estudio de la frecuencia de polimorfismos asociados …

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA

PROGRAMA INSTITUCIONAL EN BIOMEDICINA MOLECULAR

ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE POLIMORFISMOS ASOCIADOS

CON EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA PREECLAMPSIA

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN

BIOMEDICINA MOLECULAR

PRESENTA:

Q.B.P. María Eugenia Vásquez Molina

DIRECTOR: CO-DIRECTOR:

Dra. María Eugenia Chavarría O. Dr. Guillermo Pérez I.

INDICE

Pagina

RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS

5

RESUMEN

6

ABSTRACT

8

INTRODUCCIÓN 10 • Clasificación de la preeclampsia 10 • Fisiopatología de la preeclampsia 11 • Genes candidatos

14

ANTECEDENTES 15 • Glutation S-transferasa 16 • Epoxido Hidrolasa Microsomal 17 • Oxido Nitrico Sintetasa Endotelial

19

JUSTIFICACIÓN

22

OBJETIVO 23 • Objetivo general 23 • Objetivos específicos

23

MATERIAL Y MÉTODOS 24 • Extracción del DNA 25 • Epoxido Hidrolasa Microsomal 26 • Oxido Nitrico Sintetasa Endotelial 27 • Glutation S-transferasa 29 • Análisis estadístico 29

RESULTADOS 31 • Epoxido Hidrolasa Microsomal 32 • Oxido Nitrico Sintetasa Endotelial 35 • Glutation S-transferasa

38

CONCLUSIONES

40

SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTURO

43

BIBLIOGRAFÍA

44

4

RELACION DE FIGURAS Y TABLAS Figura Pagina

No. 1

Sondas de la prueba de PCR en tiempo real 26

No. 2

Productos de restricción del polimorfismo Glu298Asp del gen NOS3

28

No. 3

Productos PCR del polimorfismo eNOS4b/a del gen NOS3 29

No. 4

Productos PCR del polimorfismo Ile105Val del gen GSTPI-1 30

No. 5

Resultados de PCR en tiempo real de los polimorfismos Tyr113His e His139Arg del gen EPHX

34

No. 6

Gel de los productos de PCR de Glu298Asp del gen NOS3 36

No. 7 Gel de la restricción de los productos de PCR de Glu298Asp del gen NOS3

36

No. 8 Gel de los productos de PCR de eNOS4b/a del gen NOS3

38

No. 9 Gel de los productos de PCR de Ile105Val del gen GSTPI-1

39

No. 10 Gel de la restricción de los productos de PCR de Ile105Val del gen GSTPI-1

39

TABLAS

No. 1

Secuencias de oligonucleótidos y sondas de los polimorfismos Tyr113His e His139Arg del gen EPHX

27

No. 2

Características clínicas maternas y neonatales 31

No. 3

Distribución de Tyr113His e His139Arg del gen EPHX

33

No. 4

Distribución de la de acuerdo a la actividad enzimática de EPHX

35

No. 5

Distribución de Glu298Asp y eNOS4b/a del gen NOS3

37

No. 6

Distribución de Ile105Val del gen GSTPI-1

39

5

RESUMEN ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE POLIMORFISMOS ASOCIADOS CON EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA PREECLAMPSIA. La preeclampsia es una de las enfermedades hipertensivas del embarazo, afecta aproximadamente al 8% de todas las gestaciones y es una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad materna y neonatal. Esta enfermedad multisistémica se caracteriza por incremento en la presión sanguínea (140/90 mmHg o más) y la presencia de proteinuria (300 mg por litro en orina de 24 horas o más), aparece después de la semana 20 de gestación y revierte en el post parto. Son cuatro los factores que se ha propuesto intervienen en el desarrollo de la preeclampsia: isquemia placentaria, inadaptación inmunológica, estrés oxidativo y susceptibilidad genética. La evidencia de la participación de componentes genéticos en la preeclampsia proviene de la observación del incremento en la frecuencia con que se presenta este síndrome en madres, hijas, hermanas y nietas de mujeres que lo presentaron; sin embargo, la forma como se hereda la susceptibilidad aún no se ha definido. La fisiopatología de la preeclampsia sugiere la participación de una disfunción generalizada del endotelio vascular materno y la presencia de enfermedades vasculares como la diabetes y la hipertensión esencial predispone esta patología. Estos antecedentes han permitido proponer a varios genes como candidatos que podrían estar involucrados en la fisiopatología de la preeclampsia. Recientemente ha enfatizado la participación el estrés oxidativo en la fisiopatología de la preeclampsia. Por lo tanto, se evaluó la participación en esta patología de polimorfismos en genes que codifican para proteínas asociadas con este proceso, expresados por las células endoteliales. Objetivo. Determinar la frecuencia con que se presentan polimorfismos en los genes que codifican para las enzimas epóxido hidrolasa microsomal (EPHX), óxido nítrico sintetasa endotelial (NOS3) y glutatión S-transferasa (GSTPI-1) en pacientes derechohabientes del Instituto Mexicano del Seguro Social que cursaron un embarazo normal y con preeclampsia. Evaluar la participación de estas variantes genéticas en el riesgo de desarrollar preeclampsia. Material y Métodos. Se incluyeron en este estudio 230 mujeres primigestas: 110 con diagnóstico de preeclampsia y 120 que cursaron un embarazo normal, pacientes del Hospital de Ginecología y Obstetricia No. 3, Centro Médico Nacional “La Raza” o del Hospital de Ginecología y Obstetricia No. 4 “Luis Castelazo Ayala” del Instituto Mexicano del Seguro Social. En el DNA obtenido de leucocitos se analizaron por medio de PCR los siguientes polimorfismos: Tyr113His del exón 3 e His139Arg del exón 4 del gen de la EPHX; Glu298Asp del exón 7 y eNOS 4b/a del intrón 4 del gen NOS3 y Val105Ile del gen GSTPI-1. El análisis estadístico de los resultados se realizó con el programa SPSS para Windows 9.0. Para evaluar las diferencias entre los grupos se utilizó la prueba t de Student y la prueba de χ2 según el parámetro analizado. Se determinaron las razones de momios y sus intervalos de confianza de 95%, como una estimación del

6

riesgo relativo que representan estos polimorfismos para la presentación de preeclampsia. Se consideró como significativo un valor de p <0.05. Resultados. EPHX. En las mujeres con preeclampsia se encontró una prevalencia significativamente mayor del genotipo rápido Tyr113Tyr113 del exón 3 (81%), al compararlas con los controles (77%) (p = 0.043). Se obtuvo un OR = 1.5 (IC 95% 1.08-1.97), comparando el genotipo Tyr113Tyr113 versus los genotipos His113His113 y Tyr113His113. Cuando se compara la actividad baja de la enzima versus las actividades alta + intermedia, se encontró una diferencia que fue significativa entre las pacientes preeclámpticas y las que cursaron un embarazo normoevolutivo. El OR obtenido fue 1.88 (IC 95% 1.2-3.7; p = 0.04). Se encontró una asociación significativa entre la actividad enzimática predicha y la preeclampsia (p = 0.009), lo que se reflejó en un riesgo mayor de preeclampsia al haber actividades más altas de la enzima. NOS3. La única diferencia significativa encontrada fue la proporción de pacientes con la variante Glu298Asp298, la cual fue más común en el grupo con embarazo normoevolutivo (p = 0.029) (41% en embarazo normal, 25% en las pacientes con preeclampsia). El OR calculado para esta variante fue de 0.73 (IC 95% 0.54-0.98). La variante Asp298Asp298 se presentó con mayor frecuencia en el grupo de las preeclámpticas (5% vs. 2%), sin embargo esta diferencia no fue significativa (p = 0.27). No se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos al comparar el genotipo Glu298Glu298 versus los genotipos Glu298Asp298 y Asp298Asp298 (OR = 1.28, IC 95% 0.95-1.72, p = 0.07), ni al comparar el genotipo Asp298Asp298 versus los genotipos Glu298Asp298 y Glu298Glu298 (OR = 1.68, IC 95% 0.85-3.33, p = 0.06). No se encontraron diferencias significativas en la distribución de la frecuencia con que se presentaron las diferentes variantes del polimorfismo eNOS 4b/a al comparar ambos grupos en estudio. GSTP1A/B. La variante Ile105Val fue la más frecuente en ambos grupos estudiados, pero no hubo diferencia significativa (56% controles, 47% pacientes con preeclampsia; p = 0.43). La variante homocigota mutante Val105Val se presentó con mayor frecuencia en el grupo de las pacientes con preeclampsia. Cuarenta y dos porciento de estas pacientes presentaron esta variante, mientras que en el grupo de las mujeres con embarazo normal la proporción fue de 28% (p = 0.029). Se calculó un OR para esta variante de 1.89 (IC 95% 1.02-3.5). Conclusiones. La asociación entre un riesgo mayor de preeclampsia y la incidencia de los genotipos Tyr113Tyr, His139Arg e His139His podría reflejar un aumento en la activación endotelial en estas pacientes, por el incremento en la síntesis de compuestos reactivos asociados con una mayor actividad de la enzima EPHX. Por el contrario, el alelo Val105 del gen GSTP1 se ha asociado con una limitación en la capacidad de destoxificación de la enzima. Este alelo también se presentó con mayor frecuencia entre las pacientes con preeclampsia, lo que también puede estar asociado con la activación endotelial característico de estas pacientes. No se encontró asociación entre los polimorfismos del gen de la óxido nítrico sintetasa y la preeclampsia, como lo han sugerido otros autores. Los resultados obtenidos en este estudio apoyan el hecho de que la presencia de alguna anomalía en el sistema antioxidante aumenta significativamente el riesgo de la presencia de preeclampsia.

7

ABSTRACT FREQUENCY OF POLYMORPHISMS ASSOCIATED WITH OXIDATIVE STRESS IN PREECLAMPSIA Preeclampsia is a pregnancy hypertensive disease, affects about 8% of all pregnancies, and is one of the most important causes of maternal and neonatal morbidity and mortality. This multisystemic disease is characterized by a rise in blood pressure (140/90 mmHg or more) and proteinuria (300 mg/L in 24 hours urine or more), becomes evident after 20 gestation weeks and reverts after delivery. Four factors have been proposed as participants in the development of preeclampsia: placental ischemia, immunological maladaptation, oxidative stress and genetic susceptibility. Evidence about the role of genetic components in preeclampsia has been obtained from the observation of a rise in the frequency of this syndrome in mothers, daughters, sisters and granddaughters of women with a history of preeclampsia; however, until now it is not clear yet how this susceptibility is inherited. The pathophysiology of preeclampsia suggests the role of a generalized maternal vascular endothelium dysfunction, and the presence of vascular diseases like diabetes or essential hypertension predisposes to this pathology. These antecedents have led to propose various genes as candidates to be involved in preeclampsia pathophysiology. The role of oxidative stress in the pathophysiology of preeclampsia has been recently emphasized. Therefore, we evaluated the role in preeclampsia of polymorphisms in genes that code for endothelial cells expressed proteins related to this pathology. Objective. To determine the frequency of polymorphisms in the genes that code for the enzymes: microsomal epoxide hydrolase (EPHX), endothelial nitric oxide synthase (NOS3), and glutathione S-transferase (GSTPI-1), in patients from the Mexican Institute of Social Security with normal and preeclamptic pregnancies. To evaluate the role of these genetic variants in the risk to develop preeclampsia. Material and Methods. The study group consisted of 230 nulliparous, pregnant women consecutively recruited at the Obstetrics and Gynecology Hospitals Centro Médico Nacional “La Raza" and "Luis Castelazo Ayala" of the Mexican Institute of Social Security, with a diagnosis of preeclampsia (n = 110) or an uncomplicated, normotensive pregnancy (n = 120). Genomic DNA was isolated from the leukocytes packages obtained from each participant and the following polymorphisms were analyzed using PCR: exon 3 Tyr113His and exon 4 His139Arg from the EPHX gene; exon 7 Glu298Asp and intron 4 eNOS 4b/a from the NOS3 gene, and Val105Ile from the GSTPI-1 gene. The statistical analysis was performed with SPSS for Windows 9.0 software. To analyze differences between groups the Students t test and the χ2 test were used, depending on the parameter. Odds ratios and 95% confidence intervals were calculated, as a measure of the relative risk involved with these polymorphisms for the development of preeclampsia. Statistical significance was taken as p <0.05. Results. EPHX. Among women with preeclampsia we found a significantly higher prevalence of the fast phenotype exon 3 Tyr113Tyr113 (81%), comparing with controls (77%) (p = 0.043). An OR = 1.5 (IC 95% 1.08-1.97) was obtained comparing

8

the genotype Tyr113Tyr113 versus His113His113 and Tyr113His113. When we compared the low activity of this enzyme versus the high + intermediate activities, we found a significant difference between the preeclamptic patients and the normal pregnancy group. The OR was 1.88 (IC 95% 1.2-3.7; p = 0.04). We found a significant association between the predicted enzyme activity and preeclampsia (p = 0.009), reflecting a higher risk of preeclampsia with higher enzyme activities. NOS3. The only significant difference found was the proportion of patients showing the Glu298Asp298 variant, which was more common in the normal pregnancy group (p = 0.029) (41% normal pregnancy, 25% preeclamptic patients). The calculated OR for this variant was 0.73 (IC 95% 0.54-0.98). The Asp298Asp298 variant was found more frequently in the preeclamptic group (5% vs. 2%); however, this difference was not significant (p = 0.27). We did not find significant differences between both groups when we compared the Glu298Glu298 genotype versus the Glu298Asp298 and Asp298Asp298 genotypes (OR = 1.28, IC 95% 0.95-1.72, p = 0.07). We did not find significant differences either when we compared the Asp298Asp298 genotype versus the Glu298Asp298 and Glu298Glu298 genotypes (OR = 1.68, IC 95% 0.85-3.33, p = 0.06). Significant differences were not find in the frequency distribution of the different variants of the eNOS 4b/a polymorphism, when we compared both study groups. GSTP1A/B. The Ile105Val variant was the most frequent in both study groups, but we did not find a significant difference (56% controls, 47% preeclampsia patients; p = 0.43). The Val105Val variant was found with more frequency in the preeclamptic patients; 42% of these patients showed it, while in the normal pregnancy group the proportion was 28% (p = 0.029). The calculated OR was 1.89 (IC 95% 1.02-3.5). Conclusions. The association between a higher risk of preeclampsia and the incidence of the Tyr113Tyr, His139Arg and His139His genotypes may reflect a rise in the endothelial activation in these patients, due to the rise in the synthesis of reactive compounds related to a higher activity in the EPHX enzyme. On the other hand, the Val105 allele of the GSTP1 gene has been associated with a limitation in the detoxifying activity of this enzyme. This allele was also found more often among patients with preeclampsia, which can also be associated with the endothelial activation characteristic of these patients. We did not find association between the nitric oxide synthase gene polymorphisms and preeclampsia, as other authors have suggested. The results found in this research support the fact that the presence of any disruption in the antioxidant system significantly raises the risk of preeclampsia development.

9

INTRODUCCION La preeclampsia (PE) es una de las enfermedades hipertensivas del embarazo,

afecta aproximadamente al 8% de todas las gestaciones y es una de las causas más

importantes de morbilidad y mortalidad materna y neonatal 1-4. La PE es también

causa de retardo en el crecimiento fetal, bajo peso al nacer y nacimiento prematuro 2,5. Además, predispone a la mujer a otras complicaciones del embarazo como el

desprendimiento prematuro de la placenta, la insuficiencia renal, la hemorragia

cerebral, la coagulación intravascular diseminada y el colapso circulatorio 1,3-5.

La PE es una enfermedad multisistémica inducida por el embarazo, que se

caracteriza por incremento en la presión sanguínea (140/90 mmHg o más) y la

presencia de proteinuria (300 mg/L en orina de 24 hrs o más) y edema, aparece

habitualmente después de la semana 20 de gestación y revierte en el post parto 4. Es

más frecuente en mujeres primigestas y en los extremos de la edad reproductiva

(menores de 20 y mayores de 35 años). El embarazo gemelar y la enfermedad molar

aumentan el riesgo de presentar esta enfermedad.

En los últimos años se ha observado un aumento de los casos de PE, probablemente

como resultado del incremento en la edad materna (mayores de 35 años) y en los

nacimientos múltiples 1. Otros factores de riesgo son el intervalo inter-genésico, el

consumo de cigarro y el estrés. Existen también factores de riesgo previos a la

gestación, como son los antecedentes familiares de PE, la hipertensión arterial

crónica, la diabetes mellitus, la enfermedad renal, la obesidad y las enfermedades

trombofílicas 6-9. Además, existen factores de riesgo relacionados con la pareja: la

exposición limitada al semen, la inseminación con donación de semen y/o de

ovocitos, el sexo oral y una pareja que en una relación anterior participó en un

embarazo con PE 9-10.

Clasificación de la Preeclampsia. Con el propósito de estandarizar el manejo clínico de la PE, ésta se ha dividido en

leve y severa1:

10

Preeclampsia leve: Paciente embarazada con T.A. de 140/90 mm Hg o más, pero

menos de 160/110 mm Hg; proteinuria de 300 mg por litro o más, pero menos de 2 g,

o su equivalente en tira reactiva.

Preeclampsia severa: Paciente embarazada con T.A. de 160/110 mm Hg o más,

con la paciente en reposo en cama, en dos ocasiones con un mínimo de diferencia

de 6 horas entre uno y otro registro; proteinuria de 2 g o más en orina de 24 horas, o

bien 3+ a 4+ en examen con tira reactiva en una muestra de orina tomada al azar;

oliguria (diuresis de 24 horas menor de 400ml), edema equivalente a ++ o más y/o

trastornos cerebrales o visuales (como alteración de la conciencia, cefalea, fosfenos,

visión borrosa, diplopía), y/o dolor epigástrico o en cuadrante superior derecho del

abdomen (dolor en barra), y/o edema pulmonar, y/o cianosis, y/o función hepática

alterada, y/o trombocitopenia.

Una de las complicaciones de la preeclampsia severa es el denominado “Síndrome

de HELLP (hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count)”. Se caracteriza por

la presencia de uno o más de los síntomas de preeclampsia severa, acompañado de

dolor epigástrico “en barra”, trombocitopenia (número de plaquetas < 100 x 103 /mm),

enzimas hepáticas anormales y hemólisis.

Eclampsia: Se considera como eclampsia cualquier caso con uno o más de los

datos de hipertensión arterial, edema y/o proteinuria, independientemente de las

cifras existentes, en el cual se presenten convulsiones y/o coma1.

FISIOPATOLOGIA La fisiopatología de la PE se divide en dos etapas: alteraciones de la perfusión

placentaria y el síndrome materno 1-3. La PE solamente ocurre en presencia de la

placenta y se ha propuesto que está asociada con una falla en la invasión

trofoblástica, debida a factores mecánicos, bioquímicos y/o inmunológicos. En una

primera fase de esta invasión de los trofoblastos a los vasos maternos, que sucede

11

principalmente en el primer trimestre de gestación, se elimina la estructura muscular

de las arterias y el endotelio de la decidua, mientras el trofoblasto las sustituye. Este

proceso aumenta el diámetro de los vasos y facilita el flujo de sangre hacia la

placenta. En la segunda fase, que inicia ± a las 14 semanas de gestación y termina

en la 20ª semana, la invasión se extiende hasta la porción miometrial, pasando de un

sistema de alta resistencia a uno de baja resistencia, facilitando el intercambio de

nutrientes y gases mejorando el desarrollo fetal 5,11-14.

En la PE la invasión del trofoblasto sobre las arterias espirales es deficiente, dando

como resultado una insuficiencia placentaria, que a su vez favorece el depósito de

fibrina y trombosis que desembocan en ateroesclerosis 5,11,13,15,16. El resultado de

estas fallas son vasos con diámetros con 40% del calibre normal 2,10. Esto a su vez

ocasiona isquemia y una pobre perfusión placentaria en mujeres con eventual

desarrollo de PE.

El síndrome materno, como ya se mencionó, se caracteriza por incremento en la

presión sanguínea y alteración en la función renal; la perfusión disminuye en todos

los órganos, debido al vaso-espasmo causado por diversos agentes vasopresores y

la activación de la cascada de coagulación (plaquetas). El grado de severidad varía

de leve, asociado con hipertensión en la última parte del embarazo, hasta

alteraciones que amenazan la vida como el síndrome de HELLP y la eclampsia1,14.

Los signos y síntomas de esta enfermedad aparecen tardíamente en el embarazo (al

final del segundo y principios del tercer trimestre), aún cuando los mecanismos

fisiopatológicos involucrados parecen iniciarse en edades gestacionales tempranas

(entre 8 y 18 semanas)11-13. Existen numerosos marcadores de activación endotelial,

que se presentan en la circulación de mujeres con PE semanas o meses antes de la

evidencia clínica de la enfermedad. Por esta razón, se han estudiado una serie de

marcadores clínicos, bioquímicos y biofísicos que pudiesen contribuir en la detección

oportuna de la PE, aunque los resultados de estos estudios han sido inconsistentes y

contradictorios, probablemente por la variedad de las poblaciones analizadas y las

12

definiciones de las distintas formas de hipertensión arterial que puede manifestarse

en el embarazo 17-32.

En general son cuatro los factores que se ha propuesto intervienen en el desarrollo

de la PE: isquemia placentaria, inadaptación inmunológica, estrés oxidativo y

susceptibilidad genética. Estas categorías no son mutuamente excluyentes; en

realidad, la etiología de la PE es una combinación de todos los factores 12,14,17,19,33.

La evidencia de la participación de componentes genéticos en la PE proviene de la

observación del incremento en la frecuencia con que se presenta este síndrome en

madres, hijas, hermanas y nietas de mujeres que presentaron PE. De igual forma, el

riesgo de presentar esta enfermedad aumenta en hijas de mujeres con historia de PE

y mujeres producto de un embarazo con esta enfermedad, comparadas con mujeres

provenientes de un embarazo normal 17,34. Otra evidencia es la alta concordancia que

se ha encontrado entre gemelas idénticas comparadas con gemelas no idénticas; no

obstante, también se ha observado un gran número de gemelas idénticas que son

discordantes para el desarrollo de la PE durante sus propios embarazos. Estos casos

permiten suponer la participación del genotipo fetal como un factor importante para la

susceptibilidad a esta enfermedad 35-36. En otras investigaciones se ha encontrado

asociación entre la PE y anormalidades en los cromosomas fetales, con lo que se

apoya la contribución fetal a su etiología 2,35,37. La contribución paterna a la PE es

apoyada por el pequeño aumento, con diferencia estadísticamente significativa, en la

incidencia de hombres nacidos de embarazos con PE que fueron ligados a

embarazos con este síndrome, así como la evidencia de mujeres multigestas que al

cambiar de pareja incrementan el riesgo a presentar PE, especialmente si su nueva

pareja fue padre de un embarazo con PE en otra mujer 38.

Aunque se ha aceptado la participación de los factores genéticos en la etiología de la

PE, la forma cómo se hereda es motivo de un vigoroso debate. Existe la posibilidad

de que el desarrollo de esta patología esté determinado parcialmente por un

polimorfismo paterno silenciado y materno activo que sea expresado por el feto.

13

También se ha señalado la posible existencia de un umbral o susceptibilidad de un

locus, regulado por influencias fetales o ambientales, que defina quién desarrolla la

enfermedad. Otras investigaciones sugieren que la susceptibilidad al fenotipo de la

PE podría heredarse por vía simple (usualmente materna), a través de un gen

autosómico recesivo o un gen dominante con penetrancia incompleta 2,12,19,38.

En resumen, es poco probable que exista un genotipo particular que sea necesario

para que se presente la PE. Basándose en el hecho de que las enfermedades más

comunes del adulto, como la hipertensión, la diabetes mellitus y las neoplasias no se

heredan como factores Mendelianos simples, sino más bien varios loci confieren

“labilidad genética” predisponiendo a los individuos a la enfermedad, puede

proponerse que los “genes de la preeclampsia” actúen, posiblemente asociados con

factores ambientales, como loci de susceptibilidad que disminuyan el umbral de la

mujer y predispongan el desarrollo de esta patología. Por lo tanto, la susceptibilidad a

la PE parece ser una compleja interacción entre dos o más genes maternos, factores

ambientales y el genotipo fetal 17,34-39.

Genes Candidatos

La fisiopatología de la PE sugiere la participación de una disfunción generalizada del

endotelio vascular materno y la presencia de enfermedades vasculares como la

diabetes, la hipertensión esencial y el síndrome antifosfolípidos en las mujeres

embarazadas las predispone a esta patología 1-3,5-7,17,18. Estos antecedentes han

permitido proponer a varios genes como candidatos que podrían estar involucrados

en la fisiopatología de la PE. Los genes relacionados con el control de la presión

sanguínea, con la distribución de los líquidos corporales, con las enfermedades

vasculares, con la regulación de la remodelación vascular y con la regulación del

estrés oxidativo, parecen ser los candidatos más viables 2,39.

Los resultados de estudios de mapeo y pedigrees han sugerido la participación de

genes localizados en los cromosomas 1, 3, 4, 9 y 18 40,41, aunque la naturaleza

multifacética de la PE dificulta la determinación del fenotipo exacto, haciéndose

14

necesario un largo y cuidadoso análisis del fenotipo acorde a la complejidad de la

fisiopatología de esta enfermedad.

Recientemente se ha enfatizado la participación el estrés oxidativo en la

fisiopatología de la PE 17,33,42. Por lo tanto, es necesario evaluar la participación en

esta patología de polimorfismos en genes que codifican para proteínas asociadas

con este proceso, expresados por las células endoteliales 2,12,17,19,40,41.

ANTECEDENTES El estrés oxidativo puede ser definido como un desequilibrio entre la producción de

radicales libres y las fuerzas antioxidantes. Los organismos aeróbicos, que

sobreviven en ambientes ricos en oxígeno, requieren un sistema de defensa efectivo

contra las especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS a determinadas

concentraciones son fisiológicamente benéficas y están involucradas en mecanismos

de señalización. La concentración elevada de ROS, por el contrario, puede contribuir

al desarrollo de varias enfermedades 43.

La teoría del estrés oxidativo en la PE propone que la interacción de neutrófilos

maternos y lípidos susceptibles de oxidación con células placentarias y factores

provenientes de la placenta puede provocar estrés oxidativo, al generarse ROS 33,42,44. Al aumentar la concentración de éstas, rebasan la capacidad de

neutralización, favoreciendo la formación de lípidos peroxidados, por reacción entre

ROS y ácidos grasos no saturados (LDLc). Tanto las especies ROS como los lípidos

peroxidados son tóxicos para las células endoteliales, favoreciendo cambios

adversos en la estructura y función del endotelio vascular materno, alterando la

reactividad vascular y activando la cascada de coagulación. Se activan también

citocinas citotóxicas y proteasas (elastasa) liberadas por la activación de neutrófilos,

que destruyen la integridad de las células endoteliales, membrana vascular y la

matriz subendotelial 42. Una de las características del endotelio activado es la

alteración en el balance entre los agentes vasodilatadores como la prostaciclina y el

óxido nítrico y los vasoconstrictores como el tromboxano, con la consecuente

15

producción de endotelina y una mayor cantidad de moléculas de adhesión 33,42,45. Por

otro lado, el cambio en el metabolismo de los lípidos en mujeres con PE favorece la

acumulación de triglicéridos en las células endoteliales, interfiriendo con la función de

éstas 42,44.

La protección contra ROS y lípidos peroxidados es proveída por varios sistemas de

enzimas, como la superóxido dismutasa (SOD) 46, la glutatión S-transferasa (GSTP) 47-48, la epóxido hidrolasa microsomal (EPHX) 47,48 y la apolipoproteína E (ApoE) 49,50.

La destoxificación no enzimática se lleva a cabo por compuestos como la ferritina 51,

vitaminas C y E 33,52,53, ácido úrico, cisteína y cistina, entre otros 42. Recientemente

se están realizado estudios donde analizan la administración de vitaminas C y E

como antioxidantes, a fin de reducir el riesgo de presentar PE 53,54.

Por su naturaleza multifacética y la posibilidad de que la susceptibilidad a la PE esté

dada por la interacción entre dos o más genes y factores ambientales, se propone

analizar los polimorfismos de los genes GSTP1, EPHX y NOS3 y su asociación con

la PE.

GLUTATION S-TRANSFERASA Esta familia de enzimas participa en el metabolismo y destoxificación de compuestos

citotóxicos y carcinogénicos como son las especies reactivas de oxígeno 47-48. Estas

enzimas catalizan la adición nucleofílica de glutatión a centros electrofílicos de gran

cantidad de substancias. En humanos, las glutatión S-transferasas (GSTs) se dividen

en 4 clases, basadas en la especificidad de sustrato, identificación inmunológica,

proteínas y secuencia del DNA; éstas son: alpha (A), mu (M), pi (P) y theta (T), cada

una con varias isoenzimas con diferentes especificidades de substrato. Los genes

que las codifican se localizan en los cromosomas 6, 1, 11 y 22 respectivamente. La

subfamilia Pi se origina de un solo gen, del cual se han reportado dos variantes de

cDNA, los alelos 1a y 1b que difieren en un solo par de bases (313 [A>G]), lo que

resulta en diferencia de aminoácidos (valina vs isoleucina en el codón 105). Para

GSTPi se ha descrito una isoforma denominada GSTPI-1, que se expresa en

16

muchos órganos entre ellos la placenta. La actividad de esta enzima muestra una

gran variabilidad con importancia clínica, por lo que se ha utilizado como marcador 55.

Un grupo de investigadores en Holanda ha estudiado este polimorfismo y su

asociación con la PE. En un trabajo inicial midieron las concentraciones de glutatión

(GSH) y la actividad de varias GSTs en decidua y placenta de mujeres embarazadas

normales y con PE, encontrando que la concentración de GSH fue significativamente

más elevada en embarazos con PE 56. En otro trabajo analizaron placentas y decidua

de embarazos normales y con PE, en donde midieron la actividad de varias

isoenzimas de GST. En los resultados encontraron que la actividad de la isoforma

GSTPi disminuye en placentas con PE, lo que indica un decremento en la actividad

enzimática y por tanto menor capacidad de destoxificación 57. Posteriormente

analizaron los polimorfismos de GSTPl-1 y P450 IAI (citocromo P450) en el DNA

proveniente de leucocitos que a su vez se extrajeron de pacientes con embarazos

normales, con PE y HELLP, encontrando como resultado que el genotipo P1b-1b

(Val105-Val105) de GSTPI-1 se presentó significativamente con más frecuencia en

pacientes con PE. Este genotipo provoca una disminución en la capacidad de

destoxificación, lo que sugiere una alta susceptibilidad a la PE 58. El último reporte de

este grupo con relación a estas enzimas y los genes que las expresan incluyó tríos

(madre, padre e hijo) involucrados en embarazos que cursaron con PE y analizan el

polimorfismo Val105Ile de GSTPI-1, encontrando que la mutación Val105-Val105 fue

significativamente más frecuente en madres, padres e hijos relacionados con los

embarazos que cursaron con PE comparados con el grupo control. Estos resultados

sugieren que tanto la madre como el feto pueden contribuir al riesgo para PE; la

contribución del feto es determinada por los genes paternos, por lo que la PE puede

ser hereditaria 59.

EPOXIDO HIDROLASA MICROSOMAL (EPHX) Esta enzima se ha purificado a partir de varias especies y tipos de tejidos, mostrando

especificidad para sustratos como los hidrocarburos policíclicos aromáticos,

diferentes epóxidos y óxidos. Además tiene una participación importante en el

17

mecanismo de protección contra el estrés oxidativo a través del metabolismo de

intermediarios de epóxidos altamente reactivos 47-48.

El gen humano de la EPHX se localiza en el cromosoma 1 y se han detectado dos

alelos mutantes, uno en el exón 3 (Tyr113His) y otro en el exón 4 (His139Arg), cuya

mutación se ha asociado con un decremento del 50% y un aumento de 25% en la

actividad de la enzima EPHX respectivamente 60. De acuerdo al reporte de Hassett y

col, las mutaciones consisten en lo siguiente: en el exón 3 la sustitución de T por C,

con el cambio consiguiente de una Tirosina por Histidina en la posición 113, que

corresponde al alelo lento; en el exón 4 el cambio es A por G, resultando en la

sustitución de Histidina por Arginina en la posición 139, denominado alelo rápido. De

acuerdo a estos autores, los sujetos con baja actividad de esta enzima fueron

homocigotos para His113 o heterocigotos para His113 en combinación con

homocigotos para His139; los sujetos con actividad intermedia de la enzima fueron

homocigotos ó heterocigotos para Tyr113 e His139; por último, los sujetos con alta

actividad en la enzima fueron homocigotos para Arg139 o heterocigotos para Arg139

en combinación con homocigoto para Tyr113 61.

La variación en la actividad de la enzima EPHX podría alterar la susceptibilidad para

presentar PE. Buscando esta asociación, Zusterzeel y col, realizaron un estudio

donde incluyeron a 96 mujeres con historia de PE, 87 con historia de HELLP y 151

mujeres no embarazadas sanas. De todas ellas obtuvieron DNA proveniente de

leucocitos a fin analizar los polimorfismos del exón 3 y del exón 4 del gen EPHX.

Ellos encontraron diferencias significativas únicamente para el genotipo

Tyr113Tyr113 del exón 3, una frecuencia de 28% en el grupo con historia de PE, en

comparación con el grupo sin complicaciones que fue de 16% (p<0.01). No

encontraron diferencias para el polimorfismo His139Arg entre ambos grupos, pero

reportaron una asociación significativa entre la actividad de EPHX y la PE. Con estos

resultados concluyen que mujeres con alta actividad en el genotipo del exón 3 tienen

un aumento en la susceptibilidad a la PE, debido a la formación de compuestos

intermediarios tóxicos 62.

18

En otro estudio realizado por Laasanen y col, se analizaron los mismos

polimorfismos de los exones 3 y 4 del gen EPHX y su contribución a la

susceptibilidad para PE. Incluyeron a 133 embarazadas con PE y 115 embarazadas

sin complicaciones. En sus resultados únicamente encontraron diferencias

significativas en el haplotipo T-A (Tyr113-His139), que fue significativamente más

frecuente en el grupo de embarazos con PE comparado con el grupo control

(p=0.01), concluyendo que el haplotipo T-A de alta actividad se asocia con PE 63.

OXIDO NITRITICO SINTETASA El óxido nítrico (NO) tiene una participación importante en el control de la presión

arterial y es sintetizado por una familia de enzimas denominadas óxido nítrico

sintetasas (NOS), que a su vez son expresadas por una familia de genes

estructuralmente semejantes 64. La nomenclatura para estos genes se ha asignado

de acuerdo al tipo de células que lo expresa: nNOS purificada originalmente de

tejidos neuronales; iNOS obtenida inicialmente de macrófagos inmunoactivos; eNOS

que fue aislada del endotelio vascular. Los genes que codifican nNOS, iNOS y eNOS

también se denominan NOS1, NOS2 Y NOS3 respectivamente. Específicamente el

gen NOS3 es el que se ha asociado con la susceptibilidad a la PE, aunque son

pocos los estudios que se han realizado buscando dicha asociación 65.

La enzima NOS3 en condiciones normales genera NO continuamente, con difusión al

músculo liso principalmente, incrementando la producción de GMPc que media la

vasodilatación; además el NO es inhibidor de la activación de plaquetas y neutrófilos,

no permitiendo su acumulación en los vasos sanguíneos 66. El NO también se

encuentra involucrado en adaptaciones fisiológicas del embarazo que son cruciales,

como el incremento en la circulación sanguínea del útero y la unidad feto-placenta, la

inalterabilidad del útero entes del parto y la vasodilatación de la circulación sistémica

materna 66,67. Por lo tanto, se ha propuesto que la reducción en la biosíntesis de NO

favorece la presentación de PE y que el gen de eNOS es un candidato para

susceptibilidad a PE y eclampsia 2,19. De hecho, se ha observado en mujeres con PE

19

una reducción en la biosíntesis de NO, posiblemente provocada por deficiencia en la

enzima NOS3 65,66.

Bartha y col midieron la concentración de NO y su síntesis en suero materno. Los

resultados mostraron que las mujeres con PE tenían concentraciones

significativamente más elevadas de NO, mientras que las embarazadas con

hipertensión crónica mostraron niveles significativamente más bajos y las mujeres

con hipertensión gestacional presentaron concentraciones de NO semejantes al

grupo control 68. Por otro lado, Anumba y col, investigaron la participación del NO en

los cambios de la resistencia vascular en 20 primigestas normales, 15 primigestas

con PE y 20 mujeres no embarazadas. Concluyen que los cambios en la actividad

vascular del NO no tienen una participación importante en el incremento del tono

vascular en embarazos con PE 69.

La PE es una enfermedad vascular del embarazo probablemente causada por un

desequilibrio entre agentes vasodilatadores y vasoconstrictores, que tiene como

resultado un vasoespasmo generalizado y una perfusión deficiente en varios

órganos. Con esta visión, Napolitano y col, midieron la expresión placentaria de

endotelina-1 (ET-1) que es vasoconstrictor y de NO que es vasodilatador. El objetivo

del estudio fue valorar la interacción entre ET1 y NO en la unidad feto-placenta y con

este fin utilizaron cultivos de trofoblasto obtenidos de placentas de embarazos

normales y con PE, donde midieron la expresión del mRNA de ET-1 y NOS.

Concluyen que en los casos de PE la expresión de ET-1 aumenta, mientras que la

expresión de NOS disminuye 70.

Arngrimsson y col, investigaron la participación del gen NOS3 en el desarrollo de

hipertensión en el embarazo y la herencia familiar, a través del análisis de asociación

de genes entre hermanas afectadas en varias familias (n=50). Los resultados

sugirieron que el locus con susceptibilidad familiar a la hipertensión inducida por el

embarazo se localiza en la región 7q36 que codifica el gen NOS3 71.

20

Guo y col, realizaron un análisis de asociación de genes para el gen NOS3 en

familias australianas de diferentes etnias y con historia de PE y eclampsia, utilizando

25 microsatélites del cromosoma 7. Sus resultados no mostraron asociación entre los

marcadores del NOS3, aunque la frecuencia por etnias fue significativamente

diferente 72.

Los polimorfismos del gen NOS3 que se han asociado con alteración del tono

vascular e hipertensión arterial esencial son Glu298Asp en el exón 7 y otro en el

intrón 4 con número variable de repeticiones (eNOS4b/4a) 73-75. Estos polimorfismos

también se han asociado con el desarrollo de PE.

Savvidou y col investigaron el efecto del polimorfismo Glu298Asp del gen NOS3 en la

vasodilatación del endometrio en la parte temprana del embarazo, encontrando que

este polimorfismo se asocia con las diferencias en la adaptación vascular a las 12

semanas de gestación. Estos autores mencionan que sus resultados indican un

mecanismo potencial de enlace entre el polimorfismo Glu298Asp del gen NOS3 y el

desarrollo de desórdenes cardiovasculares y que tiene implicaciones para la

comprensión de las bases genéticas de la PE 76. Kobashi y col, analizaron el mismo

polimorfismo en 152 embarazadas con hipertensión gestacional y 335 embarazadas

normales. La frecuencia de la variante GA+AA NOS3 fue significativamente más alta

en los embarazos con hipertensión gestacional (0.23), en comparación con los

controles (0.12) (p<0.01) 77.

Por otra parte, Bashford y col se dieron a la tarea de investigar la asociación entre el

polimorfismo eNOS4b/4a y la PE. Para esto obtuvieron DNA de 87 embarazadas con

PE y 53 embarazadas sin complicaciones como controles; el alelo NOS3-A fue

significativamente más frecuente en las pacientes con PE, comparado con los

controles, por lo que concluyen que este polimorfismo se asocia con presión

sanguínea alta en la edad gestacional temprana 78.

21

JUSTIFICACION La identificación de los factores de riesgo genético en una población con alto riesgo

a la PE puede aportar información de este importante problema de salud pública y

proveer herramientas para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad. Es

importante medir la interacción genotipo-genotipo en una población y la inclusión de

varios genes candidatos, ya que se ha mencionado que la PE es una enfermedad

multifactorial donde existe la participación de varios genes. El estrés oxidativo juega

un papel importante en el inicio de los eventos que desencadenan la manifestación

clínica de la PE, por lo que resulta valioso analizar la participación de los genes

EPHX, GSTP, NOS3 y su posible asociación con PE.

La importancia de este estudio radica principalmente en que los reportes en la

literatura acerca de la presencia de polimorfismos genéticos en pacientes con PE se

han limitado básicamente al estudio de poblaciones altamente endogámicas, como

son los Mormones de Utah en los Estados Unidos, los Islandeses y los Israelitas.

También se han realizado estudios en mujeres europeas de origen caucásico

(Suecia, Escocia, Holanda, Hungría), Australianas (de origen Británico) y asiáticas

(Japón y China), pero son muy escasos los reportes de estudios realizados en

población de origen latino en Europa o Latinoamérica. Además, los resultados

obtenidos hasta ahora han indicado variaciones en la frecuencia de estos

polimorfismos, aún entre poblaciones descritas como “Caucásicas”, lo que sugiere la

posibilidad de diferencias étnicas crípticas y marcada variabilidad entre poblaciones.

Con este estudio realizado en mujeres Mexicanas, derechohabientes del IMSS en el

DF, con y sin PE, se contribuye a elucidar el papel que guarda el componente

cromosómico en la etiopatogenia de esta enfermedad en nuestra población.

La utilidad de la predicción del riesgo de desarrollar una enfermedad depende de que

ésta permita la reducción del riesgo final de esta patología. No obstante que por el

momento no existe profilaxis validada para la PE, la identificación de polimorfismos

como factores de riesgo para la PE en nuestra población facilitará la identificación de

22

las mujeres susceptibles de un seguimiento más acucioso para evitar la presentación

de complicaciones, las cuales al final son las responsables de la mortalidad materna

asociada a la PE.

HIPÓTESIS Las mujeres con preeclampsia presentan una mayor frecuencia de polimorfismos en

los genes de la EPHX, de la NOS3 y/o de la GSTPI-1 que las pacientes involucradas

en un embarazo sin complicaciones.

OBJETIVO GENERAL Determinar la frecuencia con que se presentan polimorfismos en los genes EPHX,

NOS3 Y GSTPI-1 en pacientes derechohabientes del Instituto Mexicano del Seguro

Social que cursaron un embarazo normal y con preeclampsia.

OBJETIVOS PARTICULARES 1. Determinar la frecuencia del polimorfismo Val105Ile del gen GSTPI-1, en

pacientes que cursaron con embarazo normal y con PE.

2. Determinar la frecuencia de los polimorfismos Tyr113His en el exón 3 y

His139Arg en el exón 4 del gen EPHX, en pacientes que cursaron con embarazo

normal y con PE.

3. Determinar la frecuencia de los polimorfismos Glu298Asp en el exón 7 y

eNOS4b/a en el intrón 4 del gen NOS3, en pacientes que cursaron con embarazo

normal y con PE.

4. Contrastar los resultados de las pacientes con PE con los obtenidos en mujeres

que hayan cursado con un embarazo normoevolutivo

5. Determinar las razones de momios y sus intervalos de confianza de 95%, como

una estimación del riesgo relativo que representan estos polimorfismos para la

presentación de la PE.

23

MATERIAL Y MÉTODOS Se invitó a participar en el estudio a mujeres embarazadas primigestas y de ahí se

formaron dos grupos: 110 que cursaron con PE durante el embarazo y 120 que

tuvieron un embarazo sin complicaciones. Todas las participantes eran pacientes del

Hospital de Ginecología y Obstetricia No. 3, Centro Médico Nacional “La Raza” o del

Hospital de Ginecología y Obstetricia No. 4 “Luis Castelazo Ayala” del Instituto

Mexicano del Seguro Social en la Ciudad de México.

El diagnóstico clínico de PE se estableció de acuerdo con la Norma Técnico Médica

Para la Prevención y Manejo de la Preeclampsia-Eclampsia del IMSS79, cuando una

mujer embarazada sin antecedentes de hipertensión presentó un aumento sostenido

en las cifras de presión arterial (igual o mayor a 140/90 mmHg) y proteinuria de 300

mg por litro o más en orina de 24 horas, ó 30 mg/dL en muestras de orina aislada, o

su equivalente en tira reactiva. El embarazo normal o sin complicaciones se definió

como un embarazo único en una mujer normotensa, que permaneció en esta

condición durante el embarazo, sin proteinuria y dio a luz después de las 37

semanas de gestación a un neonato sano con un peso adecuado para su edad

gestacional 80. Ninguna de las participantes tenía antecedentes o evidencias de

hipertensión arterial, diabetes mellitus, enfermedades renales, hepáticas,

hematológicas, inmunológicas o cardiovasculares.

A todas las pacientes se les solicitó su aceptación por escrito para participar en el

estudio. El protocolo fue aceptado por los comités de investigación de ambos

hospitales de ginecología y obstetricia.

A todas las participantes se les extrajo 10 ml de sangre periférica en un tubo con

EDTA 0.5M. Después de centrifugar las muestras, los leucocitos se recuperaron de

la interfase, se lavaron con solución BLGR (para eliminar los eritrocitos) y se

guardaron a -20ºC.

24

Extracción de DNA.

El DNA se extrajo como se describe a continuación y se guardó a -20ºC hasta su

análisis.

- Resuspender el paquete de leucocitos en solución BLGB (para lisar las

células)

- Incubar 5 min a temperatura ambiente.

- Centrifugar a 1,500 rpm por 15 min.

- Resuspender la pastilla precipitada en 180 µl de NaCl 5 mM.

- Agregar 90 µl de solución de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 10% y agitar

hasta obtener un aspecto viscoso.


- Agregar 616 µl de solución saturada de NaCl.


- Centrifugar a 1,500 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante.

- Al sobrenadante se añade nuevamente solución saturada de NaCl.


- Centrifugar a 1,500 rpm por 15 min.

- Recuperar el sobrenadante y precipitar con dos volúmenes de etanol absoluto


- Lavar el precipitado 2-3 veces con etanol al 70%.

- Centrifugar a 1,500 rpm por 5 min. Descartar el sobrenadante.

- Resuspender la pastilla precipitada con agua inyectable.

- Determinar su pureza y concentración por espectrofotometría.

Solución BLGR Solución BLGR

Tris base 13 mM Tris-HCl 10 mM pH 7.6

MgCl2 4.8 mM EDTA 10 mM pH 8.0

NaCl 9.9 mM NaCl 50 mM

pH 7.0 SDS 0.2 %

pH 7.0

25

EPOXIDO HIDROLASA MICROSOMAL.

Para la determinación de los polimorfismos Tyr113His del exón 3 e His139Arg del

exón 4 del gen de la EPHX, se utilizó la técnica de PCR en tiempo real. Esta prueba

permite medir en cada ciclo la cantidad de productos de PCR, así como permite

también realizar una discriminación alélica. En esta prueba se utilizan 2 sondas de

hidrólisis (oligonucleótidos marcados con un fluorocromo); una que corresponde a la

secuencia silvestre (VIC) y la otra que corresponde a la secuencia mutante (FAM).

Durante la amplificación del DNA la sonda se híbrida con su cadena complementaria,

emitiendo fluorescencia (figura 1).

En la tabla 1 se muestran tanto los oligonucleótidos como las sondas marcadas con

fluorescencia utilizadas para la determinación de los polimorfismos antes

mencionados. La mezcla de reacción se preparó en un volumen de 5 µl, con 2.5 µl de

enzima Taq-man, 0.25 µl de la sonda marcada con fluorescencia, 1 µl de DNA con

una concentración de 20 ng y 1.25 µl de H2O inyectable. La mezcla de reacción se

colocó en un termociclador ABI Prism 7000 de Applied Biosystems, con un ciclo

inicial de 10 min a 95ºC y 40 ciclos de 15 seg a 92ºC y 1 minuto a 60ºC. El programa

cuenta con un paquete que muestra los resultados en gráficas, donde se aprecia si

hay homocigotos o hetecigotos, así como una gráfica de discriminación alelica.

Figura 1. La prueba de PCR en tiempo real utiliza sondas marcadas con fluorescencia, que se unen a su secuencia blanco complementaria, en ese momento se emite la fluorescencia.

26

Tabla 1 Oligonucleótidos

Tyr113His (EPHX1) His139Arg (EPHX2)

sentido 5´GGGCTGGACATCCACTTCATC-3´

5´TGGAAGAAGCAGGTGGAGATTC-3´

antisentido 5ĆAGCCGTGCACCATCAG-3´ 5´GCGTTTTGCAAACATACCTTCAATC-3´

Sondas

VIC 5ĆAGGCCATACCCCG-3´

5ÁAGTGAGGGTATCTGTTG-3´

FAM 5ĆAGGCCGTACCCCG-3´

5´TGAGGGTGTCTGTTG-3´

Muestra las secuencias tanto de los oligonucleótidos como de las sondas usadas para la determinación de los polimorfismos Tyr113His del exón 3 e His139Arg del exón 4 del gen de la EPHX, mediante la técnica de PCR en tiempo real. OXIDO NITRICO SINTETASA ENDOTELIAL. Polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3.

La prueba de PCR para este polimorfismo se preparó con una mezcla de reacción

que incluyó 1.2 µl de Taq polimerasa, 0.5 µl de dNTPs 10 mM, 1.5 µl de MgCl2

25Mm, 2.5 µl de Buffer 10X, 1.0 µl de cada oligonucleótido, 200 ng de DNA y 17.3 µl

de H2O inyectable, para un volumen final de 25 µl. La mezcla se colocó en un

termociclador, con una desnaturalización inicial a 95ºC por 5 minutos, 33 ciclos de 30

segundos a 94ºC, 30 seg a 60ºC y 30 seg a 72ºC. Los oligonucleótidos utilizados

son: sentido 5’CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC 3’ y antisentido 5’AGT CAA TCC

CTT TGG TGG TCA C 3’. Los productos de PCR de 206 pb se identificaron en un gel

de agarosa al 2%, que corrió a 100 volts por 20 minutos. Para la identificación del

polimorfismo, los productos de PCR se digirieron utilizando las enzimas de restricción

Ban II y Mbo I, incubando por 16 horas a 37ºC. La enzima de restricción Ban II corta

en la secuencia Glu298 (silvestre), mientras que Mbo I corta en la secuencia con

Asp298 (mutante). Los productos de la restricción se corrieron en un gel de agarosa

27

al 2.5%, a 90 volts por 30 minutos. En la figura 2 se muestran los productos de

restricción homocigotos y heterocigoto.

Figura 2. Diagrama que muestra como corren en el gel de agarosa los productos de la restricción para el polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3. Polimorfismo eNOS 4b/a del intrón 4 del gen NOS3.

En este caso la prueba de PCR se preparó con 0.2 µl de Taq polimerasa, 2.5 µl de

buffer 10X, 0.5 µl de dNTPs 10 mM, 1.5 µl de MgCl2 25mM, 0.5 µl de cada

oligonucleótido, 200 ng de DNA y 17.3 µl de H2O inyectable, para un volumen total

de reacción de 25 µl. La desnaturalización inicial se llevó a cabo a 95ºC por 5

minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 56ºC por 1 minuto y 72ºC por 2

minutos. La extensión final fue a 72ºC por 5 minutos. Los oligonucleótidos utilizados

son: sentido 5´AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT 3’ y antisentido 5’ TCT CTT AGT

GCT GTG GTC AC3’. Para observar los productos de PCR se utilizó un gel de

agarosa al 1.5% que se corrió a 80 volts por 30 minutos. Los productos de 420 pb

equivalen a 5 repeticiones de 27 pb y corresponden al alelo silvestre, mientras que el

alelo mutante produce fragmentos de 393 pb, equivalentes a 4 repeticiones de 27 pb,

como lo muestra la figura 3.

28

Figura 3. Productos de PCR del polimorfismo eNOS 4b/a del intrón 4 del gen NOS3. El alelo silvestre corresponde a 420 pb y el alelo mutante a 393 pb. GLUTATION S-TRANSFERASA (GSTP1A/B) En la prueba de PCR para el polimorfismo Val105Ile del gen GSTPI-1 se utilizó 1 U

de Taq polimerasa, 1.5 µl de MgCl2 (25mM), 200 ng de Oligonucleótidos (10 mM) c/u,

1.0 µl de DNA (concentración 200 ng), en un volumen de reacción de 40.0 µl. La

mezcla se colocó en un termocilador y se programó una desnaturalización inicial de 5

min a 95oC, seguida de 35 ciclos: 30 seg a 94oC, 30 seg a 55oC y 30 seg a 72oC, con

una extensión final de 5 min a 72oC. Las secuencias de los oligonucleótidos

utilizados son: P15F 5‘ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA 3’ y P105R 5’TGA GGG

CAC AAG AAG CCC CT 3’. El tamaño de los productos de PCR fue de 176 pb. Para

el análisis de restricción se utilizaron 20 µl de los productos de PCR y 5U de la

enzima Alw261 en un volumen de 25µl, los cuales se corrieron en un gel de agarosa

al 3.5%. Los productos de la restricción son de tres tamaños, uno de 176 pb que

corresponde al alelo silvestre y que no es cortado por la enzima Alw261. El alelo

mutante se divide en dos fragmentos (91 y 85 pb). En la figura 4 se muestran los

fragmentos de la restricción para este polimorfismo.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

El análisis descriptivo se realizó calculando promedios, proporciones y desviaciones

estándar. Para evaluar las diferencias entre los grupos se utilizó la prueba t de

Student y la prueba de χ2 según el parámetro analizado. Se determinaron las

razones de momios y sus intervalos de confianza de 95%, como una estimación del

riesgo relativo que representan estos polimorfismos para la presentación de la PE.

29

Todos los análisis se realizaron utilizando el programa SPSS para Windows versión

9.0 y se consideró como significativo un valor de p <0.05.

Figura 4. Los productos de PCR para el polimorfismo Ile105Val del gen GSTPI-1 son de 176 pb. Como resultado de la restricción, el alelo silvestre permanece de 176 pb. El alelo mutante produce dos fragmentos (91 y 85 pb)

30

RESULTADOS Las características generales de la población incluida en este estudio se presentan

en la Tabla 2. No se encontraron diferencias significativas en la edad promedio entre

los casos y los controles. Los pesos de los recién nacidos y la edad gestacional al

nacimiento fueron significativamente menores en las pacientes con PE que en las

pacientes control. Como era de esperarse debido a los criterios para definir ambos

grupos, las presiones sanguíneas fueron significativamente mayores en el grupo con

PE con relación a las mujeres con embarazo normoevolutivo.

TABLA 2

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS MATERNAS Y NEONATALES

Embarazo Normal (n = 120)

Preeclampsia (n = 110)

Edad materna (años) 24.3 ± 4.7 25.6 ± 5.4

Indice de masa corporal 23.4 ± 3.1 24.7 ± 3.7

Tabaquismo (%) 23 27

Edad gestacional al nacimiento (semanas) 39.6 ± 1.2 37.2 ± 2.9*

Nacimiento por cesárea (%) 41 77 *

Peso neonatal (g) 3245 ± 414 2856 ± 700*

Presión sanguínea máxima (sistólica) (mmHg) 113 ± 9 163 ± 16*

Presión sanguínea máxima (diastólica) (mmHg) 73 ± 7 110 ± 11*

Presión sanguínea media máxima 86.0 ± 6.6 127.9 ± 11.2*

Los datos representan promedio ± DE y se analizaron por medio de χ2 (porcentajes) o

prueba t de Student

*p <0.05 vs. controles

31

- EPOXIDO HIDROLASA MICROSOMAL El análisis de PCR en tiempo real proporciona los resultados en gráficas, de acuerdo

al tipo y cantidad de fluorescencia emitida. En la figura 5 se presentan graficas

características de los polimorfismos Tyr113His del exón 3 e His139Arg del exón 4 del

gen de la EPHX .

La distribución entre las pacientes con PE y las pacientes control de las variantes

polimórficas en el exón 3 y el exón 4 del gen EPHX se muestra en la Tabla 3.

En el grupo control, el alelo que codifica para 113Tyr en el exón 3, fue más común

que el alelo que codifica para 113His. Noventa y una (77%) de las pacientes control

fueron homocigotas para la variante Tyr113Tyr113 y veintiséis (22%) fueron

heterocigotas (Tyr113His113). En las mujeres con PE se encontró una prevalencia

significativamente mayor del genotipo rápido Tyr113Tyr113 del exón 3 (81%), al

compararlas con los controles (77%) (p = 0.043). Se obtuvo un OR = 1.5 (IC 95%

1.08-1.97), comparando el genotipo Tyr113Tyr113 versus los genotipos

His113His113 y Tyr113His113. No hubo diferencias significativas en los

polimorfismos del exón 3 entre las mujeres preeclámpticas con (n = 51) o sin (n = 60)

retardo en el crecimiento intrauterino (definido como el peso al nacimiento por debajo

de la décima percentila según la edad gestacional).

Veinticinco mujeres control (21%) fueron homocigotas para el polimorfismo del exón

4 (Arg139Arg139) y 41% fue heterocigota (His139Arg139). En el grupo de las

pacientes preeclámpticas estos valores fueron 11% y 56%, respectivamente. Estos

datos dieron como resultado un OR no significativo de 2.2 (IC 95% 0.7-7.4, p = 0.20),

comparando el genotipo Arg139Arg139 versus los genotipos His139Arg139 e

His139His139.

No se encontraron diferencias en las frecuencias alélicas tanto para el exón 3 como

para el exón 4, entre los casos y los controles (χ2 = 1.90, p = 0.17 para el exón 3; χ2

= 2.88, p = 0.10 para el exón 4, respectivamente).

32

La distribución de las participantes con probables actividades alta, intermedia y baja

de la enzima EPHX se presenta en la Tabla 4. Cuando se compara la actividad baja

de la enzima versus las actividades alta + intermedia, se encontró una diferencia que

fue significativa entre las pacientes preeclámpticas y las que cursaron un embarazo

normoevolutivo. El OR obtenido de esta comparación fue 1.88 (IC 95% 1.2-3.7; p =

0.04). Se encontró una asociación significativa entre la actividad enzimática predicha

y la PE (p = 0.009), lo que se reflejó en un riesgo mayor de preeclampsia al haber

actividades más altas de la enzima.

TABLA 3 DISTRIBUCIÓN DE POLIMORFISMOS DEL GEN DE LA EPHX

Gen Variante Código Embarazo Normal Preeclampsia

Exón 3 Tyr113 Tyr113 1 77% 81%*

Tyr113 His113 2 22% 18%

His113 His113 3 0.8% 1%

Exón 4 His139 His139 1 38% 33%

His139-Arg139 2 41% 56%*

Arg139 Arg139 3 21% 11%*

Los datos fueron analizados con la prueba χ2


EPHX = epóxido hidrolasa; Tyr = tirosina; His = histidina; Arg = arginina

1 = homocigoto alelo silvestre; 2 = heterocigoto; 3 = homocigoto alelo mutado

33

A

B

C

D

Figura 5. Resultados de la prueba PCR en tiempo real de los polimorfismos Tyr113His del exón 3 e His139Arg del exón 4 del gen de la EPHX. Las figuras A y B muestran los homocigotos silvestre y mutante respectivamente, en la figura C tenemos un heterocigoto; por último la figura D muestra la tabla de discriminación alélica donde los homocigotos se encuentran en los extremos, mientras los heterocigotos están en la parte central.

34

TABLA 4 DISTRIBUCIÓN DE LA ACTIVIDAD PREDICHA DE LA EPHX

ACTIVIDAD (código)

EMBARAZO NORMAL(%)

PREECLAMPSIA (%)

Exón 3 Exón 43

BAJA

2 1 11.9 4.6

Exón 3 Exón 41 1

INTERMEDIA

2 2 34.7 39.2

Exón 3 Exón 4 3

ALTA

1 2 53.4 56.1

INTERMEDIA + ALTA

88.1 95.3*




- ÓXIDO NÍTRICO SINTETASA ENDOTELIAL Polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3

En las figuras 6 y 7 se pueden apreciar los geles de los productos de PCR y de la

restricción del polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3.

Los resultados de la distribución de las variantes de este polimorfismo entre las

pacientes con PE y las pacientes control se presentan en la Tabla 5. La única

diferencia significativa encontrada fue la proporción de pacientes con la variante

heterocigota Glu298Asp298, la cual fue más común en el grupo control con

embarazo normoevolutivo (p = 0.029). Cuarenta y uno porciento de las mujeres con

embarazo normal presentaron esta variante, mientras que en el grupo de las

pacientes con preeclampsia la proporción fue de 25%. El OR calculado para esta

variante fue de 0.73 (IC 95% 0.54-0.98). La variante Glu298Asp298 fue la que se

35

presentó con mayor frecuencia en ambos grupos (57% en los controles, 70% en las

pacientes con PE). La variante Asp298Asp298 se presentó con mayor frecuencia en

el grupo de las pacientes preeclámpticas (5% vs. 2%), sin embargo esta diferencia

no fue significativa (p = 0.27). No se encontraron diferencias significativas entre

ambos grupos al comparar el genotipo Glu298Glu298 versus los genotipos

Glu298Asp298 y Asp298Asp298 (OR = 1.28, IC 95% 0.95-1.72, p = 0.07), ni al

comparar el genotipo Asp298Asp298 versus los genotipos Glu298Asp298 y

Glu298Glu298 (OR = 1.68, IC 95% 0.85-3.33, p = 0.06).

Figura 6. Productos de PCR de 206 pb del polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3. en el primer carril corresponde al marcador de tamaño molecular, las siguientes 4 bandas corresponden a los productos de PCR y el último carril al control. 1 2 3 MA B M B M B M

Figura 7. Restricción con Ban II (B) y Mbo I (M) de los productos de PCR del polimorfismo Glu298Asp del exón 7 del gen NOS3, el pozo MA corresponde al marcador de tamaño molecular, las primeras dos bandas corresponden a la muestra 1 que es homocigoto Asp 298 (mutante), las bandas 3 y 4 corresponden a la muestra 2 que es homocigoto Glu298 (silvestre), por último las bandas 5 y 6 que son de la muestra 3 es heterocigoto Glu298Asp.

36

Polimorfismo eNOS 4b/a del intrón 4 del gen NOS3.

En la figura 8 se muestra un gel de los productos de PCR del polimorfismo eNOS

b/a del intrón 4 del gen NOS3.

que se presentaron las diferentes variantes al comparar ambos

rupos en estudio.

ABLA 5

ISTRIBUCIÓN DE POLIMORFISMOS DEL GEN DE LA NOS3

Gen Variante Código Embarazo Normal Preeclampsia

4


pacientes con PE y las pacientes control se presentan en la Tabla 5. La variante 4b-

4b fue la más frecuente en ambos grupos estudiados (89% en los controles, 87 % en

las pacientes con PE). No se encontraron diferencias significativas en la distribución

de la frecuencia con

g

T D

Glu298Asp Glu298Glu298 1 56.7% 70%

Glu298Asp298 2 41.1% 25%*

Asp298Asp298 3 2.2% 5%

eNOS4b/a 4b-4b 1 89% 87%

4b-4a 2 10% 12%

4a-4a 3 1% 1%


= homocigoto alelo silvestre; 2 = heterocigoto; 3 = homocigoto alelo mutado


ENOS3 = Oxido Nítrico Sintetasa Endotelial

1

37

MA S S H H C M

MA marcador de peso molecular

(4b)

oto mutante (4a) C Control

orfismo eNOS 4b/a en número variable de repeticiones de p

• Alelo mutante 4a, de 393 pb que equivale a 4 repeticiones de 27 pb.

GLUTATIÓN S-TRANSFERASA (GSTP1A/B)

figura 9,

ientras la figura 10 muestra la restricción para este mismo polimorfismo.

e 28% (p = 0.029). Se calculó un OR para esta variante de 1.89 (IC 95% 1.02-3.5).

S homocigoto silvestre H heterocigoto (4b/a) M homocig Figura 8. Productos de PCR del polim

27 b del intrón 4 del gen NOS3. • Alelo silvestre 4b, de 420 pb que equivale a 5 repeticiones de 27 pb.

- Los productos de PCR de 176 pb de GSTP1 A/B, se muestran en la

m


pacientes con PE y las pacientes control se presentan en la Tabla 6. La variante

heterocigota Ile105Val fue la más frecuente en ambos grupos estudiados, pero no

hubo diferencia significativa entre los dos grupos estudiados (56% en los controles,

47% en las pacientes con PE; p = 0.43). En cambio, la variante homocigota mutante

Val105Val se presentó con mayor frecuencia 42% en el grupo de las pacientes con

PE, mientras que en el grupo de las mujeres con embarazo normal la proporción fue

d

38

Figura 9. Productos de PCR para el polimorfismo GSTP1A/B de 176 pb. En el primer carril se observa el marcador de tamaño molecular, el resto de los carriles corresponden a los productos de PCR. MA Val/Val Ile/Val Ile/Ile

Figura 10. Productos de la restricción para GSTP1 A/B, en el primer carril se encuentra el marcador de tamaño molecular, en carril 2 se observa la muestra de un homocigoto mutante GSTP1b (Val105), es cortado por la enzima Alw261, produciendo dos fragmentos (91 y 85pb). En el carril 3 hay una muestra heterocigoto con bandas (176,91 y 85 pb). El carril 4 corresponde al homocigoto silvestre GSTP1a (Ile105), no es cortado por Alw261 y el fragmento es de 176pb TABLA 6 DISTRIBUCIÓN DE POLIMORFISMOS DEL GEN DE LA GSTP1

Variante Código Embarazo Normal Preeclampsia

Ile105Ile105 1 16.7% 10.5%

Ile105Val105 2 55.5% 47.4%

Val105Val105 3 27.8% 42.1% *



GSTP1 = Glutatión S-Transferasa


39

CONCLUCIONES Se ha demostrado que el estrés oxidativo tiene una participación importante en el

desarrollo de la PE, sin embargo, todavía no es claro el mecanismo involucrado. En

este trabajo se trató de elucidar si las variaciones en la frecuencia de presentación

de 5 polimorfismos en tres de los genes que participan en la regulación del estrés

oxidativo, tienen alguna participación en la susceptibilidad para la presentación de la

PE.

La enzima epóxido hidrolasa microsomal tiene una participación importante en

numerosos procesos de destoxificación que se llevan a cabo en el cuerpo humano,

así como en el metabolismo de compuestos tóxicos tanto endógenos como

exógenos. Por lo tanto, las modificaciones en su actividad normal se han asociado

con varios procesos patológicos 47,48,60,62. La presencia de polimorfismos en el gen

que codifica para esta enzima produce tanto aumento como disminución en esta

actividad. Hassett y col 61 demostraron que la sustitución de histidina por tirosina en

la posición 113 disminuye la actividad de la EPHX aproximadamente en 40%, y que

la sustitución de Arginina por Histidina en la posición 139 aumenta esta actividad en

25%. En el caso de estos polimorfismos del gen EPHX, Tyr113His en el exón 3 e

His139Arg en el exón 4, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran una

mayor frecuencia en los haplotipos relacionados con una actividad enzimática

intermedia y alta en las pacientes que cursaron un embarazo con PE. Aunque esta

diferencia fue significativa, es pequeña debido a al número de pacientes analizadas.

La asociación entre un riesgo mayor de PE y la incidencia de los genotipos

Tyr113Tyr, His139Arg e His139His podría reflejar un aumento en la activación

endotelial en estas pacientes, por el incremento en la síntesis de compuestos

reactivos asociados con una mayor actividad de esta enzima.

Estos resultados concuerdan con lo reportado por Zustezeel y col 62, así como por

Laasanen y col 63. Ambos autores reportaron que los haplotipos de alta actividad

enzimática fueron más frecuentes en las pacientes que presentaron PE, apoyando

así que estos polimorfismos están asociados con una mayor susceptibilidad a la PE.

40

Por otra parte, el óxido nítrico está involucrado en tres adaptaciones fisiológicas del

embarazo: a) vasodilatación de la circulación sistémica materna, b) incremento en la

circulación sanguínea en la tríada útero-feto-placenta y c) inalterabilidad del útero

antes del parto 67,69. Por lo tanto, se ha propuesto que la reducción en la biosíntesis

de NO favorece la presentación de PE y que el gen de eNOS es un candidato para

susceptibilidad a PE y eclampsia 2,65.

En este estudio se analizaron dos polimorfismos del gen NOS3, Glu298Asp en el

exón 7 y eNOS4b/4a. Los resultados obtenidos del análisis de ambos polimorfismos

no muestran diferencias significativas entre ambos grupos estudiados, a excepción

de una incidencia mayor de la variante Glu298Asp en el grupo control. En el estudio

realizado por Guo y col 72 se analizaron 25 microsatélites en la región del cromosoma

7q36, en el gen eNOS, no encontrando asociación entre los marcadores evaluados y

la presencia de historia de PE, lo que concuerda con nuestros resultados.

Savvidou y col 76 estudiaron el polimorfismo Glu298Asp y su asociación con el

desarrollo de enfermedades cardiovasculares en la fase temprana del embarazo.

Encontraron que los homocigotos Asp298Asp se asocian con bajo flujo sanguíneo de

las arterias uterinas en la semana 12 del embarazo y sugieren que estos resultados

muestran la participación de factores genéticos durante la adaptación vascular en el

embarazo. En un estudio de meta-análisis publicado recientemente 65 se encontró,

después de analizar 12 reportes acerca del polimorfismo Glu298Asp en la PE, que el

riesgo asociado con la variante homocigota Asp298 no fue significativo (OR = 1.12,

IC 95% 0.84-1.49). Todos estos resultados concuerdan con lo obtenido en este

estudio.

Kobashi y col 77 realizaron un estudio donde incluyeron pacientes que cursaron un

embarazo normal o hipertensión gestacional y analizaron el comportamiento del

polimorfismo Glu298Asp, encontrando diferencias significativas entre ambos grupos.

Los autores concluyeron que la variante homocigota Asp298 del gen NOS3 es un

41

factor de riesgo para la hipertensión gestacional. En nuestro estudio, a pesar de que

se observó una frecuencia de la variante Asp298Asp que fue el doble en el grupo con

PE con relación al embarazo normal, la diferencia no alcanzó significancia estadística

por el reducido número de pacientes que la presentaron. Todos estos resultados

sugieren que el polimorfismo Glu298Asp del NOS3 parece estar asociado con la

aparición de hipertensión gestacional, pero no con la PE.

Bashford y col 78 investigaron la asociación entre el polimorfismo eNOS4b/4a y la PE,

encontrando que el alelo NOS3-A fue significativamente más frecuente en las

pacientes con PE, comparadas con los controles. En sus conclusiones resaltan que

este polimorfismo debe tener influencia durante la fase temprana del embarazo. En

nuestro estudio los resultados para este polimorfismo no muestran diferencias

significativas entre los dos grupos estudiados, lo cual coincide con lo reportado por

Serrano y col para una población Colombiana con mezcla étnica 81.

Por otra parte, el metabolismo de eliminación de los compuestos xenobióticos y de

las toxinas endógenas requiere de un mecanismo en dos pasos. En primer lugar una

modificación por enzimas como el citocromo P-450 1A1 y una conjugación en una

segunda etapa, catalizada por enzimas como las glutatión S-transferasas 47,48. En el

caso del polimorfismo Ile105Val del gen GSTP1, se ha reportado una limitación en la

capacidad de destoxificación de la enzima, asociada con el alelo Val105 que es

menos funcional 82.

Se ha reportado que una variante de la GSTP1, miembro de la subfamilia Pi de la

glutatión S-transferasa, está asociada con la PE en población holandesa 58. Este

grupo de investigadores ha estudiado este polimorfismo y su relación con la actividad

de la enzima, además de su asociación con la PE56-59. En el primero de sus estudios

reportaron una baja actividad de la enzima en pacientes que presentaban PE;

posteriormente reportaron una mayor frecuencia de la mutación Val105 en las

mismas pacientes y en el último estudio que han publicado sobre este polimorfismo

incluyeron los tríos madre, padre e hijo. En este estudio también encontraron una

42

mayor frecuencia en la presencia de la mutación en los tríos que presentaron PE59.

Estos autores mencionan que estos resultados muestran que la susceptibilidad a la

PE se hereda y también proponen la participación paterna en este padecimiento. Los

resultados de este estudio muestran una mayor frecuencia de los homocigotos

Val105 en las pacientes con PE, lo que concuerda con lo reportado por este grupo de

investigadores.

Se ha demostrado que el estrés oxidativo en la placenta es clave en el desarrollo de

la patogénesis de la PE83, entendiendo el estrés oxidativo como un desequilibrio

entre la producción de radicales libres y las fuerzas antioxidantes, por lo que la

participación de los antioxidantes endógenos en la prevención de la PE es crucial. En

los últimos años, inclusive, se han realizado varios estudios multicéntricos para

analizar la posibilidad de utilizar antioxidantes exógenos como protección para la

PE54.

Los resultados obtenidos en este estudio apoyan el hecho de que la presencia de

alguna anomalía en el sistema antioxidante aumenta significativamente el riesgo de

la presencia de preeclampsia.

SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTURO Debido a la baja frecuencia de la mutación en los polimorfismos estudiados, se

deben incluir un mayor número de pacientes, con la finalidad de observar mejor las

diferencias entre los alelos.

Para esclarecer la forma en como se hereda la PE es necesario realizar estudios

donde se incluyan a padres, madres e hijos y establecer la participación paterna en

esta patología.

El estrés oxidativo tiene un papel muy importante en el desarrollo de la PE, por esta

razón es necesario estudiar otros polimorfismos que participan en el control del

estrés oxidativo.

Se requiere evaluar la relación los polimorfismos y la actividad enzimática.

43

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos en forma muy especial la colaboración y apoyo brindado por la Unidad

de Investigación Médica en Genética del Hospital de Pediatría del Centro Médico

Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social .

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