estudio de los acidos nucleicos (dna y rna) en el …

ESTUDIO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS (DNA y RNA)EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE LA ESPECIE HUMANA_

DURANTE LA ONTOGENESIS

MARGABITA RoDs y JUAN SABATER

INTRODUCCIÓN

El contenido en ADN de cada célula diploide es constante dentro deuna misma especie animal; por lo tanto, la cantidad de ADN de un órgano'o determinada región será una medida cuantitativa del número de células.presentes, valor que podrá cuantificarse en su totalidad por órgano o porunidad de peso fresco del tejido, datos cuya significación iremos desarro-llando a lo largo de nuestra exposición. HELLER y ELLIOT (1954) estabfecie-ron para el cärtex cerebral humano un contenido de ADN de 7,1 pg. porcélula.

La división celular de un determinado órgano durante la ontogénesis-es diferente entre distintas especies animales y dentro de una misma especieanimal no hay una sincronía de desarrollo entre todos los órganos y tejidos,.sino que cada uno puede tener su propia curva de multiplicación celular.hasta que se alcanza el máximo desarrollo ontogénico.

Las dificultades analíticas e interpretativas del contenido de ADN de unórgano durante la ontogénesis se hacen verdaderamente confusas en el caso,de ser el sistema nervioso el sometido a estudio. En primer lugar hay quetener en cuenta la variada celularidad de dicho tejido formado por células'neuronales y de glia (oligodendroglía, microglia, astrocitos), que hace de losvalores del ADN un dato global de crecimiento celular, pero sin que puedadiferenciarse el porcentaje de crecimiento de cada uno de los diferentes tipos,de células que lo componen y que tan diferente función tienen desde unpunto de vista fisiológico. Al estudiar las diferentes regiones del sistema ner-vioso central individualmente, tampoco se puede distinguir entre división.celular y migración celular. Por otro lado, la compleja anatomía del sistemanervioso hace que no pueda hablarse del mismo en términos cuantitativos.como un todo homogéneo, sino que ha de considerarse formado por múltiples:

186 M. RODE' S Y J. SABATER

zonas que, aun formando parte de un todo aparentemente homogéneo, tienenvalores muy distintos de componentes estructurales, como para el caso delADN y ARN pueden verse en la tabla I, correspondiente a datos de R. ',AM-

DOLT, H.H. HESS y C. THALHEIMER (1966).

TABLA I

ARN Y ADN EN SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

Región ARN(g/mg. peso seco) (pg/ing,

ADNpeso seco)

ARN/ADN

Corteza frontal 5,47 2,56 2,14Núcleo candado 4,40 3,09 1,44Corteza motora 4,38 2,56 1,72Corteza calcarina 6,41 4,34 1,47Sustancia negra 3,29 1,81 1,83Periacueducto gris 4,69 2,60 1,89Cuerpo mamilar 4,17 2,73 1,54Núcleo rojo 1,80 1,72 1,07Fórnix 2,45 2,68 0,92Cuerpo calloso 1,60 1,83 0.87Bases pedunculares 1,56 0,92 1,74Glándula pineal 15,89 10,13 1,58Organo subfórnico 17,90 8,75 2,05

Las muestras fueron obtenidas de 5 pacientes adultos, que murieron decausas no neurológicas.

De estos valores podemos comentar que en el cerebro humano las zonasmás ricas en ácidos nucleicos son el órgano subfórnico y la glándula pineal.Ambos tejidos contienen neuronas muy pequeñas con una relación ARN/ADNde 2,05 y de 1,58 para el órgano subfórnico y glándula pineal respectiva-mente. El menor contenido en ácidos nucleicos corresponde al cuerpo callo-so, fórnix, pedúnculos y núcleo rojo. El cociente ARN/ADN se toma comoproporcional al número de ARN por célula, que también puede extrapolarsecomo un índice del tamaño celular.

A la complejidad anterior, con las consiguientes dificultades interpreta-tivas de datos analíticos, hay que sumar el hecho establecido por H. HYDEN

(1962) de que las neuronas tienen unas trece veces más ARN que las célulasde glía, y dentro de las neuronas hay valores muy variables que van desde200 pg/célula en las células del hipogloso a 155 pg/célula en las células gi-gantes de Deiter, datos obtenidos en conejos. Todo ello presupone que hayque interpretar con grandes reservas, a la hora de sentar conclusiones, • losdatos aportados por determinaciones de ácidos nucleicos en determinadas

•porciones de tejido cerebral o en general del sistema nervioso.Con estos comentarios queremos llegar a la conclusión de que para el

estudio ontogénico -del sistema nervioso es imprescindible proceder a un es-tudio regional ; sin embargo, todo y con ello hts dificultades son grandes prin-cipalmente en cerebros de fetos en los que la diferenciación todavía no ha

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:alcanzado el grado suficiente para que las distintas áreas puedan sometersea disección.

Para hacer un estudio ontogénico en el hombre hay que considerar lagran dificultad que existe en obtener el material que lógicamente ha de pro-venir de abortos espontáneos o de muerte natural en centros de prematuros.Actualmente, con la reciente legalización del aborto en algunos paises, sepodrá disponer de material para estos estudios; sin embargo, hasta la fechahan habido serias dificultades, lo que explica las pocas publicaciones —teclasellas muy parciales— que existen sobre desarrollo ontogénico cerebral en laespecie humana. Post modem el contenido en ADN es bastante estable; sinembargo, hay una no despreciable hidrólisis natural del ARN que hay quetener en cuenta, lo que indudablemente limitará el número de muestras apro-vechables al considerar el tiempo mediado entre la muerte y la obtenciónde la 'pieza, así como la conservación del cadáver y de la pieza.

El primer trabajo sobre ácidos nucleicos cerebrales en la especie hu-mana durante la ontogénesis, se debe a M. WINICK (1968), y en el mismose estudian los valores de ADN, ARN y proteínas de 31 cerebros humanos,de los cuales solamente 12 corresponden a fetos de Menos de 40 semanas degestación. Un ario más tarde apareció el trabajo de HowAnn y col. (1969),que analizan el. ADN, ARN y colesterol en 28 muestras humanas, ofreciya datos tanto del cerebro como del cerebelo. A diferencia del trabajo deWINICK, este último se basa en productos obtenidos a partir de abortos, porlo que es rico en datos de fetos de edades comprendidas entre las 10 y 16 se-manas de gestación, pero solamente 6 cerebros corresponden a periodos com-prendidos entre las 20 y 30 semanas, sin ningún dato entre las 30 y 40 se-manas. Quizás el trabajo más completo es el de DosmNo y SANDS ,(1973),aparecido en fechas en que estaba ya muy avanzado nuestro trabajo, queaporta datos de 139 cerebros, pero principalmente enfocado al período post-natal, para ver el momento en que se alcanza la estabilidad en lo que res-pecta al crecimiento y diferenciación celular en la especie humana. Aportael interesante dato de que el crecimiento celular termina entre los diecio-cho meses y los dos arios de vida y no a los cinco meses, como se venía con-siderando hasta la fecha en datos más parciales de los mismos autores publi-cados en 1970 y publicados también por WINICK en 1968. Este dato es degran interés práctico a tener en cuenta sobre la acción deletérea que deter-minadas noxas externas (anoxia, desnutrición, infecciones, etc.) tienen sobreel desarrollo cerebral en relación a dejar secuelas • irreversibles.

El trabajo de WINICK (1968) ofrece una visión muy general del tenra,dado que los datos se refieren a muestras obtenidas por homogenizació-n

total del cerebro completo y, por lo tanto, no 'pueden establecerse diferenciasentre las regiones, ni tan siquiera con la tan importante por su individualidadfuncional, como es el cerebelo. Sin embargo, tiene el mérito de haber sidoel primer trabajo serio sobre el tema de los ácidos nucleicos durante la onto-génesis en la especie humana. El trabajo de HOWARD y cols. (1969) es muyinteresante por sus datos de fetos muy pequeños, desde la semana 10 hastala 20, pero es muy pobre de datos de fetos desde 20 a 40 semanas, concre-tamente ningún valor entre las 30 y 40 semanas de gestación. Al iniciar

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nuestro trabajo todavía no había aparecido el citado trabajo de DossiNG ySANDS.

Sin embargo, por la gran problemática en la obtención de material hu-mano, ya no sólo por la dificultad de obtener necropsias en condiciones, sinoademás por precisar de la certeza de que pertenecen a fetos sin problemasen su desarrollo cerebral, así como de la necesidad de conocer la edad degestación (lo que comporta conocer exactamente la fecha de la última reglade la madre) la justificación de llevar a cabo nuestro trabajo estaba fuera detoda duda, pues había en la literatura, como ya hemos indicado, una lagunaenorme de datos de fetos entre las 30 y 40 semanas de gestación. Precisa-mente nosotros estábamos por nuestra conexión con el I.P. de Prematuros yPatología Neonata' en óptimas condiciones para obtener cerebros de niñosde estos períodos de gestación. El poder seleccionar los 20 cerebros cuyosdatos se aportan en el presente trabajo, con las correspondientes determina-ciones analíticas de ADN, ARN y Proteínas en las áreas de : Lóbulo Frontal,Lóbulo Temporal, Lóbulo Occipital, Lóbulo Parietal, Cerebelo, Tronco Ce-rebral, Núcleos y Médula, ha supuesto un trabajo ininterrumpido a lo largo decasi tres arios.

INDICES BIOQUÍMICOS ESTUDIADOS

1. ADN, como índice del número de células. — Intracelularmente, elADN está casi exclusivamente localizado en el núcleo ; de todos modos, sehan aislado pequeñas cantidades de ADN en mitocondrias DAI-IL y cols.(1960) y DUBUY y cols. (1966).

Como la mayoría de células en el cerebro son diploides, generalmentehay una cantidad fija de ADN por célula, a pesar de que se han descritociertas células poliploides, pero el número de estas células es pequeño VIOLA

MP (1963). En general, el contenido en ADN en cerebros de mamíferos oscilaalrededor de 6,1-7,1 pg/cél. HELLER y ELLIOT (1954), KISSANE y ROBINS(1958), MANDEL y cols. (1948). En el cerebro de otros vertebrados, el conte-nido de ADN por célula varía mucho ( MANDEL y cols., 1964).

Para un mismo tejido, la cantidad de ácido desoxirribonucleico del nú-cleo es constante; de ahí que la dosificación cuantitativa del ADN es uníndice directo del número de células por unidad de peso del tejido, que ensí ya es un parámetro del desarrollo tisular, pero además ofrece la ventajade que todos los otros datos cuantitativos de tipo bioquímico que se obten-gan pueden referirse no a gramo de tejido, sino en relación al ADN, es decir,en tanto por célula. Desde un punto de vista de su valor absoluto por gramode tejido con el desarrollo irá lógicamente descendiendo, pues el ADN per-manece a la misma concentración, al mismo tiempo que en el SCN no haydivisión celular, y la formación de sustancias durante el desarrollo —princi-palmente lípidos— hace que este ADN se vaya «diluyendo» en valor relativodentro de un tejido cuyas estructuras extranucleares están en un aceleradodesarrollo. Por otro lado, el índice Proteínas/ADN y Peso/ADN serán índi-ces del tamaño celular en un determinado tejido, es decir, que tenemos conestos valores una idea cuantitativa del número ,de células y al mismo tiempoun índice del tamaño de estas células.


Otro punto, por el cual resulta muy interesante la determinación de ADNen cerebro, es que este órgano tiene un período limitado para poder realizarla mitosis, y por lo tanto la edad en la cual la cantidad de ADN en cereb2opermanezca constante, indicará el final del período de especial «vulnerabili-dad» cerebral.

2. ARN cerebral. — El ácido ribonucleico, aunque en parte integrantetambién del núcleo (nucléolo) cuantitativamente es un componente citoplas-mático ya soluble, ya en ribosomas, y por lo tanto su determinación cuanti-tativa será en parte un índice del tamaño celular, aunque su síntesis estáinfluenciada por muchos factores no muy conocidos en general y concreta-mente en el cerebro aún menos, por lo que como índice del tamaño celularpresentará probablemente menos constancia que los índices Proteínas/ADNo Peso fresco/ADN antes citados.

El estudio de la ontogénesis en pollos y otros animales ha servido parademostrar que el ritmo de la síntesis del ARN en cerebro es muy alto en elfeto y en el período neonatal, y cae bruscamente cuanto se inicia el desarrolloneonatal. Los factores que condicionan la tasa de síntesis del ARN en elcerebro no son muy conocidos. BAEONDES (1964) demostró que la actividadde la ARN polimerasa en preparados de agregados nucleares era más alta enel cerebro inmaduro que en el maduro (en ratas); sin embargo, en el mismoario BONDY S.C. (1964) encontraron resultados contradictorios en cerebro deconejo; de ahí que es interesante observar qué ocurre en la especie humana.

MANDEL y col. (1964) han estudiado los niveles de ARN en cerebro demamíferos (adultos), encontrando los valores más altos en el bulbo olfatorio,la materia gris cerebral y cerebelar, en el hipocampo, y los valores más bajosen el mesoencéfalo, materia blanca, médula oblongada y médula espinal. 'Aun-que es difícil en cerebros inmaduros poder aislar estructuras que aún noestán completamente definidas, será d'e gran interés poder seguir el procesoevolutivo de la formación del ARN en diferentes áreas del SNC durante eldesarrollo en la especie humana.

3. Proteínas. —Las proteínas son un índice bioquímico representa-tivo del crecimiento celular. El crecimiento de un órgano puede ocurrir poraumento del número de células o por aumento del tamaño celular. La deter-minación simple del incremento ponderal de un tejido no permite la distin-ción entre un crecimiento hiperplásico (aumento del número de células) deun. crecimiento hipertrófico (aumento del tamaño celular).

El crecimiento de un órgano cesa cuando se alcanza un peso o cantidadtotal de Proteínas, constante, lo cual implica .que la síntesis de proteínas y sudegradación están en equilibrio.

El índice proteínas/ADN refleja la cantidad de proteínas por célula ypuede ser un índice aproximado del tamaño celular, por lo que permitirádeterminar diferencias de constitución celular en las distintas regiones ana-tómicas consideradas.

El estudio evolutivo del índice Proteínas/ADN durante el desarrollo deun tejido permitirá separar las dos fases de crecimiento del mismo, ya que alfinalizarse la multiplicación celular del tejido, el indice Proteínas/ADN tiene

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que aumentar ostensiblemente. Cuando se alcance el tamaño celular adulto,la relación Proteínas ADN permanecerá constante.

O sea que el estudio de proteínas permite separar las dos fases de cre-cimiento de un órgano o tejido y determinar cuándo cesa el crecimiento deun órgano.

MATERIAL Y METODOS

MATERIAL

Se han estudiado 22 cerebros humanos de edad de gestación compren-dida entre 19 semanas y 40 semanas. También se han estudiado un caso de2 meses de edad y otro de 8 meses de edad, junto con una necropsia de cor-teza cerebral de adulto.

El material biológico ha sido obtenido del Instituto Provincial de Pre-maturos. Los tejidos sobre los que se han realizado las determinaciones fue-ron considerados como normales desde el punto de vista histopatológico.

Una vez recibidas las muestras en el laboratorio, se procedió inmedia-tamente a la disección, realizándose en la cámara fría. Las regiones anatómi-cas estudiadas han sido

Lóbulo Frontal: Comprende la porción anterior del cerebro, desde elextremo anterior hasta la cisura de Rolando.

Lóbulo Occipital: Comprende desde el extremo posterior del hemisferiohasta un plano frontal en el límite posterior de la cisura de Silvio.

Lóbulo Temporal: Que comprendo la porción inferior a la cisura de Sil-vio, limitado por la parte posterior por el plano de separación anterior delóbulo occipital.

Lóbulo Parietal: Que comprende la porción situada por encima de lacisura de Silvio, limitada anteriormente por la cisura Rolándica y posterior-mente por el límite anterior de la porción denominada lóbulo occipital.

Núcleos: Comprendiendo la porción central del hemisferio e incluyendotálamo óptimo y los núcleos basales lenticular y candado. Esta porción esmenos definida que las anteriores debido a la dificultad de delimitación enel cerebro no mielinizado, y probablemente su disección no es reproduciblevariando la proporción de las diversas estructuras que se encuentran en estaregión central del hemisferio cerebral.

Cerebelo: Comprende con exactitud el órgano autóctono de esta deno-minación.

Tronco o Bulbo: Comprende pedúnculos cerebrales, pedúnculos cerebe-losos, protuberancias y bulbo.

Médula: Que comprende el órgano anatómico de esta denominación.

Una vez separadas las distintas fracciones, se pesaron cuidadosamente,después de haber separado las membranas meníngeas. Normalmente se pro-cedió a continuación, a la realización de las extracciones y determinacionescorrespondientes, en algunos casos se conservaron las muestras durante algu-nos días a — 40° C.

Los valores correspondientes a cada muestra se agruparon según la edadde gestación en períodos de dos semanas. Lós valores en las tablas y en lasgráficas representan la media aritmética del grupo de edad comprendida en- .

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tres las dos semanas. Los resultados obtenidos se resumen en las tablasy en las figuras 1-6.

Mft0DOS.Extracción de ácidos nucleicos, técnica empleada. —De los tres métodos:

clásicos de determinación de ácidos nucleicos : Método de Schneider 1945,método de Ogur-Rosen 1950 y método de Schmidt y Thannhäuser 1945, he-,mos elegido como técnica «base» para nuestro estudio el de Schmidt y Than-nhäuser, con algunas variaciones propias que hemos introducido para su apli-cación al tejido cerebral humano.

Esquema del método utilizado :

MUESTRA, aproximadamente de 1 gramo

HOMOGENEIZAR con 10 ml. de H20 fría

Extracción con ácido frío : 1. 5 ml. TCA 30 %II. 10 ml. TCA 7 %

III. 10 ml. TCA 5%Centrifugar cada vez 10 min. a 0 0 C y 6.000 rpm.

Fracción ácido-soluble de bajopeso rno lecular (péptidos,

aminoácidos, etc.)

PRECIPITADO (proteínas, fosfolípidos yácidos nucleicos)

LAVAR COD:I. 10 ml. acetato potásico 1 %

II. 3 x 10 ml. alcohol 95 0 fríoCentrifugar cada vez 10 min. 00 C,.

6.000 Imp.

SOBRENADANTE PRECIPITADO

Extracción lípidos:C-M (1: 1) 10 ml./1 gr. tej. fresco2 x C-M (2: 1) 5 ml./1 gr. T. F.

Centrifugar 10 min. 00 C, 6.000 rpm..

•FRACCIÓN LIPÍDICA PRECIPITADO (proteínas y ácidos nucleicos)/

Lavar con 10 ml. éter y dejarsecar a temperatura ambiente

SOBRENADANTE

PRECIPITADO

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.SOBRENADANTE PRECIPITADO

Digestión con álcali : 10 ml KOH 0,5 N[5-18 horas a 37°C

HIDROLIZADO ALCALINO

Enfriar sobre hieloAñadir 4 ml. agua de;tilada fría,acidificar con 1,4 ml. PCA 65gota a gota

1SOBRENADAN' E (AHN-acido soluble) PRECIPITADO (ADN-proteínas)

Completar 20 ml. con agua fríaARN PARA VALORACIONES

Extracción con ácido en . caliente, 10 ml.TCA 5 7 15 min. a 90° C

SOBRENADANTE, [ADN-soluble (1)] PRECIPITADO (proteínas)

Añadir 5 ml. TCA 5 % frío

SORBEN ADANTE PRECIPITADO

Añadirlo a la fracción (1) y hacer la so-lución 0,5 N en PCA : 1 ml. PCA 65 %y enrasar a 20 mi. con agua destilada

A DN PARA VALORACIONES

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ARN, ADN Y PROTEÍNAS.

1) Determinación de ARN. —Hemos realizado un estudio de la deter-minación de ARN, por dosificación paralela de Fósforo . y de Ribosa.

Dosificación de Fósforo:La valoración de fósforo se basa en la digestión del compuesto fosforado

con ácido concentrado y en caliente, de modo que se obtenga un fosfatoinorgánico, las condiciones de la digestión sor críticas, LpinEnc y cols. (1956);LELOIR y cols. (1957). El ortofosfato se hace reaccionar con ácido molíbdico,para que forme un compuesto que al reducirse es de color azul.


Hemos calculado la Desviación Standard de la técnica, a partir de losvalores obtenidos determinando Usforo en la solución de ARN patrón, du-rante días sucesivos

MEDIA 111 = 11,15DESVIAC:ÖN STANDARD S = 0,88cv = 7,17

Valores del adulto: Calculados a partir de una muestra de corteza cere-bral, 90 % sustancia gris.

ARN-P 34,76 mg. ARN-P por gr. de tejido fresco.

Dosificación de Ribosa:Hay descritas numerosas reacciones colorimétricas para la valoración de

ribosa (DiscfrE y BODEN, 1957; REEVES y MUNDO, 1940; ROE y RICA, 1948;WEBB, 1956 y DISCHE, 1930). Nosotros utilizamos la reacción del orcinol deBIAL (1902), adaptada por DISCHE y SCHWARZ (1937). y MEJBAUM (1939) parala determinación de ARN, ya que ninguna de las otras reacciones descritasparece ofrecer ventajas sobre ésta.

Hemos calculado la Desviación. Standard del método a partir de lecturasde D.O. realizadas en el mismo día con ARN patrón

MEDIA ID = 0,188DESVIACIÓN STANDARD = 0,00480cv = 2,55

Comprobamos la Linealidad del método realizando una gráfica con losvalores obtenidos dosificando orcinas en la solución standard de ARN.

Valores del adulto: Calculados a partir de una muestra de cortyza ce- •rebral, 90 % sustancia gris.

ARN-P 11.9 mg. ARN-P/100 gr. de tejido fresco.

2) Determinación de ADN. —También hemos realizado un estudio dela determinación de ADN por dosificación paralela de Fósforo y Desoxirribosa.La determinación de fósforo está ya descrita en la determinación de ARN.

Dosificación de Desoxirribosa:Hemos adoptado la reacción con difenilamina, que implica la reacción

de la desoxirribosa con la difenilamina en una mezcla ácido acético glacial yácido sulfúrico a 100" C, dando un color azul. La reacción fue primeramentedescrita por DISCHE (1949) para determinar niveles de 50-100 fug de ADN.Después fue modificada por BURTON (1968), introduciendo en el reactivo ace-taldehído y manteniendo las muestras a 30° C .durante algunas horas. El mé-todo de Burton se considera el más específico.

Comprobamos la Linealidad del método realizando una gráfica con losvalores obtenidos dosificando desoxirribosa en la solución de ADN patrón.

Valores del adulto: Valor obtenido en muestra de corteza cerebral. 90 %sustancia gris.

ADN-P 4,96 mg. ADN-P/100 gr. tejido fresco.

Calculando la Desviación Standard del método, a partir de las lecturasde D.O. realizadas en un mismo día, con ADN standard tenemos:

M. RODES Y J. SABATER

MEDIA 0,276DESVIACIÓN STANDARD = 0,00955cv 3,46

3) Determinación de Proteínas totales: Para la determinación de proteí-nas utilizamos el método de Lowry ya descrito anteriormente.

RESULTADOS

VALORES ENCONTRADOS EN CEREBRO (figs. 1, 3 y 5)Acidos nucleicos. Peso total por órgano y proteínas. — En las tablas 1

y VII pueden observarse los valores correspondientes al peso total por órganoy proteínas a lo largo de la ontogénesis en el el intervalo por nosotros abarca-do. El aumento de peso corresponde a un factor de multiplicación de 4,1 y elaumento de proteínas a un factor de multiplicación de 4,4. No presenta espe-ciales características este esquema con lo esperado, si bien el haber podidoestudiar este intervalo de forma continua y no con puntos más aislados comoen trabajos de otros autores, se pueden observar dos zonas de mayor aumen-to de peso con respecto a incrementos por intervalo, que son los períodocomprendidos entre las 26 y 30 semanas de gestación y entre las 34 y 36semanas, mucho mayor incluso que el comprendido entre el embarazo a tér-mino y los dos meses de vida extrauterina. Aunque no puede de ello sacarseninguna conclusión práctica por el momento, sí es importante recordar estosvalores con vistas a observar en el futuro, si dentro de este período global de«vulnerabilidad» en el que nos movemos puede darse a estos intervalos del.período de gestación una significación especial de sensibilidad a noxas pato-lógicas. El mismo comportamiento, con estos dos puntos de inflexión, lopresentan los valores de proteínas totales (tabla VII).

ADN y ARN.—En las tablas V y VI y en la figura 1 podemos ver losvalores de ADN y ARN en cerebro. Por lo que al ADN concierne en valoresabsolutos por órgano (suma de hemisferios más núcleos) vemos que el aumen-to, aunque evidente, es muy poco acentuado, y dentro de este casi «plateau»,principalmente en la zona comprendida entre las 24 y 40 semanas, no se ob-servan los incrementos más acentuados en los intervalos para el peso totaly proteínas. Este aumento del ADN corresponderá a mitosis en célula deglia. Podemos, por lo tanto, deducir que el aumento importante de peso quehemos visto se presentaba en este intervalo será debido no a multiplicacióncelular, sino principalmente a hipertrofia celular, es decir, a la formación delas complejas estructuras de la microanatomía del sistema nervioso.

Con respecto a la concentración relativa, es decir, al valor del ADNpor 100 gr. de tejido fresco, podemos ver en la tabla III que en todos loslóbulos de cerebro se sigue un mismo esquema evolutivo con muy escasasdiferencias interlobulares, sin haber ninguno que presente con cierta cons-tancia y a lo largo de todo el intervalo unas características diferenciales conlos demás. Unicamente podríamos señalar que en el lóbulo occipital se ob-serva una mayor concentración relativa de ADN en las primeras semanas degestación estudiadas (20-30 semanas) para igualarse a continuación con los


demás lóbulos. Por ello en el comentario vamos a referirnos al valor mediode todos ellos, como representativo del grupo, y evitar así la dificultad detener que observar simultáneamente y para un mismo concepto cuatro grá-ficas distintas. En contra del aumento progresivo de peso del cerebro y delligero aumento en valor absoluto del ADN, en concentración observamos -un acentuado y constante descenso que alcanza una zona de mayor constan-cia a las 30 y 34 semanas de gestación, que se corresponde con el períodode mayor aumento de peso total considerado en incrementos por intervalo.Ello es debido al hecho de que, como ya hemos comentado, el aumento delnúmero de células es muy escaso en este período, pues la multiplicaciónneuronal ya ha finalizado y la multiplicación glial prosigue pero de formamuy constante a lo largo de todo el intervalo y hasta bastantes meses des-pués de la gestación, por lo que sus cambios no son llamativos en un inter-valo restringido como el que nosotros hemos estudiado. El aumento de pesoserá, por lo tanto, a expensas del aumento del tamaño celular, de la proli-feración de ramificaciones celulares (axon.es y dendritas), aumento de proteí-nas somáticas y de membranas y aumento de lípidos, por lo que por pesode tejido fresco el valor de ADN se va «diluyendo» ante el considerableaumento de la complejidad celular. El valor a término 8,05 mg. ADN-P/100gramos de tejido fresco se reducirá todavía en un 30 %.hasta alcanzar los va-lores del adulto, que nosotros para corteza cerebral (90% sustancia gris) he-mos encontrado del orden de 4,96 mg. de ADN-P/100 gr. de tejido fresco.

El ARN en valor absoluto por órgano sigue una línea evolutiva muysimilar a la del peso, hecho lógico si consideramos que el ARN forma partede las estructuras citoplasma-ticas y su aumento va en cierto modo unido alcrecimiento celular, ya no sólo en número, como era para el ADN (valorconstante por célula), sino también en tamaño. El valor es progresivo, sinque puedan evidenciarse incrementos porcentuales significativos dentr9 delintervalo estudiado. El valor relativo al ARN frente al descenso observadoen el ADN, se mantiene prácticamente constante, es decir, que hay un aumen-to del tamaño celular, existe en realidad una hipertrofia celular, pero lógica-mente eu concentración se mantiene prácticamente constante el valor delARN. En corteza cerebral (90 % sustancia gris) de un cerebro adulto, hemosobtenido un valor de 11,90 mg. de ARN-P/100 gr. de tejido fresco, valor sóloligeramente inferior al de 12,63 mg. ARN-P/100 gr. obtenido de un cerebroa término.

En la figura 5 y en las tablas VIII, IX y X observarnos los valores delos índices : proteínas/ADN, ARN/ADN y peso/ADN.

Esos indices serán un parámetro indicativo de lo que ocurre «por cé-lula» a lo largo de la ontogénesis. Al poner en el denominador el valor re-lativo por tejido fresco de ADN, reducimos los valores al término relativode «mg. de ADN», es decir, un índice de celularidad. Recordamos de nuevoque este índice de celularidad es global, no pudiéndose distinguir de lo quecorresponde a ADN neurona' o ADN glial. En la figura 5 vemos que la evolu-ción de los tres índices es muy similar, el índice ARN/ADN corresponde entérminos generales al aumento del tamaño celular, dado que el ARN se dis-tribuye de forma bastante uniforme en todo el citoplasma, siendo importante

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recordar que las neuronas tienen una concentración de ARN unas quince ve-ces superior a las células de da y que las zonas ricas en neuronas tendránun cociente ARN/ADN mayor que las zonas con predominio de la glía, as-pecto que veremos al hablar del cerebelo. Dentro de una zona con una mis-ma población celular, cuanto más pequeña sea la célula menor será el co-ciente ARN/ADN, por lo que dentro de un esquema global como el que serepresenta en nuestros valores vemos que a lo largo de la ontogénesis elvalor del índice ARN/ADN aumenta, lo que indica que aumenta el tamañocelular en su conjunto. El índice peso órgano/ADN se considera más re-presentativo del tamaño celular y en la figura V vemos que disminuye hastalas 26 semanas de gestación (período multiplicación activa), para aumentara continuación paralelamente a los demás índices. Las proteínas son asimis-mo un índice del crecimiento celular por ser parte integrante de todas lasestructuras de los órganos intracelulares y asimismo estar en forma soluble(principalmente estructuras enzimáticas) en el citoplasma, aspecto que lasequipara a la evolución del ARN.

VALORES ENCONTRADOS EN CEREBELO (figs. 2, 4 y 6)Peso total por órgano y proteínas (tablas I y VII). El aumento de

peso de cerebelo entre las 20 semanas de gestación y término correspondea un factor de multiplicación de 7,6 frente a un factor de 4,1 correspon-diente a cerebro. Estos valores indican el gran crecimiento de cerebelo enel período estudiado. El aumento de proteínas transcurre de una forma casiparalela al aumento de peso, entre las 20 semanas de gestación y término.

En cuanto a los incrementos de peso, cabe destacar un acentuado aumen-to con respecto a los incrementos por intervalo, en el período comprendidoentre las 27 y 30 semanas de gestación, tanto por lo que respecta al peso totalcomo al de proteínas por órgano, intervalo en el que se dobla el valor de pesototal y casi se llega a este valor por lo que respecta a proteínas. Se observanotros acentuados aumentos de peso en incrementos, aunque de menor cuan-tía —del orden de 50 %—, en los períodos comprendidos entre las 33 y 35 se-manas y entre las 35 y 38, y en el intervalo entre las 33 y 38 semanas elaumento es algo superior al 100 %. Las proteínas doblan su valor en el inter-valo comprendido entre las 35 y 38 semanas. Esto enlaza en parte con elgran incremento de peso observado para el cerebro en el período compren-dido entre las 34 y 36 semanas de gestación, confiriendo por tanto en suconjunto al período, entre las semanas 34 y 38 del embarazo, un posibleperíodo de alta vulnerabilidad del sistema nervioso en general.

ADN y ARN.—En cerebelo hay mayor proporción de células tetraploi-des que en cerebro; sin embargo, el número de las mismas en relación alde células diploides es muy pequeño, por lo que a efectos de cálculo de ce-lularidad el valor de ADN sigue siendo un parámetro válido. De forma simi-lar a lo encontrado para el peso total en el intervalo comprendido entre las27 y 30 semnas, el valor del ADN (tabla V) prácticamente se duplica, al igualque ocurre en el intervalo que va de la semana 35 a término. En la tabla Vpuede verse que la cantidad de ADN en cerebelo pasa de un valor de


10,96 mg. a las 22 semanas de gestación a 65,35 mg. (factor : 5,96) al finalde la gestación y de un valor de 65,35 al final de la gestación, a un valor de344,27 mg. (dato que no está en las tablas) (factor : 5,27) a los ocho mesesde vida postnatal. Estos datos confirman un período de gran actividad mitó-tica en cerebelo basta los ocho meses de vida.

En concentración los valores de ADN en cerebelo difieren mucho de losencontrados en cerebro (ver tabla III). De unos valores en concentración deADN superiores en cerebelo con respecto al cerebro del orden de un 50 %en las semanas 22-24, se pasa a una diferencia del 100 % en las semanas 28-30,y concentraciones cuatro veces superiores a término, y según nuestros valoresdel orden de 9 veces superior a los ocho meses de vida extrauterina. Estaelevadísima concentración en ADN del cerebelo en relación al cerebro y otrasestructuras del sistema nervioso, dan una especial personalidad a este órga-no, dentro de la fisiología neurológica, teniendo la función de un complejodentro de integración de la información. Esta gran concentración de ADNen el cerebelo condiciona en el mismo una elevadísima actividad biosintéticade ácidos nucleicos a lo largo de este período del «growth spurt», por lo quelo hace especialmente sensible a estados de anormalidad fisiológica comopueda ser la desnutrición materna o la desnutrición neonata', en la que seobserva un efecto adverso en el desarrollo que afecta principalmente al cere-belo, tal como hemos podido demostrar nosotros en trabajos de desnutriciónexperimental en ratas (F. GONZÁLEZ-SASTRE y col., 1975). En concentraciónlos valores se mantienen en una tónica creciente aunque de forma moderadahasta el período final de la gestación. Es a partir del nacimiento cuando lasdiferencias consideradas en incrementos se hacen más significativas, pasandode un valor de 36,50 mg. de ADN-P/100 gr. de tejido fresco al nacimientoa un valor de 55,09 mg. de ADN-P/100 gr. de tejido fresco a los ocho mesesde vida postnatal (factor : 1,5). Este incremento en concentración relativadel ADN en las últimas semanas de gestación y durante los primeros mesesde vida postnatal, contrasta en gran manera con lo encontrado en cerebro,en donde, como hemos visto, paralelamente a un acentuado aumento de peso,en concentración había un continuo descenso de ADN. Ello nos puede llevara la conclusión de que la función fisiológica fundamental del cerebelo estaráestrechamente relacionada con la función del ADN, que de acuerdo con es-tos resultados —y los que siguen— vemos que es el componente que confiereuna especial individualidad a este órgano y lo diferencia de las demás es-tructuras del sistema nervioso.

El ARN total (ver tabla VI) tiene un aumento progresivo, con un aumentomuy significativo del orden del 100 % entre las semanas 27-30, tal como ocu-rría en el ADN. Este período de gran proliferación del ADN, es decir, deuna gran actividad mitötica, presupone con la multiplicación celular un in-cremento correspondiente de componentes citopl asmáticos celulares, entre losque cabe destacar el ARN. Sin embargo, en concentración relativa vemosque a lo largo de todo el período comprendido entre las 20 semanas de ges-tiacón y término del embarazo, permanece casi inalterado, lo que denota laexistencia de un aumento de la celularidad diferente de la que tenía lugaren el cerebro.

202 M. RODÉS Y j. SABATER

En concentración los valores de ADN y ARN en cerebelo son superioresa los del cerebro; de ello podemos ya deducir que las células del cerebeloserán mucho más pequeñas que las del cerebro (en términos globales y con-siderando una vez más que hay que tener presente la gran heterogeneidadde la población celular cerebral).

Con respecto a los índices indicativos del tamaño celular, vernos queseñalan un tamaño mucho menor de las células de cerebelo, disminuyendomarcadamente este tamaño a partir de las 40 semanas, mientras que en cere-bro aumenta. Para el índice proteínas/ADN (fig. 6), el valor para cerebeloa término es del orden de nueve veces inferior al encontrado en cerebro, y alo largo de la ontogénesis durante la gestación este índice se mantiene, im-plicando una constancia en el tamaño celular, a diferencia de lo que ocurreen cerebro, donde hemos visto que hay un considerable aumento del tamañocelular, con un incremento de casi cinco veces en el valor del cociente pro-teínas/ADN entre la semana 20 de gestación y los valores encontrados atérmino.

Los índices ARN/ADN y peso/ADN (fig. 6) también son constantesa lo largo del descarrollo ontogénico con tendencia marcada a disminuir apartir de las 35 semanas, a diferencia del aumento que se observa en cerebroy también son del orden de cuatro veces más pequeños a término, tal comose ha encontrado para el índice proteínas/ADN; sin embargo, en los perío-dos iniciales hasta la semana 24 los valores son muy similares entre ambaszonas.

Vemos, pues, que hay un mantenimiento del tamaño celular en cerebelodurante la ontogénesis hasta las 35 semanas, a diferencia del aumento deltamaño celular observado en cerebro, y que las células cerebelares son muchomás pequeñas —del orden teórico de cuatro veces menos, según puede des-prenderse de los anteriores índices— que las células cerebrales. Y que a par-tir del nacimiento se observa una disminución muy marcada de los índicesproteínas/ADN, ARB/ADN y peso/ADN, lo cual refleja un aumento relativomás rápido en ADN que en los otros parámetros considerados, indicando,como ya hemos dicho, que éste será un período de gran actividad mitótica.

TRONCO CEREBRAL

Peso total por órgano y proteínas (tablas I y VII). — El peso total deltronco cerebral presenta a lo largo de la gestación un aumento continuo, conun único punto de inflexión ascendente importante, correspondiente al perío-do comprendido entre las semanas 27 y 30, al igual que se observó paracerebelo. El aumento de peso relativo es menor que el que se observó paracerebro y cerebelo, en relación con los valores encontrados de la semana 20a término, se encuentran pesos tres veces y media mayores, en tanto que paracerebro el factor de multiplicación para el mismo intervalo era de cuatroy para el cerebelo de ocho. Puede observarse que el aumento de peso queexperimenta el tronco cerebral entre término y ocho meses de vida postnatal,corresponde a un factor de 1,75 (dato que no está en las tablas), mientras queel aumento de peso observado en cerebelo en el mismo período correspondea un factor de 3,25, el incremento relativo ie cerebelo es, pues, de mayor


magnitud que el correspondiente al tronco cerebral durante el mismo período.Un comportamiento similar sigue la cifra de las proteínas totales (ver

tabla 7), observándose la inflexión entre las semanas 27 y 30 con un aumentodel 100 % en su valor absoluto.

ADN y ARN (tablas III, IV, V, VI y XI). — El ADN total tiene un esque-ma ascendente con un trayecto inferior al del peso total y muy similar a lo quepresenta el ARN hasta el final de la gestación„t partir de este punto la can-tidad de ADN total se multiplica por un factor de 4,75, mientras que el ARNsólo experimenta un aumento de 8,76 mg. a término a 11,46 mg. (falta datoen tablas) a los ocho meses de edad (tabla V). En concentración, es decir, conrespecto a tejido fresco (tabla III), los valores de ADN-P obtenido en troncocerebral son del orden de los obtenidos en hemisferios, pero su evoluciónes similar a la del cerebelo, es decir, al aumento brusco de la concentraciónse experimenta a partir del final de la gestación pasando de un valor de9,69 mg. ADN-P por 100 gr. de tejido fresco a 26,07 mg. ADN-P por 100 gra-mos de tejido fresco (factor : 2,7) a los 8 meses de edad.

El ARN sigue unas características muy similares a lo comentado anterior-mente, por lo que respecta a su valor total por órgano, y en concentraciónlos valores son bastante constantes a lo largo de todo el período, lo que in-dica un mantenimiento del tamaño celular. El crecimiento no marca ningúnpunto importante en cuanto a la cantidad total de ARN en tronco cerebral,obteniéndose a los ocho meses 11,46 mg. de ARN frente a un valor de8,76 mg. a término, lo que implica que en valor relativo se encuentre unaligera disminución del ARN entre el fin al de la gestación y los ocho meses.Los valores inicialmente semejantes a los encontrados en cerebelo descien-den ligeramente a término, situándose a unos niveles semejantes a los encon-trados en cerebro.

El índice ARN/ADN (tabla X) se mantiene constante a lo largo de todala gestación, siendo del orden del doble o triple a los encontrados en cerebe-lo, lo que refleja un mayor tamaño celular y del orden de los encontradosen el cerebro en períodos avanzados de la gestación, debiendo recordar queen caso del cerebro los valores aumentaban a lo largo de la gestación. En elcaso de tronco cerebral, debido a la escasez de la muestra, hemos de hacerconstar que los resultados son algo más incompletos que en las otras mues-tras debido a las dificultades de una correcta disección sobre todo en losperíodos iniciales y a no poder realizar las determinaciones por triplicadocomo para los demás órganos estudiados. Con todo, podemos resumir indi-cando que el tronco cerebral se caracteriza por . una constancia de estructura-lidad a lo largo de la gestación con un tamaño celular similar al promediodel cerebro y que con el nacimiento (teniendo en cuenta que sólo se ha estu-diado un caso) disminuyen todos los índices, paralelamente a lo que ocurreen cerebelo. Esta disminución de los indices entre el final de la gestacióny los ocho meses de vida, refleja un aumento relativo más rápido en ADNque en los otros parámetros, indicando que éste es un período de gran acti-vidad mit6tica.

204 M. nons Y J. SABATE,'H

IVIä3uLA (tablas II, III, IV, IX y X)Debido a las dificultades de obtener en condiciones la totalidad de la

médula, no podemos ofrecer datos correspondientes al valor total por órgano,tal como hemos realizado en los apartados anteriores, y en el caso de la mé-dula nos referiremos únicamente a los valores relativos a un peso dado detejido fresco. Al igual que para tronco cerebral, en muchas ocasiones hemosdispuesto de muy poca muestra, por lo que la desviación standard obtenidaen términos generales ha sido superior a las obtenidas para cerebro y cere-belo, aspecto también a tener en cuenta a la hora de valorar e interpretarlos resultados.

Las proteínas (tabla II) se mantienen en una- tónica de constancia a lolargo de la gestación. Sus valores, superiores a los del cerebro, desde los pe- -ríodos iniciales de la gestación se mantienen ligeramente superiores a termi-no ,siendo valores muy similares a los encontrados en el tronco cerebral ysemejantes a los del cerebelo en los últimos períodos de gestación.

El ARN ofrece también una evolución muy lineal (tabla IV), es decir,una uniformidad de valores a lo largo de todo el período estudiado, con va-lores muy parecidos a los del tronco cerebral y ligeramente inferiores a losencontrados en cerebelo.

El ADN en concentración mantiene una misma tónica hasta el final dela gestación, en que inicia un ligero descenso, lo que refleja una constanciade la densidad celular en este período de la gestación con un valor de 20 %superior al encontrado en lóbulos a término, pero valores del orden de un60 % inferiores en las etapas iniciales correspondientes a las semanas 20-22 degestación.

Sin duda el hecho más diferencial que existe en la médula no afectaprecisamente a los ácidos nucleicos motivo del presente estudio, sino al valorde los lípidos que indican que la mielinización es mucho más precoz en lamédula, confirmándose desde un punto de vista bioquímico el hecho ya cono-cido por histopatología que la mielinizacián tiene lugar con una secuenciaascendente en el sistema nervioso.

Los índices de tamaño celular (tablas IX y X): ARN/ADN y proteí-nas/ADN sitúan el tamaño celular de la médula en unos valores inferioresa los de los lóbulos a término, pero que a diferencia de éstos, cuyo tamañoaumenta, en las médulas existe ya una constancia de tamaño desde la se-mana 20 hasta término. Los valores guardan un ligero paralelismo a los en-contrados en núcleos, son parecidos aunque ligeramente inferiores a los deltronco cerebral y muy superiores, del orden de tres veces más que los decerebelo.

La semejanza de los valores de la médula con los de los lóbulos a térmi-no, por lo que respecta a estos índices de tamaño celular, pero con este pla-teau desde la semana 20 por lo que respecta a la médula, en contraste conlos valores muy ascendentes encontrados en cerebro, junto con el más precozdepósito de lípidos en médula con respecto a las otras zonas, es un claro ex-ponente de la asineronía de maduración del si,stema nervioso y ya no tan sóloen zonas distintas con una perfecta individualidad anatómica como puedenser los hemisferios, bulbo y cerebelo, sino ya dentro de una estructura que


presenta una continuidad funcional como es la médula-núcleos-hemisferios.Vemos, por lo tanto, que la maduración del sistema nervioso central es deltipo ascendente, y ello queda reflejado en estos valores encontrados en mé-dula en relación a los del resto de zonas estudiadas. Es una lástima no dis-poner de datos correspondientes a fetos de. menos de 20 semanas y concreta-mente del intervalo de 10-20 semanas, pero nosotros no hemos dispuesto deeste material y en la literatura no hemos encontrado valores correspondientesa médula. Probablemente se observaría un proceso cuantitativamente pare-cido al de los hemisferios, pero con un constante desfase en el tiempo.

NÚCLEOS (tablas II, III, IV, IX y X)Los núcleos presentan unas características que podríamos llamar de tran-

sición entre los valores encontrados en médula y los encontrados en hemis-ferios. Los valores en concentración de ARN son parecidos al esquema evo-lutivo de los lóbulos (tabla IV) y los de proteínas (tabla II) siguen un perfilparecido a la médula, siendo el dato más significativo de la zona el valor delos lípidos por gramo de tejido, que a lo largo de todo el período estudiadose sitúa con un valor intermedio entre la médula y - los lóbulos cerebrales.

La concentración de ADN (tabla III) en la zona es similar .a la encon-trada en médula en las semanas iniciales de nuestro estudio para situarse alnivel de los encontrados en lóbulos al término de la gestación.

DISCUSIÓN DE CONJUNTO

La discusión de los aspectos individuales de crecimiento para cada ór-gano estudiado, se ha realizado conjuntamente al presentar los resultados. Alcomparar la evolución del peso en los distintos órganos vemos que desde las20 semanas de gestación hasta el término del embarazo el cerebelo es el órga-no que experimenta un mayor incremento (factor de multiplicación 7,6), se-guido del cerebro (factor de multiplicación 4) y a continuación el troncocerebral con un factor de multiplicación de . 1,7. A pesar del mayor incre-mento experimentado por el cerebelo, dentro de este periodo, nos encontra-mos con que al final de la gestación el cerebelo sólo ha alcanzado aproxima-damente un 13 % del peso del cerebelo adulto, mientras que el cerebro poseeya alrededor de un 30 % del peso del cerebro adulto (valores adultos extraí-dos del trabajo de J. DOBBING y J. SANDS, 1973). Estos datos indican que den-tro del período estudiado el cerebelo experimenta un mayor aumentó, peroque sigue una línea evolutiva retrasada respecto al desarrollo del cerebro.

En cuanto a los Valores de ADN por órgano, observarnos el mismo fenó-meno, es decir :

20 semanas 40 semanasCEREBRO 162 mg. ADN 242 mg. ADN

CEREBELO 10,96 mg. ADN . 65,3 mg. ADN

(factor multipli-cación 1,5)(factor multipli-cación 6)


Sin embargo, la cantidad de ADN cerebral al final de la gestación esaproximadamente un 38 % del valor adulto, mientras que el cerebelo sóloha llegado a un 15 %. Los valores de peso y ADN son suficientes para afirmarque el desarrollo del cerebelo humano se realiza en una etapa retrasada res-pecto al desarrollo del cerebro en este período. Otro dato significativo es queen el período estudiado el aumento de ARN es proporcionalmente igual encerebro que en cerebelo, mientras que las proteínas experimentan un aumentoproporcionalmente mucho mayor en cerebelo que en cerebro. Al considerar losíndices peso/ADN, proteínas/ADN y ARN/ADN, mientra's en el cerebrohalla una marcada tendencia a aumentar, factor que implica que el cerebrose encuentra en una fase de marcado crecimiento celular (fase hipertrófica),en cerebelo los índices se mantienen prácticamente constantes, paralelo a unacentuado aumento del valor del ADN, señalando que este órgano se hallaen una fase de gran actividad mitótica (fase hiperplásica).

El desarrollo ontogénico del sistema nervioso central es un proceso con-tinuo que va desde los primeros estadios de la diferenciación embrionariahasta los valores del adulto. Nuestro trabajo aporta datos de fetos o niñoscon edades comprendidas entre las 20 y las 40 semanas de gestación y algu-nos valores aislados como una de niño de dos meses y otro de 8 meses devida extrauterina. Con ello queremos resaltar el hecho de que nuestra apor-tación al estudio evolutivo de los ácidos nucleicos en la especie humana esvaliosa por lo que respecta a este intervalo del desarrollo, pero es parcial siconsideramos como imagen total la comprendida entre el embrión y el adulto.Sin embargo, queremos hacer hincapié que, como veremos seguidamente, elesquema evolutivo comprendido entre el último trimestre del embarazo (apartir de las 21 semanas) y los primeros meses de vida extrauterina tienenuna especial significación biológica por corresponder al período de mayorvulnerabilidad del sistema nervioso central frente a las noxas externas y,por lo tanto, sus valores y su perfil evolutivo tienen un especial interés convistas a la interpretación de muchos aspectos de la patología perinatal.

Por otro lado, ya no con un enfoque de , esquema evolutivo, sino desdeun punto de vista práctico, a la hora de intentar valorar por medio de datosanalíticos la acción de enfermedades genéticas, infecciosas, traumas, etc., so-bre el desarrollo del sistema nervioso, será precisamente en material denecropsias de niños prematuros a término, de donde vamos principalmentea obtener muestras con fines diagnósticos, por lo que el disponer de unastablas de valores normales para las edades de gestación de este período esfactor imprescindible y limitante para poder valorar y sacar conclusiones delos datos que en un futuro obtengamos de los casos patológicos. Por ellonuestro trabajo se planteó desde el principio, ya no solamente con vistas acolaborar en la aportación de datos —escasos datos existentes— al esquemaevolutivo de los ácidos nucleicos del sistema nervioso central en la especiehumana, sino también a establecer los valores normales propios que sirvierande base para futuros estudios bioquímicos en cerebros patológicos.

Aunque vamos lógicamente a centrarnos en nuestros propios datos, nopodemos considerarlos como un todo aislado del contexto en donde se en-cuentran y, por consiguiente, los hemos de comentar unidos en parte a los

ESTUDIO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

209

valores que para otros períodos de gestación han aportado otros autores, nopudiendo tampoco ignorar los datos más completos que se disponen de laevolución de los ácidos nucleicos durante la ontogénesis del sistema nerviosocentral en otras especies animales, aportados por otros autores, y en el casode ratas completado en todo su período evolutivo por nosotros mismos.

.comparamos nuestro trabajo con los pioneros estudios realizados porMANDEL y cols. (1964):

EDAD ARNmg/cerebro

ADNmg/cerebro

ARN/ADN

4 días 400 300 1,331 año 1.400 850 1,69Adulto 2.550 1.000 2,55

y teniendo en cuenta que nosotros estudiamos por separado cerebro y cere-belo, nuestros datos concuerdan plenamente con los de MANDEL.

M. WINICK (1968) realiza su trabajo en 31 cerebros completos de fetoshumanos, de edades comprendidas entre las 13 semanas de gestación y los13 meses de vida postnatal, determinando proteínas ARN y ADN. Nuestrosvalores son mucho más bajos que los encontrados por WINICK ; sin embargo,con los de dicho autor sí que hay correspondencia por lo que respecta al ARNy proteínas. Ello es debido a que este autor en su trabajo empleó homoge-neizados de cerebro total, incluyendo los cerebelos, y debido al alto conte-nido en ADN de este órgano se incrementa el valor global para el ADN.HOWARD y cols. (1969) realizan su estudio en 28 muestras de fetos humanos,de edad de gestación comprendida entre las 10 y 39 semanas de gestación,se observa con nuestros resultados una buena correlación, tanto para el ADNcomo para el ARN. A las 39 semanas obtienen 267 mg. de ADN cerebraly 22,2 mg. de ADN cerebelar, frente a unos valores de 247 y 24 mg. de _iDNrespectivamente obtenidos por nosotros. En cuanto a la relación ARN/ADNobtienen valores de 0,85 en cerebro y 0,48 en cerebelo, frente a nuestrosvalores de 0,78 en cerebro y 0,50 en cereblo. J. DOBBING y J. SANDS (1973), enpublicación posterior al inicio de nuestro trabajo, realizan un estudio en139 cerebros humanos completos y normales, comprendidos desde las 10 se-manas de gestación hasta los 7 años de edad. Sus resultados coinciden com-.pletamente con los nuestros, obteniendo un valor de 21 mg. ADN-P como.cantidad total de ADN de cerebro al final de la gestación, frente a un valorde 24 mg. de ADN-P obtenido por nosotros. En cuanto a cerebelo obtienen7,7 mg. ADN-P a las 40 semanas, frente a un valor de 6,5 mg. ADN-P obte-nido por nosotros. Respecto a la concentración relativa de ADN obtienen :5 ,5 mg. ADN-P/100 gr. de tejido fresco frente a un valor de 4,96 mg. ADN-P/100 gr. de tejido fresco, obtenido por nosotros en corteza cerebral (90 %.sustancia gris) de adulto.

Según establecieron DOBEING y SANDS (1970), en la especie humana laformación de neuronas precede a la formación de las células de glía. Elaumento del ADN correspondiente a multiplicación de células neuronales( neuroblastos) tiene lugar desde las 15 a las 25 semanas de vida embrionaria.

210 M. itons Y j. SABATER

y los alimentos de ADN que se encuentran a partir de esta fecha y que alcan-zarán, considerados en incrementos, un máximo alrededor de los tres mesesde vida extranterina corresponden a la multiplicación de las células de Oía.Los datos aportados en nuestro trabajo corresponden por lo tanto a valoresde ADN —multiplicación celular— y ARN —crecimiento celular— del pe-ríodo final de multiplicación neurona' y del crecimiento glial en el períodoprenatal. Pese a lo que podría parecer, dado que la célula «pensante» es laneurona, el periodo de mayor vulnerabilidad del sistema nervioso es precisa-mente el de mayor crecimiento glial, y concretamente el comprendido entrelas 20 semanas de gestación hasta los tres primeros meses de vida extrauteri-na, aunque se ha visto que el proceso, aunque más lentamente, prosiguehasta aproximadamente los dos años. Ello es debido a que la multiplicaciónde neuroblastos en la especie humana ocurre dentro de las primeras sema-nas de gestación, período del embarazo materno altamente protegido. Alre-dedor del tercer mes de vida extrauterina el cerebro tiene aproximadamentela mitad del peso del adulto, en tanto que el peso corporal en el mismoperíodo se sitúa alrededor de la veinteava parte del peso del adulto a títuloaproximativo y con grandes variaciones dentro de cifras de este nivel. Elloda idea de lo que supone para el metabolismo cerebral este período índicede crecimiento, conocido según nomenclatura de DOBBING como el «braingrowth spurt.

El período mitätico neuronal precede a este período de máximo creci-miento, en el que tiene lugar la máxima actividad mitótica de la glía, queprecede y prepara la mielinización. En este periodo también tiene lugar elcrecimiento de los axones y de las dendritas, el establecimiento de lasnapsis, así como los estadios iniciales de la mielinización. La actividad fun-cional del cerebro no depende, como clásicamente se creía, del número deneuronas —dentro de unos límites—, sino de la armónica confección de sumicroestructura, que se establece precisamente en este período de máximocrecimiento. De ahí que las causas de tipo ambiental o bien de tipo genéticoque afectan al cerebro durante este período de desarrollo y formación decomplicadas estructuras a nivel celular que conducirán al desarrollo de lacompleja estructura y ultraestructura cerebral, son las que más repercusiónpueden tener sobre el futuro mental del individuo, si aceptamos que enparte o como mínimo la función mental depende de una perfecta y armó-)nica anatomía del sistema nervioso. Por lo que también en lenguaje de Dom-BINO (1968) este período de máximo «growth spurt» corresponde al llamadoperíodo de vulnerabilidad o quizás nosotros diríamos como de «máxima vul-nerabilidad», dado que hemos de aceptar que por su compleja Ontogenia elsistema nervioso es vulnerable a lo largo de todo su desarrollo. Hemos deconsiderar en términos conceptuales que en realidad en este período demáxima vulnerabilidad lo que más se va a afectar no es el número de célu-las de da, como postularon Wimcx y NOBLE (1966), sino todo el desarrollode la compleja arquitectura neuronal después de terminada la mitosis de losneuroblastos. La neurona, a diferencia de las células de otros tejidos, noalcanza su maduración funcional al término del período rnitätico, sino queal. término de la mitosis ha quedado establecido únicamente su número, pero •


sin que pueda desarrollar su función fisiológica; la función que tiene asig-nada la podría realizar cuando haya finalizado todo su desarrollo postmitóti-to, lo que supondrá el completar su crecimiento axonal y dendrítico, el es-tablecimiento de sinapsis N, el aislamiento de los axones por la específicamembrana de mielina. Todo este proceso de maduración estructural y fun-cional postmitótico neuronal es lo que corresponde al período de máximavulnerabilidad del sistema nervioso y en su etapa más importante, la peri-natal, es en la que nosotros hemos centrado nuestro trabajo. Después delnacimiento pueden formarse mitosis neuronales en el grupo de las micro-neuronas de replicación tardía («late developers») del que principalmentees rico el cerebelo, lo que, como hemos visto, es la causa de un perfil dedesarrollo cerebelar muy distinto al cerebral. Podemos resumir indicando queen la especie humana la formación de neuronas es prenatal, pero la proli-feración de la glía y la maduración de las neuronas es perinatal.

CONCLUSIONES

CEREBRO

Al estudiar por separado los diferentes lóbulos cerebrales : frontal, tem-poral, occipital y .parietal, hemos visto que todos siguen un mismo esquemaevolutivo, dentro del período estudiado, con escasas diferencias interlobu-lares, sin haber ningf.n lóbulo que presente con constancia y a lo largo detodo el intervalo unas características diferenciales con los demás. Cabríaseñalar que en el lóbulo occipital se observa una mayor concentración rela-tiva de ADN' en las primeras semanas de gestación estudiadas (20-30 sema-nas) para igualarse a continuación con los demás lóbulos, Al buscar confir-mación de este dato con los resultados morfológicos, hemos encontrado queJEANNE-CLAUDIE LARROCIIE (1967) habla de que hasta las 24 semanas de ges-tación el lóbulo occipital está poco desarrollado, siendo alrededor de las24 semanas cuando empieza a desarrollarse considerablemente tomando unaforma alargada. Este retraso se confirma al estudiar los índices : peso/ADN,proeínas/ADN y ARN/ADN, mostrando el lóbulo Ocipital valores inferioreshasta las 30 semanas en relación con los otros lóbulos.

Considerando la evolución global del cerebro, de los resultados obteni-dos en la dosificación cuantitativa del ADN en el período comprendido entrelas 20 y 40 semanas de gestación y de la representación de los otros dato,,.bioquímicos: peso, proteínas y ARN en función del ADN, puede deducirseque el cerebro se halla en una fase esencialmente de gran actividad hiper-tró9ça sinukáneamente a que existe multiplicación Esli

.No se ha alcanzado todavía un «plateau» en cuanto a la cantidad totalde ADN, por lo que sería interesante continuar el estudio postnatal deevolución de ADN, siendo opinión de Wmcx que la cantidad adulta deADN se alcanza a los cinco meses de vida postnatal, mientras DOBBING afir-ma que la multiplicación celular del sistema nervioso central no finaliza hastalo‘; dos años de vida.

Clásicainente se ha considerado el período de máximo crecimiento cere-bral como un período accidental de rápido crecimiento que puede observarse

212 M. nous Y J. SABATER

en todas las especies. En términos anatómicos puede definirse stt inicio comoel momento en que se ha alcanzado el número adulto de neuronas, quizáscon la excepción de ciertas neuronas cerebelares. Nuestros datos indicanque en la especie humana, hasta aproximadamente las 26 semanas de gesta-ción, no termina la división neurona!, empezando a partir de este momentouna acentuada fase hiperträfica acompañada de multiplicación glial.

CEREBELO

Podemos afirmar que el cerebelo sigue una línea evolutiva retrasada res-pecto al cerebro. El estudio detallado de tos índices : peso/ADN, proteí-nas/ADN y ARN/ADN muestran que el cerebelo inicia una fase agudamen-te hiperplásica a finales de la gestación y primeros meses de vida postnatal,quedando reflejado este concepto en la marcada disminución de los índicescitados en este período. Estos hechos implican que las últimas semanas degestación y primeros meses de vida son de especial vulnerabilidad frente acausas externas para el cerebelo.

TRONCO CEREBRAL

El aumento relativo de peso de tronco cerebral en el período estudiadoes menor al aumento experimentado en cerebro y en cerebelo.

Al estudiar su contenido en ADN, en concentración, siendo sus valoresdel orden de los obtenidos en hemisferios, su evolución parece ser similara la observada en cerebelo, es decir, el aumento brusco de concentración seexperimenta a partir del final de la gestación, indicando que en este Momentoinicia un período de gran actividad mitätica.

Wout,AEs un claro exponente de la asincronía de maduración del sistema ner-

vioso y ya no tan sólo en zonas distintas, con una perfecta individualidadanatómica como pueden ser hemisferios, tronco cerebral y cerebelo, sino yadentro de una estructura que presenta una continuidad funcional como esmédula-núcleos-hemisferios. Vemos, por lo tanto, que la maduración del sis-tema nervioso central es del tipo ascendente y ello queda reflejado en losvalores encontrados en médula en relación a los del resto de zonas estudia-das. Es una lástima no disponer de datos correspondientes a fetos de menosde 20 semanas y concretamente del intervalo de 10-20 semanas, pero noso-tros no hemos dispuesto de este material y en la literatura no hemos encon-trado valores correspondientes a médula. Probablemente se observaría unproceso cuantitativamente parecido al de los hemisferios, pero con constantedesfase en el tiempo.

NÚCLEOS

Los núcleos presentan unas características que podríamos llamar de tran-sición entre los valores encontrados en médula y los encontrados en hemis-ferios.

ESTUDIO DE LOS kIDOS NUCLEICOS 213

Peso

ADN

ASS 400

400 303

O.,e300

7 :

e 1'

_....,,.,

9200 .7

100

24 28 2 8seaxmo•G ngt imignto TQW5

Fig. 1. — Valores de Peso, ADN y ARN en cerebro, durante el desarrollo.

Peso

ADN

ARO60

400

50

7

il300 /

//

//

/E r 30 o'200- / :11

/

& //

//

/100- /

/

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0.--

I '' I ..-- i 4 I20 24

Ser.COCIS28 32 36 2

nacimiento 8

,-..eses

Fig. 2. — Variaciones de Peso, ADN y ARN en cerebelo, durante el des.rrollo.

ADN - P

ARN - P

11

1

20

1.5

....... ea

-13

- 5

32 3511

2:

8m2SQSno c i mi ento

24 28

semanas

entonas

naci miento MQSQS

8


Fig. 3. — Variaciones en la concentración de: ADN y ARN, en hemisfedos, duranteel desarrollo.

Fig. 4. — Variaciones en la concentración de: ADN y ARN en cerebelo, durante eldesarrollo.


Peso/ADN ARN/ADN

8 - • - . - - - Proteinas /ADN

1,5

-

6-

oo

o

/

//

1 zoo

4-

2..ser-

0,5

2-

24 26 32 362 8

samancts nacimiento meses

Fig. 5. — Estudio de las relaciones: Proteínas/ADN, ARN/ADN y Peso/ADN, en he-misferios, durante el desarrollo.

8 2

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peso/ADN

ARN/ADN

-. Prote inas/AON

\ .

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‘ \ \\ \\ \ \

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20 24 28semanas

32 36 2nacimiento

8meses 1

Fig. 6.— Estudio de las relaciones: Proteinas/ADN, ARN/ADN y Peso/ADN en cerebe-lo, durante el desarrollo.

218 M. RODÉS Y J. SABATER

TABLA IPESOS (GR.). LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.

EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

20-22(1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(2) 28-30(1) 30-32(1) 32-34(1) 34-36(2) 36-38(1) 40-42(2)

CEREBRO 80,52 93,87 100,12 141,40 187,11 214,36 199,00 277,08 284,25 33350

TRONCOCEREBRAL

2, 04 2,06 1,61 2,02 4,37 3,45 4,54 4,90 6,80 7,20

CEREBELO 2,54 2,10 3,06 4,86 8,20 8,92 8,10 12,35 19,08 10,23

TABLA IIPROTEÍNAS (Mo/GR. TF). LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.

EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS.(TE) TEJIDO FRESCO

18-20(1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(4) 28-30(2) 32-34(2) 34-36(3) 36-38(1) 40-42(4)

HEMISFERIOS 48,42 57,91 46,56 43,31 48,39 47,90 52,17 47,96 62,09

NUCLEOS 71,96 53.55 44,8o 51,59 04,58 58,02 54,90 59,29CEREBELO 60,58 47,72 43,39 45,48 56,36 60,10 53,72 71,42TRONDO CEREBRAL 75,04 60,60 54,26 54,55 75,83 65,30 54,68 67,08MEDULA 76,68 66,00 60,44 65,29 68,35 70,78 59,98 73,63

TABLA IIIADN-P (mo/100 GR. TF).

EL VALOR DE HEMISFERIOS ES LA MEDIA DE LOS VALORES OBTENIDOS• EN LOS CUATRO LÓBULOS.

EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS,MULTIPLICANDO LOS VALORES DE ADN-P POR DIEZ,

SE OBTIENEN LOS VALORES DE ADN.

(TF) TEJIDO FRESCO

18-20(1) 20-22(1) 22-24(4) 24-25(1) 25-28(4) 28-30(2) 50-32(1) 34-35(2) 40-42(4)

LOB. FRONTAL 31,20 20,10 18,29 14,22 12,69 12,60 9,21 8,11 8,08

LOB. TEMPORAL 24,75 21,57 21,15 16,72 14,71 12,44 11,07 8,13 7.76

LOB.00CIPITAL 28,39 24,42 26,83 21,61 18,07 14,21 10,42 8,31 8,73

LOB. PARIETAL 18,04 18,61 15,20 12,47 10,60 13,59 6,83 7,80

HEMISFERIOS 28,11 21,03 21,22 16,94 14,48 12,46 11,07 7,84 8,05

NUCLEOS 16,62 14,62 10,60 10,38 8,15 7,15 6,94 6,94

CEREBELO 37,66 26,60 25,03 27,57 23,04 29,95 36,50

TRONCO CEREBRAL 9,06 8,79 10,2 8,53 10,58 10,95 9,60

MEDULA 14,03 11,72 12,09 14,02 12,58 11,55 10,89


219

TABLA IVARN-P (MG/100 GR. TF).

EL VALOR DE HEMISFERIOS ES LA MEDIA DE LOS yALoREs OBTENIDOSEN LOS CUATRO LÓBULOS,

EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS.MULTIPLICANDO LOS VALORES DE ARN-P POR DIEZ,

SE OBTIENEN LOS VALORES DE ARN.(TF) TEJIDO FRESCO

18-20(1) 20-22( 1) 22- 3 4(4) 24-26(2) 26-28(4) 28-30(2) 30-32(1) 34-36(2) 36-38(1) 40-42(4)

LOB. FRONTAL 15,45 9,50 - :10,58 11,21 10,23 9;79 10,75 9,68 13,96 12;87

L06.TE14PORAL 13,93 10,99 12,59 12,73 10,63 10,10 11,03 10,76 12,83 12,70

LOB .00CIPITAL 14,68 11,34 13,36 14,23 12,49 10,54 9,63 11,76 12,81 13,13

LOO. PARIETAL 13,56 8,60 11,06 10,89 10,48 8,93 12,34 10,90 11,42 11,85

SFER1OS 14,40 10,10 11,90 12,26 10,95 . 9,84 11,03 10,77 12,78 12,63

NUCLEOS 12,13 11,83 10,43 9,71 9,24 11,45 13,42 10,13CEREBELO 17,93 14,94 14,50 12,92 12,78 17,83 16,93TRONCOCEREBRAL 14,01 10,35 12,48 13,17 14,30 15,87 11,81

MEDULA 17,27 12,43 13,21 13,51 12,48 18,76 13,19

TABLA VADN TOTAL (MG.).

LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

20-22(1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(3) 28-30(2) 30-32(1) 34-36(2) 40-42(2)

CEREBRO 162,00 180,36 217,64 203,41 227,66 238,22 226,33 242,95

TRONCO CEREBRAL 1,97(1) -- 2,21 4,71(1) 4,20 5,46 7,18

CEREBELO 10,96(1) 11,30 12,12 22,53 27,65 33,89 65,35

TABLA VIARN TOTAL (MG.).

LAS CIFRAS . SON VALORES PROMEDIOS.EL NUMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

20-22(1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(3) 28-30(2) 30-32(1) 34-36(2) 36-38(1) 40-42(2)

CEREBRO

TRONCO CEREBRAL

CEREBELO

78,61

-.

118,20

2,82(1)

5,80(1)

140,39

-.

5,25

151,82

2,58

6,62

185,82

5,75

10,75

233,56

4,93

15,33

288,09

7,88(1)

' 19,03

396,21

10,79

33,96

416,45

8,76,e

27,74

220 M. RODÉS Y J. SABATEB

TABLA VIIPROTEÍNAS TOTALES (GR.). LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.

EL NúMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

22-24(2) 24-26(1) 26-28(3) 28-30(2) 32-34(1) 34-36(2) 36-38(1) 40-42(2)

CEREBRO 4,890 6,826 6,353 9,176 9,048 13.312 17,672 21,472

TRONCO CEREBRAL 0,111 0,153 0,109 0,234 0,282 0,319 0,372 0,497

CEREBELO 0,127 0,146 0,202 0,371 0,418 0,683 1,024 1,373

TABLA VIIIRELACIÓNIT PESO FRACCIÓN/ADN (GR/MG.). LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.

EL VALOR DE HEMISFERIOS ES LA MEDIA DE LOS VALORES OBTENIDOSEN LOS CUATRO LÓBULOS.

EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉN . ESIS

20-22 (1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(3) 28-30(2) 30-32(1) 34-36(2) 40-42(2)

HEMISFERIOS 0,475 0,461 0,404 0,711 0,803 0.927 1,289 1.402

NUCLEOS 0,602 0,787 0,683 1,108 1,148 1,400 1,440 1,569CEREBELO -- 0,267 0,270 0,398 0,363 0,322 0,364 0,294TRONCO CEREBRAL -- .._ 0,914 0,927 0,821 0,013 1,033MEDULA -- 0,713 0,834 0,714 0,791 0,878 0,921

TABLA IXRELACIÓN PROTEÍNAS/ADN (1/100). LAS CIFRAS SON VALORES PROMEDIOS.


EL NúMERO DE CASOS ES EL 'INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

18-20(1) 22-24(3) 24-26(1) 26-28(2) 28-30(2) 34-36(2) 40-42(4)

HEMISFERIOS 1,73 2,91 2,81 3,04 3,92 6,35 7,74

NUCLEOS 4,61 5,50 4,31 6,29 7,95 8,63CEREBELO 1,15 1,29 1,73 1,65 1,78 2,02TRONCO CEREBRAL 6,89 5,..71 6,39 5,83 9,70MEDULA 5,63 4,99 4,65 6,05 6,75


221

TABLA XRELACIÓN ARN/ADN. LAS CIFRAS SON VALORS PROMEDIOS.


EL NÚMERO DE CASOS ES EL INDICADO ENTRE PARÉNTESIS

18-20(1) 20-22(1) 22-24(4) 24-26(1) 26-28(4) 28-30(2) 30-32(1) 34-36(2) 40-42(4)

HEMISFERIOS 0,524 0,480 0,566 0,730 0,764 0,792 1,006 1,381 1,553

NUCLEOS 0,020 0,829 1,116 1,004 1,191 1,238 1.649 1.499

CEREBELO 0,476 0,561 0,579 0,468 0,054 0,517 0,463

TRONCO CEREBRAL-- 1,546 1,177 1,153 1,543 1,351 1,443 1,221

MEDULA 1.230 1,o60 1,092 0,963 0,991 1,211

TABLA XI

EDAD ADN - P ARN - P PROTEINAS ARN / ADN PROTEINAS / ADN

( .9/ 1009r TF ) (m9/1009r TF) (mg/mg) (mg / mg) ( 1 / 100)

2 meses HEMISFERIOS 7,07 10,91 60,20 1,548 8,637

NUCLE06 7,02 10,75 67,93 1,531 9,701

8 meses CEREBELO 55,09 10,81 66,10 0,196 1,181

TM:1NC0 CEREBRAL 26,07 8,83 60,74 0,338 2,329

Adulto CORTEZA CEREBRAL 4,96

o (90% sustancia gris)

11,90 83,72 2,420 16,88

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