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Estrategias inmunológicas para el control de Mastitis
Dr. Leonardo Sáenz Iturriaga
Laboratorio de Vacunas Veterinarias
Facultad de Ciencias veterinarias y Pecuarias
Universidad de Chile
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Impacto comercial de la patología
• La mastitis es considerada la enfermedad más costosa del ganadobovino debido a que induce a una disminución entre el 4 al 30% dela producción de leche.
• Se considera que “la Mastitis representa el 70% de los gastostotales para los ganaderos”.
• La presentación subclínica es la principal forma de mastitis en losrebaños lecheros modernos, pudiendo exceder incluso el 20 al 50%de las vacas del rebaño, con una prevalencia 15 a 40 veces mayorque la presentación clínica.
• Geary et al., 2013, reveló una diferencia de hasta 29kg/vaca/305días menos de sólidos en rebaños con RCS en elestanque de leche entre 200.000-300.000 cél/ml (consideradomastitis subclínica) comparado con rebaños con RCS < 100.000cél/ml
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Desde: Gomez Arias, Marllye; 2016. UNAD
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Staphylococcus sp. 37,45%
Streptococcus sp 17,87%
Eschericha coli 8,94%.
Colombia 2003-2006
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San Martin et al 2002
VR, RM XR
Patógenos N° cepas % N° cepas %
Escherichia coli 183 40.76 40 3.95
Enterobacter spp 6 1.34 - -
Klebsiella pneumoniae 7 1.56 - -
Pseudomonas spp 3 0.67 - -
Bacilos gramnegativos NT* 4 0.89 2 0.20
SCN** 72 16.04 271 26.78
Staphylococcus aureus 73 16.25 562 55.53
Streptococcus agalactiae 8 1.78 8 0.79
Streptococcus dysgalactiae 43 9.58 33 3.26
Streptococcus uberis 15 3.34 35 3.46
Streptococcus spp 22 4.90 54 5.33
Corynrbacterium spp 9 2.00 7 0.69
Actinomyces pyogenes 2 0.45 - -
Micrococcus spp 2 0.45 - -
Total 449 100.00 1.012 100.00
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7Front. Microbiol., 28 April 2016
| https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00626
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Glándula mamaria
1. Acumulación de fluidos
presión
2. Tapón removido y esfínter
demora 2 horas en volver a
su estado
1. Esfínter muscular
estrechamente cerrado
2. Tapón de queratina
Parto y lactancia
1. Acumulación de fluidos
presión
2. Tapón removido y esfínter
demora 2 horas en volver a
su estado
Viguier, C. et al., 2006
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Sharon Elazar, Ilan Rosenshine, Nahum Y. Shipgel; The Hebrew University of Jerusalem
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Mecanismos de defensa
• Celulas somaticas: Macrofagos, linfocitos y neutrofilos.
• En infección aumenta el numero de neutrofilos englandula, con actividad fagocitica.
• Macrofagos alveolares son criticos en la señalizacióninmune, mientras que los neutrofilos son escenciales enel control y eliminación bacteriana.
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• PRR en Células Dendríticas y Macrófagos, reconocen moléculasparticulares de las bacterias y otros patógenos, denominadaspatrones moleculares asociados a patógenos (PAMP pathogenassociated molecular patterns).
• Estos PAMPs constituyen un grupo de moléculas conservadas ycompartidas por diversos grupos de microorganismos como, LPS,fragmentos de pared bacteriana, fosfolípidos, proteínas demembrana y ADN bacteriano que interactúan con PRR, tales como,TLR-4, TLR-2 y TLR-9.
• En la glándula mamaria bovina prevalecen los linfocitos con fenotipoCD8+ y en sangre periférica, predomina el fenotipo CD4+.
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Sharon Elazar, Ilan Rosenshine, Nahum Y. Shipgel; The Hebrew University of Jerusalem
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Control de una infección bacteriana
• Un efectivo control de una infección bacteriana depende de 2fuerzas opuestas
– Mecanismos específicos e inespecíficos de defensa en elhospedero.
– Expresión de factores de virulencia responsables de sobrevida yproliferación.
• La mayoría de los patógenos se limitan a proliferar en mucosa onecesitan transitar a través de ella para causar la enfermedad.
• La presencia de inmunidad local juega un rol fundamental.
• El número total de las poblaciones de leucocitos en la glándulamamaria es vital, principalmente en los inicios de la enfermedad, locual determina la duración y gravedad de la infección intramamaria.
• Las vacas que reclutan neutrófilos de forma masiva y rápida por logeneral curan espontáneamente, mientras que, vacas conrespuestas lentas o sin respuesta sufren mastitis hiperagudas oincluso formas graves de esta
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Inmunidad adquirida
• Cuatro clases de inmunoglobulinas (Ig) han sido descritas en laglándula mamaria, IgA, IgE, IgG (IgG1, IgG2) e IgM.
• Los isotipos de anticuerpos IgG1, IgG2 e IgM pueden actuar comoopsoninas mejorando la fagocitosis de neutrófilos y macrófagos.
• IgA no actúa como opsonina en la glándula mamaria bovina, sinoque induciría la aglutinación de bacterias invasoras, previniendo ladiseminación de la infección en la glándula mamaria.
• IgG1 es la subclase de anticuerpo que predomina en leche normal,debido a su transferencia selectiva a través de la barrera sangre-mamaria. Proporciona protección a través de inmunidad pasiva alternero.
• La función de IgG1 al igual que IgM sería la de neutralizar toxinasen la glándula mamaria además de bloquear la colonizaciónbacteriana y/o promover la fagocitosis de neutrófilos
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• La IgG2 es considerada como el principal anticuerpo con función deopsonina, facilitando la fagocitosis de patógenos por parte de losneutrófilos en la glándula mamaria infectada y no requiere fijacióndel complemento.
• Esto se debe a que los neutrófilos bovinos up regulan receptores dealta afinidad para la región Fc de IgG2 que estén opsonizandopatógenos al interior del tejido mamario.
• A la vez, después de la infección se suprime la transferenciaselectiva de IgG1 desde la sangre y en un tiempo de 4 a 12 horasIgG2 se convierte en el anticuerpo dominante.
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IgG1 para fijacion
del complemento
IgG2 para
opsonizacion
IgM para
neutralizacion de
endotoxina
Neutrofilos en tejido
IgG2 Fc receptor
complemento
III Panamerican Congress on Mastitis Control and Milk Quality @ 2006
Macrofgos en tejido &
neutrofilos en sangre
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CPA
MHC
LB
IL-4
IL-5
IL-13
Ac. neutralizantes
LT
M
LB
NK
IFN-Ƴ
Ac. opsonizantes
I IL-4
IL-4
Th2Respuesta
celular
IgG2
Respuesta
humoral
IgG1
IgE
Respuesta inmune
IL-12
Th1
IL-12
LT virgen
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E. Coli Staphylococcus spp Streptococcus spp
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Sharon Elazar, Ilan Rosenshine, Nahum Y. Shipgel; The Hebrew University of Jerusalem
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E. coli
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S. Aureus
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Staphylococcus aureus
Drug discovery today: Targets, Volume 10, N˚ 9, Mayo 2005
Bio-películas o biofilm• N-acetil-glucosamina
• Polisacárido intercelular de
adhesión
• Comunidades bacterianas
adheridas a un sustrato
• Enzimas codificadas por
operon ica
• Inhibición de la fagocitosis
• Colonización
• Resistencia a los AB
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Staphylococcus aureus
Cápsula
• 3 azúcares (Man- NAcA, 1-
FucNac y d-FucNAc)
• 11 serotipos, 4 caracterizados
• 2 frecuentes
• 5 y 8 comparten 12 de los 16
genes
• Prevalencia según
distribución geográfica
• Confiere resistencia a la
fagocitosis
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Staphylococcus aureus
Drug discovery today: Targets, Volume 10, N˚ 9, Mayo 2005
Toxinas
Hemolisina A• Se une a Mb. celular,
oligomeriza formando poros
y destrucción celular
• Invasión
• Se asocia a mayor
sobrevivencia intracelular
Toxina beta• Hidroliza esfingomielina
• Invasión
• Adherencia
• Escape de endosomas
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Staphylococcus aureus
Drug discovery today: Targets, Volume 10, N˚ 9, Mayo 2005
MSCRAMMs“Microbial surface
components recognizing
adhesive matrix molecules”
• Proteínas de la superficie
microbiana que interactuar con
proteínas extracelulares
Clf
• Fibrinógeno
• Adhesina
• Inhibe fagocitosis
Fbp
• Fibronectina
• Adhesina
• Sobrevivencia en etapas
tempranas de la infección
Cna
• Colágeno
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Strerptococcus spp.
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A considerar
• La defensa contra bacterias encapsuladas depende de lacapacidad fagocítica de neutrófilos y la secreción deInmunoglobulinas neutralizantes y opsonizantes.
• La presencia de IgGs anti polisacárido capsular gatilla losmecanismos por los cuales de identifica y fagocita a labacteria por opsonización.
• Sin embargo los polisacáridos capsulares generanrespuestas inmunes T independientes en las quesolamente de manera transiente se produce IgM e IgG,su inmunigenicidad es limitada y normalmente no seproduce memoria inmunológica.
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Clases de vacunas utilizadas
• Vacunas inactivadas: organismos enteros que han sido inactivadospara prevenir su multiplicación in vivo, pero que retengan suinmunogenicidad.
– La inactivación se produce generalmente usando calor (lo menosusado) o sustancias químicas (formaldehido).
– El procedimiento afecta la inmunogenicidad de los epitopes.
– Baja inmunidad celular y baja memoria
– Múltiples dosis requeridas con alto número de microorganismos.
– Alto grado de seguridad.
– Bajo costo y grado de desarrollo.
– Existen otras alternativas de inactivación actualmente enevaluación
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Evaluación y validación tecnológica de una
vacuna polivalente de subunidad contra mastitis
bovina en la zona centro y sur de Chile.
FIA PYT 0055-2012
Fondef IDeA IT15i10009
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Laboratorio de Vacunas Veterinarias
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Laboratory autorization
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Cepas de trabajo
• Cepas de E. coli : hlya, lpf, eae, sfa, pap and efa1.
• Cepas de S. aureus : clfA, fnbP, cap 5, cap 8, A-hemicaA, mecA and nuc.
• Cepas de St. Uberis : cpn60, cfu, skc/pauA, suam, hasA, hasb, hasC, gapC, oppF and lbp.
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Polisacárido conjugado
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Determinación de D.M.I.
Modelo preclínico mastitis
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Quiroga J. 2018 (tesis Magister)
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Quiroga J. 2018 (tesis Magister)
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Ensayo clínico en terreno
-45 -15 0 15 30 45 60 150 210
Parto
n=60
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Field clinical trial N°2Días de evaluación: 180 G1 (n=226): Enviracor™
G 2 (n=239): Vacuna experimental
-45 -15 0 15 30 45 60 150 210
Birth
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Field clinical trial N°3 n=240 en 2 zonas geograficas
Dias de Evaluación: 180 G 1 placebo, G 2, 3 and 4 vacuna experimental
-45 -15 0 15 30 45 60 150 210
Birth
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Las Águilas
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Las ÁguilasSanta Georgina
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Conclusiones y otros resultados
• Tesis de Doctorado en Ciencias Silvoagropecuarias y Veterinarias (Dra. Marcela Molina).
• Tesis de Magister en Ciencias Veterinarias (John Quiroga).
• Patente de invención presentada (Chile, Brasil, México y Colombia)
• 2 artículos ISI en preparación.
• Dossier de registro con la información para SAG.
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Equipo
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