GSP 0,53 ± 0,06 5,57 ± 0,41 0,96±0,15 1,80 ±0,23 0,70 ± 0,08

FP 0,21 ± 0,01 6,02 ± 0,14 0,66 ±0,03 1,67 ± 0,02 0,6 ± 0,01

DN 0,65 ± 0,05 5,80 ± 0,33 0,53 ± 0,13 1,97 ± 0,08 0,67 ± 0,06

DG 0,67 ± 0,04 5,79 ± 0,26 1,05 ± 0,13 1,81 ± 0,06 0,64 ± 0,03TABLA 12. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ORGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL

HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS

GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL

DIETA GRASA (DG)

48

La Tabla 12, indica los promedios de los pesos de corazón, hígado, tejido adiposo blanco, riñón y

gastrocnemio. El único tejido que muestra una diferencia estadísticamente significativa es el %

de tejido adiposo blanco (ver resultados en FIGURA 15) en comparación con el peso inicial del

individuo en estudio. Existe diferencia entre el grupo con dieta grasa (DG) y dieta normal (DN).

Además, entre el grupo con dieta grasa (DG) y el tratamiento con Granny Smith orgánica (GSO).

Entre el resto de los tratamientos no existe diferencia significativa, aunque si hay una tendencia a

la disminución del tejido adiposo blanco y el % del peso inicial.

FIGURA 15. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN COMPARACIÓN CON EL PESO

INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y

CONTROL DIETA GRASA (DG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05

Para realizar la asociación entre el peso del tejido adiposo blanco y los resultados de los

parámetros bioquímicos fue necesario realizar un análisis de componentes principales, el cual fue

hecho por el Programa Statgraphics Centurion, versión 10. Los resultados se muestran en la

FIGURA 16.

49

FIGURA 16. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T),

COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO

(T ADIPOSO). PARA ENSAYO 10 ML DE EXTRACTO EN 250 ML DE SOLUCIÓN FINAL

La interpretación de esta figura muestra dos grupos de datos, los puntos ubicados en el cuadrante

izquierdo de la figura corresponden al grupo de Dieta grasa y que están relacionados con las

variables (vectores) Colesterol Total , Colesterol LDL y % Tejido adiposo blanco acumulado

durante el ensayo. El resto de los puntos se ubican en el cuadrante central de la FIGURA 16, con

una leve tendencia hacia la derecha, encontrándose relacionado con el la variable Colesterol

HDL. El aumento de tamaño del T. adiposo se encuentra altamente relacionado con el aumento

del COL LDL y COL HDL. En este sentido no se ha encontrado bibliografía en la cual explique

los resultados obtenidos en el que extractos provenientes de manzana puedan mejorar los

indicadores de hipercolesterolemia, pero se puede inferir que en tejido adiposo blanco

(metabólicamente activo) están relacionados con el metabolismo del colesterol y en la

disminución de los niveles de colesterol en el plasma.

50

9.4.2 ENSAYO CONCENTRACIÓN CONSTANTE DE 400 MG / KG PESO DE RATON

El ensayo comenzó el 25 de octubre de 2011 y fue terminado el día 02 de diciembre de 2011 con

el sacrificio de los animales, de acuerdo a las normas de bioéticas que se encuentran vigentes en

la Universidad de Talca.

Hay que considerar en este ensayo que al ser constante la cantidad de fenoles ingeridos por los

animales no fue necesario cuantificar la cantidad de estos fenoles ingeridos por jaula. El cálculo

fue obtenido a partir de los datos recolectados en el ensayo de 10 ml de extracto / 250 ml de

volumen final, en donde los promedios de ingesta de los extractos ricos en fenoles en las

primeras semanas del ensayo anterior se utilizo para ajustar las concentraciones 400 mg de

fenoles / kg de ratón.

Ingesta de alimento y evolución del peso

La ingesta diaria de alimentación fue seguida rigurosamente, como lo demuestra la FIGURA 17

FIGURA 17. CONSUMO DIARIO DE ALIMENTACIÓN POR GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG / KG

PESO DE RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY

SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y

CONTROL DIETA GRASA (DG)

Se observa una etapa de adaptación por parte de los individuos en cada una de las jaulas al inicio

del ensayo por alrededor de una semana, posterior a eso la ingesta de alimentos se mantuvo

constante, disminuyendo la variabilidad observada en un comienzo.

La ingesta total de alimentos durante el ensayo se muestra en la TABLA 13

0

20

40

60

80

100

120

FO

FT

GSP

GST

GSO

FP

51

GRUPO ESTUDIO INGESTA TOTAL (GRS)DIETA GRASA 1.174FO 1.451FT 1.432GSP 1.311GST 1.428GSO 1.393FP 1.311TABLA 13. INGESTAL TOTAL DE ALIMENTACIÓN POR CADA GRUPO EN ESTUDIO DURANTE EL ENSAYO 400 MG

/ KG PESO DE RATON FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO),

GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL

(DN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG)

LOS PESOS DE LOS ANIMALES FUERON TOMADOS CADA 7 DÍAS, LOS RESULTADOS SON MOSTRADOS EN LA

FIGURA 18. Se observa que en todos los grupos en estudios aumentaron de peso de acuerdo a la

ingesta diaria de alimentación, llegando a una estabilización de los pesos en la etapa final del

ensayo.

FIGURA 18. EVOLUCIÓN DEL PESO PROMEDIO POR CADA GRUPO EN ESTUDIO EN EL ENSAYO DE 400 MG / KG

PESO DE RATON

23

28

33

38

43

48

25-o

ct

27-o

ct

29-o

ct

31-o

ct

02-n

ov

04-n

ov

06-n

ov

08-n

ov

10-n

ov

12-n

ov

14-n

ov

16-n

ov

18-n

ov

20-n

ov

22-n

ov

24-n

ov

26-n

ov

28-n

ov

30-n

ov

Peso

rato

n en

gr

Dias de ensayo

Normal

ControlGrasoFO

FT

GSO

GST

52

FIGURA 19. GANANCIA DE PESO DE TODOS LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL ENSAYO 400 MG/KG PESO DE

RATON. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y

CONTROL DIETA GRASA (CG). * VALOR P < 0,05 Y ** VALOR P < 0,05

FIGURA 19La FIGURA 19, muestra la ganancia de peso que se obtuvieron en cada uno de los

grupos experimentales para el ensayo de 400 mg de fenoles/ Kg de ratón. Se observa que existe

diferencia significativa entre el grupo control Dieta normal (DN) y el grupo Dieta grasa (DG).

Además, existe diferencia entre la dieta grasa y el resto de los grupos estudio.

53

Bioquímica del plasma

Los análisis realizados fueron Colesterol total (COL T), colesterol HDL (COL HDL), colesterol

LDL (COL LDL), triglicéridos (TRIG) y glicemia (GLI), los resultados se muestran en la

TABLA 14, en la cual se muestra el resumen de los resultados de parámetros bioquímicos sobre

los diferentes grupos en estudios, los que fueron sometidos a la misma dieta grasa más el aporte

de los diferentes extractos de manzana. Al observar y analizar los resultados se vuelven a repetir

los resultados en el ensayo de 10 ml de extracto en 250 ml de volumen final. Teniendo una

disminución en todos los grupos de COL T llegando a niveles similares a los observados en el

control normal. El análisis estadístico muestra que el parámetro en donde muestran diferencia

significativa entre la dieta grasa (DG) y los grupos en estudio fue en el colesterol total (COL T),

los resultados se muestran en la FIGURA 20. Esta figura muestra que los niveles de colesterol de

todos los grupos en el estudio disminuyeron a niveles similares al control con dieta normal (DN)

en comparación con el control de dieta grasa (DG).

COL T (mg/dl) COL HDL (mg/dl) TRIG (mg/dl) GLI (mg/dl) COL LDL (mg/dl)

FO 152,33 ±3,84 92 ± 8,4 176 ±9,02 233,5 ± 19,36 95 ± 12,7

FT 115,5 ± 10,6 90,3 ± 10,1 135 ± 6,84 167 ± 313,81 62 ± 19,9

GSO 161 ± 8,09 96,4 ± 9,4 166 ± 8,09 340 ± 7,92 53 ± 5,6

GST 149,2± 36,5 86,4 ±7,5 152 ± 23,16 363,2 ± 22,07 77 ± 15

GSP 179,4± 33,2 97,4 ±5,6 156 ± 13,42 304 ±10,83 53 ± 18,4

FP 164,5 ± 32,7 98,5 ± 5 154 ± 17,57 352,3 ± 14,64 40 ± 11,4

DN 119 ± 23,1 80 ± 19,7 121 ± 19, 6 254 ± 43,6 15 ± 7

DG 252 ± 37,18 13 ± 6,2 104 ± 28,4 159 ± 18,6 178 ± 33TABLA 14. RESUMEN DE LA CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL HDL (COL HDL),

COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS GRUPOS FUJI

ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL

(GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL DIETA GRASA

(DG). LOS RESULTADOS SE ENCUENTRAN CON EL ERROR DE LA MEDIA (E.M)

54

FO FTGSO

GSTGSP FP DN DG

0

100

200

300a

Col

este

rol t

otal

(mg/

dl)

FIGURA 20. CONCENTRACIÓN DE COLESTEROL TOTAL EN CADA UNOS DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO PARA EL

ENSAYO DE 400 MG/ KG DE PESO Y LOS GRUPOS CONTROL. FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT),

GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI

PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG).A VALOR P<0,05 .

Peso de los órganos

El resumen del peso de algunos órganos obtenidos después del sacrificio de los animales se

muestra en la TABLA 15

Corazón Hígado Tejido adiposo blanco

o

blanco

Riñón Gastrocnemio

FO 0,17 ± 0,02 5,25 ± 0,04 0,58 ± 0,01 1,83 ± 0,02 0,57 ± 0,03

FT 0,22 ± 0,01 5,22 ± 0,05 0,59 ± 0,01 1,86 ± 0,01 0,63 0,01

GSO 0,22 ± 0,01 5,29 ± 0,07 0,58 ± 0,03 1,95 ± 0,01 0,67± 0,01

GST 0,22 ± 0,01 6,33 ± 0,07 0,56 ± 0,05 1,66 ± 0,01 0,64 ± 0,05

GSP 0,19 ± 0,02 5,52 ± 0,04 0,63 ± 0,03 1,90 ± 0,01 0,72 ± 0,03

FP 0,22 ± 0,02 5,81 ± 0,09 0,57 0,03 1,78 ± 0,01 0,64 ± 0,07

DN 0,65 ± 0,05 5,80 ± 0,33 0,53 ± 0,13 1,97± 0,08 0,67 ± 0,06

DG 0,67 ± 0,04 5,79 ± 0,13 1,05 ± 0,06 1,81 ± 0,03 0,64 ± 0,03TABLA 15. RESUMEN DE LOS PESOS DE DIFERENTES ÓRGANOS DE COLESTEROL TOTAL (COLT), COLESTEROL

HDL (COL HDL), COLESTEROL LDL (COL LDL), GLICEMIA (GLI) Y COLESTERORL LDL (COL LDL). PARA LOS

GRUPOS FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH

TRADICIONAL (GST), GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP), CONTROL DIETA NORMAL (DN) Y CONTROL

DIETA GRASA (DG). CON EL RESPECTIVO ERROR DE LA MEDIA (E.M)

55

FIGURA 21. PORCENTAJE PROMEDIO DE GANANCIA DE TEJIDO ADIPOSO EN ENSAYO DE 400 MG/KG DE PESOEN

COMPARACIÓN CON EL PESO INICIAL FUJI ORGÁNICO (FO), FUJI TRADICIONAL (FT), GRANNY SMITH

ORGÁNICO (GSO), GRANNY SMITH TRADICIONAL (GST) Y GRANNY SMITH PIEL (GSP) Y FUJI PIEL (FP),

CONTROL DIETA NORMAL (CN) Y CONTROL DIETA GRASA (DG). A VALOR P < 0,001 Y B VALOR P< 0,05

La Tabla 15, indica los promedios de los pesos de corazón, hígado, tejido adiposo blanco, riñón y

gastrocnemio. El único tejido que muestra una diferencia estadísticamente significativa es el %

de tejido adiposo blanco en comparación con el peso inicial del individuo en estudio (Ver

resultados en FIGURA 21). Existe diferencia entre el grupo con Dieta grasa (DG) y el resto de

los grupos en estudio. Además, de una marcada diferencia entre el grupo dieta normal y todos los

grupos en estudio experimentales. Entre los grupos experimentales no existe diferencia

significativa.

Nuevamente se debe realizar un análisis de los componentes principales para analizar la

asociación entre el peso del tejido adiposo blanco y los resultados de los parámetros bioquímicos

es necesario realizar un análisis de componentes principales, los resultados son mostrados en la

FIGURA 22.

56

FIGURA 22. RESULTADOS DE ANALISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES DE COLESTEROL TOTAL (COL T),

COLESTEROL LDL (COL LDL), COLESTEROL HDL (COL HDL), TRIGLICERIDOS (TRIG), TEJIDO ADIPOSO BLANCO

(TAD). EN ENSAYO DE 400 MG / KG PESO DE RATON

El análisis estadístico valida los resultados obtenidos en el ensayo de 10 mL de extracto en 250

ml de volumen final, con una clara diferencia entre el grupo de control graso, los que se ubican en

el cuadrante derecho de la figura, y el resto de los datos se ubicaron en el cuadrante central de la

figura. La única diferencia que existe en este resultado es la relación que encontró la prueba

entre los resultados de COL T – COL LDL y % TAD, lo cual se relaciona con los fundamentos

bioquímicos y metabólicos conocidos hasta el momento. Lo único que presenta distorsión entre

lo que supone la teoría con la práctica, son los resultados en cuanto a los triglicéridos, los cuales

encuentra una relación con el COL –HDL, los que se pueden deber a la diferencia que existe en el

metabolismo de colesterol en las personas que en ratones (Kennedy et al., 2010).

57

X. CONCLUSIONES

Para el objetivo específico “Determinar un protocolo eficiente y saludable de extracción de

Antioxidantes fenólico con énfasis en quercetinas, sin la utilización de nitrógeno líquido y

ultrasonido”, se definió un protocolo de extracción, siguiendo los objetivos propuestos de

eliminar de este proceso la utilización de nitrógeno líquido y ultrasonido, con similares niveles de

antioxidantes a los controles utilizados (Tabla 2 y 4). Siendo sumamente importante para el

escalamiento que se podría realizar en etapas futuras si se continuara con el desarrollo de algún

producto rico en antioxidantes.

Por otra parte, la extracción de antioxidantes fenólicos, en especial de quercetinas totales desde el

material vegetal, es dependiente del tiempo, de la temperatura y la concentración de etanol

(FIGURA 3,FIGURA 4,FIGURA 5,FIGURA 6,FIGURA 7,FIGURA 8). Puesto, que al variar

estos parámetros, la cuantificación de los metabolitos presente fueron cambiando, es por esto que

las condiciones de extracciones que fueron las utilizadas son: una concentración de etanol al

80%, temperatura de extracción 80°C y 6 horas el tiempo del proceso de extracción.

Para el objetivo específico “Caracterizar los extractos mediante su capacidad antioxidantes y

contenido de fenoles”, las extracciones realizadas a partir de los desechos obtenidos de la

empresa Surfrut no perdieron una actividad antioxidante significativa, ni tampoco se redujeron en

la cantidad de fenoles que fueron cuantificados, desde el paso inicial de extracción hacia la

concentración en el evaporador rotatorio. La única diferencia que existe en el análisis de química

proximal realizados es el alto valor de lípidos presente en la muestra FP (Tabla 9), la cual está

compuesta en su gran mayoría por lípidos del tipo alcanos que podría otorgar estabilidad a la

solución con antioxidantes sin perder su actividad biológica (Tabla 5, 6, 7) y tampoco afectar la

salud de los animales en el estudio debido a que son inocuos. Se logro aumentar el contenido

tanto de fenoles y antioxidantes desde un 38% para GSO a un 5% para FP (Tabla 9),

disminuyendo desde 1.200 Gr de manzana a un extracto que varío en entre 19 y 100 gr. de

extracto (más de 100 veces).

Para el objetivo específico “Determinar si existe acción benéfica del extracto sobre el modelo

animal y si esta es dependiente de la concentración de los antioxidantes”, se logro especificar que

la acción de los extractos, disminuyo el colesterol total en el modelo animal. Con ambos ensayos

58

realizados se pudo determinar que los efectos son independientes de la concentración de

antioxidantes presente en los extractos (Tabla 11 y 14).

Además, en la administración de los diferentes extractos al modelo animal exhiben un marcado

descenso de su colesterol total, por consiguiente de un aumento del colesterol HDL y un aumento

del colesterol LDL. La comparación entre los grupos con dieta grasa (28 % de lípidos, ver tabla

8), el control normal (alimentación normal y agua para beber) y los diferentes grupos en estudio

muestran una disminución del colesterol total a niveles similares del control normal. Este

resultado parece ser independiente de la cantidad de antioxidante (constante o variable en el

transcurso del ensayo), de la variedad en estudio (Fuji o Granny Smith), del manejo agronómico

o si proviene de piel o fruto pequeño de raleo de manzana (Tabla 11 y 14). Según algunos

artículos esto podría deberse a la inhibición de la absorción de lípidos por parte de algunos

antioxidantes. (Koo & Noh, 2007), para llegar a esa conclusión en ensayos futuros se podría

cuantificar las concentraciones de lípidos en las deposiciones de los animales durante el

experimento. Según el análisis de los componentes principales, se observa que la disminución

del colesterol total se encuentra relacionada a la disminución de la cantidad de tejido adiposo

blanco.

La hipótesis que da origen a esta tesis es aceptada, ya que los extractos proveniente de la piel y

fruto pequeño de raleo de manzana es capaz de presentar mejoras en el modelo animal. La

contradicción que se puede generar, es que no puede ser definido si la disminución de los niveles

de colesterol es debido a los antioxidantes presente en el extracto.

Las aplicaciones de los resultados podrían ser varias, desde suplementos alimenticios hasta la

utilización como conservante de alimentos naturales. Efectos similares no han sido detallados en

la literatura, solamente se describen las acciones biológicas y los efectos beneficiosos que

presentan los polifenoles de uva en prevenir patologías mediadas por inflamaciones incluidas las

enfermedades cardiovasculares (Leifert & Abeywardena, 2008; Perez-Vizcaino & Duarte,2010).

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