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Copyright 2019 Cristhian Camilo Chaparro Hernández

ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS

POR EL HONGO PLEUROTUS OSTREATUS EN UN BIORREACTOR

USANDO RESIDUOS DE FRUTA COMO SUSTRATO

Proyecto de grado

Por

CRISTHIAN CAMILO CHAPARRO HERNÁNDEZ

Presentado a la facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO


Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química

Bogotá D.C

Junio 2019

ii


ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNOCELULOLÍTICAS

POR EL HONGO PLEUROTUS OSTREATUS EN UN BIORREACTOR

USANDO RESIDUOS DE FRUTA COMO SUSTRATO

Proyecto de grado

Por

CRISTHIAN CAMILO CHAPARRO HERNÁNDEZ

Presentado a la facultad de Ingeniería de la


En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO

Aprobado por:

Asesora, Rocío Sierra Ramirez, PhD.

Co-asesor, Daniel David Duran Aranguren.

Jurado, Felipe Salcedo Galán, PhD.

Director del departamento: Andrés Gonzáles Barrios, PhD.

Departamento de Ingeniería Química

Junio 2019

iii


RESUMEN

Estudio de la producción de enzimas lignocelulolíticas por el hongo Pleurotus ostreatus

en un biorreactor usando residuos de fruta como sustrato.

Cristhian Camilo Chaparro Hernández.

Universidad de los Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD.

Co- Asesor: Daniel David Duran Aranguren.

La producción de enzimas y demás productos de valor agregado a partir de residuos

agroindustriales ha sido un enfoque central en la industria biotecnológica como una

alternativa para reducir el impacto ambiental y abrir horizontes a mercados más

sostenibles. Los residuos agroindustriales se componen en su mayoría de material

lignocelulósico cuyos componentes (lignina, pectina, celulosa y hemicelulosa) son de

gran importancia para la utilización en diversas aplicaciones. En el presente estudio se

realizó la cuantificación de azúcares reductores y la evaluación de las actividades

enzimáticas de las enzimas lignocelulolíticas: lacasa, exopoligalacturonasa y

exoglucanasa, en cultivo sumergido del hongo ligninolítico Pleurotus ostreatus como

tratamiento biológico para la hidrólisis de celulosa y deslignificación de residuos de

cascara de mango y piña. Se incubaron los cultivos en frascos de vidrio a velocidades de

agitación de 75 y 150 rpm con diferentes proporciones de fruta y se sometieron los

resultados a un diseño factorial completo para posteriormente realizar el escalado a un

biorreactor Batch. Según los resultados del diseño factorial completo, la velocidad de

agitación tiene un efecto significativo en la concentración de azúcares reductores y

actividad de las enzimas estudiadas, mientras que el respectivo análisis de varianza arrojó

que la proporción de fruta Mango/Piña no tiene un efecto significativo en el valor final

de las variables de respuesta. Finalmente, a partir del análisis estadístico se realizó el

cultivo sumergido en el reactor Batch con una velocidad de agitación constante de 150

rpm y una proporción de sustrato Mango/Piña de 75%. La deslignificación de los residuos

de fruta en los cultivos incubados en frasco de vidrio se le atribuye principalmente a la

acción de la lacasa la cual alcanza una actividad enzimática de 1474,49 U/L, seguida por

la acción de la exopoligalacturonasa con una actividad enzimática máxima de 1359,52

U/L y finalmente la acción de la exoglucanasa que reportó una máxima actividad

iv


enzimática de 508,51 U/L. La actividad enzimática de la exopoligalacturonasa en el

cultivo sumergido del reactor Batch reflejó un incremento del 305,67% con respecto a los

incubados en frasco de vidrio; la actividad de la exoglucanasa obtuvo un incremento de

398,50%, mientras que la actividad de la lacasa obtuvo una disminución de 3404,23%.

Palabras clave: enzimas, residuos agroindustriales, lignocelulosa, biorreactor, actividad

enzimática.

v


NOMENCLATURA

DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico

ABTS Ácido 2-.2-azinobis-(3-etilbenzoatiazolin-6-sulfónico)

pH Potencial de Hidrógeno

rpm Revoluciones por minuto

U/L Unidades de actividad enzimática por litro

vi


TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN iii

NOMENCLATURA v

TABLA DE CONTENIDO vi

LISTA DE FIGURAS vii

LISTA DE TABLAS viii

OBJETIVOS ix

CAPÍTULOS

I INTRODUCCIÓN 1

II MATERIALES Y MÉTODOS 8

III RESULTADOS Y DISCUSIÓN 11

3.1. Montajes 11

3.1.1. Cuantificación de azúcares reductores 11

3.1.2. Medición de actividad enzimática 13

3.1.2.1. Lacasas 13

3.1.2.2. Exopoligalacturonasa 15

3.1.2.3. Exoglucanasa 17

3.1.3. Efecto de la velocidad de agitación en la concentración de

azúcares reductores y actividades enzimáticas 19

3.1.4. Efecto de los componentes presentes en la biomasa lig-

nocelulolítica de los residuos de fruta en la concentra-

ción de azúcares reductores y actividades enzimáticas 20

3.2. Biorreactor 20

3.2.1. Cuantificación de azúcares reductores 21

3.2.2. Medición de actividad enzimática 22

3.2.2.1. Lacasas 22

3.2.2.2. Exopoligalacturonasa 23

3.2.2.3. Exoglucanasa 24

3.2.3. Factores involucrados y fuentes de error en el proceso de

escalado 25

IV CONCLUSIONES 27

V TRABAJO FUTURO 28

REFERENCIAS 29

ANEXOS 33

vii


LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema de acción de la enzima lacasa 3

Figura 2. Esquematización de ambos tipos de fermentaciones 5

Figura 3. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 75 rpm 12

Figura 4. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 150 rpm 12

Figura 5. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 75 rpm 14

Figura 6. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 150 rpm 14

Figura 7. Actividad de la exopoligalacturonasa de los montajes a 75 rpm 16

Figura 8. Actividad de la exopoligalacturonasa de los montajes a 150 rpm 16

Figura 9. Actividad enzimática de exoglucanasa de los montajes a 75 rpm 18

Figura 10. Actividad enzimática de exoglucanasa de los montajes a 150 rpm 18

Figura 11. Cuantificación de los azúcares reductores del cultivo del biorreactor 22

Figura 12. Actividad enzimática de lacasas del cultivo del biorreactor 23

Figura 13. Actividad de la exopoligalacturonasa del cultivo del biorreactor 24

Figura 14. Actividad enzimática de exoglucanasa del cultivo del biorreactor 25

viii


LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Factores con sus respectivos niveles para el diseño experimental 10

ix


OBJETIVOS

• Evaluar la producción enzimática de Pleurotus ostreatus en cultivo sumergido y

agitado utilizando residuos de mango y piña como sustrato a diferentes

velocidades de agitación.

• Determinar el potencial de producción enzimática de Pleurotus ostreatus con

fermentación sumergida utilizando un biorreactor Batch.

1


CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

En el mercado mundial, la industria agrícola se encuentra en constante crecimiento. Se

estima que para el año 2030 habrá un total de 1645 millones de hectáreas destinadas para

la agricultura, presentando un crecimiento del 3.22% comparado con el año 2007

(Alexandratos & Bruinsma, 2012). Aunque estas hectáreas totales destinadas para dicha

actividad promueven empleo y alimento para toda la población trayendo grandes

beneficios para la economía principalmente de los países dependientes de la agricultura,

no toda la producción agrícola mundial es aprovechada de manera eficiente, de hecho, se

estima que un tercio del alimento producido globalmente para consumo humano es

desperdiciado, lo que equivale a aproximadamente 1.3 billones de toneladas por año

(Ravindran, Hassan, Williams, & Jaiswal, 2018). Aún, si todo el alimento producido

mundialmente fuera aprovechado para consumo humano, es inevitable la obtención de

residuos derivados entre los cuales se encuentran principalmente la cáscara de arroz, la

paja de trigo, la paja de avena, cáscara externa de la piña, entre otros (Nagendran, 2011).

Estos y otros residuos provenientes de la agricultura contienen una gran reserva de

biomasa lignocelulósica que no es aprovechada. Debido a su composición, estos residuos

tienen un gran potencial como materia prima para la producción de biocombustibles y

productos químicos reduciendo los impactos ambientales que provienen actualmente de

estas industrias (Liao, Liu, & Hodge, 2014). En vista de la gran cantidad de residuos

derivados de la agricultura generados alrededor del mundo y a sus características

bioquímicas particulares, han surgido bastantes estudios para transformar estos residuos

en productos de valor agregado. Estos estudios han estado enfocados principalmente en

el bioprocesamiento microbiano cuyos posibles productos derivados se encuentran

enzimas, ácidos orgánicos, colorantes para alimentos, bioetanol, biometano, entre otros

(Panda, Mishra, Kayitesi, & Ray, 2016).

La mayoría de los residuos agroindustriales son ricos en material lignocelulósico, fuente

importante para el desarrollo de productos como los biocombustibles que buscan ser un

reemplazo para los combustibles fósiles (Kantharaj, Boobalan, Sooriamuthu, & Mani,

2017). Con el fin de aprovechar de gran manera la biomasa lignocelulósica, es necesario

recurrir a distintos procesos para lograr la separación de los componentes de estos

residuos. Diversos pretratamientos físicos y químicos se han desarrollado para este fin,

sin embargo, estos conllevan varias desventajas como la generación de biopolímeros de

2


baja calidad. Con el fin de superar estos inconvenientes, se ha desarrollado el

pretratamiento biológico a partir de microorganismos el cual ha tenido resultados

eficientes y además cuenta con procesos amigables para el medio ambiente y de bajo

consumo energético (Kumar & Sharma, 2017).

Varios microorganismos incluyendo hongos y bacterias son capaces de degradar celulosa

y otro tipo de fibras naturales que se encuentran en la pared celular de las plantas. Por

este motivo, los hongos contribuyen de manera significativa a la degradación de material

lignocelulósico en la naturaleza produciendo diversos tipos de enzimas lignocelulolíticas

(Dashtban, Schraft, & Qin, 2009). El material lignocelulósico está compuesto

principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina (Malherbe & Cloete, 2002). La

celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal y su contenido se

encuentra en un rango estimado de 35 a 50% del peso seco de la planta (Lynd, Weimer,

van Zyl, & Pretorius, 2002). La celulosa es un polímero compuesto de subunidades de

glucosa unido a partir de enlaces 𝛼-1,4 glucosídicos y usualmente se ordena en estructuras

microcristalinas haciendo que su hidrolisis en condiciones naturales sea muy complicada

(Malherbe & Cloete, 2002). Para la degradación de la celulosa son necesarias 3 tipos de

enzimas: las endoglucanasas que hidrolizan las regiones amorfas de las fibras celulósicas

rompiendo los enlaces glucosídicos; las exoglucanasas que remueven monómeros y

dímeros del final de la cadena de glucosa; y la β-glucosidasa que hidroliza dímeros de

glucosa impidiendo la acumulación de celobiosa, la cual inhibe la acción de las

celobiohidrolasas (Malherbe & Cloete, 2002) (Béguin & Aubert, 1994). Al igual que la

celulosa, la hemicelulosa se compone de subunidades de glucosa unidas a partir de

enlaces 𝛼-1,4 glucosídicos, sin embargo, a diferencia de la celulosa, la hemicelulosa tiene

una configuración ecuatorial y además se compone de más péptidos, por lo que para su

degradación son necesarias más enzimas (Scheller & Ulvskov, 2010). Por otro lado, la

lignina es un polímero aromático que se obtiene de la fenilalanina y contiene diferentes

grupos funcionales hidroxilos, metoxilos, carboxilos y carbonilos lo que confiere su

compleja estructura. Para la degradación de lignina las enzimas más estudiadas son la

lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y la lacasa (Aarti, Valan, &

Agastian, 2015). Además, para la degradación efectiva del material lignocelulósico

también es necesario la acción de las enzimas denominadas pectinasas, encargadas de

degradar pectinas a partir de reacciones de depolimerización y esterificación (Kantharaj

et al., 2017). Las pectinas son una clase de polisacáridos complejos que se encuentran en

3


las paredes celulares de las plantas y cuya función es la de servir como agente hidratante

y de construcción para el material celulósico (Thakur, Singh, Handa, & Rao, 1997). A

continuación, se mencionarán a profundidad las enzimas lignocelulolíticas evaluadas en

el presente estudio.

Lacasas EC 1.10.2.3 Las lacasas son un tipo de oxidasas que poseen un centro activo

compuesto por cobre y se encuentran en gran variedad de bacterias, hongos, insectos y

plantas. Los cuatro átomos de cobre que se encuentran generalmente en una molécula de

lacasa se dividen en Tipo 1 (T1), Tipo 2 (T2) y un Tipo 3 binuclear (T3) (Yang et al.,

2017). El centro activo compuesto por cobre es oxidado por oxígeno o un compuesto

aromático generando un intermediario deficiente de un par de electrones. Este

intermediario será nuevamente oxidado por oxígeno o sustratos fenólicos y se completará

el ciclo gracias a cuatro oxidaciones posteriores (Páez, 2012). El ciclo completo se

observa en la Figura 1.

Figura 1. Esquema de acción de la enzima lacasa (Paéz, 2012).

La catálisis de la lacasa puede también darse con la acción de sustratos no fenólicos

gracias a la acción de mediadores. Los mediadores son un grupo de compuestos orgánicos

que tienen la habilidad de ser oxidados por la lacasa formando radicales libres capaces de

oxidar compuestos no fenólicos que la lacasa por sí sola no puede oxidar. El mediador

4


sintético más común es el ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS)

(Brijwani, Rigdon, & Vadlani, 2010)

Exopoligalacturonasa (Pectinasa) EC. 3.2.1.67 Las poligalacturonasas son las enzimas

pectinolíticas más abundantes cuya función es la de romper la cadena de ácido

galacturónico en la región lisa de la pectina con la adición de agua (Jayani, Saxena, &

Gupta, 2005).

Exoglucanasa 3.2.1.91 La exoglucanasa es una enzima que hidroliza los enlaces β-1,4

glucosídicos de los extremos de la cadena, produciendo celobiosa como producto

principal. La exoglucanasa crea una especie de túnel de unión con el sustrato, ambos lados

del túnel se forman a partir de cadenas laterales involucradas en una compleja red de

puentes de hidrógeno ricos en aminoácidos que interactúan con los azúcares (Divne et al.,

1994).

Además de los productos de valor agregado que pueden ser generados por la degradación

de la biomasa lignocelulósica, las enzimas lignocelulósicas como tal son de gran utilidad

en distintas aplicaciones. Es por ello, que la producción de enzimas microbianas se está

convirtiendo en parte central de los intereses de la industria biotecnológica a nivel

mundial debido a sus importantes usos en diversos sectores de la industria como la

farmacéutica, energética, alimenticia, entre otros (Singh, Kumar, Mittal, & Mehta, 2016).

El mercado mundial de la industria de producción de enzimas está creciendo a

velocidades gigantescas, en el año 2013 generó ganancias aproximadas de $4.8 billones

de dólares en 2014 y se estimaba que para el año 2018 alcanzara una cifra cercana a los

$7.1 billones de dólares. La utilización de residuos alimenticos para la producción de

enzimas es un futuro promisorio que se ha venido de desarrollando debido a que

proporciona seguridad y viabilidad económica para el desarrollo del proceso y del

producto (Ravindran & Jaiswal, 2016).

Con el objetivo de aprovechar el uso de residuos orgánicos que representan un bajo costo

como materia prima para la producción de enzimas, se han llevado a cabo la amplificación

de técnicas de bioprocesamiento microbiano usadas en laboratorio a gran escala. Esto ha

presentado varios retos a la industria dada la necesidad de crear condiciones ambientales

propicias para el crecimiento del microorganismo y la producción de metabolitos

secundarios (Subramaniyan & Vimala, 2012). Condiciones adversas para su crecimiento

puede resultar en la producción de compuestos no deseados o en el bajo rendimiento del

5


microorganismo. El desarrollo de técnicas como la fermentación en estado sólido y la

fermentación sumergida han liderado el nivel de producción industrial de compuestos

bioactivos. Algunos metabolitos secundarios presentan una producción más elevada en

fermentación en estado sólido que en fermentación sumergida y viceversa.

La fermentación en estado sólido se define como la fermentación efectuada en ausencia

o deficiencia de agua. Por otra parte, la fermentación sumergida hace referencia al tipo

de fermentación realizada en presencia de un exceso de agua (Singhania, Sukumaran, &

Patel, 2010). En particular, para la producción de enzimas, la fermentación sumergida es

utilizada en mayor medida debido a que utiliza un medio líquido que contiene disueltos

los nutrientes requeridos por el microorganismo (El-Barry, Abraham, & Cerda, 2015).

Este proceso de fermentación presenta el beneficio de homogeneizar el medio de cultivo

y además la posibilidad de controlar parámetros como la temperatura y el pH. Por otro

lado, la fermentación en estado sólido presenta grandes retos y dificultades en procesos

industriales debido al monitoreo y control de las variables; es por ello que se prefiere la

fermentación sumergida a la hora del escalado (El-Barry, Abraham, & Cerda, 2015). En

la Figura 2 se esquematiza ambos tipos de fermentaciones.

6


Varios grupos de microorganismos son utilizados frecuentemente en la transformación

de desechos orgánicos con material lignocelulósico utilizando alguno de estos dos tipos

de fermentación, Pleurotus ostreatus es uno de ellos. P. ostreatus es un hongo

basidiomiceto perteneciente a la familia Pleurotaceae (Papaspyridi, Aligiannis, &

Topakas, 2012). P. ostreatus es una especie de crecimiento rápido, además es de gran

importancia en la industria debido a que degrada lignina, uno de los componentes más

abundantes en los residuos agrícolas. Usualmente se realiza una fermentación en medio

sólido para la obtención de enzimas lignocelulósicas a partir de P. ostreatus, esto debido

a que requiere un menor contenido de humedad para crecer comparado con otros

microorganismos (Subramaniyan & Vimala, 2012). Sin embargo, este tipo de

fermentación en P. ostreatus presenta algunos inconvenientes como contaminación

frecuente por la manipulación del sustrato y tiempo relativamente largo en la producción

del inóculo. Es por ello, que la fermentación sumergida es una alternativa para evitar los

problemas mencionados anteriormente debido a que se obtiene el inoculo en cultivo

líquido, permitiendo producir una mayor cantidad de biomasa de mejor calidad en un

periodo de tiempo más corto (Guillén, Márquez, & Sanchez, 1998).

Teniendo en cuenta las consideraciones expuestas anteriormente en cuanto a las

características del hongo y proceso de fermentación sumergida, es posible obtener los

resultados deseados en cuanto a producción de enzimas lignocelulolíticas y tiempo de

fermentación se refiere. El objetivo de este estudio es identificar las variables de

Figura 2. Esquematización de ambos tipos de fermentaciones. Arriba: Fermentación en

estado sólido. Abajo: Fermentación sumergida. (Ravindran & Jaiswal, 2016)

7


operación del proceso que maximicen la producción de enzimas por parte del hongo y

con ello escalarlo en un biorreactor batch utilizando el principio de la fermentación

sumergida.

8


CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa. Se utilizó la cepa Pleurotus ostreatus.

Residuos de fruta. Se recolectaron residuos de fruta (mango y piña) como sustrato para la

experimentación. Estos residuos fueron previamente secados y molidos según el

protocolo de la NREL. El tamaño de partícula es de aproximadamente 1 mm.

Crecimiento de la cepa Pleurotus ostreatus en agar de malta. Se sembró la cepa Pleurotus

ostreatus en cajas de petri utilizando agar extracto de malta para facilitar el crecimiento

del hongo. Esto se realizó recolectando un plug por medio de técnica de punción

extrayendo parte del micelio para luego ubicarlo en el agar. Finalmente se lleva a

incubación durante 1 semana y se mantiene a 25ºC permitiendo que el micelio cubra

totalmente la superficie del agar.

Preparación del pre-inóculo. Se extrajeron 15 plugs de micelio del material previamente

incubado y se agregaron en 5 mL de caldo SDY en tubos de ensayo de 10 mL. Finalmente

se lleva a incubación durante 1 semana y se mantiene a 25ºC.

Preparación del inoculo. Para el inoculo es necesario esterilizar el recipiente de 0.5 L

durante dos ciclos. Además, se preparó un buffer citrato pH 5. Una vez todo el material

se esterilizó, se agregaron 170 mL del buffer citrato a cada recipiente con 1,7 g de fruta.

Esto se realizó por duplicado con el fin de mantenerlos en agitación a 150 rpm y 70 rpm

a una temperatura de 25ºC. Se realiza toma de muestras del medio líquido cada 4 días

para la medición de actividad enzimática.

Cuantificación de azúcares reductores. Para la cuantificación de azúcares reductores se

utilizó el método de DNS. Este método es una técnica colorimétrica que consiste en la

reacción de óxido-reducción entre el ácido 3,5-dinitrosalicílico y los azúcares reductores

presentes en la muestra. El poder reductor de los azúcares permite que el ácido 3,5-

dinitrosalicílico se reduzca al ácido 3-amino-5-nitrosalisílico pasando de una coloración

amarilla a una rojiza-marrón (Garriga, Almaraz, & Marchiaro, 2017). Para ello, se agrega

1 mL de extracto enzimático junto a 1 mL de DNS en tubos de ensayo de 10 mL y luego

se coloca en agua en ebullición durante 5 minutos. Posteriormente se deja enfriar hasta

temperatura ambiente y se completa el volumen con 8 mL de agua destilada. Finalmente

se mide la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm. Para conocer la concentración

9


de azúcares reductores a partir de la absorbancia es necesario hacer una curva de

calibración empleando glucosa.

Actividad enzimática de lacasas (E.C.1.10.3.2). Para medir la actividad enzimática de

lacasa se preparó una solución de ABTS 1mM en buffer acetato de sodio con pH 4,5. Se

adicionaron 50 µL de extracto enzimático junto a 950 µL de la solución ABTS-buffer

acetato y se registró la absorbancia por espectrofotometría por 10 minutos registrándola

cada minuto a una longitud de onda de 436 nm. La lectura es comparada frente a un blanco

en donde el extracto enzimático es reemplazado por agua destilada. La actividad se

cuantificó siguiendo la ley Beer-Lambert:

𝑈

𝐿=𝐴𝑉𝑡𝐹𝑑𝑡𝜀𝑉𝑚𝑙

Donde,

𝐴

𝑡= Pendiente obtenida al linealizar los resultados de absorbancia durante los 10 minutos

de reacción.

𝑉𝑡 = Volumen de la celda (1 mL)

𝐹𝑑 = Factor de dilución

𝜀 = Coeficiente de extinción molar a 436 nm (29.3 mM-1cm-1)

𝑉𝑚 = Volumen de la muestra (50 µL)

Actividad de la exopoligalacturonasa. Para cuantificar la actividad de la enzima

exopoligalacturonasa se adiciona 2 mL de una solución pectina al 1% en buffer citrato de

sodio junto a 0,5 mL de extracto enzimático en tubos de ensayo de 25 mL, la mezcla se

llevó a 50ºC durante 30 minutos. Luego, los tubos se enfrían rápidamente para detener la

reacción y se agregan 2,5 mL del reactivo DNS, la solución se lleva a ebullición durante

5 minutos. Posteriormente se agregan 10 mL de agua destilada y se procede a medir

absorbancia por espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm (Debing, Peijun,

Stangnitti, Xianzhe, & Li, 2006).

Actividad de la exoglucanasa. Para cuantificar la actividad de la enzima exoglucanasa se

adiciona 2 mL de una solución celulosa cristalina al 1% en buffer citrato de sodio junto a

0,5 mL de extracto enzimático en tubos de ensayo de 25 mL, la mezcla se llevó a 50ºC

durante 60 minutos. Luego, los tubos se enfrían rápidamente para detener la reacción y

10


se agregan 2.5 mL del reactivo DNS, la solución se lleva a ebullición durante 5 minutos.

Posteriormente se agregan 10 mL de agua destilada y se procede a medir absorbancia por

espectrofotometría a una longitud de onda de 540 nm (Montoya, 2008).

Diseño experimental. Para este estudio se realizó un diseño factorial completo en donde

se definieron como factores la velocidad de agitación, la proporción de fruta y el tiempo

de incubación. Los niveles para cada factor se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Factores con sus respectivos niveles para el planteamiento del diseño factorial

completo.

Factor Nivel

Velocidad de agitación (rpm) 75 150

Concentración de fruta (%) 25 50 75

Tiempo de incubación (días) 4 8 12 15 20

Se realizaron 3 réplicas para un total de 90 experimentos. Se tomaron como variables de

respuesta la concentración de azúcares reductores y la actividad de cada enzima estudiada

en el presente proyecto.

Preparación del inóculo para el biorreactor. Se extrajeron 8 plugs de micelio del material

fúngico previamente incubado y se agregaron en 50 mL de caldo SDY en matraces

Erlenmeyer de 250 mL. Se incubaron durante 7 días a 25 °C y posteriormente cada uno

se resembraron en matraces Erlenmeyer de 1000 mL con 500 mL del mismo medio para

obtener el inóculo del biorreactor. Los matraces se llevaron nuevamente a incubación

durante 7 días y se mantuvieron en agitación constante a 150 rpm y a una temperatura de

25 °C.

Preparación del medio de cultivo para el biorreactor. Se preparó 1 L de buffer citrato pH

5 y se mezcló junto a 10 g de fruta. El medio de cultivo se esterilizó junto al biorreactor

antes de empezar la fermentación.

Biorreactor. Se utilizó un Biorreactor New Brunswick BioFlo®/CelliGen® 115 de 7,5 L

para el montaje junto a una turbina Rushton de 6,4 cm de diámetro. El cultivo se mantuvo

a una temperatura de 26 °C, agitación constante de 150 rpm y aireación de 0.65 vvm. Se

realiza toma de muestras del medio líquido cada 24 horas para la medición de actividad

enzimática.

11


CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Montajes

3.1.1 Cuantificación de azúcares reductores

En la Figura 3 se muestra el comportamiento obtenido para la concentración de azúcares

reductores durante 20 días de cultivo a una velocidad de agitación de 75 rpm y las distintas

proporciones de concentración de fruta. Las concentraciones de azúcares en los montajes

permanecen casi constantes con un leve incremento en el día 8 de incubación y su

posterior disminución hasta el día 20 para alcanzar aproximadamente las mismas

concentraciones que en el día 4. Este comportamiento no difiere de gran manera para las

concentraciones de azucares reductores de los montajes cultivados a 150 rpm como se

observa en la Figura 4. La concentración máxima de azúcares reductores para los cultivos

incubados a 75 rpm fue de 13,58 g/L con una proporción de fruta de 50% mango, mientras

que para los cultivos incubados a una velocidad de agitación de 150 rpm la concentración

máxima fue de 14,53 g/L con una proporción de fruta de 50%. Cabe resaltar que, para los

cultivos incubados a ambas velocidades de agitación, la concentración máxima de

azúcares reductores no difiere de gran manera con las otras proporciones de fruta.

Este comportamiento en la concentración de azúcares es consistente con el encontrado

por el estudio de Hidalgo, Narváez, Pedroza, & Velásquez (2012) quienes reportaron que

la concentración de azúcares reductores llegó a un pico en el primer día de incubación y

luego empezó a decrecer gradualmente hasta el día 7. Aunque el comportamiento es

similar, los días de incubación donde se presenta la máxima concentración cambia, esto

debido a que el sustrato que se utilizó en dicho estudio para la liberación de azúcares

reductores es distinto al utilizado en este ensayo.

Despúes de 8 días de incubación, el hongo probablemente empezó a consumir azúcares

simples y por tanto la concentración empezó a disminuir gradualmente a través del tiempo

(Hidalgo et al., 2012).

12


Figura 3. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 75 rpm. Los

valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la

desviación estándar.

Figura 4. Cuantificación de los azúcares reductores de los cultivos a 150 rpm. Los



0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Conce

ntr

acón (

g/L

)

Días25 % Mango 50 % Mango 75 % Mango

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Co

nce

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g/L

)

Días

25 % Mango 50 % Mango 75 % Mango

13


Se realizó un diseño factorial completo con el cual se concluye con un nivel de

significancia del 5% que la velocidad de agitación (p-value = 0,034) y tiempo de

incubación (p-value = 0,000) tiene un efecto significativo en la concentración de azúcares

reductores, mientras que la concentración de fruta (p-value = 0,526) no tiene un efecto

significativo sobre la concentración de azúcares reductores. Adicionalmente, se construyó

una gráfica de efectos principales en donde se observa que la tasa media de concentración

de azúcares reductores es mayor en el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación

de 75 rpm. Por otra parte, la proporción de fruta no afecta de manera significativa la

concentración media de azúcares reductores como se logra corroborar en esta gráfica y

en el análisis de varianza mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica

de efectos principales se encuentra en el Anexo 2.1.

3.1.2 Medición de actividad enzimática

3.1.2.1 Lacasas

En las Figuras 5 y 6 se presenta la curva de comportamiento de la actividad enzimática

de lacasas para las velocidades de agitación de 75 y 150 rpm respectivamente. La

actividad enzimática en los cultivos con una velocidad de 75 rpm alcanzó un pico en el

día 10 de incubación para todas las proporciones de frutas y luego los niveles de actividad

fueron disminuyendo gradualmente. Por otro lado, para los cultivos incubados a una

velocidad de 150 rpm, la actividad máxima de lacasas encontró un pico en el día 12 de

incubación para todas las proporciones de frutas exceptuando los cultivos que crecieron

en una proporción de 25% mango como sustrato, la cual alcanzó un pico en el día 15 de

incubación, de igual manera los niveles de actividad disminuyeron gradualmente. Este

comportamiento concuerda con los estudios realizados por Sekme, Ataci, & Arisan

(2013) y Rodrigues et al. (2012) en donde se demostró que la actividad enzimática de

lacasas incrementa hasta alcanzar un pico y luego disminuye hasta un valor similar a la

inicial. Esto se debe posiblemente a la rápida diminución de contenido de lignina una vez

se alcanza la actividad enzimática máxima de lacasas (Leatham, 1985). Para una

velocidad de 75 rpm la actividad máxima fue de 1212,20 U/L con una proporción de fruta

de 25% mango, mientras que para una velocidad de agitación de 150 rpm la actividad

máxima fue de 1474,49 U/L con una proporción de fruta de 50% mango.

14


Figura 5. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 75 rpm. Los valores se

tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la


Figura 6. Actividad enzimática de lacasas de los montajes a 150 rpm. Los valores se

tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error representan la


437,06

1212,20

684,35598,32 562,00

395,13

1085,53

929,47

705,10

364,00

458,25

839,54

479,00562,00 518,34

0

500

1000

1500

2000

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

95,84

996,58

1350,46

1463,65

1303,09

369,49

1317,94

1474,49

1090,26

930,46

149,18

614,95

1131,46

943,68

834,50

0

500

1000

1500

2000

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

15


A partir del diseño factorial realizado se concluye con un nivel de significancia del 5%

que la velocidad de agitación (p-value = 0,012) y tiempo de incubación (p-value = 0,001)

tiene un efecto significativo en la actividad enzimática de lacasas, mientras que la

concentración de fruta (p-value = 0,188) no tiene un efecto significativo sobre dicha

actividad. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos principales en donde se

observa que la tasa media de actividad enzimática de lacasas es mayor entre los días 8 y

12 de incubación y a una velocidad de agitación de 150 rpm. La proporción de fruta por

otra parte no afecta de manera significativa la tasa media de actividad enzimática como

se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis de varianza mencionado anteriormente.

El análisis de varianza y la gráfica de efectos principales se encuentran en el Anexo 2.2.

3.1.2.2 Exopoligalacturonasa

La actividad enzimática de exopoligalacturonasa se midió con la ayuda del reactivo DNS

y se estimó a partir de la curva de calibración realizada con glucosa, dicha curva se

encuentra en el Anexo 1. A partir de los datos obtenidos se lograron construir los perfiles

de actividad para los cultivos incubados a 75 y 150 rpm. En la Figura 7 se observa el

perfil de actividad enzimática de exopoligalacturonasa para los cultivos incubados a 75

rpm donde alcanza un pico en el día 8 y posteriormente decrece de manera gradual. De

manera similar, los cultivos incubados a 150 rpm presentan su actividad máxima en el 8

día de incubación como se aprecia en la Figura 8, con un posterior decrecimiento en la

actividad enzimática. Para los cultivos incubados con una velocidad de agitación de 75

rpm la actividad máxima de exopoligalacturonasa fue de 1359,52 U/L en el día 8 de

incubación con una proporción de fruta de 75% de mango, mientras que para los cultivos

incubados a 150 rpm la actividad máxima de la enzima resulto ser de 1012,87 U/L con

una proporción de fruta de 50% de mango.

En el estudio realizado por Adeleke, Odunfa, Olanbiwonninu, & Owoseni (2012) donde

evaluaron la producción enzimática de la poligalacturonasa de Penicillum atrovenetum,

Apergillus flavus y Aspergillus oryzae usando cáscara de naranja como sustrato, se

presentó un comportamiento similar al obtenido en este ensayo donde la actividad

enzimática de todas las cepas alcanzan un pico en el día 5 de incubación y posteriormente

decrece de manera gradual hasta el día 15.

16


Figura 7. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa de los montajes a 75 rpm.

Los valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error

representan la desviación estándar.

Figura 8. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa de los montajes a 150 rpm.

Los valores se tomaron como la media de las 3 réplicas y las barras de error

representan la desviación estándar.

411,92

1160,43

704,91

536,34

382,64

658,30

1209,73

713,07611,68

395,16

816,13

1359,52

632,14656,84

475,19

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

404,55

782,71

493,41

361,62

363,97

972,861012,87

484,92

355,25360,04

730,51 726,15

576,47

384,87

376,49

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

17




tiene un efecto significativo en la actividad de exopoligalacturonasa, mientras que la

concentración de fruta (p-value = 0,019) no tiene un efecto significativo sobre la

concentración de dicha enzima. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos

principales en donde se observa que la tasa media de actividad de exopoligalacturonasa

es mayor en el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación de 75 rpm. Por otra

parte, la proporción de fruta no afecta de manera significativa la actividad enzimática

media de exopoligalacturonasa como se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis

de varianza mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica de efectos

principales se encuentran en el Anexo 2.3.

3.1.2.3 Exoglucanasa

La actividad enzimática de exoglucanasa al igual que la de exopoligalacturonasa se midió

con la ayuda del reactivo DNS y se estimó con la respectiva curva de calibración. En la

Figura 9 se observa el perfil de actividad enzimática de exoglucanasa para los cultivos

incubados a 75 rpm donde alcanza un pico en el día 8 y posteriormente decrece de manera

gradual. De manera similar, los cultivos incubados a 150 rpm presentan su concentración

máxima en el 8 día de incubación como se aprecia en la Figura 10, con un posterior

decrecimiento en la actividad enzimática. Para los cultivos incubados con una velocidad

de agitación de 75 rpm la actividad máxima de exoglucanasa fue de 4,19 g/L en el día 8

de incubación con una proporción de fruta de 75% de mango, mientras que para los

cultivos incubados a 150 rpm la actividad máxima de la enzima resulto ser de 5,50 g/L

con una proporción de fruta de 75% de mango. Este comportamiento resulto muy similar

al perfil de actividad para la enzima exopoligalacturonasa

En el estudio realizado por Khalil, Hoque, Basunia, Alam, & Khan (2011), la actividad

de exoglucanasa alcanza su valor máximo en el día 10 y luego los niveles disminuyen de

manera gradual hasta alcanzar valores iguales o cercanos a 0 en el día 14. En un estudio

similar realizado por Goyal & Soni (2011) donde evaluaban la actividad enzimática de la

exoglucanasa utilizando como microorganismo Pleurotus florida y como sustrato CMC,

encontraron que esta enzima alcanza su máxima actividad en el día 10 de incubación y

luego disminuye. Por tanto, los resultados obtenidos en este ensayo concuerdan con los

reportados en la literatura en donde la actividad enzimática de exoglucanasa va

18


aumentando de manera progresiva hasta alcanzar un pico y luego decrece de manera

gradual.

Figura 9. Actividad enzimática de la exoglucanasa de los montajes a 75 rpm. Los



Figura 10. Actividad enzimática de la exoglucanasa de los montajes a 150 rpm. Los



317,97

376,82

294,27284,49

214,90

305,51

386,72

316,91 310,54

163,82

323,06

387,50

277,84

310,48

240,89

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

277,56

432,66

208,98 195,23189,53

266,44

430,76

206,35 207,86 203,22

247,10

508,51

240,73217,03 214,85

0

100

200

300

400

500

600

4 8 12 15 20

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25 % Mango

50 % Mango

75 % Mango

19




tiene un efecto significativo en la actividad enzimática de exoglucanasa, mientras que la

concentración de fruta (p-value = 0,371) no tiene un efecto significativo sobre la actividad

de dicha enzima. Adicionalmente, se construyó una gráfica de efectos principales en

donde se observa que la tasa media de actividad enzimática de exoglucanasa es mayor en

el día 8 de incubación y a una velocidad de agitación de 75 rpm. Por otra parte, la

proporción de fruta no afecta de manera significativa la concentración media de

exoglucanasa como se logra corroborar en esta gráfica y en el análisis de varianza

mencionado anteriormente. El análisis de varianza y la gráfica de efectos principales se

encuentra representada en el Anexo 2.4.

3.1.3 Efecto de la velocidad de agitación en la concentración de azúcares

reductores y actividades enzimáticas

En el presente estudio, fue posible corroborar que efectivamente la velocidad de agitación

tiene un efecto significativo en todas las variables de respuesta evaluadas. Esto debido a

que todos los p-value fueron menores al nivel de significancia (𝛼=0,05). Mussato,

Dragone, Fernandes, Milagres, & Roberto (2008) indican en su estudio que la velocidad

de agitación tiene un efecto negativo en el rendimiento de glucosa y la conversión de

celulosa, es decir, ambas variables de respuesta aumentan al disminuir la velocidad de

agitación. Cabe resaltar que en este estudio se evaluaron tres velocidades de agitación:

100, 150 y 200 rpm. Por tanto, no es posible realizar una comparación amplia dado que

el estudio no incluyó en su análisis la velocidad de agitación de 75 rpm. En este estudio

se utilizó residuo de grano cervecero. Este comportamiento también se presentó en otros

estudios donde se utilizaron sustratos diferentes. Por ejemplo, Mukataka, Tada, &

Takahashi (1983) utilizando como sustrato Avicel y pulpa de papel evidenciaron que

velocidades muy altas de agitación (>200 rpm) disminuían la hidrólisis enzimática de la

celulosa, mientras que velocidades moderadas (100-200 rpm) promovían una buena tasa

de hidrolisis y conversión. Sin embargo, estos resultados pueden no ser consistentes

dependiendo del microorganismo que se esté utilizando. En el estudio realizado por

Vamanu et al. (2011) donde utilizó Pleurotus ostreatus, encontró que a una velocidad de

150 rpm se obtuvo mayor cantidad de biomasa, lo que repercute en una mayor capacidad

del hongo para producir enzimas lignocelulolíticas, en dicho estudio se evaluaron

velocidades de agitación de 0, 50, 100, 150, 200 y 250 rpm. Los resultados arrojados en

20


el presente estudio son consistentes con los encontrados en la literatura ya que al utilizar

una velocidad de 150 rpm 3 de las 4 variables de respuesta logran alcanzar un valor medio

mayor comparado con la velocidad de agitación de 75 rpm como se observan en las

gráficas de efectos principales que se encuentran en Anexos.

3.1.4 Efecto de los componentes presentes en la biomasa lignocelulósica

de los residuos de fruta en la concentración de azúcares reductores

y actividades enzimáticas

A partir del análisis de varianza arrojado por el diseño factorial completo realizado, fue

posible corroborar que la proporción de fruta mango/piña no tiene un efecto significativo

en las variables de respuesta analizadas. Esto debido a que todos los p-value arrojados

por dicho análisis resultaron ser mayores al nivel de significancia (𝛼=0,05). Para tener

una visión global del efecto que tiene el sustrato específico utilizado en cada una de las

proporciones evaluadas, es necesario relacionar el contenido de los componentes que

tienen los residuos de fruta con los resultados de actividades enzimáticas encontrados. De

acuerdo con el estudio realizado por Jahid, Gupta, & Kumar (2018) el contenido de

celulosa, hemicelulosa y lignina en la cascara de mango es de 38,4; 13,9 y 27,9%

respectivamente; mientras que el contenido de estos tres componentes en la cáscara de

piña se reparten de la siguiente manera: celulosa (22,4%), hemicelulosa (11,1%) y lignina

(6,5%). El bajo contenido de lignina presente en la cáscara de piña facilita el acceso a

azúcares fermentables y por consecuente genera un medio rico en glucosa. En el estudio

realizado por Dúran, Cruz, Gonzáles, & Sierra (2018) se evidencia que al utilizar residuos

de cáscara de piña como sustrato, decrece la actividad enzimática de lacasas, esto debido

a la inhibición de la enzima causada por la alta concentración de glucosa en el medio (Ire

& Ahuekwe, 2016). Los resultados arrojados en el presente estudio son consistentes con

los encontrados en la literatura ya que el valor medio de actividad enzimática de lacasas

es mayor a una proporción de mango/piña del 25%, es decir, con un contenido menor de

lignina. Esto se corrobora con la gráfica de efectos principales para la actividad

enzimática de lacasas que se presenta en la Figura A.2.2.1 encontrada en Anexos.

3.2 Biorreactor

A partir del diseño factorial completo realizado, se construyeron gráficas de optimización

con el fin de determinar los niveles que en interacción maximizan los valores de las

variables de respuesta. Estas gráficas se pueden visualizar en la Figura A.2.5.

21


Al observar con detenimiento las gráficas de optimización, es posible concluir que con el

diseño factorial realizado la concentración de azúcares reductores es máxima al utilizar

una velocidad de agitación de 150 rpm y una concentración de fruta de 75% mango. La

actividad de lacasas se maximiza al utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y una

concentración de fruta como sustrato de 50% mango. En cuanto a la concentración de

exopoligalacturonasa, esta se maximiza al utilizar una velocidad de agitación de 75 rpm

y una concentración de fruta de 75% mango. Finalmente, la concentración de

exoglucanasa es máxima al utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y 75% mango.

A partir de estos resultados, se decidió utilizar una velocidad de agitación de 150 rpm y

una concentración de fruta de 75% mango. Esto se debe a que a esta velocidad de

agitación se maximiza el valor de 3 de las 4 variables de respuesta como se destacó

anteriormente. En cuanto a la concentración de fruta, esta también permite la

maximización de 3 de las 4 variables de respuesta. No obstante, como se vio reflejado en

los análisis de varianza, la concentración de fruta no es muy significativa en el valor que

toma las variables de respuesta. Por este motivo se considera más importante la elección

de la velocidad de agitación.

3.2.1 Cuantificación de azúcares reductores

En la Figura 11 se observa el perfil de concentración de azúcares reductores en el

biorreactor batch. Se puede apreciar un aumento progresivo de la concentración de

azúcares reductores hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una concentración

máxima de 33,42 g/L. Se obtuvo un aumento del 130% en la concentración de azúcares

reductores con respecto a la mayor concentración encontrada en los montajes. Esto se

debe a la gran disponibilidad de glucosa que existe en el medio debido a la acción de las

enzimas que descomponen el material lignocelulósico en monosacáridos y disacáridos los

cuales varios de ellos actúan como azúcares reductores aumentando su concentración

(Asif et al., 2011).

22


Figura 11. Cuantificación de los azúcares reductores del cultivo del biorreactor.

3.2.2 Medición de actividad enzimática

3.2.2.1 Lacasas

En la Figura 12 se observa el perfil de actividad enzimática de lacasas el cual no es

constante llegando a un máximo local en el día 2, presentando posteriormente una

disminución hasta el día 5 y aumentando nuevamente de manera gradual hasta llegar al

máximo global en el día 8 de fermentación.

Además, la actividad de lacasas presentó un valor muchísimo más bajo en comparación

con los montajes donde se presentaban valores con 2 órdenes de magnitud mayores. Esto

puede deberse a que, al exceder la concentración de glucosa como fuente de carbono, esta

causa un efecto inhibitorio en la actividad enzimática de lacasas disminuyendo su

producción (Sekme et al., 2013). La celulosa disponible de las cáscaras de fruta que se

agregaron como sustrato pudieron actuar como activador de la producción de lacasas

durante los primeros dos días (Ire & Ahuekwe, 2016). No obstante, debido al exceso de

sustrato añadido al biorreactor (10 g), la celulosa posiblemente se empezó a degradar a

una tasa muy alta permitiendo el fácil acceso a grandes cantidades de glucosa que como

se mencionó anteriormente, actúa como inhibidor para la producción de lacasa evitando

una gran actividad enzimática de esta.

18,09 17,43

24,84 28,14

26,94

33,42

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Conce

ntr

acón (

g/L

)

Días

23


Adiconalmente, el estrés hidrodinámico por parte de la agitación y la aireación parece

tener un efecto negativo en la producción de lacasas. En el estudio realizado por Hess et

al. (2002) se obtuvo una menor actividad de lacasas en el biorreactor comparado con los

montajes realizado en los matraces. Esto se debe probablemente al daño del micelio

causado por la alta tasa de cizalla que ocurre en mayor medida cerca al eje de la turbina.

Sin embargo, no hay suficientes reportes en literatura para concluir en el efecto directo

que tienen sobre la producción de lacasas en biorreactores. En el estudio realizado por

Valencia, Gómez, Galindo, & Serrano (2014) se evidencia que la disminución en la

producción de lacasas en el biorreactor se debe a la producción de proteasas por parte de

Pleurotus ostreatus y no tanto por el estrés hidrodinámico generado por la agitación y

aireación.

Figura 12. Actividad enzimática de lacasas del cultivo del biorreactor.

3.2.2.2 Exopoligalacturonasa

En la Figura 13 se observa el perfil de concentración de exopoligalacturonasa presentando

un comportamiento creciente hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una

actividad máxima de 5515,20 U/L. Se obtuvo un aumento del 305,67% en la actividad

enzimática de exopoligalacturonasa con respecto a la mayor concentración encontrada en

los montajes. Este gran aumento se debe probablemente a la gran cantidad de glucosa y

pectina presente en el medio debido a la gran cantidad de fruta que se agregó (10 g)

además de la concentración de glucosa que ya se estaba presente en el inóculo. En un

19,45

28,53

1,302,59

14,27

37,61

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 5 6 7 8

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

24


estudio realizado por Abbasi, Mortazavipoor, & Setudeh (2011), se evidenció que la

actividad enzimática de exopoligalacturonasa aumenta de manera significativa cuando se

utiliza glucosa y pectina como medio de cultivo.

Figura 13. Actividad enzimática de la exopoligalacturonasa del cultivo del biorreactor.

3.2.2.3 Exoglucanasa

En la Figura 14 se observa el perfil de actividad enzimática de exoglucanasa presentando

un comportamiento creciente hasta el día 8 de fermentación donde se alcanzó una

actividad máxima de 2534,93 U/L.

972,52734,09

2682,48

3515,49

4827,39

5515,20

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

1 2 5 6 7 8

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

25


Figura 14. Actividad enzimática de la exoglucanasa de del cultivo del biorreactor.

Se obtuvo un aumento del 398,5% en la actividad enzimática de exoglucanasa con

respecto a la mayor concentración encontrada en los montajes. Este aumento que se

obtuvo con respecto a los cultivos incubados en frascos de vidrios se debe posiblemente

al alto contenido de celulosa presente en los residuos de fruta (mango y piña) utilizados

como medio de cultivo para la fermentación (Dúran, Cruz, Gonzáles, & Sierra, 2018).

3.2.3 Factores involucrados y fuentes de error en el proceso de escalado

Este estudio implica la apertura para investigaciones posteriores en cuanto a la producción

de enzimas lignocelulolíticas por parte del hongo Pleutotus ostreatus con residuos de

fruta como sustrato a escala de biorreactor ya que es la primera vez que se realiza en el

Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los Andes. Es por ello, que es

necesario hablar con más detalle de los factores implicados en el proceso y posibles

fuentes de error que hicieron parte de este. Para la fermentación en el biorreactor se

esperaba utilizar una aireación de 1 vvm basada en la literatura (Guillén, Márquez, &

Sanchez, 1998). Sin embargo, en el laboratorio la aireación máxima posible era de 2,5

L/min que con 3,8 L de volumen de trabajo utilizado para la fermentación equivale a 0,65

vvm. En el estudio realizado por Valencia et al. (2014) la agitación y aireación tiene un

efecto negativo en la producción enzimática, afectando la actividad de producción de

lacasa a altas velocidades de agitación y tasas de aireación. En su investigación

encontraron que la producción de lacasas mejoraba al nivel de aireación y agitación más

1539,60

1707,28

1486,78

1826,49

2300,01

2534,93

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1 2 5 6 7 8

Act

ivid

ad (

U/L

)

Días

26


bajo; 0,94 kW/m3 s y 0.1 vvm respectivamente. Sin embargo, en el estudio realizado por

Fenice, Sermanni, Federici, & D'Annibale (2003) se encontró que la actividad enzimática

incrementaba al utilizar una aireación entre 0,5 y 1 vvm, mientras que aireaciones altas

(1,5 vvm) disminuían la producción enzimática de manera drástica, en este estudio se

utilizó una velocidad de agitación de 500 rpm. Al observar los resultados de ambos

estudios, es posible determinar que utilizar una aireación alta afecta de gran manera la

producción enzimática. No obstante, en el estudio de Valencia et al. (2014) se encontró

que la aireación óptima es 5 veces menor que en el estudio reportado por Fenice et al.

(2003), cabe resaltar que la velocidad de agitación utilizada en ambos estudios fue

distinta, por lo que posiblemente la interacción de estos dos factores es relevante a la hora

de evaluar la producción enzimática. En cuanto a las fuentes de error que imposibilitaron

la obtención de resultados más exactos, se encuentra el método de calentamiento utilizado

para mantener el cultivo a 25°C el cual se basaba en una manta térmica que gracias a las

grandes temperaturas que alcanzaba, una parte del material residual de las frutas quedaba

pegada en las paredes del recipiente impidiendo el aprovechamiento total del medio de

cultivo.

27


CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES

Se evaluaron las actividades enzimáticas de lacasa, exopoligalacturonasa y exoglucanasa

para la hidrólisis de celulosa y la deslignificación del material orgánico presente en los

residuos de fruta y se cuantificó la concentración de azúcares reductores. Se encontró un

efecto significativo de la velocidad de agitación en la actividad enzimática de los

biocatalizadores evaluados y en la concentración de azúcares, esto debido a las

propiedades del hongo Pleurotus ostreatus. La deslignificación de los residuos orgánicos

se le atribuye en su mayoría a la acción de la lacasa dada su mayor actividad comparada

con las demás enzimas. Sin embargo, en el cultivo sumergido del biorreactor Batch la

actividad de la lacasa sufre un decrecimiento radical dada la inhibición de la enzima por

saturación de glucosa. El potencial de producción de enzimas lignocelulolíticas en un

biorreactor Batch es promisorio debido al gran incremento en actividad de exoglucanasa

y exopoligalacturonasa que se evidenció en este proyecto, en cuanto a la lacasa es

necesario tener en cuenta la cantidad de glucosa presente en el medio para evitar

inhibición e incrementar su producción.

28


CAPÍTULO V

TRABAJO FUTURO

Para seguir con la línea de investigación enfocada en el escalamiento del proceso de

producción de enzimas lignocelulolíticas es necesario en primera instancia realizar una

búsqueda rigurosa en literatura para lograr encontrar el valor óptimo de las variables que

permiten una producción enzimática máxima y así evitar hacer varios experimentos que

limitan el tiempo y uso de equipos y reactivos. En cuanto al biorreactor, sería necesario

estudiar el efecto que tienen distintos tipos de impeller en la producción de enzimas

lignocelulolíticas y así realizar un mejor proceso de escalado. Además, sería

recomendable agregar Cobre y Cadmio al medio de cultivo en el momento de realizar la

fermentación ya que activa la enzima lacasa permitiendo una mayor deslignificación del

material orgánico por parte del hongo Pleurotus ostreatus (Baldrian & Gabriel, 2002).

29


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33


ANEXOS

Anexo 1: Curva de calibración de DNS

Figura A.1.1. Curva de calibración usando glucosa.

Anexo 2: Pruebas estadísticas

A.2.1 Análisis de varianza para concentración de azúcares reductores

Fuente GL

Modelo 29

Lineal 7

Velocidad de agitación (rpm) 1

Concentración de fruta (%) 2

Tiempo de incubación (días) 4

Interacciones de 2 términos 14

Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 2

Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 4

Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8


Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 8

Error 60

y = 1,6552x - 0,0778

R² = 0,9915

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abso

rban

cia

Concentración (g/L)

34


Total 89

Fuente

Valor

F

Modelo 3,18

Lineal 10,79

Velocidad de agitación (rpm) 4,72

Concentración de fruta (%) 0,65

Tiempo de incubación (días) 17,38

Interacciones de 2 términos 0,59

Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%) 0,33

Velocidad de agitación (rpm)*Tiempo de incubación (días) 1,04

Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación (días) 0,43


Velocidad de agitación (rpm)*Concentración de fruta (%)*Tiempo de incubación

(días)

1,04

Error

Total

Fuente

Valor

p

Modelo 0,000

Lineal 0,000










(días)

0,420

Error

Total

35


Figura A.2.1.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de azúcares

reductores.

A.2.2 Análisis de varianza para actividad enzimática de lacasas

Fuente GL

Modelo 29

Lineal 7










Error 60

Total 89

Fuente

Valor

F

Modelo 1,68

Lineal 4,61

36











(días)

0,24

Error

Total

Fuente

Valor

p

Modelo 0,046

Lineal 0,000










(días)

0,981

Error

Total

37


Figura A.2.2.1. Gráfica de efectos principales para la actividad enzimática de lacasas

A.2.3 Análisis de varianza para concentración de exopoligalacturonasa

Fuente GL

Modelo 29

Lineal 7










Error 60

Total 89

Fuente

Valor

p

Modelo 0,000

Lineal 0,000


38










(días)

0,773

Error

Total

Figura A.2.3.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de

exopoligalacturonasa.

A.2.4 Análisis de varianza para concentración de exoglucanasa

Fuente GL

Modelo 29

Lineal 7




39








Error 60

Total 89

Fuente

Valor

F

Modelo 5,11

Lineal 17,15










(días)

0,45

Error

Total

Fuente

Valor

p

Modelo 0,000

Lineal 0,000









40



(días)

0,886

Error

Total

Figura A.2.4.1. Gráfica de efectos principales para la concentración de exoglucanasa.

41


Figura A.2.5. Gráficas de optimización para maximizar las variables de respuesta. De

arriba a abajo: azúcares reductores, lacasas, exopoligalacturonasa y exoglucanasa.

estudio de la producciÓn de enzimas …

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