estudi de noves dianes terapÈutiques en el...

0

A LA RECERCA D’UNA ESPERANÇA ESTUDI DE NOVES DIANES TERAPÈUTIQUES EN EL CÀNCER

- Heterogeneïtat intra-tumoral, cèl·lules mare del càncer i aplicació en tractaments –

1

ÍNDEX.

0. Introducció ........................................................................................................... 3

1. Part teòrica ........................................................................................................... 4

1.1.- Sistema nerviós ..................................................................................................... 4

1.1.1.- Les neurones ................................................................................................... 4

1.1.2.- Neuròglia ......................................................................................................... 5

1.1.3.- Sistema nerviós central .................................................................................. 6

1.1.4.- Sistema nerviós perifèric ............................................................................... 9

1.2.- Tumors intracranials ............................................................................................ 10

1.2.1.- Classificació i característiques generals ........................................................ 11

1.2.2.- Símptomes .................................................................................................... 13

1.2.3.- Diagnòstic ..................................................................................................... 14

1.2.4.- Tractament .................................................................................................... 16

1.2.5.- Pronòstic ....................................................................................................... 16

1.2.6.- Glioblastoma multiforme .............................................................................. 17

1.3.- Cèl·lules mare ...................................................................................................... 18

1.4.- Citoquines ............................................................................................................ 20

2. Part pràctica ....................................................................................................... 21

2.1.- Objectius i hipòtesis ............................................................................................. 21

2.2.- Precedents ........................................................................................................... 21

2.3.- Pla de treball ........................................................................................................ 22

2.4.- Material ................................................................................................................ 22

2.4.1.- FACS .............................................................................................................. 22

2.4.2.- Fàrmac B ....................................................................................................... 24

2.5.- Mètodes ............................................................................................................... 25

2.5.1.- Obtenció de cultius ....................................................................................... 25

2.5.2.- Marcatge de cèl·lules tumorals i recompte .................................................. 26

2.5.3.- Marcatge de cèl·lules mortes ....................................................................... 27

2.6.- Resultats .............................................................................................................. 28

2.6.1.- Tractament de les cèl·lules amb fàrmac B .................................................... 28

2.6.2.- Irradiació de les cèl·lules .............................................................................. 29

2.6.3.- Combinació del fàrmac B amb irradiació ...................................................... 31

2

3. Conclusions ........................................................................................................ 33

4. Noves hipòtesis .................................................................................................. 34

5. Glossari .............................................................................................................. 35

6. Recerca del càncer en els mitjans de comunicació ............................................... 36

7. Bibliografia ......................................................................................................... 39

8. Agraïments ......................................................................................................... 41

9. Annexos ............................................................................................................. 42

3

0. INTRODUCCIÓ.

Aquest treball és el resultat d’una estada realitzada a l’Institut d’Oncologia de la Vall d’Hebron (VHIO) i concretament amb l’equip dirigit pel Dr. Seoane.

L’oportunitat de participar en la recerca que està realitzant aquest grup de treball se’m va plantejar gràcies al projecte Joves i Ciència de CatalunyaCaixa, del qual en formo part. Durant la primera fase d’aquest projecte, d’una durada de tres anys, era necessari fer una investigació i redactar un article científic que havia de presentar el gener del 2012 (annex III).

El VHIO va acceptar que realitzés la meva investigació i l’article sobre l’estudi que està duent a terme. Consisteix en investigar el paper de les cèl·lules mare tumorals per al tractament del glioblastoma multiforme o GBM. L’equip docent del meu centre va aprovar que amplies l’article i l’utilitzés com a treball de recerca. L’interès per realitzar un treball sobre el càncer se’m va plantejar per la vivència d’un cas molt proper i perquè m’interessa el món de la medicina. El terme “càncer” engloba un nombre molt gran de malalties neoplàsiques malignes diferents, per aquesta raó, vaig haver de focalitzar el meu treball i centrar-me en un tipus de tumor concret: el glioblastoma multiforme (GBM). El GBM és un dels tumor més agressius i mortífers dels tumors intracranials i, per tant, la recerca destinada a trobar un fàrmac per a combatre aquest tumor té un interès especial. El grup d’investigació de la Vall d’Hebron ha estudiat els diversos mecanismes moleculars que sostenen aquest tumor i han desenvolupat un fàrmac, que malgrat estar en fase de proves, ja dóna resultats esperançadors tal i com es demostra en aquest treball. La recerca està basada en l’estudi de l’heterogeneïtat cel·lular del tumor i concretament, amb un tipus de cèl·lules anomenades glioma stem cells o GICs. Les GICs són les cèl·lules mare tumorals i, com descriuen diverses recerques anteriors, són les causants de la proliferació, la recurrència i la resistència als tractaments convencionals del glioblastoma multiforme. El meu treball plasma una part d’aquesta recerca i prova la possible efectivitat in vitro del fàrmac desenvolupat per aquest grup d’investigació oncològica. El Dr. Seoane em va demanar que per la seguretat de la investigació no anomenés en cap cas la composició del fàrmac. És per aquest motiu que en aquesta memòria el fàrmac s’anomena “fàrmac B” o “Drug B” sense especificar les seves característiques.

Malgrat aquesta recerca està focalitzada en el GBM, hi ha l’esperança que els descobriments puguin aplicar-se a d’altres tipus de tumors.

Aquest treball està estructurat en tres parts. En primer lloc, hi ha una part teòrica que permet conèixer el sistema nerviós i entendre determinats aspectes dels tumors intracranials i de la recerca en el camp de l’oncologia, que permeten respondre les primeres preguntes sobre el càncer, com per exemple, la classificació o el grau d’incidència en la població. En segon lloc, hi ha la part de recerca experimental que consisteix en la prova del fàrmac per al tractament del glioblastoma multiforme desenvolupat al laboratori de la Vall d’Hebron. Finalment, s’han extret i analitzat les dades obtingudes durant el treball al laboratori, que han servit per contrastar i validar les hipòtesis inicials.

4

1. PART TEÒRICA. 1.1.SISTEMA NERVIÓS

Amb un pes de 2 Kg, al voltant del 3% del pes corporal, el sistema nerviós (SN) és un dels sistemes més petits, però alhora, el més complex de l’organisme. Consisteix en una xarxa d’estructures especialitzades amb la funció de controlar i regular el funcionament dels diferents òrgans i estructures corporals, tot coordinant la seva interrelació i també la relació de l’organisme amb l’exterior.

Gairebé tots els organismes animals presenten alguna estructura especialitzada que els permet respondre als estímuls però el sistema nerviós humà presenta unes diferències fonamentals.

D’una banda, el gran desenvolupament de l’escorça cerebral permet a l’ésser humà desenvolupar funcions superiors, com les funcions intel·lectuals. D’altra banda, malgrat totes les estructures del SN hi són presents des del naixement i no es reprodueixen, el desenvolupament d’aquest sistema no és complet en el moment del naixement de l’individu. Gràcies a aquestes característiques exclusives del sistema nerviós humà, l’home és capaç d’adaptar-se a qualsevol circumstància, gairebé sense límits preestablerts.

Des del punt de vista anatòmic, hem de diferenciar dues parts: el sistema nerviós central i el sistema nerviós perifèric. El sistema nerviós central (SNC) és la part del SN continguda a l’interior del crani (on hi ha l’anomenat encèfal- compost pel cervell, el cerebel i el tronc encefàlic-) i la columna vertebral (on es troba la medul·la espinal).

A través del orificis que hi ha entre les vèrtebres passen els nervis que connecten la medul·la espinal amb les diverses estructures del cos. El conjunt de nervis de l’exterior del SNC, que transmeten els impulsos nerviosos, és l’anomenat sistema nerviós perifèric (SNP).

Tant el sistema nerviós central com el perifèric es componen fonamentalment de cèl·lules especialitzades i amb característiques exclusives, les quals els permeten realitzar la seva funció dins d’aquest sistema: les neurones i les cèl·lules de la glia.

1.1.1.LES NEURONES

Les neurones són les cèl·lules del sistema nerviós que desencadenen i transmeten impulsos nerviosos. En l’ésser humà hi ha aproximadament cent mil milions de neurones repartides en les diverses parts del cos. Hi ha neurones de moltes llargades diferents en funció de la part del cos on es troben. Per exemple, hi ha neurones que transmeten impulsos a l’interior del sistema nerviós central i que són de només 1mm de llargada. Les neurones motores que permeten moure els dits dels peus, en canvi, s’estenen des de la zona lumbar fins al músculs del peu.

Malgrat la gran varietat de neurones, totes presenten la mateixa estructura fonamental: cos cel·lular i prolongacions.

5

El cos cel·lular és la zona on es troba el nucli, format pel conjunt de substàncies fonamentals que regulen el funcionament d’una cèl·lula. El nucli està envoltat per una xarxa de fibres anomenades neurofibril·les, de funció desconeguda.

Les neurones presenten dos tipus de prolongacions. D’una banda, trobem les dendrites que són prolongacions per on l’impuls entra al cos cel·lular (el nombre és variable en relació al tipus de neurona). D’altra banda, l’axó o neurita és la prolongació única de la neurona a través de la qual l’impuls nerviós és transmès des del cos cel·lular a d’altres neurones, fibres musculars o cèl·lula glandular.

Imatge 1. Les parts bàsiques de les neurones són les dendrites, el cos cel·lular i l’axó.

1.1.2.LES NEURÒGLIA

Les cèl·lules de la glia o neuròglia són cèl·lules especialitzades del sistema nerviós que realitzen una funció estructural i col·laboren en la nutrició i l’eliminació de substàncies de rebuig cel·lular. A diferència de les neurones, les cèl·lules glials no intervenen en la generació i propagació dels impulsos nerviosos, i es poden dividir i multiplicar en el sistema nerviós ja madur. En cas d’una lesió o malaltia, la neuròglia es multiplica i emplena els espais que anteriorment ocupaven les neurones. Els tumors cerebrals derivats de la glia, tendeixen a ser molt malignes i a desenvolupar-se amb gran rapidesa.

Cal diferenciar tres tipus de cèl·lules de la glia: astròcits, oligodendròglia i micròglia. Els astròcits són cèl·lules de forma estrellada amb prolongacions, les quals uneixen els capil·lars sanguinis, entre sí o amb les neurones.

La micròglia, cèl·lules petites i amb poques prolongacions, realitzen funcions fagocítiques: eliminen les dendrites cel·lulars que es formen durant el

6

desenvolupament normal de sistema nerviós i fagociten microorganismes i teixits afectats.

La oligodendròglia són el conjunt de cèl·lules que embolcallen alguns axons i formen una sèrie de capes concèntriques anomenades beina de Schwann. Aquest embolcall conté la mielina que és una lipoproteïna que realitza una funció d’aïllant i augmenta la velocitat de transmissió de l’impuls nerviós.

La mielina té un color blanc, en contrast amb el color grisós dels cossos neuronals. Per aquesta raó, les parts del SN on hi predominen els cossos neuronals són denominats substància gris i, en canvi, les zones on hi predominen les fibres nervioses cobertes de mielina reben el nom de substància blanca.

Imatge 2. La neuròglia està formada per diversos tipus de cèl·lules glials: els astròcits, l’oligodendròglia i la micròglia.

1.1.3.SISTEMA NERVIÓS CENTRAL (SNC)

El sistema nerviós central (SNC) és el conjunt de cossos neuronals i neuròglia que es troben distribuïts en la part interior del crani (encèfal) i del canal raquidi de la columna vertebral (medul·la espinal).

Encèfal

L’encèfal és la massa nerviosa continguda a l’interior del crani. Està envoltada per les meninges, que són tres membranes anomenades: duramadre, piamadre i aracnoides. Anatòmicament hem de dividir l’encèfal en tres part molt voluminoses: cervell, cerebel i bulb raquidi, i d’unes altres de mida inferior: diencèfal (amb l’hipotàlem) i el mesencèfal.

7

Cervell

El cervell és la part superior del sistema nerviós i la de més massa. Es compon de dues parts simètriques anomenades hemisferis cerebrals. Cada hemisferi realitza una funció diferent dins el sistema nerviós central.

La part més externa és l’escorça cerebral que consisteix en substància grisa, formada fonamentalment per cossos de neurones. La superfície del cervell és irregular i forma diversos solcs anomenats circumvolucions, i unes fissures profundes denominades cissures, les quals delimiten diverses zones o lòbuls. Cadascun dels lòbuls és denominat en relació amb l’os sota del qual es troba (parietal, frontal, temporal, occipital...). Les cissures principals són les anomenades cissures de Silvio i de Rolando. Sota l’escorça, hi ha la substància blanca del cervell, formada pels axons de les neurones corticals i els de neurones d’altres parts de l’encèfal que s’adrecen a aquesta zona del sistema nerviós central. En la substància blanca hi destaca el cos callós, una làmina blanca constituïda per nombroses fibres que connecta l’hemisferi cerebral dret i esquerra, coordinant-ne les seves funcions.

Dins la substància blanca hi ha acumulacions de cossos neuronals que constitueixen els nuclis grisos centrals. El més gran d’aquests nuclis és el tàlem, una massa ovoide que es troba en cadascun dels dos hemisferis. La combinació d’alguns d’aquest nuclis grisos constitueixen l’hipotàlem el qual, a través de diverses fibres nervioses i vasos sanguinis, connecta amb la hipòfisi, una glàndula situada sota el cervell que regula el sistema endocrí.

El tàlem està connectat amb l’escorça cerebral i amb la resta de parts del sistema nerviós central mitjanant la càpsula interna, una important làmina de substància blanca formada per fibres nervioses.

Imatge 3. Estructures que constitueixen el cervell.

8

Tronc encefàlic

El tronc encefàlic és la zona de l’encèfal que es troba entre el cervell i la medul·la espinal. Les fibres que surten del cervell s’uneixen a un conjunt de fibres nervioses que connecten les diverses zones del SNC, els peduncles cerebrals. Els dos peduncles s’uneixen i formen la protuberància anular o pont de Varoli. Aquesta protuberància és contínua amb el bulb raquidi, zona de pas entre l’encèfal i la medul·la espinal.

El tronc encefàlic es constitueix per un conjunt de fibres que pugen i baixen del cervell i del cerebel. El conjunt de fibres que regulen la contracció muscular voluntària es creuen d’un costat a l’altre del bulb raquidi. Això explica el fet que cada un dels hemisferis controli la contracció muscular del costat oposat.

La majoria dels nuclis dels nervis cranials, que comuniquen el SNC amb els receptors sensorials, les glàndules i els músculs, els situem en aquesta zona de l’encèfal. Aquests nervis són molt importants ja que transmeten la sensibilitat dels òrgans sensorials, els impulsos nerviosos de la musculatura facial així com la regulació de funcions com ara la respiració o la freqüència cardíaca. Només dos dels dotze nervis cranials, l’òptic i l’olfactori, neixen al cervell, mentre que la resta tenen l’origen al tronc encefàlic.

Cerebel

El cerebel és una massa situada sota el cervell, darrere el tronc encefàlic. Presenta una aspecte ramificat fet que justifica la seva altra denominació: arbre de la vida.

La part més superficial del cerebel és substància grisa, formada per diverses capes de neurones interconnectades. A la part interior també hi trobem substància grisa, formada per la unió dels diversos cossos neuronals. A través d’aquestes connexions, el cerebel supervisa l’activitat nerviosa, controla l’equilibri i el to muscular, i coordina els moviments voluntaris.

Medul·la espinal

La medul·la espinal és un cilindre allargat, de color blanc, que s’estén des de la base del crani fins a la zona lumbar.

Es considera que la medul·la espinal està dividida en diverses zones, les quals s’anomenen diferent en relació amb la zona de la columna vertebral per on passen els nervis que hi connecten (cervical, dorsal, lumbar, sacra...).

A la zona més superficial hi trobem un conjunt de fibres nervioses, els cordons medul·lars, que connecten entre si diverses zones de la medul·la i l’encèfal amb la pell, els músculs i els òrgans del cos. A la part central de la medul·la hi trobem substància grisa, formada per les neurones que es connecten amb les fibres nervioses procedents de la pell i òrgans, i que alhora s’enllacen amb els feixos de fibres que pugen i baixen per la medul·la.

9

Imatge 4. Parts del sistema nerviós central (SNC).

1.1.4.SISTEMA NERVIÓS PERIFÈRIC (SNP)

El sistema nerviós perifèric és la part del sistema nerviós formada pels nervis i els cossos neuronals que es troben fóra de l’encèfal i la medul·la espinal (ganglis). El SNP està format pel sistema nerviós voluntari i pel sistema nerviós involuntari o vegetatiu.

Sistema nerviós voluntari

Només hi ha una dotzena de nervis a cada costat del cos que provinguin directament del cervell o del tronc de l’encèfal, els parells cranials. Són molt més abundants els nervis raquidis, els que surten de la medul·la espinal. Cada nervi raquidi es compon de dues arrels: l’arrel anterior i l’arrel posterior. L’arrel anterior surt de la part anterior de la medul·la i la formen els axons de les neurones de la prominència anterior medul·lar i fibres descendents de nivells superiors. L’arrel posterior es compon dels axons que transmeten els estímuls nerviosos procedents de la pell i el òrgans. Els cossos de les neurones que formen les fibres de l’arrel posterior es localitzen al gangli espinal o raquidi, un engruiximent d’aquesta mateixa arrel. Al gangli, hi arribem les dendrites procedents de la pell i els òrgans, i en surten els axons que transmeten els impulsos a la medul·la, on entren per la part posterior i estableixen contacte amb les neurones de la prominència posterior.

A mesura que es van allunyant de la medul·la, els diversos nervis es van ramificant i donen lloc a nervis de diàmetre inferior que es connecten amb músculs, òrgans i pell.

A la pell, els nervis acaben amb unes ramificacions fines d’estructura especial que se situen en diversos nivells i constitueixen els receptors que detecten el tacte, el dolor... També hi ha aquest tipus de terminacions nervioses als músculs i òrgans interns que permeten detectar-ne l’estat. A més de terminacions sensitives, trobem terminacions motores que transmeten impulsos i permeten la contracció muscular.

10

Sistema nerviós vegetatiu o autònom

El sistema nerviós vegetatiu és el conjunt de nervis que connecten la musculatura llisa i els receptors sensorials inconscients amb el SNC. Controla especialment el funcionament dels òrgans interns.

Algunes neurones del sistema nerviós vegetatiu es troben fora del sistema nerviós central i formen agrupacions neuronals o ganglis. A prop dels mateixos òrgans interns hi ha uns ganglis grossos, els ganglis vegetatius paraviscerals. Hi ha d’altres ganglis, anomenats ganglis simpàtics que se situen al costat de la columna vertebral, s’uneixen entre si i constitueixen les cadenes ganglionars paravertebrals, de les qual n’hi una a cada costat.

Així doncs el sistema nerviós vegetatiu està constituït per nervis que produeixen moviments involuntaris i sensacions inconscients, a través de les connexions entre els ganglis, els nervis i els receptors sensorials.

Imatge 5. Sistema Nerviós central i perifèric.

1.2.TUMORS INTRACRANIALS

El terme “càncer” fa referència a un ampli i divers grup de malalties amb característiques molt concretes per a cada tipus, però totes són el resultat d’un creixement incontrolat de les cèl·lules indiferenciades en un teixit.

En aquest treball es fa referència a un tipus concret de tumor maligne cerebral que pertany a la categoria de tumors intracranials.

11

1.2.1.Classificació i característiques generals.

Anomenem tumor intracranial tot aquell creixement cel·lular anòmal provinent dels teixits que conformen les estructures contingudes al crani, els components de les quals alteren el seu funcionament normal i es desenvolupen independentment del teixit que els ha originat.

L’origen del creixement descontrolat de les cèl·lules en aquests teixits encara no s’ha determinat malgrat s’estan fent diverses recerques. S’ha descobert que en alguns casos hi ha una relació hereditària i també amb d’altres malalties com per exemple l’esclerosi tuberosa.

Hi ha moltes maneres diferents de classificar els tumors intracraneals. Una de les més utilitzades és classifar-los en relació a la zona del cervell que afecten.

Els gliomes són tumors originats a les cèl·lules de la neuròglia, és a dir, les que formen el teixit de sosteniment i defensa del teixit nerviós. Segons el tipus de cèl·lules de la neuròglia que s’afecta, parlem de: astrocitoma, glioma de tronc encefàlic, glioblastoma multiforme, medul·loblastoma, oligodendroglioma, ependimoma, meningioma, neurinoma.

Els astrocitomes són gliomes originats als astròcits i constitueixen al voltant del 10% del total de tumors intracranials. En relació a la zona on s’expandeixen tenen unes característiques exclusives. Un dels astrocitomes més comuns, que apareix al voltant del 20 anys, és l’astrocitoma cerebral, localitzat als hemisferis cerebrals. També trobem els astrocitomes cerebel·losos, que són freqüents a la població més jove, de 5 a 10 anys, així com el glioma de tronc encefàlic també molt abundant en aquesta franja d’edat. Un altre tipus de glioma, és el glioblastoma multiforme (GMB), sovint anomenat glioblastoma o astrocitoma maligne. Aquest, constitueix el 50% dels gliomes i és molt freqüent entre els 50 i els 60 anys, especialment en els homes. Es caracteritza per un ràpid creixement del tumor que passa de la substància blanca als diferents hemisferis cerebrals i fins i tot pot arribar a atènyer l’escorça cerebral i després al líquid cefaloraquidi, a través del qual es difondrà a d’altres parts del sistema nerviós centrals, a l’encèfal o a la medul·la espinal. (s’ampliarà més endavant ja que és el tumor tractat en aquest treball).

Altres tipus de gliomes són el medul·loblastoma, el qual deriva de les cèl·lules embrionàries que procedeixen del cerebel, els oligodendrogliomes, els ependimomes, els meningiomes i els neurinomes (originats a les cèl·lules de Swhann).

A l’interior del crani també hi podem localitzar tumors congènits, els quals són derivats de les cèl·lules de l’embrió que, en el curs del desenvolupament, creixen de manera anormal i originen masses tumorals. Dins la gran varietat de tumors congènits el craniofaringioma i el tumor epidermoide en són els més destacats.

A part dels gliomes, també trobem altres categories de tumors intracranials: adenomes pituïtaris (tumors de la hipòfisis), pinealomes (tumors de la glàndula pineal, localitzada

12

entre els dos tàlems), tumors dels ossos del crani (afecten a l’estructura òssia del crani), tumors vasculars (originats als vasos de l’encèfal)...

Imatge 6. Localització d’alguns dels tumors intracranials més freqüents.

TUMORS INTRACRANIALS

Gliomes

Astrocitoma

De tronc encefàlic

Glioblastoma multiforme

Medul·loblastoma

Oligodendroglioma

Ependimoma

Meningioma

Neurinoma

Tumors congènits Craniofaringioma

Epidermoide

Altres tipus destacats

Adenomes pituïtaris

Pinealomes

Tumors dels ossos del crani

Tumors vasculars

13

Hi ha d’altres menes de classificar-los: si són tumors benignes o malignes, o si són primaris o secundaris.

*METÀSTASI: propagació de cèl·lules cancerígenes d’una part del cos a una altra. Com a resultat de la metàstasis es poden formar nous tumors, els quals rebran el mateix nom i tindran el mateix tipus de cèl·lules que el càncer primari.

En relació amb el els tumors intracranials, la majoria de tipus no formen metàstasis, a excepció d’un 10-20%. Això sí, no sempre els tumors intracranials són primaris, és a dir, que hi ha tumors malignes com el de pulmó que solen derivar a un tumor intracranial com a resultat de la metàstasis. Aleshores, parlarem d’un tumor intracranial secundari.

1.2.2.Símptomes.

Els símptomes que provoquen els tumors intracranials depenen del tipus de tumor que es tracta, perquè aquests varien en relació amb la localització i el desenvolupament de la pròpia tumoració. Tot i això, hi ha una sèrie de símptomes neurològics característics, pel fet que el seu creixement provoca una hipertensió intracranial, és a dir, un augment de la pressió interior del crani.

El crani dels adults és rígid i per tant, encara que s’hi desenvolupi una tumoració a l’interior no es pot expandir cap enfora. Això provoca que es desplacin i es pressionin les estructures de l’interior del crani. A mesura que el tumor creix, el líquid cèfalo-raquidi, que circula per l’interior dels ventricles cerebrals i per l’espai comprès entre les membranes meníngies que envolten completament l’encèfal, s’acumula als espais


BENIGNES: tumor que creix sense envair els teixits veïns i en la majoria dels casos amb un bon pronòstic. En el cas concret dels tumors intracranials, aquesta afirmació no és del tot certa. La benignitat d’un tumor depèn sobretot de la velocitat amb què creix, la delimitació i la localització.

MALIGNES: tumor que creix envaint teixit veïns, que provoca la reaparició dels tumors després del tractament i, en alguns casos, metàstasis*.


PRIMARI: tumor que es situa al lloc en el qual es va originar en un primer moment. Per exemple, els diversos tipus de glioma.

SECUNDARI: tumor que s’origina com a resultat d’una metàstasis, és a dir, de l’extensió de cèl·lules cancerígenes del teixit original del tumor, cap a d’altres.

14

que queden lliures, incrementa la pressió cranial i provoca una compressió de tot l’encèfal.

El primer indicador d’un augment de la pressió intracranial, és la cefalea. Aquest símptoma, el qual afecte a la majoria del pacients amb aquesta patologia en algun o altre estadi del desenvolupament tumoral, consisteix en un mal de cap continu, generalment persistent i d’intensitat variable. Aquest indicador és molt comú en els astrocitomes cerebrals, els glioblastomes multiformes i els oligodendrogliomes.

Molts tumors també irriten el centre del vòmit, localitzat al tronc encefàlic i provoquen el vòmit, generalment sense nàusees prèvies. Si hi ha una gran compressió sobre el tronc encefàlic, podrien afectar els nuclis nerviosos que controlen les funcions vitals. La compressió d’aquests nervis pot generar canvis en la freqüència cardíaca, la pressió sanguínia, la respiració o la regulació de la temperatura corporal. En principi aquests trastorns no són de molta importància, però en fases avançades poden arribar a causar la mort.

Imatge 7. Centre del vòmit.

Una quarta part dels tumors intracranials provoca símptomes mentals, com ara els canvis de conducta, la somnolència, irritabilitat, pèrdua de la memòria,... També són freqüents els trencament del vasos sanguinis propers al tumor que provoquen hemorràgies internes i es manifesten amb un accident vascular, així com la pèrdua de visió a causa de la compressió del nervi òptic i dels vasos sanguinis que irriguen la retina.

A més dels símptomes generals relatius a la hipertensió intracranial, cada tumor provoca una sèrie d’efectes sobre l’individu relacionats amb el desenvolupament i les característiques pròpies del tumor.

1.2.3.Diagnòstic.

Els primers indicadors que insinuen la presència d’un tumor intracranial, són els símptomes descrits en l’aparat anterior. També és molt orientadora l’exploració neurològica, que inclou l’examen de la força muscular i els reflexos de totes les parts

15

del cos. Si els resultats són dubtosos o presenten alguna irregularitat, en general es realitzen radiografies del crani, que posen en evidència algunes alteracions. Igualment, se sol practicar una audiometria i una exploració de l’ull per mirar si hi ha hagut una afectació d’aquesta zona.

Imatge 8. Radiografia del crani..

La punció lumbar es realitza en cas d’una possible invasió del líquid cèfalo-raquidi. No és una pràctica molt comú ja que en cas que el tumor hagi provocat una hipertensió intracranial important, pot ser perillosa.

La tomografia axial computada o TAC és un mètode de diagnosi de tumors cerebrals molt emprat ja que pot detectar amb nitidesa tumors fins de 5mm de diàmetre. Encara és més sofisticada la tècnica de TEP (tomografia amb emissió de positrons), que subministra gran informació sobre el flux sanguini i el metabolisme cerebral.

En les primeres etapes del desenvolupament del tumor, les dimensions del tumor poden ser insuficients com per ser visualitzat en un TAC. Aleshores generalment es fa una ressonància magnètica nuclear (RMN). En certes ocasions, també s’utilitza l’arteriografia cerebral per tal d’estudiar la vascularització d’un tumor. Aquesta tècnica és molt pràctica per preparar una operació quirúrgica d’extirpació del tumor, per tenir coneixement dels vasos sanguinis propers al tumor i els que el nodreixen.

L’electroencefalograma, o EEG, s’empra per al diagnòstic de trastorns en algun punt de l’escorça cerebral o per a localitzar tumors dels hemisferis cerebrals propers a l’escorça.

Malgrat tots aquests mètodes ens poden ajudar a diagnosticar un tumor intracranial en un pacient, la naturalesa exacta del tumor només es pot determinar mitjançant l’estudi microscòpic d’una mostra del teixit tumoral. L’estudi histològic s’efectua després d’una intervenció quirúrgica, procediment que constitueix el tractament més comú d’un tumor d’aquest tipus.

16

Imatge 9. Exemples de imatges del cervell a través de EEG, TAC, TEP i IRM.

1.2.4.Tractament.

El tractament depèn del tipus de tumor intracranial que presenta el pacient. Malgrat això, en la majoria de casos, els oncòlegs recorren a una intervenció quirúrgica, molt útil si es tracta d’un tumor benigne localitzat en una zona de fàcil accés. No s’utilitzarà la cirurgia si el tumor és molt extens i afecta estructures vitals o zones inaccessibles.

També s’utilitzen molt els tractaments de radioteràpia i quimioteràpia, generalment combinada amb cirurgia, perquè redueix la grandària del tumor. Aquest mètode s’empra molt sovint quan no s’ha pogut fer una extirpació completa del tumor i es vol evitar el desenvolupament de la massa tumoral.

Per a atenuar els símptomes, s’utilitzen medicaments per combatre la hipertensió intracranial, com els corticoides.

1.2.5.Pronòstic.

Els tumors intracranials constitueixen la segona causa neurològica de mort, després dels accidents vasculars.

En el següent gràfic hi podem observar la probabilitat de supervivència de pacients amb tumors als sistema nerviós central detectats a Girona del 1994 fins el 2005*.

Al cap d’aproximadament 5 anys de la detecció i tractament del tumor, el percentatge de supervivència va ser de 15,3%, més alt en les dones (16,5%), que en els homes (14,3%).

17

Imatge 10. Corba de supervivència de pacients diagnosticats amb un tumors del SNC. (Girona, 1994-2005).

Però cal tenir en compte els diversos subtipus de tumors i els seus respectius percentatges de supervivència, ja que cada tumor té una agressivitat i resistència específica. La supervivència va ser de 15,5% en els astrocitomes, 41,6% en els oligodendrogliomes i oligoastrocitomes, de 42,7% en tumors d’ependimoma, de 33,4% en els tumors embrionaris i de 5,2% en els glioblastomes.

* Rafael Fuentes-Raspal, Loreto Vilardell, Ferran Perez-Bueno, Carmen Joly, Maria Garcia-Gil, Adelaida Garcia-Velasco, Rafael Marcos-Gragera. Population-based incidence and survival of central nervous system (CNS) malignancies in Girona (Spain) 1994–2005. J Neurooncol (2011) 101:117–123. DOI 10.1007/s11060-010-0240-7. 1.2.6.Glioblastoma multiforme (GBM)

Després d’una visió general dels tumors intracranials, els efectes, el seu tractament i pronòstic, ens centrem en el tumor que s’estudia en aquesta recerca, el glioblastoma multiforme o GBM.

És el tumor intracranial primari del SNC més freqüent. Va ser identificat per Virchow l’any 1863 com a tumor d’origen glial. L’any 1926 Bailey i Cushing van canviar la nomenclatura d’espongioblastoma multiforme pel terme de glioblastoma multiforme, ja utilitzat per Mallory l’any 1914. La denominació “multiforme” està relacionada amb l’aspecte molt variable d’aquest tumor maligne tant macro com microscòpicament.

Generalment el trobem localitzat a la substància blanca cerebral i afecta els lòbuls frontal, temporal i parietal. També és possible que el tumor travessi el cos callós i afecti els dos hemisferis cerebrals.

Hi ha una certa confusió alhora de classificar-lo. Alguns científics el consideren un subtipus d’astrocitoma però d’altres, consideren que les característiques són molt pròpies i per tant, que s’hauria de classificar com a grup independent.

18

Quant als símptomes, el glioblastoma multiforme pot presentar-se amb cefalea, convulsions, dèficits neurològics focals, trastorns de coordinació, alteració de la memòria, limitacions de la parla i comprensió, accidents vasculars cerebrals (ACV) i canvis de personalitat, irritabilitat, agressivitat...

El GBM és el tumor intracranial més freqüent en adults d’entre els 50 i els 60 anys. Representa el 50% dels total de tumors de la glia i predomina en el sexe masculí. Malgrat és molt infreqüent que es presenti abans dels 30 anys, també s’han descrit casos de glioblastomes en infants o en nadons de pocs mesos de vida. Tot i que es tracta d’un tumor que rarament forma metàstasis, el GBM és el tumor intracranial més maligne a causa del seu ràpid i agressiu desenvolupament. El temps de supervivència dels pacients és de només 15 mesos tot i els tractaments, com podem observar en la següent gràfica.

Imatge 11. En aquest gràfic podem observar el percentatge de supervivència en pacients tractats només amb radioteràpia, o amb radioteràpia i quimioteràpia. Es pot observar que la probabilitat de supervivència disminueix a mesura que passa el temps, i als 15 mesos ja està per sota del 50%, independentment del tractament. Així doncs, el glioblastoma multiforme és un càncer freqüent entre la població adulta i alhora mortífer. A més a més, no es coneix un tractament que sigui decisiu per l’eliminació d’aquest tumor i això dificulta molt la supervivència dels afectats. És per aquesta raó, que el centre de recerca de la Vall d’Hebron, així com altres centres d’arreu del món, estan estudiant les característiques del tumor per tal de trobar fàrmacs que podrien salvar la vida d’un percentatge molt elevat de població.

1.3.CÈL·LULES MARE

Les cèl·lules mare són cèl·lules no especialitzades, indiferenciades. Però hi ha diversos nivells d’indiferenciació: cèl·lules totipotents, pluripotents o multipotents. Les cèl·lules

19

mare totipotents són aquelles que poden originar qualsevol tipus de cèl·lula, per exemple, les cèl·lules de la mòrula que, en el desenvolupament embrionari, donen tots els tipus diferents de cèl·lules de l’organisme. Les pluripotents són aquelles que es poden desenvolupar en molts tipus de teixits, però no en tots. Les cèl·lules de la massa interna de la blàstula en són un clar exemple ja que tenen la capacitat de donar els diversos tipus de cèl·lules de l’organisme, però no poden originar cèl·lules de teixits entraembrionaris, és a dir, poden originar les cèl·lules de les capes germinatives, mesoderm, endoderm i ectoderm, però no poden formar cèl·lules de la placenta, el còrion o l’amni. La següent imatge mostra els diversos teixits que hi ha en un mòrula i en una blàstula, les quals presenten cèl·lules amb diferents graus de desenvolupament.

Imatge 12. La mòrula, que és el conjunt de cèl·lules mare embrionàries (blastòcits), es forma en el primer estadi de desenvolupament d’un zigot. Per tant, les cèl·lules de la mòrula són totipotents, és a dir, que poden donar qualsevol cèl·lula. En el següent estadi de desenvolupament embrionari, es forma la blàstula que ja presenta dos grups de cèl·lules mare amb diverses línies d’especialització diferents. D’una banda trobem les cèl·lules de la zona externa o extraembrionàries, que constitueixen el trofoblast (part de la blàstula que no forma l’embrió, sinó les membranes extraembrionaries que el protegeix- còrion i amni- i que formen la placenta), d’altra banda trobem les cèl·lules de la massa interna que formen l’embrioblast (part de la blàstula que formarà l’embrió i que es divideix en ectoderm, mesoderm i endoderm en el cas dels mamífers). Així doncs, tant unes cèl·lules com les altres estan en el mateix grau de diferenciació: són pluripotents, és a dir, poden donar una varietat àmplia de cèl·lules però no totes.

Finalment trobem el mínim grau d’indiferenciació, la multipotencialitat cel·lular. Són aquelles cèl·lules mare que hi ha als teixits diferenciats i que poden originar diversos tipus de cèl·lules d’aquell teixit. Si només poden originar alguns dels tipus de cèl·lules especialitzades d’aquell teixit, s’anomenen oligopotents. En són exemple les cèl·lules

20

del moll d’ós que fan hematopoiesi i donen, o megacariòcits (unipotent) o cèl·lules mare de leucòcits (oligopotents.)

Si la cèl·lula no està indiferenciada, és a dir, està especialitzada, l’anomenem unipotent.

1.4.CITOQUINES

Les citoquines són molècules de pes molecular baix que intervenen en la regulació dels processos de divisió i diferenciació cel·lular, entre d’altres funcions.

La recerca dels últims anys ha determinat la seva importància en oncologia ja que estimulen la proliferació cel·lular i inhibeixen la diferenciació de les cèl·lules, fet que permet la proliferació del càncer.

Les citoquines actuen sobre les cèl·lules, per exemple, quan s’uneixen a receptors específics de la seva membrana o lligands. A l’unir-se als receptors de membrana de les cèl·lules, desencadenen tota una sèrie de reaccions a l’interior de les cèl·lules que provoquen canvis biològics. A més a més, les últimes recerques mostren que un alt nivell de determinades citoquines indueix a una mitosi molt accelerada. Això aplicat al càncer, podria indicar que un augment de citoquines indueix la ràpida proliferació del càncer.

Algunes citoquines també són les encarregades de l’especialització cel·lular. Si una citoquina determinada s’uneix a un marcador de membrana concret, es desenvolupen processos d’especialització cel·lular. L’especialització o diferenciació cel·lular ve determinada pel fet que cada tipus cel·lular expressa només uns determinats gens, que són els que estan relacionats amb la seva especialització, és a dir, que només transcriuen la part de la informació genètica necessària per realitzar les seves funcions. Les cèl·lules adultes o especialitzades són el resultat d’una diferenciació de les cèl·lules mare.

La possibilitat d’aplicació terapèutica d’aquests coneixements en el món de la recerca oncològica, és el que han treballat els investigadors del centre de recerca de la Vall d’Hebron. Una família de citoquines inicien un senyal en el nucli a través d’una interacció lligand-receptor. Aquest senyal provoca que s’activi la transcripció de diferents gens, és a dir, que l’ADN passi la seva informació a una molècula de ARN i aquest, en el reticle endoplasmàtic, dirigeix la síntesi de la corresponent proteïna. En el cas concret de l’estudi que està realitzant aquest centre de Barcelona, han descobert que un grup concret de citoquines provoquen la síntesi d’unes proteïnes que permeten a la cèl·lula mantenir-se indiferenciada a la massa tumoral i així esdevenir un cèl·lula mare tumoral. El fet que una cèl·lula tumoral no es diferenciï provoca que aquesta sigui molt resistent als tractaments convencionals, que doni noves cèl·lules tumorals i per tant, que en permeti la proliferació. Així doncs, podem afirmar que aquesta família de citoquines incrementa la capacitat oncogènica de les cèl·lules mare tumorals. Una possible nova línia de tractaments podria mirar d’inhibir aquestes citoquines. Així, les cèl·lules s’especialitzarien i/o es reduiria la seva capacitat de proliferació.

21

2. PART PRÀCTICA.

2.1.OBJECTIUS I HIPÒTESIS

L’objectiu d’aquest treball d’investigació és determinar l’efectivitat del fàrmac B per induir la diferenciació de les GICs i així fer més vulnerables les cèl·lules del GBM als tractaments convencionals, com és la radioteràpia.

Per tal de complir aquest objectiu s’han plantejat dues hipòtesis:

1. Els alts percentatges de CD44 o CD44-high en una preparació i per tant, un nombre elevat de cèl·lules mare, estan relacionats amb una capacitat proliferativa molt gran i amb una resistència als tractaments convencionals.

2. Si combinem el pretractament amb el fàrmac B amb la radioteràpia, la proliferació del tumor decaurà i aconseguirem reduir la massa tumoral.

2.2.PRECEDENTS

Des de fa aproximadament 6 anys s’està estudiant des de diferents fronts la biologia de les cèl·lules del GBM i les possibilitats de teràpia en relació a la histologia del tumor.

Les diverses investigacions que s’han fet en aquest camp de recerca són per exemple buscar un tractament basat en l’estructura molecular del tumor, el descobriment i el posterior estudi de les cèl·lules mare tumorals com a causants de la radioresistència i per tant, la seva implicació en el desenvolupament de nous tractaments anticancerosos, entre d’altres estudis.

També cal tenir en compte que hi ha molts centres de recerca que estan realitzant investigació en el camp de l’oncologia. Per exemple, hi ha diversos centres de recerca que estan estudiant la influència de canals de potassi en la diagnosi i tractament del càncer*. Per tant, el centre de la Vall d’Hebron de Barcelona juntament amb d’altres centres de recerca punters d’arreu del món, duen a terme investigacions per a la diagnosi i tractament del càncer a través de l’estudi molecular dels diversos tipus de tumors.

* Bernhard Hemmerlein, Rüdiger M Weseloh, Fernanda Mello de Queiroz, Hendrik Knötgen, Araceli Sánchez, María E Rubio, Sabine Martin, Tessa Schliephacke, Marc Jenke, Heinz-Joachim-Radzun, Walter Stühmer and Luis A Pardo. Overexpression of Eag1 potassium channels in clinical tumours. Molecular Cancer 2006. doi:10.1186/1476-4598-5-41.

Pardo, L.A.; Gomez-Varela, D.; Major, F.; Sansuk, K.; Leurs, R.; Downie, B.R.; Tietze, L.F.; Stuhmer, W. Approaches Targeting KV10.1 Open a Novel Window for Cancer Diagnosis and Therapy. February 2012. Current Medicinal Chemistry. Volume 19, Number 5, pp. 675-682(8).

22

2.3.PLA DE TREBALL

Per tal d’aconseguir verificar les hipòtesis, s’ha desenvolupat un esquema que servirà com a pla de treball durant tot el desenvolupament del treball de recerca.

2.4.MATERIALS

2.4.1.FACS

El FACS o FITC (Fluorescence-activated cell sorting) és un mètode de citometria de flux que permet classificar una mostra heterogènia de cèl·lules, basant-se en la dispersió de la llum i de les característiques fluorescents de les diverses cèl·lules.

Les diverses cèl·lules es marquen amb un anticòs, lligat amb un marcador fluorescent, que donarà color a les cèl·lules amb l’antigen positiu.

La mostra es passa per un feix de llum làser, que excita el marcador, i per un receptor fotoelèctric que mesura la intensitat de l’emissió fluorescent. El FACS va connectat a un ordinador, que analitza els resultats i els mostra en forma d’un gràfic. En el gràfic hi ha representades les diverses cèl·lules (cada un dels punts negres), en relació amb els nivells de fluorescència (eix de les Y) o de la mida de la cèl·lula (eix de les X).

Els alts percentatges de CD44-high en una preparació estan relacionats amb una capacitat proliferativa molt gran i amb una resistència als tractaments convencionals.

El pretractament amb el fàrmac B i tractament de radioteràpia aconsegueix una major reducció de la massa tumoral.

Obtenció de cultius provinents de tumors rics en GICs de pacients amb GBM.

Marcatge de cèl·lules tumorals (CD44) i recompte (FITC).

Marcatge de cèl·lules mortes (iodur de propidi), percentatges d’apoptosis.

Tractament amb: 1. Irradiació (Irr) 2. Fàrmac B (DRUG B) 3. Fàrmac B + Irradiació (IRR+DRUG B) - Hi ha un grup control (sense tractament)

23

Imatge 13. Gràfic del resultat del recompte de cèl·lules mitjançant el FACS.

Les cèl·lules es podran separar en base a la intensitat d’emissió de llum, per així poder estudiar les propietats biològiques concretes de cada cèl·lula.

En el cas d’aquest treball, el FACS s’ha utilitzat per calcular els nivells de CD44 de les cèl·lules canceroses així com, l’apoptosi o mort cel·lular, fent marcatge amb iodur de propidi.

El CD44 és un anticòs que permet la diferenciació de les cèl·lules mare (stem cells) de les que no ho són (non-stem cells). Els anticossos com el CD44 només tenen la capacitat d’adherir-se a uns certs tipus de lligands. Les cèl·lules tumorals que no són CICs (cancer initiating cells), no tenen aquests receptors de membrana i, per aquesta raó, els anticossos no s’hi uneixen. L’anticòs CD44 està combinat amb una proteïna que fa de marcador fluorescent i només s’unirà a les cèl·lules mare tumoral, les quals donaran alts nivells de fluorescència.

Quan s’introdueixen les preparacions al FACS, el programa d’ordinador calcula el nivell de fluorescència i això permet determinar el nombre de GICs.

Imatge 14. El FACS.

24

Imatge 15. Esquema que mostra el funcionament del FACS.

2.4.2.FÀRMAC B

Les cèl·lules mare tumorals es caracteritzen per un nivell d’indiferenciació molt alt. El fàrmac que ha estat desenvolupat al centre de Recerca VHIO de la Vall d’Hebron de Barcelona és un inhibidor que indueix a la diferenciació de les cèl·lules mare canceroses.

Totes les cèl·lules tenen una sèrie de marcadors de membrana que són específics de cada cèl·lula, s’anomenen antígens. Cada antigen té una relació exclusiva amb un anticòs concret. Diversos investigadors del centre de recerca de la Vall d’Hebron van descobrir el marcador de membrana que permetia a les GICs de mantenir-se indiferenciades i va desenvolupar un anticòs específic per a aquest lligand que bloqueja el marcador de membrana i provoca la diferenciació de la cèl·lula mare, denominat Fàrmac B en aquest treball.

Imatge 16. En la imatge es descriu el lliganque tenen, a través de diverses reaccions químiques al nucli de la cèl·lula i per tanles seves característiques. Aquest fàrmac està en fase de proves. D’una banda, s’està fent proves al laboratori (fase 1) amb cultius cel·lulars per aquest treball. D’altra banda, tapacients terminals i amb ratolins (fase 2).

2.5.MÈTODES

2.5.1. Obtenció de cultius provinent de tumors rics en GICs de p

El procés previ a aquest experiment, en el qual jo no hi he intervingut, consisteix en el procés quirúrgic d’extracció d’una mostra del tumor d’un pacient i la formació de neurosferes de glioblastoma multiforme (agrupació de cèl·lules tumpodem observar mitjançant el microscopi). Aquestes preparacions són la base del procediment seguit en els altres apartats.

Imatge 17. Neurosferes provinents d’una mostra del tumor d’un pacient.

Després del procés descrit en eprovinents de tumor de pacients. Es necessiten moltes preparacions de cada tumor ja que el comptatge per FACS de les GICs amb alts percentates de CD44 cel·lular i per tant, cada sembra només

En la imatge es descriu el lligand entre antigen-anticòs, i es que tenen, a través de diverses reaccions químiques al nucli de la cèl·lula i per tan

Aquest fàrmac està en fase de proves. D’una banda, s’està fent proves al laboratori (fase 1) amb cultius cel·lulars per tal de provar la seva efectivitat, com es mostra en

banda, també s’està provant la seva toxicitat pacients terminals i amb ratolins (fase 2).

2.5.1. Obtenció de cultius provinent de tumors rics en GICs de pacients amb GBM.

El procés previ a aquest experiment, en el qual jo no hi he intervingut, consisteix en el d’extracció d’una mostra del tumor d’un pacient i la formació de

neurosferes de glioblastoma multiforme (agrupació de cèl·lules tumpodem observar mitjançant el microscopi). Aquestes preparacions són la base del procediment seguit en els altres apartats.

Neurosferes provinents d’una mostra del tumor d’un pacient.

Després del procés descrit en el diagrama anterior es sembren diferents neurosferes provinents de tumor de pacients. Es necessiten moltes preparacions de cada tumor ja

per FACS de les GICs amb alts percentates de CD44 cel·lular i per tant, cada sembra només pot ser analitzada una vegada.

25

anticòs, i es mostra l’efecte que tenen, a través de diverses reaccions químiques al nucli de la cèl·lula i per tant, en

Aquest fàrmac està en fase de proves. D’una banda, s’està fent proves al laboratori tal de provar la seva efectivitat, com es mostra en

itat in vivo, amb

acients amb GBM.

El procés previ a aquest experiment, en el qual jo no hi he intervingut, consisteix en el d’extracció d’una mostra del tumor d’un pacient i la formació de

neurosferes de glioblastoma multiforme (agrupació de cèl·lules tumorals les quals podem observar mitjançant el microscopi). Aquestes preparacions són la base del

Neurosferes provinents d’una mostra del tumor d’un pacient.

l diagrama anterior es sembren diferents neurosferes provinents de tumor de pacients. Es necessiten moltes preparacions de cada tumor ja

per FACS de les GICs amb alts percentates de CD44 provoca mort

26

2.5.2.Marcatge amb CD44- marcador de cèl·lules mare tumorals

El CD44 és una proteïna de membrana molt abundant a les cèl·lules mare tumorals del glioblastoma multiforme (o GICs) i això permet el comptatge del percentatge de cèl·lules mare en una mostra. Els anticossos detecten aquest marcador de membrana i s’hi uneixen en una reacció d’antigen-anticòs.

Per aconseguir la màxima separació de les cèl·lules, es col·loca la mostra líquida en diversos Eppendorfs i es centrifuga de manera que les cèl·lules queden adherides a la part inferior del tub i es pot aspirar el líquid sobrenedant, el qual no té contingut cel·lular. Es neteja les cèl·lules amb PBS (phosphate buffered saline), que és un tampó amb una concentració isotònica, i per tant no provoca la turgència i lisi de les cèl·lules per osmosi.

La preparació es torna a centrifugar i a separar el líquid acel·lular. S’hi afegeix ACCUTASE que és un reactiu que disgrega les agrupacions cel·lulars. Després del cicle de centrifugació i aspiració del líquid sobrenedant, ja es tenen les cèl·lules completament separades.

S’afegeix immunoglobulina humana G (IGg), que és un anticòs humà que bloqueja la resta de receptors de membrana. Aquest procés es realitza per evitar que el marcador s’uneixi a una cèl·lula que no té el receptor que estem estudiant a causa d’un error i provoqui que el recompte sigui imprecís. Això ens permet obtenir resultats el màxim d’acurats.

Es combina l’anticòs CD44 amb una proteïna de fluorescència verda (FITC). Aquest anticòs, juntament amb el marcador fluorescent, s’uneix al marcador de membrana CD44 de les cèl·lules de la preparació.

Imatge 18. ESQUEMA DEL MARCATGE DE LES CÈL·LULES AMB CD44.

Com que les CICs (cancer initiating cells) tenen alts nivells d’aquesta proteïna de membrana, el percentatge resultat es correspon al de les cèl·lules mare tumorals. Amb aquest mètode, s’aconsegueix determinar el percentatge de CICs que hi ha en la preparació. Això serà útil per tal de determinar si es compleix la hipòtesis sobre la major resistència de les GICs (cèl·lules mare del glioma) enfront als tractament de quimioteràpia i radioteràpia.

27

Imatge 19. EXEMPLE DE MARCATGE DEL CD44. En l’eix de les Y, s’observen els nivells de fluorescència (FITC-FL1 és el canal del FACS que calcula els nivells de color verd). Les cèl·lules situades a la part superior del gràfic tenen alts nivells de CD44 perquè tenen un gran contingut d’anticòs que genera alts nivells de fluorescència. En aquest gràfic hi ha un total de 13,52% de cèl·lules mare tumorals de glioblastoma (per sobre de la línia).

2.5.3.Marcatge amb iodur de propidi- apoptosis.

Utilitzem el FACS per calcular el percentatge de mort cel·lular en les diferents mostres.

El iodur de propidi és un marcador fluorescent que entra a l’interior de les cèl·lules que tenen la membrana trencada i que per tant, han patit o estan patint apoptosis. A més a més, aquest marcador emet una fluorescència des de l’interior de les cèl·lules, la qual és mesurada pel FACS i així es determina el nombre de cèl·lules que han permès l’entrada del iodur propidi al seu citoplasma i per tant, el nombre de cèl·lules mortes.

Els valors obtinguts per aquest mètode s’han de normalitzar per al valor inicial de cèl·lules de cada mostra. A més a més, gràcies al marcatge amb el iodur de propidi, es poden descartar les cèl·lules mortes en el cas que es vulgui estudiar les característiques cel·lulars de les vives. El procés es repeteix en els dies 1, 5, 10, 15 i 20, per tal d’analitzar la proliferació de les cèl·lules i l’efectivitat dels tractaments (irradiació i DRUG B).

Imatge 20. ESQUERRA- MIDA I COMPLEXITAT CEL·LULAR. Les cèl·lula que es troben al centre de l’eix de coordenades són cèl·lules mortes o fragments cel·lulars. El comptatge

28

cel·lular només es fa amb les cèl·lules contingudes a l’interior del contorn vermell, que es correspon a les cèl·lules vives.

Imatge 21. DRETA- MARCATGE AMB IODUR DE PROPIDI. Es tracta d’un gràfic que mostra els resultats de la mateixa mostra que en la figura 20. FL3 capta la fluorescència vermella o taronja del iodur de propidi. La membrana de les cèl·lules mortes està trencada i per tant, el iodur de propidi hi pot entrar, són positives (part superior). Les cèl·lules vives són negatives (casella blava).

2.6.RESULTATS

2.6.1.Tractament de les cèl·lules amb DRUG B disminueix el percentatge de CD44-high.

El fàrmac B indueix la diferenciació de les cèl·lules mare tumorals i això fa que es diferenciïn i que esdevinguin non-stem cells. Per tant, nosaltres podem dir que el fàrmac B redueix el percentatge de CD44-high. Els resultats de l’experiment corroboren la nostra hipòtesis inicial.

Imatge 22. Els quatre gràfics mostren els percentatge de CD44 obtinguts de dos pacients diferents, E48 a la part superior i, E53 a la part inferior. A l’esquerra, que es correspon a les mostres sense tractar amb el fàrmac B, hi ha un percentatge superior de CD44-high (per sobre de la línia). Els percentatges de CD44-high, que es correspon amb el percentatge de GICs, són de 24,74% i 10,74%.

29

A la dreta, que són les mostres un cop tractades amb el fàrmac B, els percentatge són de només 12,18% i 4%.

Imatge 23. En aquest gràfic podem comparar els percentatges de CD44-high amb tractament i sense. Les mostres de les quals s’han extret els resultats són les mateixes que ens els gràfics anteriors.

2.6.2.La irradiació de les cèl·lules incrementa el percentatge de CD44-high: el tractament amb el fàrmac B redueix aquest creixement.

En irradiar les cèl·lules, s’aconsegueix eliminar les cèl·lules tumorals que són vulnerables als tractaments més comuns. Però les cèl·lules mare tumorals són resistents als tractaments convencionals i per tant, no s’eliminaran amb irradiació.

El fàrmac B indueix la diferenciació de les cèl·lules mare i els fa perdre la resistència a la radioteràpia, a més a més d’altres característiques. Així doncs, el percentatge de CD44 és inferior perquè el nombre de GICs s’ha reduït. Els resultats demostren que és efectiu, com es pot observar en els següents gràfics.

30

Imatge 24. Els gràfics mostren els percentatges de CD44-high en el tercer dia de comptatge. A la part superior hi ha els resultats del pacient E48 i a la part inferior es corresponen als de E53.

Imatge 25. Aquests gràfics mostren els mateixos resultats de la figura 24. La segona columna es correspon amb els nivells de CD44 a les mostres irradiades. El percentatge de CD44-high és més gran que en el grup control, en la primera columna (percentatge inicial). Això ens indica que quan s’irradien les cèl·lules, s’eliminen les non-stem cells, però no les GICs, ja que són resistents. Si comparem el resultat de la quarta columna (preparació irradiada i pre-tractada amb el fàrmac B), el percentatge de CD44-high és més baix. Els resultats verifiquen l’efectivitat del fàrmac B en fer vulnerables les stem cells a la radioteràpia.

31

2.6.3.Les cèl·lules mare del tumor glioblastoma presenten resistència als tractaments de radioteràpia: el pre-tractament amb el fàrmac B les sensibilitza a la irradiació.

Es calculen les corbes de proliferació i el percentatge d’apoptosis per determinar si el fàrmac B és o no efectiu per reduir la massa tumoral. Periòdicament es compten el nombre de cèl·lules que hi ha a cada mostra i es normalitzen els valors pel nombre inicial de cèl·lules: 5,000 cèl·lules.

El fàrmac B fa que les cèl·lules siguin més vulnerables a l’apoptosis induïda per la radioteràpia. Els resultats, com es pot comprovar en els gràfics següents, confirmen la hipòtesis que la combinació de la irradiació i el pre-tractament amb el fàrmac B provoquen un percentatge superior d’apoptosis.

Imatge 26. Aquest gràfic il·lustra les corbes de proliferació de les mostres del pacient E48 en els quatre dies que s’ha fet el comptatge cel·lular. El creixement del grup control presenta un comportament normal. La línia verda representa la proliferació de les cèl·lules només tractades amb el fàrmac B, la qual també és normal ja que el fàrmac no elimina les cèl·lules. Observem però, que hi ha un decreixement entre el tercer i el quart recompte que podríem relacionar amb un deteriorament de l’ambient i un dèficit de nutrients. Les cèl·lules irradiades no mostren la mateixa proliferació que en el grup control, però això no implica la seva efectivitat per aturar el desenvolupament de la massa tumoral. En canvi, la línia lila mostra una decreixement de la proliferació, el que indica que la combinació del pre-tractament amb el fàrmac B i la irradiació ha estat efectiva per aturar la proliferació del tumor de glioblastoma.

32

Imatge 27. Les mostres del pacient E53 també demostren l’efectivitat del fàrmac B. Les cèl·lules irradiades i pre-tractades amb el fàrmac B, no proliferen com les cèl·lules només irradiades.

33

3. CONCLUSIONS

El glioblastoma multiforme (GBM) és un tumor molt mortífer, comú entre la població adulta, tal com mostren les dades recollides en aquesta memòria. Com que afecta a la zona del sistema nerviós central, el tractament és molt complicat i fins i tot, pot arribar a ser impossible.

En el plantejament inicial d’aquest treball es va fixar l’objectiu de determinar l’efectivitat del fàrmac B per induir la diferenciació de les GICs i així fer més vulnerables les cèl·lules tumorals del GBM als tractaments convencionals. Els diferents experiments realitzats i que es descriuen en els apartats anteriors, expliquen les diverses etapes que han permès arribar a aquestes conclusions. Cal tenir en compte que els resultats obtinguts no es poden interpretar com a definitius per provar aquest tractament ja que cal fer-ne moltes rèpliques abans de posar-lo a disposició de les persones.

Una de les hipòtesis d’aquest treball és demostrar la relació que hi ha entre els alts percentatges de CD44 a la membrana cel·lular (cèl·lules mare) amb la gran capacitat proliferativa i de resistència a tractaments com la radioteràpia. Els resultats obtinguts verifiquen la hipòtesi i per tant es pot afirmar que aquesta relació existeix. Així doncs, les cèl·lules mare en el GBM són les causant de l’agressivitat i persistència del tumor i, en conseqüència, la clau per descobrir un tractament per aquest tipus de neoplàsia maligna.

El segon plantejament, que s’ha verificat amb els resultats obtinguts, és demostrar que el fàrmac B indueix la diferenciació de les cèl·lules mare tumorals (stem cells) i redueix els nivells de CD44-high.

El principal objectiu d’aquest treball és comprovar la hipòtesi inicial sobre la major reducció de la massa tumoral en combinar un pretractament amb fàrmac B amb una dosis de radioteràpia. En els diversos gràfics realitzats a partir de les dades obtingudes experimentalment, s’ha pogut observar que hi ha hagut un reducció més elevada del nombre de cèl·lules amb la combinació del pretractament i la radiació en comparació amb les cèl·lules només irradiades o amb el grup control (sense cap tipus de manipulació). Així doncs, i sense tenir en compte la necessitat de repetir-ho, es pot afirmar que els resultats obtinguts han verificat la hipòtesi i que per tant, el fàrmac B és efectiu per a debilitar les cèl·lules mare tumorals i així permetre un major efecte del tractament amb irradiació.

Cal tenir en compte que també s’ha descartat que el fàrmac B pugui induir a l’apoptosi, com s’ha observat en fer els comptatges dels cultius amb cèl·lules només pretractades. La massa tumoral ha continuat creixent però el fàrmac ha aconseguit reduir els percentatges de CD44-high, que es correspon amb el nombre de cèl·lules mare. Aquests resultats no es contradiuen amb les hipòtesis inicials, simplement mostren que la funcionalitat del tractament no és la mort de les cèl·lules tumorals, sinó la reducció del nombre de GICs.

34

Si finalment aquest fàrmac es pogués comercialitzar, podria augmentar la probabilitat de supervivència d’aquests pacients. Tot i això, el fàrmac B encara està en fase de prova, que engloba estudis in vitro i in vivo, tant en ratolins com en humans.

En el cas dels ratolins, se’ls transfereixen cèl·lules mare d’un GBM i després, són tractats amb la combinació del fàrmac B i la radioteràpia. Els investigadors segueixen el desenvolupament del tumor a traves de RMN (Ressonància magnètica nuclear o MRI), calculant els percentatges de CD44 per tal de determinar si els resultats in vivo coincideixen amb els resultats in vitro. A més a més, es calculen les corbes de proliferació per calcular la capacitat d’autorenovació de les cèl·lules després de ser tractades. Els resultats obtinguts en aquesta primera fase d’estudi són favorables. A nivell hospitalari també s’està provant el fàrmac en pacients per verificar-ne la seva efectivitat. Els resultats que s’obtinguin de tots aquests tests seran decisius i permetran, o no, que el fàrmac surti al mercat. Les dades obtingudes en els diverses etapes d’estudi del fàrmac permeten ser optimista sobre el futur d’aquest nou tractament desenvolupat al centre VHIO per la cura del glioblastoma. Però cal fer moltes rèpliques per tal de determinar, amb certesa, l’efectivitat d’aquest mètode terapèutic.

4. NOVES HIPÒTESIS

Aquesta recerca està en el primer esglaó de desenvolupament i és el principi de diferents línies d’investigació en oncologia. El mètode utilitzat en aquest estudi, primer determinant el mecanisme que utilitzen les cèl·lules i posteriorment trobant una manera de blocar-lo, podria ser un patró a seguir per tal de descobrir nous tractaments en altres tipus de càncers. La següent pregunta, per tant, és si aquest fàrmac seria efectiu o no, per tractar altres tipus de tumors.

Donat que tots els tumors necessiten cèl·lules mare (stem cells) per tal de formar-se i de proliferar, i alguns grups d’investigació han detectat la presència de CICs en diversos tumors, es creu que aquests podrien coincidir en algunes característiques amb el GBM, com per exemple la presència d’alts nivells de CD44-high o la resistència als tractaments convencionals. Així doncs, aquests tumors podrien ser tractats amb el mateix fàrmac i per tant, la combinació del fàrmac B i la radioteràpia podria aplicar-se, no només als tumors de glioblastoma, sinó també, a neoplàsies que afecten altres zones del cos. La investigació que està fent el centre de Recerca de la Vall d’Hebron, en la qual jo he participat, és la base de moltes noves línies de treball i una esperança per a totes les persones que estan patint càncer.

35

5. GLOSSARI.

1. Lligands o receptors específics de membrana: Un receptor és una molècula proteica, situada o bé a la membrana plasmàtica o al citoplasma d'una cèl·lula, a la qual es pot adherir una molècula. Una molècula que s'uneix a un receptor rep el nom de lligand, i pot ser un pèptid , una hormona, un fàrmac o una toxina, i quan es produeix aquesta unió, el receptor experimenta un canvi que generalment inicia una resposta cel·lular. Els canvis induïts pels lligands als receptors resulten en canvis fisiològics que constitueixen l'activitat biològica dels lligands.

2. Marcadors de membrana: Són proteïnes que es troben a la membrana de les cèl·lules i realitzen funcions de diferenciació i maduració cel·lular, estat d’activació cel·lular, com a receptors (antígens, immunoglobulines, citoquines...) o com a lligands.

3. Antigen: es tracta d’un tipus de marcador de membrana que pot induir a la formació d’anticossos. Pot ser una substància de l’exterior de l’organisme, com un producte químic, bacteri, virus, pol·len..., com també pot ser produïda pel propi organisme enfront de toxines o cèl·lules.

4. Anticòs: és una glicoproteïna (macromolècula formada per proteïnes i glúcids), també anomenat immunoglobulina. El sistema immunitari és l’encarregat de secretar anticossos enfront de diversos antígens per a combatre l’entrada de cossos desconeguts per l’organisme. Hi ha una relació específica entre antigen i anticòs, és a dir, que cada anticòs només s’uneix a un tipus d’antigen concret.

5. Quimioteràpia: és un tipus de tractament que es caracteritza per la introducció de productes químics per tal de combatre un virus, bacteri, fong o cèl·lules canceroses. En aquest treball quan s’utilitza el terme “quimioteràpia” es fa referència a la quimioteràpia anticancerosa, és a dir, tractament per al càncer.

6. Radioteràpia: teràpia que consisteix amb la utilització de rajos d’alta energia per a destruir o reduir-les cèl·lules tumorals d’una zona específicament delimitada. Es fa servir per tractar alguns tipus de càncers, però no tots. La radioteràpia pot actuar destruint les cèl·lules directament o bé interferint en el seu creixement.

36

6. RECERCA DEL CÀNCER EN ELS MITJANS DE COMUNICACIÓ.

Durant la realització d’aquesta memòria s’ha buscat informació en els diversos mitjans de comunicació per tal de seguir les notícies sobre l’evolució de l’estudi dut a terme per l’Institut d’Oncologia de la Vall d’Hebron en relació amb aquest treball. A l’annex I hi ha els articles de premsa escrita.

MEDI DATA TÍTOL CONTINGUT

La Vanguardia 7 d’abril 2009

Vall d’Hebron abre la vía a mejorar el tratamiento de los tumores cerebrales.

Investigadors de l’hospital de la Vall d’Hebron han descobert com progressen els gliomes i com esdevenen un dels tipus de càncers més difícils de tractar.

Els matins de TV3 http://www.tv3.cat/videos/3265755/Joan-Seoane-La-descoberta-no-ens-permet-la-deteccio-precoc-del-tumor-pero-podrem-preveuren-el-pronostic

14 de desembre de

2010

Joan Seoane: "La descoberta no ens permet la detecció precoç del tumor, però podrem preveure'n el pronòstic".

Entrevista a Joan Seoane on explica que han aconseguit identificar les cèl·lules que fan que un tumor comenci i, a partir d'aquí, han pogut atacar-les amb un fàrmac, i frenar la propagació de la malaltia.

tv1 http://www.youtube.com/watch?v=v

9aJPqN2VCk

14 de desembre de

2010

Un equipo de investigadores logra identificar las células iniciadoras del tumor cerebral

Identifiquen les cèl·lules iniciadores dels tumors cerebrals i plantegen la possible aplicació d’aquest estudi per desenvolupar noves vies terapèutiques.

La Vanguardia 5 de febrer de 2012

Seoane: “El objetivo es erradicar el tumor”.

Entrevista al Dr. Joan Seoane, director d’una investigació per trobar noves vies terapèutiques en el tractament del càncer.

Medical Express http://medicalxpress.com

19 de febrer de 2012

The USP15 biological thermostat: A promising novel therapeutic target in cancer.

Les característiques moleculars de l’enzim detectat pel centre de recerca de la Vall d’Hebron en alguns tipus de tumors indiquen que aquesta pot ser una bona via terapèutica per al tractament d’aquestes malalties.

europapress.cat 19 de febrer Descobreixen una proteïna implicada en l’expansió del tumor cerebral.

Científics del laboratori del VHIO han descobert que la proteïna USP15 està implicada en l’expansió del tumor cerebral a causa de les seves característiques moleculars.

Diari ARA http://www.ara.cat


Troben la proteïna que fa créixer alguns tumors cerebrals.

Un grup d’investigació de l’Institut d’Oncologia de la Vall d’Hebron identifica una proteïna anomenada USP15, principal responsable del creixement d’alguns tumors cerebrals i altres tumors com el de mama o d’ovaris.

37

Diario medico.com


La proteína USP15 promueve la oncogénesis en glioblastoma.

Es publiquen els resultats de la investigació, dirigida per l’Institut d’Oncologia de la Vall d’Hebron, a Barcelona, en l’edició electrònica de Nature Medicine.

Top News http://www.topnews.in/health


Promising novel therapeutic target for cancer identified.

Després de molts anys d’estudi de les bases moleculars del glioblastoma, un grup de científics ha identificat una nova via terapèutica per aquesta malaltia.

Ediciones Médicas (EMO) www.edicionesmedicas.com.ar


Identifican el termostato biológico que induce la proliferación del cáncer cerebral más común.

Un grup de recerca de la Vall d’Hebron descobreix la proteïna USP15, la qual “regula la progressió tumoral i és crítica pel desenvolupament del càncer”.

La Vanguardia 20 de febrer de 2012

Vall d’Hebron descubre una estrategia para atacar tumores cerebrales.

El centre de recerca de la Vall d’Hebron identifica l’enzim USP15 i proposa una nova via de tractament dels tumors cerebrals.

La Voz de Galicia http://www.lavozdegalicia.es


Descubren una nueva vía terapéutica contra el cáncer.

La identificació de la USP15 i l’estudi del seu funcionament biològic permetrà desenvolupar fàrmacs per lluitar contra alguns tipus de càncers, com el de glioblastoma.

324 http://www.324.cat/noticia/1605872

/societat/Un-equip-de-la-Vall-dHebron-descobreix-un-tractament-per-frenar-el-cancer-cerebral-mes-

agressiu-i-mes-comu


Un equip de la Vall d'Hebron descobreix un tractament per frenar el càncer cerebral més agressiu i més comú

El Nature Medicine publica una investigació realitzada per l’Institut d’oncologia de la Vall d’Hebron que pot representar un avenç per a una part dels afectats pels tumors cerebrals més agressius. S’emmarca en el camp de recerca que busca entendre els mecanismes genètics del càncer per poder desactivar-los.

El Periódico 27 de febrer del 2012

Un “cavall de troia” per lluitar contra el tumor cerebral.

Dos equips de científics catalans treballen conjuntament en una nova estratègia contra els tumors cerebrals bassada en l’ús d’unes petites molècules capaces de travessar les barreres defensives del mateix òrgan.

ecancertv http://ecancer.org/tv/pubdate/1548

16 de juliol de 2012

Highlights of the 22nd EACR meeting and tackling glioblastoma

Entrevista al Dr. Joan Seoane on explica els nous avenços en la recerca d’un tractament pel GBM i destaca la importància del treball multidisciplinari per aconseguir millorar els mètodes de tractament, fins ara insuficients.

38

“Tinc una idea” rtve.es http://www.rtve.es/alacarta/videos/ti

nc-una-idea/tinc-idea-joan-seoane/1538001/

27 de setembre de

2012

Tinc una idea - Joan Seoane Joan Seoane és el director d’un nou programa que busca guanyar la batalla al càncer i que funciona a l'hospital de la Vall d'Hebron. Aquest programa explica les diverses disciplines professionals implicades en aquest estudi: neurocirurgians, oncòlegs, patòlegs i investigadors.

39

7. BIBLIOGRAFIA

Pàgines web. MedicalNet.com, Medical dictionary. California: MedicalNet.com; 1996 [actualitzada el 14 de juny de 2012; accés 31 de juliol de 2012]. Disponible a: http://www.medterms.com/script/main/art.asp?articlekey=38747 Boston University; iGEM 07. Boston: Boston University; 2007- [actualitzada el 11 de Juny de 2007; accés el 31 de juliol de 2012]. Disponible a: http://2007.igem.org/wiki/index.php/Boston_University/Fluorescence-Activated_Cell_Sorting Ángel Luis García Villalón. El sistema nervioso central. Madrid: Àngel Luis García Villalón.; 2000- [actualització el 12 de gener de 2000; accés el 3 d’agost de 2012].Disponible a: www.uam.es/personal_pdi/medicina/algvilla/fundamentos/nervioso/central.htm Col·legi oficial Infermeres i Infermers, Infermera virtaul. Barcelona: Col·legi oficial Infermeres i Infermers; 2005- [actualitzada el 16 de juny de 2012; accés el 4 d’agost de 2012]. Disponible a: www.infermeravirtual.com Medicapanamericana.com, Editorial medica panamericana. Madrid: Medicapanamericana.com; 2010- [actualitzada el 4 d’agost de 2012; accés el 5 d’agost de 2012]. Disponible a: www.medicapanamericana.com/tortosa University of Aberdeen aye-Switch; iGEM 10. Aberdeen: University of Averdeen; 2010- [actualitzada el 8 de novembre de 2010; accés l’1 d’agost de 2012]. Disponible a: http://2010.igem.org/FACS_analysis_of_fluorescent_proteins

Imatges.

Imatge portada: http://www.latidosdenervion.com/2010/06/magnifico-dardo.html

1. http://www.enciclopedia.cat/fitxa_v2.jsp?NDCHEC=0126187

2. http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_09.htm

3. http://www.enciclopedia.cat/fitxa_v2.jsp?NDCHEC=0090194

4. http://www.definicionabc.com/social/sistema-nervioso-central.php

5. http://www.ms-gateway.ie/my-life-with-ms/introduction/what-is-ms-179.htm

6. http://www.saintjosephsgammaknife.org/brain-tumors-types

7. http://www.cesamet.com/hcp-nausea-and-vomiting-pathways.asp

8. http://www.radiologictechnology.org/content/82/4/387.citation

40

9.http://psi-anjen.blogia.com/2007/112701-metodos-de-exploracion-cerebral.-eeg-tac-tep-e-irm.php

10. Rafael Fuentes-Raspal, Loreto Vilardell, Ferran Perez-Bueno, Carmen Joly, Maria Garcia-Gil, Adelaida Garcia-Velasco, Rafael Marcos-Gragera. Population-based incidence and survival of central nervous system (CNS) malignancies in Girona (Spain) 1994–2005. J Neurooncol (2011) 101:117–123. DOI 10.1007/s11060-010-0240-7. 11. Nature Reviews Neurology 1, 88-95 (December 2005) | doi:10.1038/ncpneuro0045. Drug Insight: temozolomide as a treatment for malignant glioma—impact of a recent trial. 12. http://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell 13. Gràfic realitzat durant la recerca. 14. Imatge d’obtenció pròpia durant la recerca.

15. http://2010.igem.org/FACS_analysis_of_fluorescent_proteins.

16. http://descubrelainmunologa-m1.blogspot.com.es/2011/04/los-antigenos.html

17. Imatge cedida pel centre de Recerca de la Vall d’Hebron.

18- 27. Gràfics realitzats durant la recerca.

Llibres.

1. WEINBERG, Robert A. The biology of cancer. New york: Garland Science, 2006.

2. CALDUCH, Josep H. Enciclopèdia de Medicina i Salut, volum 2. Barcelona: Enciclopèdia Catalana, 1999.

Articles.

1. Seoane, J. Cell Cycle. Landes Bioscience. 2009; 3787-3805.

2. Sanchís García, MJ. Tumores gliales astrocitarios de alto grado. 2009; Doctoral thesis, Valencia.

3. Judit Anido, Andrea Sáez-Borderías, Alba Gonzàlez-Juncà, Gerard Folch, Laura Rodón, Maria A. Carmona, Rosa M. Prieto-Sánchez, Ignasi Barba, Elena Martínez-Sáez, Ludmila Prudkin, Isabel Cuartas, Carolina Raventós, Francisco Martínez-Ricarte, M. Antonia Poca, David García-Dorado, Michael Lahn, Jonathan Yingling, Jordi Rodón, Juan Sahuquillo, José Baselga, Joan Seoane et al. Cancer Cell 2010. Vall d’Hebron Institute of Oncology.

41

Recerques.

1. Tetyana Denysenko, Luisa Gennero, Maria Augusta Roos, Antonio Melcarne, Carola Juenemann, Giuliano Faccani, Isabella Morra, Giovanni Cavallo, Stefano Reguzzi, Gianpiero Pescarmona and Antonio Ponzetto. Glioblastoma cancer stem cells: heterogeneity, microenvironment and related therapeutic strategies Cell biochemistry and function. Wiley InterScience. (www.interscience.wiley.com). 2010; 28: 343–351. DOI: 10.1002/cbf.1666.

2. Sith Sathornsumetee, David A. Reardon, Annick Desjardins, Jennifer A. Quinn, James J. Vredenburgh, Jeremy N. Rich. Molecularly Targeted Therapy for Malignant Glioma. Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). 2007; DOI 10.1002/cncr.22741.

3. Atsushi Natsume, Sayano Kinjo, Kanako Yuki, Takenori Kato, Masasuke Ohno ,Kazuya Motomura, Kenichiro Iwami, Toshihiko Wakabayashi. Glioma-initiating cells and molecular pathology: implications for therapy. The Japan Society of Brain Tumor Pathology. 2011; DOI 10.1007/s10014-010-0011-3.

4. Shideng Bao, Qiulian Wu, Roger E. McLendon, Yueling Hao, Qing Shi, Anita B. Hjelmeland, Mark W. Dewhirst, Darell D. Bigner & Jeremy, N. Rich. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature Science. 2006; Vol 444. doi:10.1038/nature05236.

5. Jialiang Wang, Timothy P. Wakeman, Justin D. Latha, Anita B. Hjelmeland, Xiao-Fan Wang, Rebekah R. White, Jeremy N. Rich, and Bruce A. Sullenger. Notch Promotes Radioresistance of Glioma Stem Cells. Stem Cells. 2010; 28(1): 17–28. doi:10.1002/stem.261.

6. Lin Cheng, Shideng Bao, Jeremy N.Rich. Potential Therapeutic Implications of Cancer Stem Cells in Glioblastoma. Biochem Pharmacol. 2010; 80(5):654-655. Doi: 10.1016/j.bcp.2010.04.035.

8. AGRAÏMENTS

Aquest treball no hauria estat possible sense l’ajuda de: Dr. Joan Seoane i Alba Gonzàlez, Vall d’Hebron Institut d’Oncologia, Barcelona. Dr. Fransesc Soler, Institut Català d’Oncologia (ICO), Girona. Bernadeta Fàbrega, Laboratori d’Anatomia Patològica, Hospital Trueta. Concepció Ferrés i Roser Melià, IES-SEP La Garrotxa. El programa de Joves i Ciència de CatalunyaCaixa. A tot l’equip docent de l’Escola Pia d’Olot. Vull dedicar aquest treball especialment al meu avi.

42

ANNEXOS

43

ANNEX I

RECERCA DEL CÀNCER EN ELS MITJANS DE COMUNICACIÓ

64

ANNEX II

FOTOGRAFIES

65

Preparació de les mostres per al comptatge mitjançant el FACS (Laboratoris VHIO)

Observació de neurosferes al microscopi (Laboratoris VHIO)

Preparació de les cèl·lules amb el marcador per realitzar el comptatge cel·lular (laboratoris VHIO)

Neurosferes ( Foto Laboratoris VHIO)

66

ANNEX III

ARTICLE PRESENTAT AL PROGRAMA JOVES I CIÈNCIA DE CATALUNYACAIXA,

CLAU D’INICI D’AQUESTA MEMÒRIA

gener 2012

67

Intra-tumoral heterogeneity, cancer stem cells and application in cancer treatments

ABSTRACT

The results I am presenting in this article were obtained in collaboration with the group of Dr. Seoane. This group is mainly working on glioblastoma multiforme (GBM) tumors, the most aggressive and deadliest form of brain tumor. They are studying the molecular mechanisms that drive this tumor in order to improve the treatments for this disease.

The team in Vall d’Hebron has discovered that there is one type of cell which is the key to cancer treatments, the glioma stem cell, or glioma initiating cells (GIC)1. GICs are the tumor-initiating cells and are responsible for proliferation, recurrence and resistance to conventional therapies.

The study of molecular mechanisms involved in the control of GICs, specifically cytokines, is the critical therapeutic target in this tumor.

The main objective of this project is to study the effectiveness of combining the use of a newly developed drug, which is in clinical trials in GBM patients in Vall d’Hebron Hospital, with radiotherapy which is the standard of care for GBM patients.

The results obtained from patient-derived samples suggest that the combination of these two treatments may effectively target GICs thus decreasing the probability of relapse after the treatment.

Although this treatment is in the initial stages of testing (in vitro, in vivo) current results are encouraging. There is hope that this new treatment may be used in patients in the near future in order to obtain positive results. This could open new areas of research into treatment of other tumor types.

My project includes the results of practical research being undertaken to test if this treatment may be used in future the context of anti-cancer therapy.

68

INTRODUCTION

This article is the result of an internship at the Vall d’Hebron Institute of Oncology, in the Gene Expression and Cancer group, lead by Dr Seoane. This group is mainly focused in studying the pathogenesis and gene alterations in glioblastoma, the most frequent type of brain cancer in adults. This research has two main objectives. On one hand, study the concept of intra-tumoral heterogeneity and, on the other hand, apply the results to improve treatment of this type of cancer.

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common type of central nervous system (CNS) cancer in adults and is also one of the deadliest type of cancer, with an average survival rate of only 15 months in patients despite treatment, as is shown in Fig. 1

Fig. 1.

Reference: Nature Reviews Neurology 1, 88-95 (December 2005) |doi:10.1038/ncpneuro0045. Drug Insight: temozolomide as a treatment for malignant

glioma—impact of a recent trial.

Figure 1. - In this graph we can observe the survival percentage of GBM patients treated only with radiotherapy or with radiotherapy and temozolomide (chemo-therapy). We can see that the survival rate diminishes significantly over time, with a median survival time of 15 months in most of the cases. This shows that this cancer is both one of the most common among adults and one of the most deadly.

Thus, research to find a treatment to eradicate this tumor is extremely relevant.

69

We locate GBM in the Central Nervous System (CNS), specifically in the neuroglia, which represents nearly half of the volume of CNS. The glial cells, the cells of the neuroglia, do not transmit nervous impulses, as opposed to neurons, but they can multiply and divide in the CNS when it is mature.

In case of an injury or a disease, glial cells multiply to fill in the damaged neuron positions. This is the reason why glial tumors, called gliomes, tend to be very malign, as they grow fast, are more resistant to treatment and show a high capacity for recurrence. There are six types of glial cells: astrocytes, oligodendrocytes, microglia and ependimary cells exclusively found in the CNS and Schwann cells and satellite cells present in the peripheral nervous system (PNS). GBM only affects astrocytes. Specifically, this tumor develops only in a subtype of astrocytes, fibrous astrocytes, which have characteristic long and less branched processes and are located in the white matter.

Both macroscopic and microscopic aspects, of this malign neoplasm is very heterogeneous. This is why it is called multiform.

At a clinical level, we must distinguish two subtypes of GBM according to age, genetics, evolution and prognosis: primary GBM and secondary GBM2.

Primary GBM is a cerebral type of tumor that appears de novo without evolving from a less aggressive form. It tends to show a rapid development of the clinical symptoms. Secondary GBM, however, is the result of a longer evolution of the cells. Reports show slightly higher survival rates in primary GBM. In general, though, GBM is one of the worst diagnoses because of its fast and widespread dissemination.

The project developed in Vall d’Hebron is based on the study of the tumor mass in this type of cancers. Specifically, the studies are based on the idea that in the tumor mass there is cellular heterogeneity, that is, there is morphological and functional diversity among the cells.

Recent research has shown that there is another level of heterogeneity, which has made it possible to discover stem cells, tumor-initiating cells. The so-called stem cells or Cancer Initiating Cells (CICs) share some characteristics with normal stem cells (pluripotency, self-renewal capacity, resistance to conventional therapies such as radio or chemotherapy…etc) that make them a good therapeutic target. They are responsible for the initiation of tumors once inoculated in mice and they can promote relapse after treatment. These features are the consequence of a lower level of differentiation than in non-stem cells. CICs have higher levels of CD44, which helps us to identify them in a tumor mass. The percentage of CD44-high cells correlates with the proportion of glioma initiating cells (GICs). A tumor with a lot of CD44-high cells means that there are a lot of stem cells, hence it is going to be more difficult to treat the tumor and it will be more prone to relapse.

Nowadays, cancer stem cells have become a therapeutic target in anticancer treatments and an important point in the fight against cancer, as well as one of the objectives of this research.

70

Through the research in this field, some researchers have discovered the molecular mechanisms necessary for the cancer stem cells to maintaining in an undifferentiated state.

In the case of this project, we are interested in the study of the cytokine B which is known to have an important role in maintain the GICs CD44high subpopulation3.

B is a pleiotropic cytokine which has an oncogenic role, promoting proliferation, invasion, migration, inmunosupression and metastasis.

This group has recently identified B, as a critical oncogene for glioma which maintains the GICs, thus, increase proliferation and self-renewal on the tumor mass.

We can pharmacologically block B pathway with a specific compound call DRUG B*. This compound is able to reduce the CD44high population of GICs and the combination of this drug with the radiotherapy which is the standard of care for GBM patients is decreasing the CD44high and so is sensitizing the tumoral cells to radiotherapy.

The knowledge of the molecular mechanisms involved in the biology of CICs is critical for designing anticancer treatments and for finding the way to improve survival rates among those affected by this pathology.

* No reference of the medicine is listed above as it is still under testing.

71

MATERIAL AND METHODS

SORTING WITH CD44 MARKER- STEM CELLS

CD44 is a membrane protein which is highly prevalent in stem cells and thus allows us to count the percentage of stem cells in a sample. Antibodies recognize this membrane protein.

After extraction from a patient, tumor cells are cultivated as neurospheres. In order to count the cells, clusters must be broken to obtain isolated cells.

Neurospheres are found scattered in a culture. Before starting the sorting, neuroespheres are put inside Eppendorfs. To separate them, we spin the samples for twenty seconds. Cells adhere to the bottom of the tube while the supernatant remains above. The supernatant is aspirated out as it contains no cells.

We wash the cells with Phosphate buffered saline (PBS). As it is an isotonic solution, we prevent cells from exploding through osmosis.

The preparation is spun and aspirated again and, then we add ACCUTASE, a reactive to disaggregate neurospheres; that is to say, to break cell clusters.

After another spin and wash cycle, we obtain completely separate cells.

We block nonspecific interactions with normal human IgG.

CD44 antibody is conjugated with a green fluorescent protein (FITC). Antibody specifically binds to CD44 protein and the cells that express higher levels of GICs and will have higher levels of fluorescence. In this way, are able to count the proportion of stem cells from each sample.

Preparations are incubated with the antibody refrigerated for 20 minutes at 4 degrees so the antibody can tag properly to the cell membranes. The cells are then washed with PBS and spun to collect the antibody which has not stuck to cells. Finally we add PBS to maintain the cells in suspension.

FACS4 calculates the levels of green fluorescence (FITC), which corresponds to the levels of CD44.

Fig. 2

SSC-H

FL1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

86.48 %

13.52%

72

Figure 2. EXAMPLE OF CD44 SORTING. In Y axis, we see the levels of green fluorescence (FITC-FL1 is the FACS channel that calculates green color levels). The cells found in the upper part of the graph have higher levels of CD44 because they have higher level of antibody. Above the line there are GICs, which have higher levels of CD44 than non-stem cells. In this graph there is a total of 13.5% of GICs.

SORTING WITH PROPIDIUM IODIDE – APOPTOSIS

We use FACS to calculate the percentage of apoptosis in the different samples.

Propidium iodide is a fluorescent marker used in cytofluorometry. It is introduced in dead or dying cells whose membranes are broken. It produces a certain level of fluorescence in these cells. Once the process is over, FACS analyses the preparations and determines the percentage of apoptosis using the fluorescent marker.

FACS calculates the number of cells which pass per time in a sample. Values must be normalized as function of the initial number of cells (5,000) and dead cells must be substracted using propidium iodide. The process is repeated on days 1, 5, 10, 15 and 20, to analyze cells proliferation and viability with the different treatments (radiation and DRUG B).

Fig.3 Fig. 4

Figure 3. LEFT- SIZE AND CELLULAR COMPLEXITY. Cells found in the center axis coordinates are cell fragments or dead cells. Cellular counting is only done with cells found inside the red gate. It corresponds to live cells.

Figure 4. RIGHT- SORTING WITH PROPIDIUM IODIDE. FL3 capture red/orange fluorescent of propidium iodide. The membrane of dead cell is broken or altered, thus, propidium iodide can enter in them, they are positive (upper part). Live cells are negative (blue box).

RESULTS

OBTAINING CULTURES FROM PATIENTS RICH IN CANCER STEM CELLS

The process previous to this experiment, in which I did not take part, involved the extraction of a tumor sample from a patient and the formation of GBM neurospheres. Neurospheres are a group of tumor cells which we can observe in a microscope. These samples are the basis for this research.

Fig. 5

Figure 5. Neurospheres from patie

After the process shown in the diagram, different neurospheres from the patients are sown in the cell trays. Manyof a group of cells causes apoptosis, and therefore sample is needed for each cell count

TREATMENT OF CELLS WITH DRUG B DIMINISHES THE PERCENTAGE OF CD44

CD44 is an antibody that allows us to differentiate stem cells from nonAntibodies such as CD44 only have tNon-stem cells do not have these membrane receptors and, therefore, antibodies do not tag.

CD44 antibody is conjugated with a fluorescent protein; and yield high levels of fluorescence.

When we introduce the settingsof fluorescence and, consequently, we will be able to determine the number of stem cells.

Neurospheres from patient-derived glioma sample

After the process shown in the diagram, different neurospheres from the patients are Many samples from the same patient are needed since analysis

of a group of cells causes apoptosis, and therefore cannot be reused. A different sample is needed for each cell count.

TREATMENT OF CELLS WITH DRUG B DIMINISHES THE PERCENTAGE OF CD44

CD44 is an antibody that allows us to differentiate stem cells from nonAntibodies such as CD44 only have the capacity to adhere to a certain type of ligands.

stem cells do not have these membrane receptors and, therefore, antibodies do

CD44 antibody is conjugated with a fluorescent protein; it will tag only to stem cells fluorescence.

settings in the FACS, a computer program calculates the level of fluorescence and, consequently, we will be able to determine the number of stem

73

After the process shown in the diagram, different neurospheres from the patients are are needed since analysis

e reused. A different

TREATMENT OF CELLS WITH DRUG B DIMINISHES THE PERCENTAGE OF CD44-HIGH

CD44 is an antibody that allows us to differentiate stem cells from non-stem cells. he capacity to adhere to a certain type of ligands.

stem cells do not have these membrane receptors and, therefore, antibodies do

it will tag only to stem cells

FACS, a computer program calculates the level of fluorescence and, consequently, we will be able to determine the number of stem

74

DRUG B induces the differentiation of stem cells, thus, they become non-stem cells and non resistant. Overall, we can say that DRUG B reduces CD44-high percentage. The results of this experiment corroborate the hypothesis.

Fig. 6.

Figure 6. These four graphs show the percentages of CD44 from two different patients, GBM1 in the top and, GBM2 below. On the left, there is a higher percentage of CD44-high (above the line). These samples have not been treated with DRUG B. The percentages of CD44-high (which is the percentage of GICs) are 10.74% and 24.74%.

On the right, is the graph of the treated samples by DRUG B. The percentages are lower, only of 4% and 12.18%.

e53inh.020

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

96.00%

4.00%

e53.019

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

89.26%

10.74%

e48.017

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

75.26%

24.74%

e48 inh.018

SSC-HF

L1-

H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

87.82%

12.18%

GBM 1 GBM 1 + DRUG B

GBM 2 GBM 2 + DRUG B

75

Fig. 7.

Figure 7. Here we can compare the percentages of CD44-high with treatment and without it. These are the same samples as in the previous graphs.

In conclusion, DRUG B reduces the percentage CD44-high, thus, it reduces the number of GICs in the samples.

IRRADIATION OF CELLS INCREASES THE PERCENTAGE OF CD44-HIGH: TREATMENT WITH DRUG B CAN PREVENT THIS INCREASE.

By irradiating the cells, we eliminate tumor cells that are vulnerable to conventional treatments. However, GICs are resistant to these treatments and will not be eradicated by radiation.

DRUG B induces stem cells to differentiate and to lose resistance to radio-therapy, in addition to other characteristics. In this way, CD44-high percentages are lower because the number of GICs has been reduced. Our experiment demonstrates the effectiveness. The results are represented in the following graphs:

0

5

10

15

20

25

30

E48 E53

NO DRUG B

DRUG B

GBM 1 GBM 2

76

Fig. 8.

Figure 8. The above graphs show the percentage of CD44-high. At top there are the results from GBM1 and below are the GBM2 samples. These values represent the count on the third day.

Fig. 9.

0

5

10

15

20

25

CONTROL IRR DRUG B IRR + B

GBM1

CD44- high

e48 contr.025

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

90.51%

9.49%

e53 contr.030

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

76.48%

23.52%

e53 irr.031

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

67.58%

32.42%

e53 inh.032

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

87.11%

12.89%

e53 inh irr.033

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

83.15%

16.85%

Control GBM1 e48 irr.026

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

78.90%

21.10%

e48+inh.027

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

86.12%

13.88%

e48+inh irr.028

SSC-H

FL

1-H

0 256 512 768 102410

0

101

102

103

104

90.68%

9.32%

IRR GBM1

Control GBM2

DRUG B GBM1 IRR + DRUG B GBM1

IRR GBM2 DRUG B GBM2 IRR + DRUG B GBM2

77

Figure 9. (This graphs show the same results that in fig.8 )

The second column shows the levels of CD44 in irradiated cells. The CD44-high percentage is higher than the control group in the first column (initial percentage). This indicates that when we irradiate cells, we kill non-stem cells, but GICs because they are resistant.

If we compare the percentage in the fourth column (irradiated and pre-treated with B), the percentage of CD44-high is lower. The results verify the effectiveness of DRUG B in making stem cells vulnerable to radio-therapy.

GICs SHOW RESISTANCE TO RADIATION THERAPY: TREATMENT WITH DRUG B MAKES THEM VULNERABLE

We calculate the proliferation curves and the percentage of apoptosis to determinate whether DRUG B is effective in reducing tumor mass. We count cells in the sample periodically and we normalize the values for the initial number of cells, 5,000 cells.

The drug makes cells more vulnerable to apoptosis induced by radio-therapy. On avarage, cells that were irradiated and pre-treated have a higher level of apoptosis.

Using this method, we can test whether DRUG B is effective. The graphs show the results and verify the hypothesis.

0

5

10

15

20

25

30

35

CONTROL IRR DRUG B IRR + B

GBM2

CD44-high

78

Fig. 10.

Figure 10. This graph illustrates the proliferation curve of GMB2 samples. The tumor mass; in control the group, has a natural growth. The green line represents the sample only treated with DRUG B. The proliferation continues because the drug does not kill the cells.

Irradiated samples do not show the same degree of growth as the control group but it continues to increase.

The combination of DRUG B and radiation stops the proliferation.

Fig. 11.

Figure 11. The samples of GBM1 (in this graph) also demonstrate the effectiveness of DRUG B. The irradiated and pre-treated samples do not proliferate as the irradiated cells. We not a decline in the irradiated cell count. The cells die due to a deterioration of the environment and deficiency of nutrients.

0

200

400

600

800

1000

1 2 3 4

GBM2 viable cells

E53Control

E53IRR control

E53inh

E53IRR inh

0

500

1000

1500

2000

2500

1 2 3 4

GMB1 viable cells

E48Control

E48IRR control

E48inh

E48IRR inh

GMB1 Control

GBM1 IRR

GBM1 DRUG B

GBM1 DRUG B +IRR

GBM2 Control

GBM2 IRR

GBM2 DRUG B

GBM2 DRUG B +IRR

79

DISCUSSION

The results of this experiment prove the effectiveness of DRUG B and verify our initial hypothesis.

We have been able to demonstrate that DRUG B produces glioma initiating cells differentiation and reduces levels of CD44 high GICs. When we analyze the results of combining DRUG B with radiation therapy, we see higher levels of apoptosis than in those cells that were not treated with the drug. This proves that, in addition, to differentiating GICs, DRUG B weakens the stem cells resistance to conventional treatments such as radio-therapy. DRUG B makes stem cells vulnerable to apoptosis induced by radiation.

Proliferation curves show high growth of the tumor cells in the control group. This is because no treatment has been applied to these cells and, consequently, the natural process of proliferation and self-renewal has continued. By studying the curve representing the growth of irradiated cells, we can conclude that irradiation reduces growth, but not completely. The presence of a high number of stem cells allows GBM tumor cells to proliferate.

Observing the data of cells only treated with DRUG B, we can determine that the growth of the tumor cells is not affected. This does not contradict our initial hypothesis because DRUG B does not induce apoptosis on its own. However, the growth of tumor cells has been inhibited in those cells that were both treated with DRUG B and radio-therapy.

Although this process will need to be repeated a number of times before it passes the early stages of the creation of a new treatment, current results allow us to be optimistic about the effectiveness of DRUG B in the treatment of tumors.

The Glioblastoma Multiforme tumor (GBM) is a deadly tumor, wide spread in the adult population. As it affects the central nervous system, treatment is complicated and sometimes impossible. The use of this drug tested in Vall d’Hebron on patients could increase the probability of survival. However, this drug has not been completely tested. It is important to highlight that it is being tested in vivo, both on animals and on patients. In the case of mice, GBM tumor cells are introduced into the brain and then animals are treated with DRUG B and radio-therapy. Researchers follow the development of the tumor mass by RMN (Resonance magnetic nuclear or MRI) calculating CD44 percentages in order to determine if reduction occurs as in vitro tests. So far, results of in vivo tests are positive. The toxicity of the drug is also being tested on cancer patients.

NEW HYPOTHESIS

This research is in its initial stages. The development of this drug is a starting point for different lines of research in oncology. The method this laboratory has been using_ first determining the mechanism the cells use and then finding a way to block it_ can be a pattern to follow in order to discover new treatments for other types of cancer.

80

The next question would be, then, whether this drug could be used in different kinds of tumors.

As all tumors need a stem cell population to initiate the tumor (Cancer Initiating Cells) and several groups have reported the presence of CICs in different tumor types, we think that they can share some characteristics, as for example the presence of CD44high or the radio-resistance. As they share some characteristics, we can postulate that they can be targeted with the same drug. So maybe the combination of DRUG B with radiotherapy may be effective not only in GBM but in other tumor types. This is something that can be further investigated in the future, to extrapolate our results in different tumors.

If this hypothesis is proved true, we may use new treatments, such as those discussed in this paper, to treat tumors affecting other parts of the body.

ACKNOWLEDGEMENTS

I wish to thank: Dr. Joan Seoane and Alba Gonzàlez, Vall d’Hebron Institute of Oncology, Barcelona. Dr. Francesc Soler, Institut Català d’Oncologia (ICO), Girona. Bernadeta Fàbrega, laboratory of Anatomia Patològica, Hospital Trueta. Concepció Ferrés and Roser Melià, IES-SEP La Garrotxa. Joves i Ciència program, CatalunyaCaixa.

REFERENCES

1. Seoane, J. Cell Cycle. Landes Bioscience. 2009; 3787-3805.

2. Sanchís García, MJ. Tumores gliales astrocitarios de alto grado. 2009; Doctoral thesis, Valencia.

3. Judit Anido, Andrea Sáez-Borderías, Alba Gonzàlez-Juncà, Gerard Folch, Laura Rodón, Maria A. Carmona, Rosa M. Prieto-Sánchez, Ignasi Barba, Elena Martínez-Sáez, Ludmila Prudkin, Isabel Cuartas, Carolina Raventós, Francisco Martínez-Ricarte, M. Antonia Poca, David García-Dorado, Michael Lahn, Jonathan Yingling, Jordi Rodón, Juan Sahuquillo, José Baselga, Joan Seoane et al. Cancer Cell 2010. Vall d’Hebron Institute of Oncology.

4. WEINBERG, Robert A. The biology of cancer. New york: Garland Science, 2006.

BIBLIOGRAPHY

1. Tetyana Denysenko, Luisa Gennero, Maria Augusta Roos, Antonio Melcarne, Carola Juenemann, Giuliano Faccani, Isabella Morra, Giovanni Cavallo, Stefano Reguzzi, Gianpiero Pescarmona and Antonio Ponzetto. Glioblastoma cancer stem cells: heterogeneity, microenvironment and related therapeutic strategies Cell biochemistry

81

and function. Wiley InterScience. (www.interscience.wiley.com). 2010; 28: 343–351. DOI: 10.1002/cbf.1666.

2. Sith Sathornsumetee, David A. Reardon, Annick Desjardins, Jennifer A. Quinn, James J. Vredenburgh, Jeremy N. Rich. Molecularly Targeted Therapy for Malignant Glioma. Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). 2007; DOI 10.1002/cncr.22741.

3. Atsushi Natsume, Sayano Kinjo, Kanako Yuki, Takenori Kato, Masasuke Ohno ,Kazuya Motomura, Kenichiro Iwami, Toshihiko Wakabayashi. Glioma-initiating cells and molecular pathology: implications for therapy. The Japan Society of Brain Tumor Pathology. 2011; DOI 10.1007/s10014-010-0011-3.

4. Shideng Bao, Qiulian Wu, Roger E. McLendon, Yueling Hao, Qing Shi, Anita B. Hjelmeland, Mark W. Dewhirst, Darell D. Bigner & Jeremy, N. Rich. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature Science. 2006; Vol 444. doi:10.1038/nature05236.

5. Jialiang Wang, Timothy P. Wakeman, Justin D. Latha, Anita B. Hjelmeland, Xiao-Fan Wang, Rebekah R. White, Jeremy N. Rich, and Bruce A. Sullenger. Notch Promotes Radioresistance of Glioma Stem Cells. Stem Cells. 2010; 28(1): 17–28. doi:10.1002/stem.261.

6. Lin Cheng, Shideng Bao, Jeremy N.Rich. Potential Therapeutic Implications of Cancer Stem Cells in Glioblastoma. Biochem Pharmacol. 2010; 80(5):654-655. Doi: 10.1016/j.bcp.2010.04.035.

82

ANNEX IV

PÒSTER DIVULGATIU REALITZAT PER A LA PRESENTACIÓ DE LA PART

PRÀCTICA DEL TREBALL, TANT A L’INSTITUT COM A LES NOVES

PROMOCIONS DEL PROGRAMA JOVES I CIÈNCIA.

(Original 70x100 cm.)

estudi de noves dianes terapÈutiques en el...

Documents