estado actual de la piscirickettsiosis en salmones

Estado actual de la Piscirickettsiosis en Salmones

Larenas, J.; Contreras, J. y Smith, P.

Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y PecuariasSanta Rosa 11.735, Santiago (Chile)

Financiado por Fondo Nacional de Investigación y Tecnología (FONDECYT) Nº 1960976, Chile

Infecciones rickettsiales en peces Aunque es conocida hace mucho tiempo la importancia y presencia de estos microorganismos enmamíferos, éstos sólo se han podido identificar y caracterizar en los últimos años en animales acuáticos. Losagentes rickettsiales en peces comenzaron a ser asociadas a enfermedades de importancia a desde fines delos años 80, fecha desde la cual han producido pérdidas económicas por altas mortalidades. En algunos casosse han aislado estos microorganismos tipo rickettsial, pero en otros sólo se han observado en frotis, cortes detejido o por microscopía electrónica en diferentes regiones del mundo (Figura 1) sin poder llegar a sercaracterizados plenamente.

El primer antecedente de la presencia de un microorganismo tipo rickettsia en peces, fue descrito porMohamed en 1939 (Fryer y Mauel, 1997). Dicho reporte establece que en un pez enfermo de la especieTetrodon fahaka proveniente del río Nilo en Egipto, se observaron dentro de monocitos y en el plasma,pequeñas formas cocoides que se teñían eosinofílicas con Giemsa. De acuerdo a las característicasobservadas se pensó podía corresponder a una rickettsia, sin embargo, no se realizaron otros estudios paraconfirmar el tipo de agente (Fryer y Lannan, 1994).

Figura 1. Principales reportes de infecciones por agentes rickettsiales en peces en el mundo: Las fechasindican el año de la observación o aislamiento de la infección por rickettsia. En amarillo se muestra aquellasinfecciones que han afectado a salmónidos. Cada color representa diferentes tipos de peces.

En Alemania, en 1975, Özel y Schwanz-Pfitzner aislaron por primera vez un probable agente rickettsial

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desde un pez. El microorganismo fue obtenido de truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss) que demostrabansignos de la enfermedad producida por el virus de Egtved (actualmente conocida como septicemia viralhemorrágica: VHS). Se utilizaron muestras de corazón, riñón, bazo y branquias de peces enfermos, que secultivaron en la línea celular RTG-2 (derivada de gónadas de trucha arco iris) donde se produjo efectocitopático. Mediante microscopía electrónica se determinó que correspondía a algún agente del tiporickettsia, sin embargo, no se preservó al microorganismo para futuros estudios. De acuerdo a lo anterior, nose le pudo caracterizar completamente ni determinar su potencial rol patógeno (Garcés y col, 1991).

Posteriormente en Gran Bretaña, en las costas de Gales, Davies (1986) observó la presencia de RLO(Rickettsia Like Organism) en cortes histológicos y por microscopía electrónica de muestras de bazo deCallionymus lyra. La presencia del agente fue sólo un hallazgo casual, en un estudio que pretendía encontrarun parásito frecuente de la sangre denominado Haemogregarina quadrigemina.

Entre 1988 y 1992 se presentaron brotes de baja mortalidad en salmón del Atlántico cultivados en la zonade la costa oeste de Noruega. Las lesiones macroscópicas e histopatológicas indicaban un gran compromisohepático por lo que la enfermedad se denominó inicialmente "hepatitis necrotizante del salmón". De acuerdoa los estudios epidemiológicos y patológicos realizados por Olsen y col. (1997), se determinó que laenfermedad afectó sólo a "smolts" que habían sido transferidos recientemente al mar y que normalmenteestaban en altas densidades y pobres condiciones nutricionales. Además, en muchos casos se reportó laenfermedad posterior a un "bloom" de algas. Las lesiones más comunes fueron focos necróticos endiferentes órganos, en especial en hígado y la presencia de un microorganismo cocoide dentro de diferentescélulas en vacuolas citoplasmáticas. En 1992, se logró aislar una rickettsia en cultivos celulares libres deantibióticos y que reaccionaba positivamente a anticuerpos anti-Piscirickettsia salmonis medianteinmunofluorescencia (Olsen y col. (1997).

Piscirickettsia salmonis corresponde a la primera rickettsia aislada y caracterizada en peces. Esta bacteriafue aislada inicialmente en Chile en 1989 por Fryer y col. (1990) y Cvitanich y col. (1991), desde salmonesde cultivo afectados por altas mortalidades. El agente corresponde a una nueva especie, quetaxonómicamente está clasificada provisoriamente dentro de un nuevo género (Fryer y col., 1992). Producelesiones necróticas en diversos órganos y afecta a diversas especies de salmónidos cultivados en Chile. Laenfermedad que produce ha sido denominada de diversas formas tales como, "síndrome de Huito","síndrome del salmón coho" (Bravo y Campos, 1989a y b), "síndrome rickettsial salmonídeo" (SRS)(Cvitanich y col., 1991) y "piscirickettsiosis" (Fryer y col., 1992).

En 1995, Cvitanich y col. describieron un agente RLO, momentáneamente denominado U2, en salmonesdel Atlántico cultivados en el lago Llanquihue y en el mar (Décima Región de Chile), que se multiplicasolamente en cultivos celulares. Las mortalidades que produce van de un 4 a 12% semanal en agua dulcemanteniéndose así hasta unas seis semanas de transferidos al mar. La enfermedad corresponde a unasepticemia que afecta principalmente a bazo y riñón y que cursa con anemia severa. El U2 es una bacteriaGram negativa, cocoide, inmóvil y de un tamaño variable que oscila entre 0,2 a 0,8 mm de diámetro. Esteagente no ha sido caracterizado completamente hasta la fecha.

En Canadá, a fines de 1991, la tasa de mortalidad aumentó de un 0,01% a 0,06% semanal, en salmones delAtlántico cultivados en la fase marina, en la costa oeste de British Columbia. Los signos más importantesfueron oscurecimiento, nado lento y anorexia. Las lesiones correspondieron a exoftalmia, estomatitisnecrótica, úlceras dérmicas sobre el pedúnculo caudal, petequias en la serosa, espleno y hepatomegalia, yfocos blanquecinos y fibrosis en hígado. Histopatológicamente hubo necrosis en diversos órganos einflamación. Vasculitis y trombosis también fueron observadas. Dentro de macrófagos se encontraronmicroorganismos basofílicos, Gram negativos, Giemsa positivos, Macchiavello negativos y se teñían azulcon azul de toluidina. Los signos y lesiones postmortem fueron concordantes con los encontrados conpiscirickettsiosis en Chile (Brocklebank, y col., 1992 a y b). Una condición similar, probablemente idéntica,se presentó en 1970 y 1978 en salmón rosado silvestre (O. gorbuscha) cultivados en tanques con agua demar con propósitos experimentales (Kent, 1992). Otro cuadro de semejantes características se presentó en1980, en coho y chinook. (Brocklebank, y col., 1992 a y b). En ninguno de los casos mencionados se intentóel aislamiento del agente. Recientemente, Jones y col. (1997 y 1998) aislaron un agente similar a P. salmonisdesde salmones del Atlántico cultivados en la costa este de Cánada, sugiriendo que correspondería a unacepa de esta bacteria.

Una enfermedad similar a la descrita en Canadá, se presentó en 1991 en el Oeste de Irlanda. Al igual que laanterior, afectó a "postsmolts" de salmón del Atlántico, siendo las lesiones macro y microscópicas muysimilares a las descritas para la piscirickettsiosis. Aunque no se aisló ningún agente causal, en la mayoría delos tejidos, fue observado un microorganismo similar a P. salmonis. Las bajas mortalidades que sepresentaron fueron atribuidas a las bajas densidades poblacionales en cultivo (Rodger y Drinan, 1993). Entre1995 - 1996 se produjeron nuevamente cuatro brotes de mortalidad en Irlanda del Norte, lográndose aislar enesa oportunidad un agente rickettsial en cultivo celular de la línea CHSE-214, que reaccionó positivamente aanticuerpos anti P. salmonis. La etiología de la enfermedad fue confirmada mediante inoculaciónexperimental (Palmer y col., 1997).

Grant y col. (1996) reportaron el aislamiento de un microorganismo RLO en Escocia que produjo altasmortalidades en salmón del Atlántico, a fines de 1995. Los signos clínicos se caracterizaron por nadoanormal y a la necropsia solamente se evidenció esplenomegalia. La lesión histopatológica máscaracterística fue encefalitis asociada a vasculitis, encontrándose gran cantidad de un microorganismococoide, basofílico y de aproximadamente 1 mm de diámetro. El agente fue aislado desde cerebro en la líneacelular CHSE-214 sin antibiótico, donde produjo un efecto citopático a los nueve días de incubación a 15ºC.El RLO fue sensible a oxitetraciclina y ácido oxolínico. La enfermedad pudo ser reproducida en formaexperimental completándose los postulados de Koch.

Recientemente Chen y col. (1994), describieron la primera enfermedad producida por un RLO en tilapia(Tilapia nilotica). La afección se produjo entre 1992 y 1993, provocando una tasa de mortalidad que enpromedio fue de 30% y cuyo máximo alcanzó un 75% en algunas piscifactorías. Las lesiones principales secaracterizaron por necrosis, vasculitis, trombosis, inflamación crónica y presencia de nódulos blanquecinosen diversos órganos. En todos los tejidos analizados se observó la presencia de un microorganismo tiporickettsia dentro de vacuolas intracitoplasmáticas. Este agente fue aislado a partir de muestras de bazo en lalínea celular CHSE-214, sin embargo, en ésta no produjo efecto citopático. La enfermedad fue reproducidamediante la inoculación experimental de tejido esplénico proveniente de peces naturalmente infectados. Unaenfermedad de características similares ha sido descrita hace poco en Japón (Wada y col., 1995).

Khoo y col. (1995) detectaron la presencia de RLO en dos peces tropicales de agua dulce (Panaquesuttoni), enviados desde Colombia a Estados Unidos. El hallazgo se efectuó mediante exámenes citológicos,histopatológicos y microscopía electrónica de transmisión. Las lesiones macroscópicas fueron reno yesplenomegalia. El organismo se detectó dentro de vacuolas citoplasmáticas de monocitos y macrófagos debazo, corazón riñón e hígado.

En el mediterráneo de Francia, Comps y col. (1995), encontraron RLO en el cerebro de "Sea bass"juveniles (Dicentrarchus labrax), los cuales presentaban comportamientos de nado anormal.

La denominada intoxicación o enfermedad por salmón, es una afección rickettsial que afecta a perros yzorros, siendo transmitida mediante un tremátodo que actúa de vector, constituyéndose el salmón sólo comoun huésped intermediario. La asociación entre la muerte de los perros y el parásito fue descubierta en losinicios del siglo XIX en Norte América, cuando se observó que los perros que eran alimentados con salmóncrudo morían frecuentemente. El agente etiológico es Neorickettsia helmintheca que se encuentra enmetacercarias de la tenia Nanophyetus salmincola. El ciclo del parásito requiere además del caracol de laespecie Oxytrema silicula (Fig. 2), que se encuentra sólo en la región noroeste del Pacífico de EstadosUnidos y en la costa este de Siberia (Georgi y Georgi, 1994).

Figura 2. Ciclo vital del parásito tremátodo Nanophyetus salmincola: Todos los estados del parásitopueden ser vectores de Neorickettsia helminthoeca.

El ciclo de vida de N. salmincola se ilustra en la figura número 2. Los huevos eliminados en las heces danorigen a embriones que eclosionan (miracidios) después de un largo período de incubación (87-200 días).Luego, parasitan al caracol (estado de redia) que habita ríos correntosos. Hasta la fecha no se ha demostradola formación de esporoquistes. Posteriormente cercarias invaden a los peces, especialmente salmónidos(también afecta peces no salmónidos y a la salamandra del Pacífico), a través de la piel y las branquias,formando el estado de metacercaria. Estas se encuentran diseminadas por todo el cuerpo del pez, pero seconcentran especialmente en riñón, músculos y aletas. En general esta parasitosis no produce signos clínicosen los perros, sin embargo, este parásito puede transportar a la bacteria denominada Neorickettsiahelminthoeca, la cual produce severas alteraciones gastroentéricas y en muchos casos la muerte. Se cree queel verdadero huésped definitivo para el parásito son el mapache y el zorrillo. Estos animales, así como elhombre parecen ser inmunes a la infección por la rickettsia aunque pueden ser afectados eventualmente porel parásito (Georgi y Georgi, 1994).

PiscirickettsiosisHistoria natural de la enfermedad

Los primeros brotes de la enfermedad se presentaron a fines del año 1989, aunque se ha sugerido que éstaestaría presente al menos desde 1981 (Bravo y Campos, 1989a). Inicialmente fue descrita sólo en salmóncoho (Síndrome del salmón coho), pero pronto fueron afectadas todas las especies de salmónidos cultivadasen Chile, llegando a producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros (Bravo y Campos, 1989a y1989b; Cvitanich y col. 1990; Alvarado y col., 1990; Fryer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991;Cvitanich y col., 1991). Los cálculos iniciales establecieron una mortalidad de 1,5 millones de salmonescoho, lo que representó una pérdida estimada de 10 millones de dólares para el año 1989 (Cvitanich y col.,1990).

La enfermedad ha sido descrita principalmente en agua de mar y estuarina (Bravo y Campos, 1989a y1989b; Fryer y col., 1990; Branson y Nieto, 1991; Cvitanich y col., 1991) y muy ocasionalmente en aguadulce (Bravo, 1994; Gaggero y col., 1995). Los primeros brotes se relacionaron a un período posterior afluctuaciones en la temperatura del agua, presencia de un "bloom" de algas no-tóxicas y/o estrés relacionado

a severas tormentas (Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1990). Las epizootias se presentan especialmente entreotoño y primavera (Bravo y Campos, 1989a, Alvarado y col., 1990; Cvitanich y col., 1991) cuando lastemperaturas oscilan entre 9 - 16ºC (Lannan y Fryer, 1994). Recientemente, se ha propuesto que el procesode esmoltificación puede incrementar la susceptibilidad de los salmones infectados (Graumann y col., 1997).

Es necesario recordar que en un inicio debido a la aparente especificidad de la infección por el salmóncoho, la tendencia fue por un lado disminuir las densidades y por otro aumentar la producción de salmón delAtlántico y trucha arco iris. Frente a esa nueva situación la enfermedad comenzó a diagnosticarse de formacreciente en estas especies (Alvarado y col., 1990).

Signos clínicos y lesiones

Los signos clínicos se caracterizan por un nado en la superficie, lento, errático y a veces en tirabuzón.Además se ha descrito letargia, anorexia, choque contra las paredes de la balsa jaula, orillamiento yoscurecimiento. Las lesiones macroscópicas externas (Fotografía 1), más relevantes, incluyen: descamación,palidez branquial, hemorragias equimóticas y petequiales en la base de las aletas, nódulos y úlceras en la pielde hasta 2 cm de diámetro (Bravo y Campos, 1989a y b; Cubillos y col., 1990; Cvitanich y col., 1990;Schäfer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-muñoz, 1991; Cvitanich y col., 1991; Larenas y col., 1995). Losniveles de hematocrito reflejan una severa anemia (Bravo y Campos, 1989a y 1989b; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991).

Fotografía 1. Lesiones producidas por Piscirickettsia salmonis: Salmón del Atlántico infectadonaturalmente con P. salmonis. Se puede observar hemorragias en la base de las aletas (a) y en eltejido muscular (b) de la pared abdominal. Además se aprecia el hígado de aspecto moteado (c) yesplenomegalia (d).

En el análisis de necropsia de la cavidad abdominal, es frecuente encontrar la presencia de ascitis, reno yesplenomegalia, nodulaciones subcapsulares de color cremoso a amarillento en el hígado, presencia de unapseudomembrana sobre el corazón y hemorragias petequiales en estómago, ciegos pilóricos, intestino, vejiganatatoria, muscular y grasa viceral (Schäfer y col., 1990; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Cvitanich ycol., 1991; Larenas y col., 1995). En la mayoría de los casos el intestino está lleno con un contenido mucosoamarillento y el estómago con un líquido transparente seromucoso (Schäfer y col., 1990); esto último da laimpresión de que el pez haya tragado agua (Alvarado y col., 1990).

Desde el punto de vista histopatológico las lesiones principales corresponden a necrosis en diversosórganos y tejidos, siendo los más afectados el riñón, hígado, bazo e intestino (Fotografías 2, 3 y 4). También

es común observar lesiones vasculares semejantes a las descritas para rickettsias en mamíferos, tales comonecrosis endotelial y formación de trombos. Además se puede encontrar macrófagos conteniendoorganismos dentro del citoplasma, coagulación intravascular, inflamación perivascular, pericarditis,endocarditis, lesión inflamatoria crónica en la lámina propia del intestino, incremento del número de célulasgranulares del estrato granuloso intestinal e hiperplasia y fusión laminillar (Cubillos y col., 1990; Cvitanichy col., 1991; Branson y Nieto Díaz-Muñoz, 1991; Larenas y col, 1995).

Fotografía 2. Lesiones histopatológicas producidas por Piscirickettsia salmonis: Hígado. Salmón cohoexperimentalmente infectado con P. salmonis. Se observa necrosis (a) y el agente rickettsial con aspectomorular dentro de una gran vacuola citoplasmática (b). Giemsa. 400X.

Fotografía 3. Riñón anterior. Presencia de P. salmonis en el interior del citoplasma deuna célula endotelial. Tejido proveniente de salmón coho inoculadointraperitonealmente. Giemsa. 1000X.

Fotografía 4. Severo daño endotelial y formación de un trombo. Salmón coho inoculadoexperimentalmente vía intraperitoneal. H/E. 400X.

Características del agente etiológico

Piscirickettsia salmonis es un agente patógeno intracelular obligado, que se multiplica por división binaria.Es citopático para diferentes líneas celulares de salmónidos y de algunas de peces de aguas cálidas (Tabla 1),produciendo inicialmente la formación de agrupaciones de células redondeadas y vacuoladas y finalmente lalisis con desprendimiento de la monocapa (Fryer y col., 1990) (Fotografía 5). Su temperatura óptima decrecimiento se encuentra dentro del intervalo de 15 a 18ºC, disminuyendo marcadamente su replicación bajo10ºC y sobre 21ºC. Para su conservación a -70ºC se recomienda el uso de DMSO como criopreservante(Fryer y col., 1990).

Fotografía 5. Cultivo celular (CHSE-214) infectado con P. salmonis: Las células del cultivopresentan vacuolas citoplasmáticas en cuyo interior se observa la presencia de microorganismoscocoides correspondientes a P. salmonis. 1000X.

El microorganismo es Gram negativo, inmóvil, no encapsulado, pleomórfico, habitualmente cocoide, enpares o en forma de anillo y de un tamaño variable entre 0.5-1.5 mm de diámetro (Fryer y col., 1990;Cvitanich y col., 1991). En frotis de sangre y tejidos las rickettsias se tiñen con hematoxilina-eosina (HE),

Giemsa y azul de metileno (Bravo y Campos, 1989; Cvitanich y col., 1990), observándose dentro devacuolas citoplasmáticas rodeadas por una membrana (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; Almendrasy col., 1997b), en forma esparcida o agrupaciones que le dan un aspecto de mórula (Cvitanich y col., 1991).Mediante microscopía electrónica se ha observado que el agente posee en su superficie dos membranas, unaexterna ondulada y una interna citoplasmática, que es característico de agentes rickettsiales (Fryer y col.,1990). Posee además estructuras similares a ribosomas cerca de la membrana plasmática, un ADN fibrilar enla región central y estructuras esféricas electro densas (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991) (Fotografía6).

Fotografía 6. P. salmonis observada mediante microscopio de transmisión: Piscirickettsiasalmonis en un corte para microscopía electrónica. El microorganismo se observa dentro de unavacuola. Nótese la membrana externa ondulada.

De acuerdo a los trabajos realizados por Kuzyk y col. (1996), existen seis antígenos principales en labacteria. Una molécula de 11 kDa, que representa probablemente un oligosacárido (LOS) componente dellipopolisacárido (LPS) que es parte de la membrana externa de las rickettsias y gramnegativos. Poseeademás un LOS de 16 kDa, que formaría parte del "core" y cuatro proteínas de un tamaño molecular de 65,60, 54 y 51 kDa. Recientemente Barnes y col. (1998), han obtenido resultados diferentes a los autoresanteriores, lo que se ha explicado por la metodología de purificación del agente y el uso de un distintoantisuero anti P. salmonis de conejo. En este último trabajo se establecieron ocho proteínas antigénicasprobablemente propias de P. salmonis (108, 95, 60, 56, 40, 36, 32 y 20 kDa), de las cuales sólo tres tienenpesos moleculares similares a los resultados de los investigadores anteriores. Los principales antígenosestarían dados por pesos moleculares de 56, 36 y 20 kDa.

Tabla 1. Líneas celulares que permiten la multiplicación de Piscirickettsia salmonis.

Línea celular Especie de origen Cepa u origen de P. salmonis Referencia

CHSE-214 Oncorhynchus tshawytscha LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990

Salmón coho (Chile) Cvitanich y col., 1991

CSE-119 Oncorhynchus kisutch LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990


CHH-1 Oncorhynchus keta LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990


RTG-2 Oncorhynchus mykiss LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990


EPC Cyprinus carpio LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990


FHM Pimephales promela LF-89, Salmón Coho (Chile) Fryer y col., 1990


BF-2 Ictalurus nebulosus LF-89, Salmón Cohoa (Chile) Almendras y col., 1997b

a El comienzo del efecto citopático es tardío (45 días postinoculación)

Sensibilidad frente a antibióticos

De acuerdo a los estudios de Fryer y col. (1990), la cepa de P. salmonis aislada (LF-89) a partir de losprimeros brotes de la enfermedad, demostraron una sensibilidad frente a numerosos antibióticos, siendo sóloresistente a penicilina. Además, Cvitanich y col. (1991) observaron que los siguientes compuestos inhibíanel crecimiento de la bacteria en cultivos celulares: Claritromicina, cloramfenicol, eritromicina, gentamicina,oxitetraciclina y sarafloxacina (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991). Sin embargo, estudiosrelativamente recientes, han sugerido una posible generación de resistencia frente a diferentesquimioterápicos utilizados para el tratamiento de la piscirickettsiosis (Tabla 2). Al respecto, la cepa SLGO-95, presenta resistencia a todos los antibióticos estudiados, atribuido al uso excesivo de estas drogas porvarios años (Smith y col., 1996b). Pocas son las investigaciones realizadas en aislamientos de otros países.El único estudio publicado de Palmer y col. (1997), ha evidenciado resistencia de un aislamiento de Irlandadel Norte, frente a cotrimoxasol, furazolidona y penicilina y sensibilidad a ácido oxolínico (Tabla 2).

Recientemente, Arriagada y col. (1996), han determinado que la citometría de flujo puede ser un métodoaltamente sensible para determinar concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) de antibióticos para P.salmonis, ya que proporciona el estado de infección de cada célula analizada, siendo posible obtener losresultados en un menor tiempo.

Procedimientos de diagnóstico

La inoculación de líneas celulares con tejido renal, proveniente de peces infectados, es el método másconcluyente para la detección de P. salmonis (Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991; OIE, 1997), sinembargo, constituye un problema el hecho de que éstos deben ser usados sin antibióticos, debido a lasensibilidad de la rickettsia frente a ellos (Fryer y Mauel, 1997).

Los métodos recomendados de tinción de frotis y tejidos son Gram, Giemsa, naranja de acridina (Fryer ycol., 1990; Cvitanich y col., 1991; Lannan y Fryer, 1991; Lannan y Fryer, 1993; OIE, 1997) y/o azul detoluidina (Larenas y col., 1995). Estas técnicas son adecuadas para la identificación inicial de rutina. Elmétodo de inmunofluorescencia indirecta, desarrollado por Lannan y col. (1991), es en la actualidad uno delos métodos más sensible y específico para el diagnóstico de la piscirickettsiosis. Esta técnica ha sidomodificada mediante el uso de microondas (Larenas y col., 1996a), disminuyendo marcadamente lostiempos de incubación del primer y segundo anticuerpo, sin variar la especificidad y sensibilidad.

Recientemente se han desarrollado dos técnicas de ELISA por laboratorios comerciales (RelisaTM-SRS,Microtek International Ltd. Canadá. y RicK-DtextTM, DiagXotics, Inc. USA ) para el diagnóstico de P.salmonis a partir de muestras renales.

El reciente desarrollo de una técnica de PCR ("Polymerase Chain Reaction") abre nuevas expectativas enel diagnóstico de la piscirickettsiosis. Al respecto, Mauel y col. (1996) han desarrollado cuatro "primers"(PS2S, PS2AS, PS3AS y EM90AS) que permiten diferenciar P. salmonis de otras bacterias, así como la

diferenciación de la cepa EM-90 con la de referencia, LF-89. Esta prueba es altamente sensible y específica,pudiendo detectar hasta 1 Dosis Infectante de Cultivo de Tejido 50% (TCID50).

Tabla 2. Sensibilidad de aislados de P. salmonis frente a diferentes antibióticos.

AntibióticoReferencia

Inhibición delcrecimiento Cepa y/u origen Concentración

(CMI) Referencia

Ac. Oxolínico No SLGO-94 1 mg/mLa Smith y col., 1996b

No LF-89 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

No SLGO-95 3 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si EM-90 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si Irlanda 1 mg/mL Palmer y col., 1997

Claritromicina Si Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Cloramfenicol No SLGO-95 20 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si LF-89 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si EM-90 1 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si Chile 4 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Si SLGO-94 5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Cotrimoxasol No Irlanda 40 mg/mL Palmer y col., 1997

Eritromicina Si Chile 10 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Espectinomicina No Chile > 100 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Estreptomicina Si LF-89 100 mg/mL Fryer y col., 1990

Flumequina No SLGO-94 >100 mg/mLa Smith y col., 1996b


No EM-90 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si LF-89 0,1 mg/mL a Smith y col., 1996b

Furazolidona No Irlanda 50 mg/mL Palmer y col., 1997

Gentamicina No SLGO-94 25 mg/mLa Smith y col., 1996b

No LF-89 38 mg/mLa Smith y col., 1996b

No EM-90 50 mg/mLa Smith y col., 1996b


Si LF-89 50 mg/mL Fryer y col., 1990

Oxitetraciclina No SLGO-95 3 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si EM-90 0,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si Irlanda 1 mg/mL Palmer y col., 1997

Si Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Si SLGO-94 1 mg/mLa Smith y col., 1996b

Si LF-89 2,5 mg/mLa Smith y col., 1996b

Penicilina No Chile >100 UI/mLa Cvitanich y col., 1991

No LF-89 100 UI/mL Fryer y col., 1990

No Irlanda 100 UI/mL Palmer y col., 1997

Sarafloxacina Si Chile 0,1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Tetraciclina Si Chile 1 mg/mLa Cvitanich y col., 1991

Si LF-89 15 mg/mL Fryer y col., 1990

a Valores de CMI

Diseminación de la infección

Transmisión horizontal

De acuerdo a los reportes tanto en condiciones naturales como experimentales, se haestablecido que todas las especies de salmónidos cultivadas en Chile son susceptibles de serafectadas por la enfermedad (Bravo y Campos, 1989a y b; Alvarado y col., 1990; Branson yNieto Díaz-Muñoz, 1990; Cvitanich y col. 1990; Fryer y col., 1990; Cvitanich y col., 1991;Fryer y Mauel, 1997). Sin embargo, no existen suficientes estudios que hayan determinado lasdiferencias en susceptibilidad entre las especies salmonídeas. Al respecto, Smith y col. (1996a)han demostrado experimentalmente una mayor resistencia a la infección en truchas arco iris enrelación a salmón coho, estableciendo para este último el DL50 (Dosis letal 50%) y la DI50(Dosis infectante 50%) (Tabla 3).

Tabla 3. Dosis letal 50% (DL50) y dosis infectante 50% (DI50) ensalmón coho y trucha arco iris inoculadas vía intraperitoneal (Smithy col., 1996a).

Especie DL50 (TCID50/mL) DI50 (TCID50/mL)

Salmón coho 102,8 101,9

Trucha arco iris No determinada 102,4

Las experiencias realizadas por Cvitanich y col. (1991), Almendras y col. (1997a) y Salinas ycol. (1997), han demostrado transmisión horizontal en condiciones de agua dulce, la cual se vefavorecida por el contacto entre los peces (Almendras y col., 1997a) y al aumentar la densidadpoblacional (Salinas y col. 1997). La infección se produce a pesar de que se ha demostrado invitro una baja viabilidad de P. salmonis en agua dulce (Lannan y Fryer, 1994).Experimentalmente, se ha observado que el agente es eliminado mediante las heces, orina ybilis, que podrían constituir las posibles vías de infección (Salinas y col., 1997) (Figura 3).

De acuerdo a Salinas y col. (1997), la transmisión horizontal en condiciones de agua dulce,depende directamente de la densidad poblacional. En sus investigaciones lograron mortalidadesacumuladas de un 4% con una densidad de 20 kg/m3 y 14% con 40 kg/m3, en truchas arco irismantenidas en cohabitación con inoculadas con P. salmonis vía intraperitoneal (IP). Estosresultados contrastan con los obtenidos por Almendras y col. (1997a), que obtuvieron

mortalidades superiores al 50% en Salmón del Atlántico a 27 kg/m3, sin embargo en este últimocaso, un 76% de los peces estaban infectados de forma concomitante con Aeromonassalmonicida. De acuerdo con estos resultados, la infección horizontal se favorece al aumentar elcontacto entre los peces (Almendras y col., 1997a). Al respecto, Garcés y col. (1991), nolograron demostrar este tipo de transmisión en salmones coho mantenidos en cohabitación coninoculados, lo que probablemente se debió a la baja densidad poblacional con que se trabajó (3kg/m3).

La enfermedad natural se presenta generalmente 6 a 12 semanas del ingreso de los "smolts" almar (Alvarado y col., 1990; Cvitanich y col., 1991). Fryer y col. (1990), han postulado laposible presencia de vectores marinos que mantendrían al agente. Esta hipótesis ha sidoreafirmada por Garcés y col. (1991) que han demostrado experimentalmente que los pecestambién son susceptibles en condiciones de agua dulce, lo que asociado al hecho de la escasapresentación natural de la enfermedad en esas condiciones, hacen suponer que la fuente seencuentra en el mar. Los resultados de Garcés y col. (1994), Venegas (1995) y Correal (1996),han demostrado la presencia de P. salmonis, mediante inmunofluorescencia, en el parásitohematófago denominado Ceratothoa gaudichaudii y en el ectoparásito Caligus sp. (Tabla 4) locual indica que pueden ser vectores o reservorios marinos del agente.

Se ha sugerido la posible participación de especies acuáticas como fuentes o reservorios de laenfermedad (Tabla 4). Mediante anticuerpos policlonales anti-P. salmonis, utilizando la técnicade inmunofluorescencia indirecta, se ha detectado positividad en cabrilla, jurel, choritos,picorocos, copépodos de vida libre y poliquetos, sin embargo, la participación que puedancumplir estas especies no ha sido dilucidada (Venegas, 1995; Correal, 1996) (Tabla 4).

Recientemente, Smith y col. (1998) han demostrado en forma experimental que P. salmonispuede penetrar por piel y branquias sin lesiones en ausencia de vectores. Además estosinvestigadores establecieron que la inoculación subcutánea del agente patógeno es capaz deproducir altas mortalidades, lo cual sugiere que los ectoparásitos pudieran jugar un papel en latransmisión horizontal de la enfermedad.

De acuerdo a los antecedentes anteriores, se puede colegir que probablemente P. salmonis eseliminado en las heces y orina de peces infectados, especialmente de aquellos que presentansignos y síntomas de piscirickettsiosis; luego es capaz de infectar peces vía branquial y/o por lapiel intacta. Las condiciones de supervivencia en agua salada, la presencia de ectoparásitoscomo Caligus sp. y Ceratothoa gaudichaudii o lesiones traumáticas de la piel, probablementefavorecen la diseminación de la infección. Los antecedentes hasta la fecha disponibles nopermiten establecer la importancia de reservorios o vectores marinos (Fig. 3).

Tabla 4. Positividad a P. salmonis mediante inmunofluorescencia indirecta en peces, moluscos, parásitos y copépodos de vidalibre asociados a jaulas de cultivo de salmónidos infectados en forma natural en condiciones de agua de mar.

Nombrecomún Nombre científico Número

muestreado Positivos % Período Referencia

Peces

Cabrilla Paralabrax humeralis 4 1 25 Inv-Prim Venegas, 1996

Jurel Trachurus murphyi 58 5b 8,6 Verano Correal, 1995

50 1 2 Inv-Prim Venegas, 1996

Pejerrey Basilichthys australis 52 0 0 Verano Correal, 1995

Róbalo Eliginops maclovinus 2 0 0 Inv-Prim Venegas, 1996

10 0 0 Verano Correal, 1995

Merluza Merluccius sp. 9 0 0 Inv-Prim Venegas, 1996

Moluscos

Chorito Mytilus chilensis

120 5 4,2 Verano Correal, 1995

195 0 0 Inv-Prim Venegas, 1996

Crustáceos

Picorocos Balanus psittacus 120 0 0 Verano Correal, 1995

188 10 5,3 Inv-Prim Venegas, 1996

Copépodos devida libre

No determinado.Diversas especies



Ectoparásitos

Ceratotoa Ceratothoa gaudichaudii 60 6 10 Verano Correal, 1995


Caligus Caligus sp. 72a 2b 2,8 Verano Venegas, 1996

189 13 6,9 Inv-Prim Correal, 1995

Anélidos

Poliquetos No determinado.Diversas especies


aTotal de frotis obtenidos b Muestras sospechosas

Transmisión vertical

Los primeros antecedentes que sugirieron la existencia de transmisión vertical fueronentregados por Bustos y col. (1994), sin embargo, los resultados obtenidos por dichainvestigación no fueron concluyentes, debido principalmente a que los grupos controlesnegativo también aparecieron infectados con P. salmonis. En forma experimental, Larenas y col.(1996b) han logrado la infección vertical de ovas al estado de ojo, provenientes de reproductoresmachos y/o hembras inoculados IP con el agente rickettsial. El agente fue demostrado tanto enfluido seminal y ovárico, así como en el interior de espermios y ovas no fertilizadas. Estosresultados sin embargo pueden no estar reflejando las condiciones de infección natural. En untrabajo reciente, no publicado, hemos determinado la existencia de transmisión vertical ensalmones coho naturalmente infectados lo que corrobora los resultados experimentales.

Figura 3. Transmisión de Piscirickettsia salmonis: Vías de excreción y posibles vías de transmisión depiscirickettsiosis.

Medidas de Prevención

Hasta la fecha los intentos para evitar los brotes de la enfermedad han sido infructuosos y no se la hapodido erradicar de zonas endémicas. Para reducir las pérdidas, en general los centros de cultivo handisminuido las densidades poblacionales por jaula, de acuerdo a observaciones empíricas pero noadecuadamente comprobadas. Esta medida fue recomendada en los inicios de los primeros brotes de laenfermedad por Bravo y Campos (1989), quienes además recomendaron disminuir las medidas de manejopara evitar el estrés en los peces.

Los resultados de las terapias con antibióticos vía oral o inyectable han sido inconsistentes y en general nohan sido capaces de controlar la enfermedad de forma efectiva. Esto además ha estado correlacionado alposible hecho de la aparición de resistencia en algunas cepas (Smith y col., 1996b), variabilidad en lostiempos y dosis de aplicación de las drogas y el uso cada vez mayor de nuevas alternativas de tratamiento.

Los resultados de Salinas y col. (1997) han demostrado la excreción de P. salmonis en heces, orina y bilisde peces experimentalmente infectados. La eliminación del agente por estas vías, tiende a aumentar en lospeces que se encuentran moribundos. Estos estudios, asociados al hecho de que la supervivencia del agenteen agua salada es alta (Lannan y Fryer, 1994), hacen aconsejable la pronta extracción de los peces enfermosy muertos de las balsas afectadas. Lo anterior está asociado además a la posibilidad de entrada del agente porla vía branquial y cutánea intacta (Pérez, 1997; Smith y col., 1998).

La posible elaboración de una vacuna aparece hoy en día como una posible estrategia para controlar laenfermedad (Smith y col., 1995), sin embargo, faltan mayores investigaciones en relación a la respuestainmunoprotectiva que ellas pueden generar (Smith y col., 1997). Smith y col. (1995) han tenidoaparentemente buen éxito con una vacuna formalinizada de P. salmonis (cepa LF-89) en condiciones decampo. Paradójicamente, los resultados indicaron que el uso de una mayor concentración de antígeno conadyuvante de Freund no favoreció una respuesta protectora (Gráfico 1).

En condiciones experimentales se ha observado una disminución de las mortalidades en peces vacunadoscon una bacterina preparada con la cepa LF-89, comparado con peces inoculados IP. Estos resultadossugieren que existe una respuesta inmunoprotectiva, sin embargo, las variaciones genéticas y antigénicas deP. salmonis deben ser consideradas en las estrategias futuras para el desarrollo de vacunas (Smith y col.,

1997).

Recientemente, mediante radioinmunoensayo (RIA) se ha determinado una elevación, aunque moderada,de los niveles de anticuerpos circulantes en peces vacunados, desafiados en forma experimental, así como enpeces naturalmente infectados (Smith y col., 1997).

En la actualidad existen dos vacunas inactivadas de P. salmonis (Ricketvac Aqua®, LaboratoriosRecalcine, Santiago, Chile. Aqua Vac-SRS®, Aquaculture S.A. Services and Research, Santiago, Chile),disponibles comercialmente en Chile, sin embargo, sus efectividades no han sido suficientementedocumentadas en condiciones experimentales y de campo. De acuerdo a los fabricantes estás pueden conferirun índice de protección de hasta un 71%.

Gráfico 1. Mortalidad acumulada (%) en salmones coho (Oncorhynchus kisutch) vacunados conbacterinas de P. salmonis y desafiados en condiciones de campo (Smith y col., 1995).

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Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 5, noviembre 1998

http://www.revistaaquatic.com/

estado actual de la piscirickettsiosis en salmones

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