estudio cromatografico comparativo de los ácidos grasos presentes en las semillas de anona

8/7/2019 estudio cromatografico comparativo de los cidos grasos presentes en las semillas de anona

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Vector, Volumen 2, Enero - Diciembre 2007, pgs 103 - 112Recibido 6 Septiembre 2007, Aprobado 21 Noviembre 2007

Estudio cromatogrco comparativo de los cidosgrasos presentes en semilla de

Annona cherimolioidesyAnnona muricata L

Ocampo S., Diana M.Betancur J., Luz A.

Ortiz, Aristfeles

Ocampo C., Rogelio

Resumen

La familia Anonceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias bioactivas de diversanaturaleza qumica, en hojas, raz, frutas y semillas. De esta familia se han caracterizado y reportadoalcaloides, terpenoides, avonoides, acetogeninas y aceites saponicables. La bioactividad de este tipode metabolitos de plantas anonceas est asociada a su efecto como insecticidas, actividad citotxica,antitumoral, antibacterial, pesticida, antimalarial, anti-leishmaniasis y propiedades antehelmiticas.

A nivel de fruto, esta familia es importante por la pulpa, que usualmente es utilizada como alimento yparticularmente para la elaboracin de productos industriales alimenticios tales como jugos, cremas yproductos saborizantes.

Las especies de la familia anoncea, contienen en la semilla triglicridos basados en cidos grasos saturadose insaturados. Los ms caractersticos son: cido linoleico, cido oleico, cido esterico y cido linolenico,entre otros. Los aceites y otros extractos de la planta contienen trazas de acetogeninas de reconocidacitotoxicidad, que le coneren importantes propiedades e inters a esta familia botnica.

En este estudio, los cidos grasos del aceite de semilla de annona cherimolioides y annona muricata fueronaislados por extraccin de la fraccin grasa con hexano, y derivatizados mediante transestericacin

con metanol en presencia cataltica de BF3. Los respectivos steres de metilo fueron analizadoscomparativamente para las dos especies, mediante cromatografa de gases acoplada a masas (GC-MS).

Palabras clave: Annona,Annona cherimolioides, cidos grasos libres, CG-MS, derivatizacin de cidosgrasos libres.

Comparative chromatographic study of fay acids present inAnnona cherimolioides andAnnona muricata L seed

Abstract

The family Anonaceae is characterized by the presence of numerous bioactive substances of diversechemical nature, in leaves, root, fruits and seeds. Saponiable alkaloids, terpenoids, avonoids, acetogeninsand oils of this family have been characterized and reported. The bioactivity of this type of metabolites ofsoursop plants is associated to its eect as an insecticide; cytotoxic, antitumorlike, antibacterial, pesticideand antimalarial activity, anti-leishmaniasis and antehelmintic properties.

Departamento de Qumica, Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] Centro de Investigaciones del Caf, CENICAF


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Ocampo S., Diana M.; Betancur J., Luz A.; Ortiz, Aristfeles; Ocampo C., Rogelio

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At the fruit level of this family, the pulp is important, which is usually used as foods and particularly forindustrial food product elaboration such as juices, creams and avoring products.

The species of the anonacea family contain triglycerides based on saturated and unsaturated fay acidsin the seeds. The most characteristic being: linoleic acid, oleic acid, stearic acid, and linolenic acid, amongothers. The oils and other extracts of the plant contain traces of acetogenins of recognized cytotoxicity,

which confers important properties and interest to this botanical family.

In this study, the fay acids of the seed oil of Annona cherimolioides and Annona muricata were isolatedby extraction of the greasy fraction with hexane, and derivatized by means of transesterication withmethanol in catalytic presence of BF3. The respective methyl esters were analyzed comparatively for thetwo species, by means of gas chromatography- mass spectrometry (GC-MS).

Key words: Soursop, Annona cherimolioides, free fay acids, CG-MS, derivatization of free fayacids.

Antecedentes

La familia Anoncea, ms conocida popularmente como la familia de la Guanbana,1 comprende cercade 2500 especies agrupadas en 130 gneros, constituidos por rboles, arbustos y lianas, distribuidas enlas regiones tropicales de Amrica, Asia y Madagascar.2,3

Desde 1982 se ha intensicado la investigacin de sus especies por haberse descubierto un gran potencialde productos naturales con una amplia variedad de actividades Biolgicas.4

Dentro de la familia Annonaceae hay gneros que se caracterizan por el inters econmico de sus frutos.Tal es el caso de laAnnona squamosa,5Annona muricata,6Annona cherimolia7,8 yAnnona reticulata .

La literatura reporta estudios sobre aceites esenciales y cidos grasos en varios gneros de esta familiabuscando la posibilidad de que sean usados como aditivos aromticos naturales, principalmente enalimentos,10 bebidas o su aplicacin como insecticidas.7 La especie mas estudiada a nivel mundial es laAnnona muricata ( Guanbana).11 Aproximadamente el 70% de los cidos grasos de la guanbana soninsaturados, ubicando los aceites que tiene dentro de un rango aceptable entre los aceites alimenticiosconvencionales,12 tan estables como el aceite de algodn, maz y soya. Sin embargo hay que advertir que,al extraer el aceite de semilla deAnnona muricata con otros solventes, ste es extrado junto con sustanciasqumicamente bioactivas y citotxicas que pueden actuar como inhibidores del crecimiento de larvas eninsectos y microorganismos, y que se han reportado como txicas para los humanos.13,14

El objeto de este artculo es mostrar, de manera comparativa, el estudio de los cidos grasos presentes

enAnnona cherimolioides frente a los cidos grasos presentes en otras especies del mismo gnero, ya quees una planta que no presenta reportes de este tipo en la literatura Internacional.15,16 Los cidos grasos,derivatizados en forma de sus steres de metilo, fueron analizados mediante la tcnica de CG-MS.

Annona cherimolioides (Triana y Plancton) R.F.Fries, especie conocida con el nombre vulgar o vernculo deann de monte, o guanabanito de monte(en Colombia), y clasicada en el herbario de la Universidadde Caldas como Raimondia cherimolioides es una especie Anonceae tropical andina, muy connada enColombia, poco estudiada hasta el momento por la comunidad cientca mundial.15


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Estudio cromatogrfco comparativo de los cidos grasos presentes en semilla deAnnona cherimolioides yAnnona muricata L

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Mtodos y materiales

Materiales y reactivos

Reactivos

Se utiliz etanol de 98% de pureza (marca Merck). Los solventes grado cromatogrco metanol y hexano,fueron comprados a Merck.

Material Vegetal: Los frutos deAnnona cherimoliodes ( Ann de monte) se recolectaron en el municipiode Aranzazu, Departamento de Caldas ubicado en las coordenadas norte 0515.054, No y 7529.966

longitud oeste, altitud 1940m.s.n.m. El estudio de los aspectos botnicos y la geoubicacin de la planta enel Departamento de Caldas fueron realizados por el profesor Jos Jaramillo Pli y sus colaboradores.16

Una muestra Botnica fue clasicada en el herbario Nacional de Colombia, Sede Medelln y comparadascon los ejemplares que se tienen en la Universidad de Caldas. Los frutos de annona muricata L (Guanbana)fueron obtenidas comercialmente.


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CROMATOGRAFO DE GASES

Condiciones cromatogrfcas:

Cromatgrafo de gases 6890 plus. Columna HP-5 (5 % fenil-metilsilicona, 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm).Gas, helio. Rampa de temperatura horno: 280 C, 0.50 C/min hasta 360, 3 C/min durante 12 min., 380

hasta 15.29 min.Modo: Split. Temperatura inicial: 360 C. Presin: 24.59 psi. Velocidad Split: 25:1.Flujo split: 32.5 mL/min.Flujo total: 36.4 mL/min. Temperatura del inyector: 360C. Flujo constante: 1,1 ml/min. Presin a 50 C:10,5 psi.

Detector Masas: Mass selective detector 5973 HP.Modo SCAN. MS source: 240.Total ow: 36.4. MS quard: 180. EM volts: 2294DC polarity: negative. Ion polarity: positive. Foreline: 75

EXTRACCCIN Y FRACCIONAMIENTO

Preparacin de los extractos

Se llev a cabo el siguiente protocolo para la obtencin de los steres de metilo de los cidos grasos,ilustrado grcamente en la gura 1:

a. Percolacin con etanol durante 2 semanas: Las semillas de Annona cherimoliodes (500g) libres deimpurezas, se secaron a temperatura ambiente y fueron molidas y sometidos a percolacin con etanolde 96% durante 2 semanas. Cada da se recoga el ltrado y se someta a evaporacin mediante vaco, yel solvente era reemplazado da a da. Los extractos obtenidos diariamente se fueron combinando hastacompletar las dos semanas de la operacin. Se obtuvo as un jarabe aceitoso de color caf, fraccin quefue denominada F01-SG(fraccin etanlica de semilla de guanbana).

Idntico procedimiento fue llevado a cabo con semillas de Annona muricata L (500g), dandolugar a la

fraccin F01-SA(fraccin etanlica de semilla de Ann de monte).

Las fracciones F01-SA y F01-SGfueron sometidas a secado mediante evaporacin rotatoria. El marcose desech en cada caso.

b.Particin de cada extracto etanlico entre hexano y metanol-agua (90:10): La fraccin F01-SA fuesometida a particin entre hexano y metanol acuoso 90:10. Se separ la fase metanlica acuosa de lafase en hexano. Cada fraccin se someti a secado mediante evaporacin rotatoria, y posteriormente,aplicacin de alto vaco. De esta manera se obtuvieron las siguientes fracciones: fraccin metanlica deann de monte (F02-SA), un jarabe caf con aceite, y la fraccin en hexano de semilla de ann de monte(aceite amarillo) rotulada como F03-SA.

Idntico procedimiento de particin se llev a cabo partiendo de la fraccin F01-SG de guanbana, dandolugar a lafraccin metanlica de guanbana F02-SG y a la fraccin en hexano de semilla de Guanbana(F03-SG).


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Figura 1. Proceso de extraccin de los cidos grasos en semilla de annona cherimolioides(ann de monte) y annona muricata L. (Guanbana)

DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS POR CROMATOGRAFA GC-MS

Estndares: Con el n de vericar el factor de respuesta, dos patrones de cidos grasos que estabanpresentes en las muestras por analizar, fueron sometidos a anlisis cromatogrco, previa preparaciny derivatizacin a diferentes concentraciones. Se sigui el procedimiento que se detalla a continuacin:

Preparacin de los estndares para calibracin: Se parti de dos cidos grasos grado reactivo Merck: cido

palmtico y cido esterico. De cada uno de ellos se prepar una solucin stock a una concentracin de1000ppm y a partir de all se realizaron 5 diluciones a las siguientes concentraciones 1000ppm, 500ppm,250 ppm, 125 ppm y 63 ppm, las cuales fueron sometidas al siguiente protocolo de estericacin (gura2), para luego ser llevadas a anlisis cromatogrco y construir la respectiva curva de calibracin:

a. De cada estndar se hizo una solucin a una concentracin de 1000 ppm en hexano.b. De las soluciones anteriores se prepararon las diferentes diluciones a concentraciones de 1000ppm,500ppm, 250ppm 125ppm y 63ppm. Cada solucin se llev a sequedad con nitrgeno gaseoso.c. A cada una se le adicionaron 3mL de BF3 en MeOH al 20%. Se sometieron a calentamiento a 80Cdurante una hora mediante reujo.d. A cada dilucin se le adicionaron 500L de hexano, pasados uno minutos se recuper la fase superiorcorrespondiente a la fase que contiene los cidos grasos metilados presentes en el material vegetal.

e. Los steres de metilo de los cidos grasos estndares fueron entonces llevados a anlisis cromatogrcoobteniendo las siguientes ecuaciones de estandarizacin:

CIDO ESTERICO CIDO PALMTICO

Repuesta= 1.02X 104 Amt + 3.36X 105

Coeente de deteccin= 0.990Repuesta= 1.05X 104 Amt + 2.80X 105 Coe-ente de deteccin= 0.994


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Preparacin de las muestras de la fraccin en hexano de ann de monte y Guanbana para CG-MS

Se tomaron por separado las fracciones en hexano de la semilla de ann de monte y de Guanbana (F03-SA y F03-SG), y se sometieron al mismo protocolo ilustrado en la gura 2.

Figura 2. Protocolo derivatizacin de cidos grasos

Resultados y discusin

Los cromatogramas muestran el aceite de annona cherimolioides (6 seales),Annona muricata (4 seales) ylos estndares utilizados (2 seales). En las muestras analizadas se encontraron los picos correspondientesa los estndares cido palmtico y cido esterico. A otros tiempos de retencin aparecieron otras sealescorrespondientes a los ismeros de los estndares de tipo insaturado, para el cido palmitico (C:16), el

cido palmitoleico (C16:1

), el cido esterico (C:18) los cidos oleico(C18:1

), linoleico (C18:29,12

) ylinolnico (C18:39,12,15). Tambin aparece el cido araquidnico (C20:45,8,11,14) en muy poca cantidad.


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El anlisis de los fragmentos principales de cada espectro dio como resultado los cidos grasos en la tabla1, de donde se puede decir que al comparar el aceite de semilla de annona muricata y annona cherimolioidesmediante el anlisis de su composicin porcentual en cidos grasos- es similar para el cido palmtico,en guanbana con una composicin del 25.65% y en ann de monte con una composicin 25.43%.; para elcido linoleico en guanbana con una composicin del 23.86% y en ann de monte con una composicin

del 20.46%; para el cido Oleico en Guanbana con una composicin del 44.60% y en ann de monte conuna composicin del 46.37%. Con algunas diferencias en composicin se encuentra el cido esterico conuna composicin en guanbana del 5.89% y en ann de monte del 11.15%.


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Tabla 1.Tiempos de retencin de los steres de metilo de los cidos grasos de aceite y de guanbana y de aceite de ann demonte

ACEITE GUANABANA ACEITE ANON DE MONTE

PICO COMPUESTO T.R. (min) PICO COMPUESTO T.R. (min)1 Palmitato de Metilo ,34 1 Palmitoleato de Metilo ,24

2 Linoleato de Metilo 10,18 2 Palmitato de Metilo ,34

3 Oleato de Metilo 10,19 3 Linoleato de Metilo 10,19

4 Estearato de Metilo 10,31 4 Oleato de Metilo 10,22

5 Estearato de Metilo 10,31

6 Araquidato de Metilo 11,21

A partir del contraste entre el aceite deAnnona muricata10 yAnnona cherimolioides se puede concluir que

laAnnona cherimolioides tiene la presencia en cantidades mnimas del cido palmitoleico (composicin1.42%) y cido araquidnico con una composicin del 1.08%.

Comparando los cidos grasos presentes en Annona cherimolioides con los reportados en la literaturapara otras especies del mismo gnero Annona como lo sonAnnona muricata 17,Annona cherimolia 6,Annonasquamosa; se puede decir que su composicin es similar en cido palmtico, cido oleico, cido linoleicoy cido esterico como se observa en la tabla 2.

Tabla 2.Composicin porcentual de los cidos grasos de varias especies anonceas

ACIDO GRASO A. muricata L. A. cherimola A. squamosaA. muricata

L. U de C

A.

cherimolioides U.de C

Oleato de Metilo 44% 43% 37% 45% 46.37%

Linoleato de Metilo 30% 35% 10.9% 24% 14.55%

Palmitato de Metilo 19% 12% 0% 26% 25.43%

Estearato de Metilo 5% 8% 9.3% 6% 11.15%

Linoleniato de Metilo 0,00% 1% 0% 0% 0%

Palmitoleato de Metilo 2% 0% 0% 0% 1.42%

Araquidato de Metilo 0% 1% 3.3% 0% 1.10%

Isoricinoleato de Metilo 0% 0% 9.8% 0% 0%

De acuerdo con los anlisis realizados, se puede concluir que, los cidos grasos comunes presentes tantoen el ann de monte como en la guanbana son: cido palmtico, cido oleico, cido esterico y cidolinoleico. Como cidos grasos diferentes aparecen el araquidico y palmitoleico, cidos grasos que son dealto uso en alimentos. En el caso especco de los aceites de semillas de especies anonceas, la comunidadcientca ha advertido de su alto potencial citotxico, por lo cual est contraindicada su aplicacin en laindustria alimenticia.


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Agradecimientos

Los autores agradecen a la Vice-Rectora de Investigaciones y postgrados de la Universidad de Caldaspor el apoyo econmico para la nanciacin de este proyecto, y al Doctor Nstor Riao de CENICAFE.Igualmente agradece la asesora del profesor Nstor Riao Cabrera del Departamento de Qumica de laUniversidad de Caldas.

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