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PAPEL DE LOS ENZIMAS DE MACERACIN EN LA

EXTRACCIN DE TANINOS DE LAS SEMILLAS

Jimnez-Pascual, E.; Busse-Valverde, N.; Gmez-Plaza, E.; Lpez-Roca,

J.M.; Bautista-Ortn, A.B.

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Nutricin y Bromatologa,

Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo,

30071, Murcia.

* encarnag@um.es, tel. 34968367323, fax 34968364147

RESUMEN

Los taninos se encuentran en los hollejos y en las semillas de las uvas

y son importantes en la calidad del vino tinto, ya que participan en las

sensaciones de astringencia y amargor y en la estabilizacin del color. Los

enzimas de maceracin se han utilizado tradicionalmente para mejorar la

extraccin de compuestos fenlicos de los hollejos y no se ha determinado el

papel que pueden jugar en la degradacin de las semillas y extraccin de

sus compuestos fenlicos. En este trabajo se muestra el efecto de distintas

actividades enzimticas puras y un enzima comercial en la liberacin de

taninos de las semillas de uvas de las variedades Monastrell y Cabernet

Sauvignon. Los resultados obtenidos muestran que los enzimas de

maceracin parecen favorecer la degradacin de las paredes celulares de

las semillas favoreciendo la salida de los taninos.

PALABRAS CLAVE: taninos, semillas de uva, maceracin, enzimas de

maceracin.

ABSTRACT

Tannins are localized in the grape skins and seeds and are important

for red wine quality since they participate in astringency, bitterness and color

stabilization. The maceration enzymes have been traditionally used to

improve the extraction of phenolic compounds from skins, but their role on

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the seed degradation and the phenolic compounds release have not been

determined. This work shows the effect of different pure enzyme activities

and a commercial enzyme in the release of tannins from seeds of Monastrell

and Cabernet Sauvignon grape varieties. The results demonstrate that the

maceration enzymes seem to favour the degradation of seed cell walls,

promoting the diffusion of tannins.

KEYWORDS: tannins, grape seeds, maceration, maceration enzymes

INTRODUCCIN

Los taninos estn localizados en los hollejos y semillas de la uva y su

concentracin y composicin dependen del tejido donde se encuentren

(Bourzeix et al., 1986; Ricardo da Silva et al., 1991). Las semillas contienen

mayor concentracin de taninos que los hollejos y mayor proporcin de

unidades galoiladas (Labarbe et al., 1999; Prieur et al., 1984), mientras que

los hollejos contienen subunidades de epigalocatequina en su estructura

(Labarbe et al., 1999; Souquet et al., 1996) y presentan mayor grado de

polimerizacin que los taninos de las semillas (Cheynier et al., 1997;

Moutounet et al., 1996).

En el hollejo, los taninos se encuentran en las vacuolas como taninos

condensadas, ligados a la membrana proteofosfolipdica e integrados en la

pared celular (Amrani Joutei y Glories 1994). En las semillas, los taninos

ocupan una posicin de defensa del embrin, estando presentes en la

epidermis, la parte media del tegumento externo y la capa interna del

tegumento interno (Cadot et al., 2006). Los flavanoles monomricos estn

concentrados en el tegumento externo, por tanto, estos compuestos

deberan ser particularmente extrados durante el proceso de elaboracin del

vino. Cadot et al. (2006) indicaron que la zona que se encuentra entre la

cutcula y las capas internas lignificadas del tegumento externo son, tal vez,

las ms importantes en cuanto a la concentracin de polifenoles, ya que

ellas contienen la mayor parte de compuestos solubles. La presencia del

tegumento medio, el cual es impermeable y muy duro, podra impedir la

extractabilidad de los compuestos fenlicos del tegumento interno durante el

proceso de elaboracin del vino.

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Durante el proceso de maceracin, estos compuestos pasan al mosto-

vino. La extraccin de taninos del hollejo, al igual que para los antocianos,

requiere la degradacin de las paredes celulares y estn presentes en el

mosto-vino desde el inicio de la maceracin. Se trata esencialmente de un

proceso de difusin y la extensin del mismo depende de su concentracin,

de la composicin de las paredes celulares y el mtodo de elaboracin

(Ortega-Regules et al., 2006; Busse-Valverde et al., 2010). En cambio,

parece ser, que los taninos de las semillas solo sern extrados hacia el final

del proceso de maceracin, cuando los lpidos de las semillas sean

eliminados (Glories y Saucier, 2000) por la presencia de altos contenidos de

etanol.

Los taninos son importantes en la calidad del vino tinto, ya que ellos

participan en las sensaciones de astringencia y amargor (Gawel, 1998; Vidal

et al., 2003) y en la estabilizacin del color (Cheynier et al., 2006). Estas

sensaciones dependen del grado medio de polimerizacin de los taninos, es

decir del tamao medio de estos compuestos, y especialmente de la

composicin de los mismos, de tal manera que la astringencia es mayor al

incrementar el grado medio de polimerizacin y el porcentaje de galoilacin

de los taninos (Llaudy et al., 2004). En cambio, la presencia de unidades de

epigalocatequina en los taninos parece disminuir esta percepcin en el vino

(Vidal et al., 2003; Fernndez et al., 2007). Por ello, los taninos de los

hollejos se han considerado mejores organolpticamente que los taninos de

las semillas y la utilizacin de diferentes tcnicas de elaboracin han

buscado ayudar a modular la proporcin de taninos de hollejos y semillas en

los vinos.

Una de estas tcnicas de elaboracin es el uso de enzimas de

maceracin. El efecto de estos enzimas sobre los antocianos y el color de

los vinos tintos ha sido ampliamente estudiado, aunque a veces los

resultados han sido contradictorios (Canal-Llaubres y Pouns, 2002; Pardo

et al., 1999; Revilla y Gonzalez-Sanjose, 2002; Watson et al., 1999; Bautista-

Ortn et al., 2005). Por el contrario, apenas se ha estudiado su papel en la

extraccin de taninos, aunque algunos autores han encontrado un aumento

de estos compuestos en vinos donde se han utilizado enzimas de

maceracin (Bautista-Ortn et al., 2005, Romero-Cascales et al., 2008; Gil-

Muoz et al., 2009; Ducasse et al., 2010), resultados que se han atribuido a

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una mayor degradacin de las paredes celulares del hollejo, ya que la accin

de los enzimas sobre la extraccin de polifenoles de las semillas no ha sido

todava demostrada.

El objetivo de este estudio pretende conocer si las actividades

enzimticas normalmente presentes en los enzimas de maceracin

comerciales, as como un producto comercial que integra varias de estas

actividades, actan en la liberacin de los taninos de las semillas de uvas de

las variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon.

MATERIALES Y MTODOS

El material vegetal de estudio ha sido semillas de uvas de las

variedades Monastrell y Cabernet Sauvignon, cultivadas en secano en una

parcela de la D. O. de Jumilla, pertenecientes a la bodega Finca Omblancas.

Las uvas presentaban un grado de maduracin entorno a 15 Be.

0.5 g de semillas de ambas variedades fueron maceradas con 15 mL

de dos soluciones modelo: una acuosa (5 g/L de cido tartrico) y otra

hidroalcohlica (12,5% etanol y 5 g/L cido tartrico), ambas ajustadas a pH

3,6. La extraccin se llev a cabo en un agitador magntico a 700 rpm y a

temperatura ambiente durante 48 horas, todo ello en oscuridad. Transcurrido

el tiempo de extraccin, el sobrenadante fue separado y filtrado usando

filtros de Nylon de 0,2 m. Posteriormente, 4 mL del extracto filtrado fueron

concentrados en un centrivap (Labconco, USA) a 50 C durante 8 horas. El

extracto seco obtenido fue redisuelto en 0,8 mL de metanol.

Tambin se realizaron ensayos con diferentes enzimas, 4 puros y un

enzima comercial, usado normalmente en el proceso de elaboracin de los

vinos tintos, para poder comprobar si este tiene algn efecto en la extraccin

de taninos de las semillas: xilanasa, celulasa, poligalacturonasa y

pectnmetilesterasa (Sigma Aldrich) y Enozym vintage (Agrovin, Alcazar de

San Juan) con actividad poligalacturonasa, pectnliasa, pectnesterasa y -

glucanasa. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado.

Para poder tener informacin sobre el contenido, porcentaje de

galoilacin y grado medio de polimerizacin de los taninos (GPm) en

semillas de uva se ha utilizado el mtodo de la fluoroglucinolisis propuesto

por Kennedy y Jones (2001). Este mtodo est basado en la ruptura de los

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enlaces interflavnicos en medio cido y en presencia de un agente

nucleoflico (fluoroglucinol), seguido de un anlisis por cromatografa lquida

de alta resolucin (HPLC) de los productos de reaccin segn el mtodo

propuesto por Busse-Valverde et al. (2010).

El tratamiento estadstico de los datos se ha realizado utilizando el

paquete estadstico Statgraphics 5.0 Plus.

RESULTADOS

Las Tablas 1 y 2 muestran el contenido y composicin de los taninos

en las soluciones control; acuosa (SA) e hidroalcohlica (SH) tras el proceso

de maceracin de las semillas de las variedades Monastrell y Cabernet

Sauvignon y el papel de las diferentes actividades enzimticas. Los

resultados muestran que se obtienen altos contenidos de taninos tras el

proceso macerativo, incluso cuando el medio extractante no contiene etanol,

demostrndose que no es crucial la presencia de etanol en el medio para

que se extraigan los compuestos fenlicos de las semillas, contrariamente a

lo comentado por otros autores (Singleton y Draper, 1964; Llaudy et al.,

2004; Cerpa-Caldern y Kennedy, 2008). De todas formas, se observa que

en presencia de alcohol se consigue extraer mayor cantidad de

proantocianidinas de las semillas, siendo dicho incremento del 43% para

Monastrell y del 80% para Cabernet Sauvignon. El alcohol favorece la

eliminacin de los lpidos que recubren la semilla (Glories y Saucier, 2000),

promoviendo adems, una mayor degradacin de la cutcula y de las

paredes celulares de las clulas donde se encuentran presentes los taninos

y favoreciendo la difusin de los mismos al medio. Gonzlez-Manzano et al.

(2004), en estudios realizados con soluciones modelo, observaron tambin

una ligera extraccin de taninos de bajo grado de polimerizacin de las

semillas en ausencia de alcohol, incrementndose la cantidad liberada

notablemente con el tiempo de contacto y la concentracin de etanol en el

medio. En la misma lnea, De Freitas et al. (2000) tambin encontraron un

incremento importante de los taninos de las semillas en vinos de Cabernet

Sauvignon tras la etapa de maceracin post-fermentativa como resultado de

un mayor contacto de las mismas con el alcohol obtenido durante el proceso

de fermentacin.

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Los contenidos de taninos obtenidos en este estudio son mucho ms

grandes que los encontrados por Cosme et al. (2009) para vinos de

Cabernet Sauvignon a lo largo de tres vendimias (289-776 mg/L) o por

Romero-Cascales (2008) y Busse-Valverde et al. (2010) para vinos de

Monastrell (489 y 835 mg/L) y de Cabernet S. (757 y 845 mg/L). Es posible

que la continua agitacin aplicada en los diferentes ensayos haga que la

extraccin de estos compuestos sea ms efectiva que bajo las condiciones

de elaboracin en bodega, periodo durante el cual slo una pequea

fraccin de taninos, tanto de las pieles como de las semillas de la uva, es

extrada. Adems, la retencin de taninos, sobre todo de aquellos de mayor

peso molecular en las paredes celulares de la pulpa, pueden causar una

menor presencia de los mismos en el vino (Bindon et al., 2010).

El grado medio de polimerizacin de los taninos (GPm) es mayor en

semillas de Monastrell que en las de Cabernet Sauvignon, incrementndose

en ambos casos con la presencia de alcohol. Este resultado puede ser

debido a que el etanol produzca una mayor extraccin de taninos de las

paredes celulares, lugar donde se encuentran las ms polimerizadas (Geny

et al., 2003). Por el contrario, el estudio de Del Llaudy et al. (2008) con

soluciones modelo, no encontraron diferencias en los valores de GPm de los

taninos extrados de semillas de Cabernet Sauvignon maceradas con

diferente contenido de alcohol, aunque s en la astringencia de los mismos.

Estos autores indicaron que esto poda ser debido a que el GPm no

representa el porcentaje de las diferentes fracciones de diferente tamao

que componen a los taninos y por tanto, con el mismo GPm, la proporcin de

oligmeros puede ser diferente, vindose afectada tanto la astringencia

como el amargor.

En el caso del porcentaje de galoilacin, en solucin acuosa es similar

para Monastrell y Cabernet Sauvignon, pero en presencia de etanol, la

galoilacin de los taninos se incrementa, sobre todo para Cabernet

Sauvignon. Gonzlez-Manzano et al. (2004) tambin encontraron un

incremento en el contenido de derivados galoilados con el aumento del

porcentaje de etanol en el medio. Busse-Valverde et al. (2010) encontraron,

en vinos, valores de galoilacin ms bajos a los encontrados en este estudio,

lo cual puede ser debido a la contribucin de los taninos extrados del

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hollejo, que tienen porcentajes de galoilacin ms bajos que los taninos de

semilla.

Tras la aplicacin de enzimas, en el caso de Monastrell y en medio

acuoso (Tabla 2) se observa un aumento importante en la extraccin de

taninos con los diferentes enzimas utilizados, excepto en el caso de los

enzimas xilanasa y pectnmetilesterasa, al mostrar valores de taninos no

significativamente diferentes respecto a la solucin testigo sin enzima. En el

caso de los enzimas puros, la poligalacturonasa consigue triplicar el

contenido de taninos y la celulasa duplicarlo, mientras que el complejo

enzimtico consigue cuadriplicar en el medio los valores de estos

compuestos. La pared celular de las clulas de las semillas est compuesta

por hemicelulosa, celulosa y pectinas, por tanto, es de esperar que la

celulasa y la poligalacturonasa y el complejo enzimtico consigan

incrementar el contenido de taninos en el medio, tras una mayor degradacin

de sta. Estos resultados fueron previamente intuidos en los estudios de

Passos et al. (2009ab), ya que comprobaron que un pretratamiento previo de

las semillas de uvas con ccteles enzimticos a base de celulasa,

hemicelulasa, poligalacturonasa y proteasas incrementaba notablemente la

extraccin de aceite de las semillas, debido a su accin en la destruccin de

la organizacin celular y subcelular de los tejidos de las semillas, tales como

las paredes celulares y el citoplasma (Sineiro et al., 1998).

El grado medio de polimerizacin de los taninos se incrementa

ligeramente con la adicin de enzimas, aunque slo se observan diferencias

significativas respecto al testigo con los enzimas xilanasa y

pectnmetilesterasa. Esto puede ser debido a que estos enzimas acten slo

sobre las paredes celulares de las clulas de las semillas, lugar donde se

encuentran los taninos ms polimerizados (Geny et al., 2003), mientras que

el resto de enzimas tambin pueden llegar hasta zonas ms internas de las

clulas, favoreciendo la salida de taninos menos polimerizados, vindose de

esta manera compensado el tamao de los mismos.

Respecto al porcentaje de galoilacin, este aumenta significativamente

con la presencia de cualquiera de los enzimas, excepto en el caso de

pectnmetilesterasa y xilanasa. El complejo enzimtico y poligalacturonasa

dan lugar a la mayor presencia de taninos galoilados, seguidos de celulasa.

Geny et al. (2003) encontraron que la proporcin de (-)-epicatequina-3-O-

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galato era mayor en la fraccin de las paredes celulares que en la fraccin

interna de las clulas de las semillas, por lo que una mayor degradacin de

dichas paredes por parte de estos enzimas podra favorecer una mayor

liberacin de taninos ms galoilados.

Con la presencia de alcohol, los enzimas tambin consiguen una

mayor difusin de taninos al medio. La celulasa, poligalacturonasa y

pectnmetilesterasa (que no tenan efecto en medio acuoso) consiguen

triplicar el contenido de taninos, mientras que con el enzima comercial los

valores son incrementados aproximadamente sobre seis veces. Estos

resultados parecen indicar que la presencia de alcohol facilita an mas la

accin de los enzimas y principalmente de pectnmetilesterasa y Enozym

vintage.

El medio hidroalcohlico es comparable con un vino, y entre los pocos

estudios que hay sobre la influencia de enzimas de maceracin en la

extraccin de taninos (Sun et al., 1998; Romero-Cascales et al., 2008 y Gil-

Muoz et al., 2009) los resultados han mostrado normalmente un incremento

de taninos en el vino, atribuido siempre a la mayor degradacin de las pieles

por parte de hemicelulasas y celulasas presentes en los enzimas de

maceracin, proporcionando vinos con ms cuerpo y estructura (Watson,

2000). Nosotros demostramos en este estudio, que ese incremento de

taninos no es solamente atribuible a los taninos de los hollejos puesto que

tambin se produce la degradacin de las semillas.

El grado medio de polimerizacin de los taninos es menor con el

enzima comercial y la pectnmetilesterasa. Tambin son observadas

diferencias significativas en el caso del porcentaje de galoilacin,

consiguiendo taninos ms galoilados con el enzima comercial y

poligalacturonasa, seguidos de celulasa. Hay que destacar que los taninos

presentes en la solucin testigo sin enzima presentan valores de este

porcentaje similares a aquellos obtenidos en medio acuoso, indicando que el

alcohol no consigue llegar, en el caso de Monastrell, hasta los taninos que se

encuentran en la fraccin interna de las clulas de las semillas.

Para semillas de Cabernet Sauvignon y en solucin acuosa (Tabla 2),

slo con celulosa y Enozym vintage se consigue incrementar

significativamente los valores de taninos en el medio, mientras que en medio

alcohlico, xilanasa y el enzima comercial son los nicos enzimas que no

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muestran ningn efecto. El grado medio de polimerizacin de los taninos es

mayor con xilanasa y menor con celulasa, poligalacturonasa y el enzima

comercial en medio acuoso y con la presencia de alcohol, solo

poligalacturonasa afecta de forma importante al tamao de estos

compuestos.

En cuanto al porcentaje de galoilacin, en ausencia de alcohol, o bien

no se ve prcticamente afectado, como es el caso de celulasa,

poligalacturonasa y el enzima comercial, o bien disminuye con

pectnmetilesterasa y xilanasa y en presencia de ste, al igual que ocurre

con el grado medio de polimerizacin, slo incrementa de forma ms

significativa con poligalacturonasa.

El grado medio de polimerizacin y el porcentaje de galoilacin de los

taninos afectan a las caractersticas organolpticas del vino, principalmente

a las sensaciones de astringencia y amargor, y parece que estas

sensaciones son ms potenciadas en presencia de alcohol y con algunos de

los enzimas empleados tanto para Monastrell como para Cabernet

Sauvignon.

El diferente comportamiento observado de los enzimas con semillas

de Cabernet Sauvignon, respecto al obtenido con semillas de Monastrell en

el mismo medio, puede ser indicativo de la existencia de diferencias a nivel

estructural y composicin entre las semillas de ambas variedades. Dichas

diferencias ya fueron encontradas por Ortega-Regules et al. (2008) a nivel

del hollejo.

Estos resultados indican que los taninos de las semillas pueden ser

difundidos al mosto-vino ya desde el inicio de la maceracin en ausencia de

alcohol, aunque su extraccin va a ser ms importante cuando el alcohol est

presente. Los enzimas de maceracin utilizados normalmente en el proceso

de elaboracin de los vinos tintos para incrementar el color tambin pueden

incrementar la extraccin de los taninos de las semillas (y no solo los del

hollejo), estando su efecto ms o menos marcado por el tipo de actividad

presente en los mismos y la variedad de uva. Esto es importante tenerlo en

cuenta, sobre todo cuando la uva llega poco madura a bodega, ya que, en

estas condiciones, el uso de enzimas de maceracin es bastante comn para

favorecer la extraccin de color, pero estos productos enolgicos podran

degradar ms fcilmente las paredes celulares de las clulas de las semillas,

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al estar menos lignificadas, favoreciendo una mayor salida de taninos al

mosto-vino, incrementando el cuerpo, pero sobre todo las sensaciones de

astringencia y amargor en el vino.

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15

Taninos mg/L GPm %Galoilacin

Solucin acuosa

Testigo 1126a 8,9a 9,0a

Celulasa 2402b 9,5ab 10,6b

PG 3345c 9,1a 14,7c

Xilanasa 1535ab 10,3c 10,6b

PE 1168a 9,9bc 7,9a

EV 4622d 9,0a 15,4c

Solucin hidroalcohlica

Testigo 1616a 9,1cd 10,2a

Celulasa 4851c 8,9c 13,1b

PG 4501c 9,2cd 15,4c

Xilanasa 2444b 9,3d 10,8a

PE 4603c 7,7a 10,3a

EV 7727d 8,3b 15,7c

Taninos mg/L GPm %Galoilacin

Solucin acuosa

Testigo 2572ab 7,0c 9,2c

Celulasa 3897d 5,5a 9,2c

PG 2872bc 5,9ab 8,8bc

Xilanasa 2254a 7,8d 6,7a

PE 3135bcd 6,4bc 8,1b

EV 3464cd 6,2ab 9,5c

Solucin hidroalcohlica

Testigo 4659a 8,6d 10,8a

Celulasa 5751d 5,4a 11,0ab

PG 5161bc 8,2cd 11,4b

Xilanasa 4525a 8,0bcd 11,6c

PE 5452cd 7,2b 10,9ab

EV 4883ab 7,4bc 11,0ab

Tabla 1. Concentracin, grado medio de polimerizacin (GPm) y porcentaje de galoilacin de los taninos en semillas de Monastrell en solucin acuosa e hidroalcohlica tras la adicin

de diferentes enzimas.

Abreviaciones: PG: Poligalacturonasa; PE: Pectnmetilesterasa; EV: Enozym vintage. Letras diferentes en una misma columna y para cada medio significa diferencias estadsticamente significativas segn el test LSD (P