establecimiento de un protocolo para la …
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ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIÓN in vitro DE SEGMENTOS DE HOJAS DE Dracula chimaera.
ADRIANA LUCIA RIOS ALZATE
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
Rodolfo Mejía
Director
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA
Bogota D.C. Octubre 5 de 2007
ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIÓN in vitro
DE SEGMENTOS DE HOJAS DE Dracula chimaera
ADRIANA LUCIA RIOS ALZATE
APROBADO
Rodolfo Mejía, Ingeniero Agrónomo Sandra Constantino, Bióloga Director Asesor
Concepción Baylon, Bióloga Asesor
Maria del Pilar Márquez, Biologa Loyla Rodríguez, Bióloga Jurado Jurado
ESTABLECIMIENTO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIÓN in vitro DE SEGMENTOS DE HOJAS DE Dracula chimaera.
ADRIANA LUCIA RIOS ALZATE
APROBADO
Angela Umaña, Bióloga Andrea Forero, Bióloga Decano Académico Director de Carrera
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción………………………………………………………………………...1
2. Marco teórico y revisión de literatura………………………………………………2
2.1. Género Dracula…………………………………………………………………...2
2.1.1. Clasificación taxonómica……………………………………………………….2
2.1.2. Características morfológicas……………………………………………………2
2.1.3. Hábitat…………………………………………………………………………..3
2.2. Cultivo in vitro……………………………………………………………………4
2.2.1. Ventajas y desventajas del cultivo in vitro……………………………………..4
2.2.2. Cultivo in vitro de Orquídeas…………………………………………………...4
2.2.3. Etapas de la micropropagación…………………………………………………6
2.2.3.1. Preparación del explante……………………………………………………...6
2.2.3.2. Crecimiento del inóculo………………………………………………………7
2.2.4. Factores que afectan el desarrollo in vitro……………………………………...7
2.2.5. Problemas del cultivo in vitro…………………………………………………..8
2.2.5.1. Contaminación………………………………………………………………..8
2.2.5.2. Clorosis……………………………………………………………………….8
2.2.5.3. Oxidación fenólica……………………………………………………………8
2.2.5.4. Hiperhidratación…..…...……………………………………………………..9
2.2.5.5. Variación somaclonal……………………………………………………….10
2.2.5.6. Recalcitrancia………………………………………………………………..10
2.3. Reguladores de crecimiento……………………………………………………..10
2.4. Respuesta morfogénica del explante…………………………………………….12
2.4.1. Embriogénesis somática………………………………………………………12
2.4.2. Organogénesis…………………………………………………………………13
2.4.3. Cuerpos protocórmicos………………………………………………………..13
3. Formulación del problema y justificación………………………………………...14
3.1. Formulación del problema………………………………………………………14
3.2. Preguntas de investigación……………………………………………………...14
3.3. Justificación de la investigación………………………………………………...15
4. Objetivos…………………………………………………………………………..16
4.1. Objetivo general………………………………………………………………....16
4.2. Objetivos específicos……………………………………………………………16
5. Materiales y métodos……………………………………………………………...17
5.1. Diseño de la investigación………………………………………………………17
5.2. Población de estudio y muestra……………………………….………………...18
5.3. Variables del estudio……………………………………………………………20
5.4. Métodos.………………………………………………………………………...20
5.4.1. Desinfección…………………………………………………………………..20
5.4.2. Inducción de respuesta morfogénica...……………………………………...…22
5.6. Recolección de la información………………………………………………….25
5.7. Análisis de información…………………………………………………………25
6. Resultados y discusión…………………………………………………………….26
6.1. Desinfección…………………………………………………………………….26
6.2. Inducción de respuesta morfogénica…...………………………………………..40
7. Conclusiones…………………………………………………………………...….42
8. Recomendaciones………………………………………...……………………….43
9. Referencias………………………………………………………………………...45
10. Anexos…………………………………………………………………………...50
Resumen. La técnica de cultivo de tejidos se ha empleado en muchos géneros de
orquídeas de interés comercial. Aproximadamente el 55% de las especies de Dracula
son exclusivas de Colombia y tienen un gran valor como especies ornamentales, el
estudio de la propagación in vitro será fundamental para la comercialización y
conservación de estas especies.
El objetivo general de este trabajo fue desarrollar una metodología adecuada para la
introducción in vitro de segmentos de hojas de Dracula chimaera. Los objetivos
específicos fueron: 1. Establecer un protocolo de desinfección eficaz para los
explantes de Dracula chimaera y 2. Estudiar el efecto de diferentes concentraciones
de las hormonas ANA, k, 2,4-D y BAP en la inducción de respuestas morfogénicas de
los explantes de Dracula chimaera.
Los segmentos de hojas de D. chimaera fueron desinfectados con alcohol al 70% y
diferentes concentraciones de NaClO en diferentes tiempos. Como variables de
respuesta se tomaron el número de explantes contaminados, oxidados y cloróticos.
Se realizaron tres ensayos de desinfección, el mejor resultado se obtuvo con el
tratamiento 4 (2.5% NaClO durante 5 minutos) del tercer ensayo. Este tratamiento se
aplicó a todos los explantes de los tratamientos hormonales para los cuales se utilizó
ANA (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), BAP (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), 2,4-D (1, 2mg/L) y K (0.2, 0.5,
1, 2mg/L). No se observó ninguna respuesta de los explantes a los tratamientos
hormonales.
Cuando los explantes proceden de plantas adultas es necesario un adecuado
tratamiento de desinfección y el uso de antioxidantes. Las respuestas al cultivo de
tejidos están influenciadas por la fisiología de la planta donadora, la manipulación in
vitro y el estrés fisiológico que sufre el explante al colocarlo en condiciones in vitro.
Palabras claves. Cultivo de tejidos, desinfección, Dracula chimaera.
Abstract. The tissue culture has been used in many orchids of commercial interest.
Approximately 55% of the species of Dracula are exclusive of Colombia and have a
great value like ornamental species, the study of the propagation in vitro will be
fundamental for its commercialization and conservation.
The present investigation deals with development of a methodology for in vitro
establishment of leaf explants of Dracula chimaera, devise a method for the
development of surface sterilization protocol and to examine the effect of NAA, 2,4-
D, BAP and K on in vitro morphogenesis of leaf explants.
Young leaves of mature plants of D. chimaera were sterilized with 70% ethanol and
different concentrations of NaClO in different times. The number of contaminated,
phenolized and chlorotics explants were measured. Three tests of disinfection were
made, the best result was obtained with treatment 4 (2.5% NaClO 5 minutes) of the
third test. This treatment was applied to explantes of the hormonal treatments for
which was used NAA (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), BAP (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), 2,4-D (1,
2mg/L) and Kinetin (0.2, 0.5, 1, 2mg/L). Any answer of the explants was observed to
the hormonal treatments.
When the explantes come from adult plants is necessary a suitable treatment of
disinfection and the use of antioxidant. Tissue culture responses are influenced by
three main factors the physiology of the donor plant, in vitro manipulation and in
vitro plant stress physiology.
Key words. Dracula chimaera, surface sterilization, tissue culture.
1. Introducción
En Colombia cada vez se cultivan más especies de orquídeas nativas para la
comercialización y aumenta la preocupación por su supervivencia debido al deterioro
ambiental y a la colecta indiscriminada, sobre todo si se tiene en cuenta que en
condiciones naturales la germinación de las semillas de orquídeas es baja por carecer
de endospermo y que su desarrollo puede tardar varios años desde la germinación
hasta la floración. Entre estas orquídeas nativas cultivadas como ornamentales se
encuentran muchas del género Dracula, del cual aproximadamente el 55% de sus
especies son endémicas de diversas regiones del país, por lo cual el estudio de la
propagación in vitro será primordial para lograr una producción exitosa a nivel
comercial sin que se vean afectadas las poblaciones naturales.
La técnica de cultivo de tejidos se ha empleado en muchos géneros de orquídeas de
interés comercial y ha sido reconocida como una práctica esencial para la
micropropagación y para la biotecnología en general, puesto que ayuda a resolver la
problemática que existe para reproducir las orquídeas de manera tradicional (división
de la planta), para eliminar enfermedades en plantas de interés comercial, aumentar
las poblaciones de híbridos o variedades y para mantener la identidad genética.
Con el fin de obtener metodologías específicas para el cultivo de tejidos es necesario
establecer protocolos que aseguren condiciones adecuadas de desinfección de los
explantes, inducción de la desdiferenciación celular y regeneración de plantas
completas.
2. Marco teórico y revisión de literatura
2.1. Género Dracula
2.1.1. Clasificación taxonómica
El género Dracula pertenece a la familia Orchidaceae, subfamilia Epidendroide, tribu
Epidendreae y subtribu Pleurothallinidae, estuvo dentro del género Masdevallia hasta
1978 cuando Luer los separó. El género Dracula cuenta con aproximadamente 105
especies de las cuales 72 especies se encuentran en Colombia (Calderón & Farfán,
2003).
2.1.2. Características morfológicas
El género Dracula se caracteriza por no tener pseudobulbos, en cada tallo se
desarrolla una hoja grande y delgada, carinada, con ápice mucronado y con una
costilla media claramente definida; las hojas son glabras de un color verde oscuro a
claro y sustituyen las funciones del pseudobulbo como almacenadoras de nutrientes;
algunos tallos florales se desarrollan erectos mientras otros como los de las especies
epífitas se encuentran entre las raíces colgando debajo de la planta; las inflorescencias
emergen de la base de la planta; flores de color vinotinto, negruzco o café con los
sépalos internamente pubescentes, notoriamente dilatados y terminados en cordones
largos y delgados; pétalos muy pequeños, ensanchados y bilaminados o bivalvados
apicalmente y sin el diente que tiene Masdevallia en el margen labelar o en la base; el
labelo es generalmente sacciforme con venas radiales y dividido en un hipoquilo y
epiquilo; los pétalos y el labelo forman una figura parecida a una cara en el centro de
la flor (Calderón & Farfán, 2003; Ortiz, 1990; Vargas, 2002).
2.1.3. Hábitat
El género Dracula es exclusivamente neotropical, se distribuye desde México hasta
Perú excluyendo Las Antillas, Venezuela, Bolivia y Brasil; la mayoría de las especies
se encuentran entre los 1500 y los 2500m de altitud y muy pocas crecen al nivel del
mar. Este género esta particularmente diversificado en la cordillera central y los
Andes occidentales. La especie Dracula chimaera (Figura 1) sólo se encuentra en
Colombia, en los departamentos de Antioquia, Cauca y Choco entre los 1300 y los
2200m de altitud (Calderón & Farfán, 2003; Ortiz, 1990). Esta especie es epífita y
tiene preferencia por la sombra y las temperaturas bajas.
Figura 1. Fotografía de la flor de D. chimaera tomada en un cultivo comercial de orquídeas situado en
el Municipio de Fusagasuga.
2.2. Cultivo in vitro
2.2.1. Ventajas y desventajas del cultivo in vitro
La propagación in vitro es de gran utilidad ya que se pueden obtener plantas libres de
virus, reproducir híbridos valiosos, mejorar la calidad comercial y recuperar especies
que se encuentran en vía de extinción. Además se pueden producir plantas todo el
año sin importar las condiciones climáticas, permite obtener grandes cantidades de
plantas a partir de pocos explantes, se pueden generar variedades de interés
agronómico y se obtienen mejores condiciones fitosanitarias lo cual es benéfico para
la comercialización (Peláez, 2002).
Sin embargo, antes de optar por esta técnica se debe analizar muy bien la situación
de costo – beneficio del cultivo a producir, pues esta es una técnica costosa, por lo
que se debe conocer con certeza los campos en los que la técnica tiene aplicabilidad
para tomar una decisión adecuada. Los costos se deben a la mano de obra
especializada, a que las tasas de producción durante la micropropagación son
limitadas, al pobre enraizamiento y a las bajas tasas de supervivencia de las plántulas
durante la aclimatación, además se necesita tecnología avanzada y métodos
específicos para obtener buenos resultados. Otro inconveniente es que se pueden
producir variaciones no deseadas en los especimenes (Alonso, 2002).
2.2.2. Cultivo in vitro de orquídeas
La familia Orchidaceae fue el primer grupo de especies vegetales de interés
económico en las cuales se aplicaron técnicas de cultivo in vitro. El primer método
para la germinación de semillas in vitro de orquídeas fue desarrollado por Moore en
1849 (Arditti & Ernest, 1993). Las orquídeas tienen una inmensa diversidad
bioquímica, fisiológica y genética por lo cual existe toda una variedad de medios
designados para la multiplicación de cada especie, el medio propuesto por Knudson C
de 1946 es el más usado para siembra in vitro de semillas, las formulas descritas por
Vancin and Went de 1946 y Murashige y Skoog de 1962 son las más usadas para la
propagación clonal (Rego-Oliveira & Faria, 2005). Knudson en 1946 logró la
germinación asimbiótica de orquídeas en un medio de cultivo que contenía pulpa de
banano para contrarrestar las bajas concentraciones de nutrientes. Sin embargo, el
medio de cultivo más utilizado es el desarrollado por Murashige y Skoog en 1962
que ha sido probado exitosamente para la germinación y crecimiento de muchas
especies, debido principalmente a los altos contenidos de nitrógeno y potasio (Serna,
1999), como lo muestran los resultados obtenidos con semillas en muchas especies de
orquídeas que evidencian la necesidad de utilizar medios básicos relativamente
complejos como el Murashige y Skoog, con el cual se obtiene mayor número de
semillas germinadas, ya que con otros más sencillos se obtienen germinaciones muy
bajas (Flachsland et al. 1996; Lin et al., 2000).
La técnica de cultivo de tejidos para la multiplicación clonal de orquídeas se inició
con Morel en 1960 quien cultivó meristemos apicales de Cymbidium para obtener
plantas libres de virus y observó que era posible obtener gran cantidad de plantas
idénticas a la planta original. Morel también logró la producción de cuerpos
protocórmicos (Protocorm like Bodies) a partir de meristemos en varias orquídeas:
Cattleya, Phalaenopsis, Phaius, Miltonia, Odontoglossum, Odontioda y
Ophrysvanda. Estas investigaciones han sido de gran utilidad para la propagación de
orquídeas ya que se obtienen plantas libres de virus, se reproducen híbridos valiosos y
se puede mejorar la calidad comercial (Tokuhara & Mii, 2001).
Para la propagación clonal se han utilizado diferentes órganos: hojas (Arditti et al.,
1971; Nasiruddin et al., 2003), tallos (Tokuhara & Mii, 2001), raíces y rizomas
(Kerbauy & Maranhão, 1996; Bekele et al., 1995) e inflorescencias (Arditti & Ernest,
1993). En el caso de las orquídeas y de otras plantas ornamentales las hojas pueden
ser utilizadas para la propagación de plantas de interés comercial. La mayoría de las
investigaciones de cultivo de tejidos realizadas con ápices de hojas utilizan plantas
obtenidas de semillas sembradas in vitro, sin embargo estas plantas presentan gran
variabilidad genética. Una solución para esto es utilizar explantes de plantas adultas
con características comerciales deseables (Arditti et al., 1971; Ignacimuthu et al.,
1999).
2.2.3. Etapas de la micropropagación
2.2.3.1. Preparación del explante
Para la desinfección del explante se utiliza etanol al 70% para eliminar las burbujas
de aire para que el desinfectante, clorox� (hipoclorito de sodio) o hipoclorito de
calcio, tenga mejor contacto con el explante. Luego se utiliza un desinfectante que
puede ser hipoclorito de calcio o hipoclorito de sodio, se puede agregar Tween 20
para reducir la tensión superficial posteriormente se lava el explante con agua
destilada (Pierik, 1990). Para lograr una desinfección más efectiva se puede hacer
una inmersión del explante en un funguicida en la cámara de flujo laminar antes de
sumergirlo en alcohol.
La desinfeción para los ápices de hojas de orquídeas provenientes de hojas jóvenes de
plantas adultas puede variar según el tamaño del explante, su procedencia, etc., para
los géneros Aranda y Asconcenda se utilizó clorox al 10% durante 15-20 minutos,
para Cattleya se utilizó hipoclorito de calcio (10g en 140ml de agua) durante 10
minutos, para Dendrobium los explantes fueron colocados en clorox de 10 a 30% por
10 min., en Phalaenopsis se utilizó etanol al 70% (2 ó 3 inmersiones) luego
hipoclorito de calcio 7% por 10 min. y para el género Renantanda se usó etanol al
95% seguido de 10 min. en clorox. Todos estos procedimientos finalizan con 3
lavados con agua destilada para eliminar el hipoclorito de calcio o el clorox (Arditti
& Ernest, 1993).
2.2.3.2. Crecimiento del inóculo
Según las condiciones de cultivo, el explante se puede multiplicar por formación de
callo o sin ella. Sin embargo, se debe tener en cuenta que la formación de callo
implica diferentes grados de variación, que puede ser de tipo epigenético o
mutaciones verdaderas. La fase de crecimiento puede darse debido al aumento de
tamaño de las células, a su división o a ambas cosas. Esto dependerá de las
características del explante y de las condiciones in vitro (Jarret & Linz, 1991).
2.2.4. Factores que afectan el desarrollo in vitro
El proceso de regeneración dependerá de algunos factores como la planta donadora su
genotipo y estado fisiológico, los requerimientos nutricionales y hormonales varían
dependiendo de las diferentes edades fisiológicas, además mientras más joven y
menos diferenciado sea el tejido que se va a sembrar mejor será la respuesta in vitro
Los explantes provenientes de tejidos jóvenes poseen un alto grado de actividad
meristemática y tienden a tener mayor plasticidad in vitro, sin embargo la variabilidad
de la respuesta en explantes de la misma especie puede ser grande. El tamaño del
explante influye también en su repuesta ya que los explantes grandes aunque más
difíciles de desinfectar tienen un potencial regenerador mayor y no son tan
susceptibles a daños como los pequeños (Jarret & Linz, 1991).
Para la selección del explante se debe tener en cuenta el sistema de propagación de la
planta, si tiene reproducción por semilla las partes embrionarias o de las plántulas son
las más utilizadas, si se propagan vegetativamente los brotes jóvenes y los ápices
meristemáticos son usualmente la fuente del explante. El medio de cultivo
incluyendo su composición química y su forma física afecta el desarrollo in vitro, los
reguladores de crecimiento según sus concentraciones endógenas y exógenas y sus
interacciones pueden inhibir o promover la morfogénesis. Otros factores como la
temperatura que depende del lugar de procedencia de la planta, la luz (calidad,
intensidad y fotoperiodo) y el pH del medio entre otros (Jarret & Linz, 1991).
2.2.5. Problemas del cultivo in vitro
2.2.5.1. Contaminación
La mayor parte de la contaminación en el cultivo de tejidos procede de la planta
donadora del explante, dependiendo del tipo de explante se pueden transmitir
microorganismos del interior o de la superficie del explante. Los principales
microorganismos asociados a la superficie de las plantas son hongos, bacterias y
levaduras, la mayoría de ellos se pueden eliminar con esterilización superficial. Los
microorganismos endófitos pueden ser virus, viroides, micoplasmas, bacterias y
hongos que no se pueden eliminar por esterilización aunque su crecimiento puede ser
inhibido por altas concentraciones de sal, azúcar y por el pH (Alonso, 2002).
2.2.5.2. Clorosis
La clorosis es una alteración en las plantas que se manifiesta por el color amarillento
de los tejidos verdes, puede ser una respuesta al lavado de los explantes con
hipoclorito de sodio debido a las altas concentraciones y tiempos de inmersión que
causan inhibición de la biosíntesis de la clorofila y los carotenoides (Rivera, 1998).
2.2.5.3. Oxidación fenólica
Cuando se cultiva in vitro, la oxidación fenólica puede ocasionar serios problemas en
el establecimiento y supervivencia de los explantes de la mayoría de las especies.
Cuando los tejidos sufren daños mecánicos como los que se producen al aislar el
explante de la planta madre se liberan compuestos fenólicos que se manifiestan con
un ennegrecimiento del medio de cultivo alrededor del explante y que se puede
extender a todo el medio y provocar daños o inhibición del crecimiento y hasta la
muerte del explante. El ennegrecimiento y la inhibición del crecimiento dependen
mucho del genotipo y la edad del explante siendo más problemático en especies con
altos niveles de taninos y otros hidroxifenoles y en tejidos viejos que tienden a
producir más exudados fenólicos que los tejidos jóvenes (Alonso, 2002).
El ennegrecimiento de los tejidos ocurre por acción de enzimas oxidasas que son
secretadas, sintetizadas o están presentes en los tejidos heridos o senescentes. Dichos
exudados varían de especie a especie y suelen ser mezclas de complejos de sustancias
fenólicas. La práctica más común para contrarrestar el efecto de la oxidación
fenólica, es agregar antioxidantes al medio de cultivo que pueden ser inhibidores de
la polifenoloxidasa o adsorbentes, entre los más empleados están el ácido ascórbico,
el ácido cítrico, el ácido málico y el carbón activado (Pierik, 1990).
2.2.5.4. Hiperhidratación
La hiperhidratación o vitrificación es un desorden fisiológico que afecta a los cultivos
in vitro y que se manifiesta por la presencia de células translúcidas, alargadas,
fácilmente quebradizas y con apariencia acuosa lo cual causa perdida de la capacidad
de regeneración y bajas tasas de multiplicación. Este desorden, que en ciertos casos
impide el establecimiento de plántulas en condiciones ex vitro, se manifiesta
principalmente en las hojas y afecta a dos de los procesos más importantes que
realizan en estas: la fotosíntesis y el intercambio gaseoso, en menor medidita también
afecta tallos y raíces. Los estudios realizados sobre la vitrificación, señalan que los
defectos anatómicos y fisiológicos observados, son el resultado de varias alteraciones
en determinadas rutas metabólicas. Así los cambios en la síntesis de proteínas,
afectan a varias enzimas implicadas en la fotosíntesis (Rubisco), a la síntesis de
celulosa y lignina (PAL, glucano sintetasa), y a procesos asociados a la producción de
etileno (peroxidasas). Los factores causantes de la hiperhidratación pueden ser: alta
concentración de iones amonio en el medio, reguladores de crecimiento, temperatura,
potencial de agua (dado por la cantidad de agar y la concentración de iones en el
medio), humedad relativa y el genotipo de la planta (Gaspar et al. 1998 en Peláez,
2002).
2.2.5.5. Variación somaclonal
La variación somaclonal se da cuando ocurren modificaciones genéticas en las células
y tejidos que se cultivan in vitro y que se manifiestan como mutaciones que se
heredan a la progenie de las plantas regeneradas. Estas variaciones suelen consistir
en la aparición de plantas más pequeñas, cambios de color o mosaicos, cambios de
habito de crecimiento y cambios en la productividad. Estos cambios pueden llevar a
la aparición de nuevas variedades (Alonso, 2002). El origen de la variación no
siempre es claro, puede deberse a un reordenamiento cromosómico, un entrecruce
somático, un intercambio de cromátidas hermanas, una alteración de los nucleótidos
por metilación, una perturbación de la replica de ADN, un silenciamiento o una
activación de genes por mutaciones en regiones no codificadas (Tabares et al., 1991).
2.2.5.6. Recalcitrancia
La recalcitrancia es la incapacidad de las células, tejidos y órganos de las plantas para
responder a las condiciones del cultivo de tejido y puede darse en todos los niveles
del cultivo. La respuesta al cultivo de tejidos se ve influenciada por cuatro factores
principales: el genotipo de la planta donadora, la fisiología de la planta donadora, la
manipulación in vitro y por el estrés in vitro (Benson, 2000).
2.3. Reguladores de crecimiento
Los reguladores de crecimiento también llamados fitohormonas o biorreguladores son
compuestos químicos sintetizados por las plantas, ampliamente distribuidos en el
reino vegetal y con actividad biológica específica a concentraciones extremadamente
bajas. Los reguladores de crecimiento actúan estimulando o inhibiendo el desarrollo
de los tejidos vegetales, sin embargo su efecto no sólo está determinado por la
concentración de la sustancia, sino por factores ambientales como la luz, la
temperatura y la sensibilidad de los tejidos. En la actualidad también se utilizan
reguladores de crecimiento sintéticos, los cuales poseen una mayor capacidad de
producir respuestas fisiológicas y una menor susceptibilidad a la degradación por la
luz y la temperatura (Salisbury & Ross, 1992).
Dependiendo de la clase y de las concentraciones de los reguladores de crecimiento
se estimula o inhibe el desarrollo de los tejidos vegetales; las auxinas como el ácido
naftalen-acético (ANA) producen elongación celular y la expansión de tejidos,
división celular (inducen la formación de callo y promueven su crecimiento) y la
formación de raíces adventicias (Pierik, 1990). Para el cultivo in vitro de segmentos
de hojas en orquídeas las concentraciones de auxinas van desde 1mg/L hasta 5mg/L,
en el género Epidendrum se utiliza 1mg/L de 2,4-D (Arditti et al., 1971), en Aranda
2mg/L y en Dendrobium 5mg/L (Arditti & Ernest, 1993). Para la orquídea
Dendrobium formosum en formación de protocormo a partir de callo de hoja se
utilizaron concentraciones de ANA de 0, 0.5 y 1mg/L siendo la ultima concentración
con la que más protocormos se obtuvieron. El ácido indol-acético (AIA), otra auxina,
se usa para la inducción de callo entre 0.0001 a 10mg/L, bajando su concentración
(menos de 0.0001mg/L) se puede estimular organogénesis en las raíces, el AIA se
inactiva con la luz y es rápidamente oxidado por las células de las plantas (Nasiruddin
et al., 2003).
Las citoquininas como la bencil-amino-purina (BAP) estimulan el crecimiento y el
desarrollo, estimulan la división celular especialmente si ha hay auxinas presentes y
en altas concentraciones puede inducir la formación de vástagos adventicios (Jarret &
Linz, 1991). En los estudios realizados con segmentos de hojas en orquídeas las
concentraciones de citoquininas van de 0.5mg/L en Epidendrum hasta 5mg/L en
Dendrobium, en el género Aranda se utilizan concentraciones de 2mg/L mientras en
Cattleya se utiliza 1mg/L (Arditti & Ernest, 1993). Para Dendrobium formosum las
concentraciones de BAP utilizadas fueron 0, 2, 4 y 6mg/L (Nasiruddin et al., 2003).
La kinetina (furfuril-amino-purina) a menudo se incluye en medios de cultivo para la
inducción y crecimiento de callo, para el cultivo de células en suspensión y para la
inducción de la morfogénesis (0.01 a 2mg/L en orquídeas), las concentraciones altas
de kinetina pueden ser usadas para la rápida multiplicación de brotes, botones axilares
o adventicios y yemas meristemáticas. Las giberelinas se incorporan al medio para
ayudar a la maduración normal y a la germinación de los embriones (Pierik, 1990).
2.4. Respuesta morfogénica del explante
La capacidad de regenerar una planta completa que tienen las células vegetales
cuando están sometidas a estímulos adecuados se denomina totipotencia. Así, las
células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones
somáticos de acuerdo con la competencia que posean y el estímulo que reciban. Esta
regeneración ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciación, donde las
células responden ante cualquier estímulo organogénico o embriogénico; la fase de
inducción, donde las células se determinan para formar un órgano o embrión, y la
fase de realización, donde se forma el órgano o embrión. Estas fases están
directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la
optimización de los protocolos de regeneración debe realizarse teniendo en cuenta los
requerimientos intrínsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo (Lindsey, 1989).
2.4.1. Embriogénesis somática
La embriogénesis somática es la producción de embriones a partir de tejido somático
sin la fusión de gametos y puede darse por vía directa o indirecta. Cuando los
embriones se producen directamente de las células del explante sin previa formación
de callo debido a la presencia de células pre-embriogénicas determinadas, se
denomina embriogénesis somática directa. En otras ocasiones los tejidos producen
un callo que se caracteriza por poseer células con paredes gruesas, núcleo prominente
y alta densidad citoplasmática, lo que se denomina vía indirecta. En orquídeas hay
ejemplos de embriogénesis somática en Epidendrum ruizianum a partir de plántulas
(Peláez, 2002) y en Malaxis palmosa a partir de ápices de hojas (Jarret & Linz, 1991).
Se necesita la presencia de una auxina en concentraciones altas para la inducción de
un callo embriogénico. El ANA generalmente se utiliza en concentraciones de 1 a
10mg/L. El papel de las citoquininas no es tan claro, pero se cree que son esenciales
para la maduración y germinación de los embriones somáticos (Hurtado & Merino,
2001).
2.4.2. Organogénesis
La organogénesis implica el desarrollo de yemas o de meristemos radicales a partir de
los explantes, directamente o a partir de callo. Para que la organogénesis pueda
ocurrir a partir de un callo se deben producir cambios que conduzcan a la
organización celular (Jarret & Linz, 1991).
Las diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento producen diferentes
respuestas en el explante. Las auxinas tienen un efecto estimulante en la formación
de raíces e inhibidor en la formación de yemas. La diferenciación de yemas se da
cultivando los callos en un medio con una relación citoquinina:auxina alta mientras
para la diferenciación de raíces se requiere un medio con una relación
citoquinina:auxina baja (Hurtado & Merino, 2001).
2.4.3. Cuerpos protocórmicos (Protocorm like Body)
Durante el cultivo in vitro se puede desarrollar un cuerpo protocórmico que es una
masa de células muy parecida al protocormo que se forma cuando las células de los
embriones de orquídeas germinan y crecen hasta producir una masa de células en
condiciones naturales. Estos protocormos, con estructuras similares a raíces pueden o
no comenzar inmediatamente a producir clorofila dependiendo de la disponibilidad de
nutrientes (Chang et al., 2005).
3. Formulación del problema y justificación
3.1. Formulación del problema
El porcentaje de germinación en las semillas de orquídeas en condiciones naturales es
muy bajo. A pesar de que cada cápsula puede contener aproximadamente tres
millones y medio de semillas, sólo unas cuantas germinan, dificultando así la
selección y producción masiva para fines comerciales o para conservación. Por esta
razón, se han realizado numerosos estudios orientados hacia la obtención de técnicas
de micropropagación que garanticen un porcentaje elevado de nuevos individuos.
Ya que aproximadamente el 68% de las especies descritas de Dracula se encuentran
en Colombia (Calderón & Farfán, 2003) y dado que tienen un valor como especies
ornamentales, el estudio de la propagación in vitro será fundamental para su
comercialización y conservación, ayudando por una parte a maximizar su producción
y por otra a la conservación de especies en peligro ya sea mediante el aumento de las
poblaciones naturales o su conservación ex situ.
3.2. Preguntas de investigación
¿Existen diferencias en la respuesta de los explantes de hojas de plantas adultas a las
diferentes concentraciones y diferentes tiempos de inmersión en NaClO?
¿Existe diferencia en la acción de las distintas concentraciones de BAP, kinetina,
ANA y 2,4-D sobre los explante de hojas de plantas adultas?
3.3. Justificación
La floricultura se ha convertido en un importante sector económico de nuestro país.
Sin embargo, Colombia ha sido productor y exportador especialmente de especies no
nativas como crisantemos, rosas y claveles; desconociendo el uso y aprovechamiento
de especies propias (Marulanda & Isaza, 2004). Teniendo en cuenta que de las 105
especies que existen del genero Dracula 72 especies se han encontrado en Colombia,
de las cuales aproximadamente el 81% son endémicas (Calderón & Farfán, 2003) y
que en Colombia muchas orquídeas se encuentran en peligro de extinción por la
destrucción de sus hábitats y la extracción masiva de individuos por su alto valor
comercial como especies ornamentales (en especial los géneros Pescatorea, Anguloa
y Masdevallia) (Instituto Alexander von Humboldt, 1998), se hace
indispensable desarrollar metodologías de propagación que conduzcan a su
preservación y a un comercio que no dañe las poblaciones naturales.
La micropropagación es una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento,
ya que se pueden producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de
un genotipo seleccionado y con una tasa de multiplicación en teoría ilimitada. La
micropropagación también presenta otras ventajas cuando se la compara con otros
sistemas de propagación como la reducción del tiempo de multiplicación, mayor
control de sanidad del material que se propaga y la posibilidad de multiplicar
rápidamente una variedad de la que existan pocos individuos (Villalobos & Thorpe,
1991). Otra ventaja de este tipo de cultivo es que no implica la destrucción de la
planta utilizada (Arditti et al., 1971).
El empleo del cultivo de tejidos se ve justificado debido a la problemática que existe
para reproducir las plantas en campo ya sea para conservación o comercialización, la
presencia de enfermedades en plantas con una demanda comercial alta, por las bajas
poblaciones de híbridos o nuevas variedades que se obtienen por procesos naturales y
por la posibilidad de mantener la identidad genética, siempre y cuando no se realicen
subcultivos sucesivamente y no se utilicen altas concentraciones de reguladores de
crecimiento.
Desde el punto de vista comercial el cultivo de tejidos se justifica si se quiere obtener
plantas con características superiores, por esto el uso de plantas adultas cuyas
características ya hayan sido probadas, ofrece grandes ventajas sobre el cultivo de
semillas debido a que la variabilidad genética es menor.
4. Objetivos
4.1. Objetivo general
Desarrollar una metodología adecuada para el establecimiento in vitro de segmentos
de hojas jóvenes de D. chimaera.
4.2. Objetivos específicos
1. Establecer un protocolo de desinfección eficaz para los explantes de hojas jóvenes
de D. chimaera.
2. Estudiar el efecto de diferentes concentraciones de las hormonas ANA (Acido
naftaleno-acético), kinetina, 2,4-D (Ácido diclorofenoxi-acético) y BAP (Bencil-
amino-purina) en la inducción de una respuesta morfogénica de los explantes de hojas
jóvenes de D. chimaera.
5. Materiales y métodos.
5.1. Diseño de la investigación.
Como factores de diseño se tomaron las concentraciones de Hipoclorito de sodio, de
reguladores de crecimiento y los tiempos de inmersión de los explantes en
Hipoclorito de sodio, las diferentes concentraciones y tiempos fueron los niveles de
dichos factores. Para cada factor se midieron una serie de variables respuesta
tomando como unidad de respuesta al explante (Tabla 1).
Tabla 1. Factores de diseño con sus respectivos niveles y variables respuesta para la fase de
desinfección y de inducción de respuesta morfogénica de los segmentos de hoja de D. chimaera.
Factor de diseño Niveles Variable respuesta Unidad de
respuesta Unidad
Experimental
Número de explantes contaminados
Número de explantes
con clorosis
Número de explantes oxidados
Concentración de NaClO
1%, 2%, 2.25% y 2.5%
Porcentaje de sobrevivencia
Explante
Frasco
Número de explantes
contaminados
Número de explantes con clorosis
Número de explantes
oxidados
Tiempo de inmersión en NaClO
5, 10 y 15 Minutos
Porcentaje de sobrevivencia
Explante
Frasco
Número de explantes
que producen regeneración directa
Número de explantes
que producen regeneración
indirecta
Concentración de BAP
0, 0.5, 1, 2 y 3mg/L
Número de explantes
sin respuesta
Explante
Frasco
Porcentaje de sobrevivencia
Número de explantes
que producen regeneración directa
Número de explantes
que producen regeneración
indirecta
Concentración de ANA
0, 0.5, 1, 2 y 3mg/L
Número de explantes sin respuesta
Explante
Frasco
Número de explantes
que producen regeneración directa
Número de explantes
que producen regeneración
indirecta
Concentración de 2,4-D
1 y 2mg/L
Número de explantes
sin respuesta
Explante
Frasco
Número de explantes
que producen regeneración directa
Número de explantes
que producen regeneración
indirecta
Concentración de K
0.2, 0.5, 1 y 2mg/L
Número de explantes
sin respuesta
Explante
Frasco
5.1.1. Población de estudio y muestra.
Las poblaciones naturales de D. chimaera sólo se encuentra en Colombia, en los
departamentos de Antioquia, Cauca y Chocó. Para el estudio se utilizaron 25 plantas
adultas de D. chimaera como material donador de los explantes provenientes de un
cultivo comercial de orquídeas situado en el Municipio de Fusagasugá y se
trasladaron a la Unidad Docente-productiva El Remanso de la Universidad de
Ciencias Aplicadas y Ambientales (UDCA) hasta que se inició el experimento.
Con el objetivo de disminuir la contaminación in vitro se aplicó Derosal 500 SC
solución concentrada (0.3ml/L), un fungicida sistémico, a las plantas del primer
experimento de desinfección 8 días antes de obtener los explantes. Días antes del
tercer experimento de desinfección se aplicó a las plantas otro fungicida, Ditane M45
(450g/200L).
Los experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Agrícola de
la U.D.C.A. Las muestras fueron los segmentos tomados de hojas jóvenes de D.
chimaera. Por hojas jóvenes se considerarón hojas de aproximadamente 5cm de
altura y que presentaron la cubierta que las protege todavía intacta (Anexo 1). En el
laboratorio se cortaron los explantes de aproximadamente 1cm2 de manera que la
nervadura de la hoja quedara en el centro de cada explante, y se llevó a cabo la
desinfección del material según los diferentes tratamientos, el tratamiento con mejor
resultado en la desinfección se utilizó en la fase de respuesta morfogénica (Figura 2).
Para los explantes utilizados para la fase de desinfección no se tuvo en cuenta la
posición del explante en el medio mientras que los explantes utilizados para la fase de
respuesta morfogénica se colocaron con la parte abaxial hacia el medio de cultivo.
Figura 2. Diagrama de la metodología a seguir para la introducción in vitro de segmentos de hoja de
D. chimaera (Modificado de Roca & Mroginski, 1991).
Planta adulta
Explante
Medio de cultivo
1. Sin respuesta
2. Cultivo contaminado
3. Tejido oxidado
4. Regeneración indirecta
5. Regeneración directa
Desinfección
Respuesta Hoja joven
6.1.2. Variables del estudio.
En las pruebas de desinfección se evaluó el número de explantes con contaminación
por hongos o bacterias, oxidación, clorosis y el porcentaje de sobrevivencia de los
explantes, es decir, explantes que no presentaron contaminación, oxidación o clorosis.
En la etapa de inducción de respuesta morfogénica se evaluó la respuesta de los
explantes a los diferentes tratamientos mediante el número de explantes
contaminados, oxidados, que producen regeneración indirecta, regeneración directa y
explantes que no producen respuesta.
5.2. Métodos
5.2.1. Desinfección
Se realizaron tres experimentos de desinfección para determinar el procedimiento
más adecuado:
Primer experimento de desinfección: 8 días antes de obtener los explantes se aplicó
a las plantas Derosal 500 SC solución concentrada (0.3ml/L), un fungicida sistémico.
Las plantas se lavaron con detergente luego se cortaron los explantes y se
introdujeron en Tween 20 al 0.1% durante 20 minutos, en la cámara de flujo laminar
se sumergieron en alcohol etílico al 70% durante 30 segundos, luego en tres
concentraciones de Clorox® (1, 2, 2.5 % v/v) en diferentes tiempos de inmersión (5,
10, 15 minutos) para un total de nueve tratamientos con tres repeticiones y tres
explantes por repetición (Tabla 2), luego de realizada la inmersión, se lavaron tres
veces los explantes en agua destilada estéril y se sembraron en el medio de cultivo.
En este experimento para el alcohol, el hipoclorito y los lavados de agua destilada se
utilizaron diferentes cajas de petri y se trasladaron los explantes de una caja de petri a
otra con ayuda de una gasa.
Tabla 2. Tratamientos de desinfección con diferentes concentraciones de Hipoclorito de sodio y
diferentes tiempos de inmersión de los explantes.
Tiempo
[ ]NaOCl
5 minutos 10 minutos 15 minutos
1% T1 T2 T3
2% T4 T5 T6
2.5% T7 T8 T9
Segundo experimento de desinfección: Las plantas se lavaron con detergente luego
se cortaron los explantes y se introdujeron en Tween 20 0.1% durante 20 minutos, en
la cámara de flujo laminar se sumergieron en alcohol etílico al 70% durante 30
segundos, luego en tres concentraciones de Clorox® (2, 2.25, 2.5 % v/v) en
diferentes tiempos de inmersión (5, 10, 15 minutos) para un total de nueve
tratamientos con tres repeticiones y tres explantes por repetición (Tabla 3), luego de
realizada la inmersión, se lavaron tres veces los explantes en agua destilada estéril.
Antes de sembrar los explantes se sumergieron en Acido cítrico (0.5%) por 30
minutos para reducir la oxidación. En este experimento para el alcohol, el hipoclorito
y los lavados de agua destilada se utilizaron diferentes frascos y se trasladaron los
explantes de una caja de Petri a otra con ayuda de una gasa.
Tabla 3. Tratamientos de desinfección con diferentes concentraciones de Hipoclorito de sodio y
diferentes tiempos de inmersión de los explantes.
Tiempo
[ ]NaOCl
5 minutos 10 minutos 15 minutos
2% T10 T11 T12
2.25% T13 T14 T15
2.5% T16 T17 T18
Tercer experimento de desinfección: Se cortaron las hojas de las plantas, se lavaron
con jabón Protex y luego se sumergieron en Tween 20 al 0.1% durante 20 minutos, se
llevaron a la cámara de flujo laminar y se sumergieron en un fungicida y bactericida
(Venturina 2ml/L) durante 20 minutos, seguido de alcohol etílico al 70% durante 30
segundos, luego en dos concentraciones de Clorox® (2 y 2.5 % v/v) en diferentes
tiempos de inmersión (5, 10, 15 minutos) para un total de seis tratamientos con tres
repeticiones y dos explantes por repetición (Tabla 4), luego de realizada la inmersión
los explantes se lavaron tres veces con agua destilada estéril, se cortaron los explantes
y se sembraron en el medio de cultivo. En este experimento las hojas se mantuvieron
en un frasco al cual se aplicó la venturina, el alcohol, el hipoclorito y los enjuagues de
agua destilada.
Tabla 4. Tratamientos de desinfección con diferentes concentraciones de Hipoclorito de sodio y
diferentes tiempos de inmersión de los explantes.
Tiempo
[ ]NaOCl
5 minutos 10 minutos 15 minutos
2% T19 T20 T21
2.5% T22 T23 T24
Medio de cultivo
En las pruebas de desinfección se utilizó un medio sólido Murashige and Skoog
MSMA (Medio A para multiplicación de brotes) (34700mg/L) de Sigma (Anexo 2)
suplementado con Mioinsitol (100mg/L), Sacarosa (10000mg/L), Agar de Sigma
(Cultivo de tejido vegetal) (8000mg/L) y con pH ajustado a 5.8.
5.2.2. Inducción de respuesta morfogénica.
Se realizaron dos experimentos con tratamientos hormonales para los cuales se utilizó
el tratamiento de desinfección más exitoso del tercer experimento (tratamiento 4):
lavado con jabón Protex, inmersión en Tween 20 al 0.1% durante 20 minutos,
inmersión en Venturina (2ml/L) durante 20 minutos, seguida de alcohol etílico al
70% durante 30 segundos y finalmente inmersión en Clorox® (2.5 % v/v) durante 5
minutos, posteriormente se cortaron los explantes y se sembraron en el medio de
cultivo.
Primer experimento de inducción de respuesta morfogénica: Antes de sembrar los
explantes se sumergieron en Acido cítrico (0.5%) por 30 minutos para reducir la
oxidación. En esta etapa se evaluó las respuestas de los explantes a las diferentes
concentraciones hormonales. Está fase tuvo una duración aproximada de 8 semanas,
dentro de las cuales se esperó una respuesta morfogenética del explante. Se realizaron
25 tratamientos con tres repeticiones cada uno y dos explantes por repetición (Tabla
5).
Tabla 5. Tratamientos hormonales para el primer experimento.
ANA
BAP
0mg/L
0.5mg/L
1mg/L
2mg/L
3mg/L
0mg/L T1 T2 T3 T4 T5
0.5mg/L T6 T7 T8 T9 T10
1mg/L T11 T12 T13 T14 T15
2mg/L T16 T17 T18 T19 T20
3mg/L T21 T22 T23 T24 T25
Medio de cultivo
Los explantes se sembraron en medio Murashige & Skoog basal salt mixture
(4.33g/L) de Phytotechnology, enriquecido con Tiamina (0.1mg/L), Glicina (2mg/L),
Piridoxina (0.5mg/L), Inositol (100mg/L), Niacina (0.5mg/L) y con las hormonas
ANA (Acido naftaleno-acético) (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L) y BAP (Bencil-amino-purina)
(0, 0.5, 1, 2, 3mg/L). El pH se ajustó a 5.8. El BAP se agregó al medio antes de
autoclavar y el ANA se esterilizó con un filtro Millipore (0.22µm).
Segundo experimento de inducción de respuesta morfogénica: En esta etapa se
evaluó las respuestas de los explantes a las diferentes concentraciones hormonales.
Se realizaron cuatro tratamientos con cinco repeticiones cada uno y dos explantes por
repetición (Tabla 6).
Tabla 6. Tratamientos hormonales para el segundo experimento.
Tratamiento Auxinas (mg/L) Kinetina (mg/L) 26 ANA (0.5) 0.2 27 ANA (1) 1 28 2,4-D (1) 0.5 29 2,4-D (2) 2
Medio de cultivo
Los explantes se sembraron en medio Murashige & Skoog basal salt mixture
(4.33g/L) de Phytotechnology, enriquecido con Tiamina (0.1mg/L), Glicina (2mg/L),
Piridoxina (0.5mg/L), Inositol (100mg/L), Niacina (0.5 mg/L), Carbón activado
(20mg/L), Ácido cítrico (1000mg/L) y con las hormonas ANA (0.5, 1mg/L), 2,4-D
(1, 2mg/L) y Kinetina (0.2, 0.5, 1, 2mg/L). El pH se ajustó a 5.8.
Frascos de cultivo
Se utilizaron frascos de cultivo de vidrio con tapas de aluminio selladas con
Parafilm®. Los frascos fueron autoclavados a 121 ºC por 40 minutos y 1.2kg/cm2 de
presión.
Condiciones de cultivo
Los frascos se mantuvieron bajo una fuente de luz proporcionada por un tubo
fluorescente de 36 W, con un fotoperíodo de 15 horas luz y una temperatura de 21-
25º C.
5.3 Recolección de la información.
La recolección de la información en los diferentes experimentos, tanto de
desinfección como de inducción de respuesta morfogénica se realizó cada 8 días, se
llevó un registro fotográfico y los datos se consignaron en formatos especiales. Para
la fase de desinfección, los datos recolectados durante 3 semanas por cada
experimento se consignaron en una tabla (Anexo 3) teniendo en cuenta la fecha de la
observación, los diferentes tratamientos y las variables a observar. Para la fase de
inducción de respuesta morfogénica los datos obtenidos se consignaron en un formato
para observar los cambios producidos por las concentraciones hormonales en los
explantes (Anexo 4). Para el análisis estadístico los datos de las observaciones fueron
transferidos a otro formato en Excel (Anexo 5).
5.4 Análisis de información.
Los datos fueron tabulados teniendo en cuenta las diferentes concentraciones de
hipoclorito de sodio para la parte de desinfección y las diferentes concentraciones
hormonales para la fase de inducción de respuesta morfogénica con las respectivas
variables y sus valores, también se realizaron gráficas para observar la tendencia de
los valores de cada variable para cada tratamiento a través del tiempo.
Se utilizó el programa SAS para comparar los diferentes tratamientos de los
experimentos de desinfección por medio de un ANAVA, con un diseño
completamente al azar con igual número de repeticiones puesto que las unidades
experimentales eran homogéneas (Hurtado & Merino, 2001). Para determinar que
tratamientos presentaban diferencias significativas se realizaron pruebas de
Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y Turkey.
6. Resultados y discusión
6.1. Desinfección
En la fase de desinfección en el primer experimento se observó una diferencia
significativa entre los tratamientos 1,4,5 y 9 con respecto a los demás tratamientos ya
que la contaminación fue del 100% mientras que en los otros fue del 66,66% (Anexo
6), sin embargo todos presentaron altos niveles de contaminación, mientras en el
tratamiento 15 del segundo experimento se observó una disminución significativa de
la contaminación de los explantes (33,33%) con respecto a los otros tratamientos
(Anexo 7), sin embargo, se obtuvieron mejores resultados en el tercer experimento de
desinfección en el cual todos los explantes de tres tratamientos (19, 21 y 22) quedaron
libres de contaminación (Anexo 8) (Figura 3).
Los mayores contaminantes en el cultivo de tejidos son los hongos y las bacterias que
comúnmente se encuentran en las plantas en condiciones naturales, pero debido a que
el medio de cultivo es rico en nutrientes estos hongos y bacterias crecen causando
casi siempre la muerte del explante (Skirvin et al., 1999). Algunos estudios sugieren
que el estrés que se causa a los explantes al cultivarlos in vitro puede ocasionar la
propagación de bacterias endógenas y algunas veces a pesar de que bacterias, como
las Xanthomonas, pueden causar gran pérdida de explantes conforme crecen y se
multiplican, algunos explantes pueden sobrevivir y continuar su desarrollo junto a la
bacteria (Hine-Gómez y Valverde-Cerdas, 2003).
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3Semanas
Con
tam
inac
ión
(%)
T1: 100%
T2: 66%
T3:66%
T4: 100%
T5: 100%
T6:66%
T7: 66%
T8: 66%
T9: 100%
-20
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Con
tam
inac
ión
(%)
T10: 100%
T11: 100%
T12: 66%
T13: 77%
T14: 100%
T15: 33%
T16: 100%
T17: 100%
T18: 100%
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Con
tam
inac
ión
(%)
T19: 0%
T20: 50%
T21: 0%
T22: 0%
T23: 16%
T24: 100%
Figura 3. Porcentaje de explantes con contaminación por tratamiento 1, 2 y 3 semanas después de la
siembra para cada experimento de desinfección realizado: A. Primer experimento, B. Segundo
experimento y C. Tercer experimento.
C
A
B
El alto porcentaje de contaminación de los explantes en el primer y segundo
experimento pudo deberse al cambio de los explantes de una caja de Petri a otra para
cada paso de la metodología, a diferencia del tercer experimento donde se utilizó un
frasco dentro del cual se mantuvieron los explantes durante todos los pasos de la
desinfección, lo cual redujo notoriamente la contaminación. El pH del medio de
cultivo también puede incidir en el porcentaje de contaminación. Skirvin et al.
(1999) compararon el crecimiento de bacterias en medios de cultivo para plantas
perennes con dos rangos de pH (4.5 a 5.2 vs. 5.6 a 5.8) y observaron que el pH más
ácido inhibe el crecimiento de las bacterias contaminantes.
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta cuando se utilizan explantes que
no provienen de plántulas germinadas in vitro es que generalmente la contaminación
es alta, por ejemplo, en el estudio realizado por Goh y Tan (1979) con hojas jóvenes
de plantas adultas de Renantanda (Orchidaceae) el mayor porcentaje de
contaminación fue del 54% y el menor fue del 30% (Arditti & Ernest, 1993). En este
trabajo se obtuvieron muy buenos resultados en cuanto a la desinfección de los
explantes con el tratamiento 4 del tercer experimento, además cuando se aplico este
tratamiento para la fase de tratamientos hormonales solo el 4% de los explantes
presentaron contaminación.
Toda la contaminación que se presentó en los experimentos de desinfección de hojas
de D. chimaera fue causada por hongos y por bacterias (Figura 4). En todos los casos
que se observaron, la contaminación partía del explantes y no de algún punto del
medio de cultivo, lo cual indica que la contaminación venía del explante o de las
herramientas utilizadas para su manipulación y no del medio de cultivo (Figura 5).
0
20
40
60
80
100
Con
tam
inac
ión
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
Fúngica
Bacterial
0
20
40
60
80
100
Con
tam
inac
ión
(%)
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tratamiento
Fungica
Bacterial
0
20
40
60
80
100
Con
tam
inac
ión
(%)
19 20 21 22 23 24
Tratamiento
Fúngica
Bacterial
Figura 4. Porcentaje de la contaminación causada por hongos y bacterias en cada uno de los
tratamientos con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A.
Primer experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras
iguales no son significativamente diferentes.
A
B
C
A A A A B B B B B
A A A A A A B B C
A B C C C C
Figura 5. Segmentos de hoja de D. chimaera: A. Contaminado por una bacteria lisa, B. Contaminado
por una bacteria rugosa, C, D, E y F. Contaminados por hongos.
C
B A
D
E F
Tanto para el primer experimento como para el segundo, el porcentaje de clorosis fue
muy alto. Para el primer experimento se presentaron diferencias significativas entre
los tratamientos 5, 6, 7 8 y 9 donde el 100% de los explantes presentaron clorosis y
los tratamientos 1, 2 y 3 donde el porcentaje fue menor (77,77%, 66,66% y 77,77%
respectivamente) (Anexo 9). En cuanto al segundo experimento no se presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos debido a que el 100% de los explantes
de todos los tratamientos presentaron clorosis (Anexo 10). En el tercer experimento
se presento una diferencia significativa entre los tratamientos 19 y 23 que presentaron
clorosis y los tratamientos 20, 21, 22 y 24 en los que los explantes no presentaron
ningún tipo de clorosis (Anexo 11).
En el primer experimento la concentración de hipoclorito más baja, del 1%
(tratamientos 1,2 y 3), presentó el menor porcentaje de clorosis mientras que en el
segundo experimento donde la concentración menor de Hipoclorito de sodio fue del
2% todos los explantes presentaron clorosis después de sumergirlos en NaClO al
igual que en las concentraciones más altas del primer experimento. En el tercer
experimento la clorosis se redujo significativamente al cortar los explantes después
del tratamiento con NaClO y no antes como se hizo en los experimentos anteriores
(figura 6 y figura 7). En muchos casos se observó una disminución en la clorosis de
los explantes con el tiempo debido a que tienden a oscurecerse.
En otros cultivos in vitro con hojas jóvenes de plantas adultas se utilizaron
concentraciones más altas de los desinfectantes y tiempos más prolongados, en
Aranda 10% de clorox, en Ascocenda 10% por 15 minutos, en Dendrobium 10 a 30%
por 10 minutos, en Renantanda 10% de clorox por 10 minutos y en Phalaenopsis 7%
de hipoclorito de calcio por 10 minutos (Arditti & Ernest, 1993), y en ningún caso
hacen referencia a clorosis u oxidación de los explantes como sucedió con los
explantes de hojas de D. chimaera.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Clo
rosi
s (%
)
T1: 77%
T2: 77%
T3: 77%
T4: 88%
T5: 100
T6: 100%
T7: 100%
T8: 100%
T9: 100%
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Clo
rosi
s (%
)
T10: 100%
T11: 100%
T12: 100%
T13: 100%
T14: 100%
T15: 100%
T16: 100%
T17: 100%
T18: 100%
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Clo
rosi
s (%
)
T19: 50%
T20: 0%
T21: 0%
T22: 0%
T23: 83%
T24: 0%
Figura 6. Porcentaje de explantes con clorosis por tratamiento 1, 2 y 3 semanas después de la siembra para cada experimento de desinfección realizado: A. Primer experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento.
A
B
C
0
20
40
60
80
100
Clo
rosi
s (%
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
Totalmenteclorótico
Bordescloróticos
0
20
40
60
80
100
120
Clo
rosi
s (%
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
Totalmentecloróticos
Bordescloróticos
0
20
40
60
80
100
Clo
rosi
s (%
)
1 2 3 4 5 6
Tratamiento
Totalmentecloróticos
Bordescloróticos
Figura 7. Porcentaje de la clorosis en bordes y en todo el explante para cada uno de los tratamientos
con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A. Primer
experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras iguales no
son significativamente diferentes.
A
C
B
A A A A A B B B B
A A A A A A A A A
A B C C C C
Aunque la mayoría de los explantes solo se tornaban cloróticos en los bordes,
principalmente en el primer y segundo experimento de desinfección, algunos con el
tiempo se tornaron completamente blancos (Figura 8). Por esto, es muy importante
tener en cuenta las dosis y los tiempos de inmersión utilizados pues todos los
desinfectantes son tóxicos para los tejidos (Sánchez-Cuevas & Salaverría, 2004).
Figura 8. Segmentos de hoja de D. chimaera: A. Completamente verde, B. Clorótico en el borde y
C. Completamente clorótico.
Para la variable oxidación en el primer experimento no se presentaron diferencias
significativas entre tratamientos debido a que todos los explantes presentaron altos
niveles de oxidación (Anexo 12). Para el segundo experimento de desinfección se
presentó una diferencia entre los tratamientos 13,14 y 17 con respecto a los demás
tratamientos porque presentaron una oxidación más alta, el tratamiento 16 presento el
porcentaje de oxidación más bajo (Anexo 13). En el tercer experimento se presentó
una diferencia significativa entre los tratamientos 20,21 y 24 que presentaron un
100% de oxidación y los tratamientos 19 y 23 con respecto al tratamiento 22 que no
presentó oxidación (Anexo 14). Los tratamientos 20 y 21 son los tiempos más altos
(10 y 15 minutos) de la concentración de hipoclorito de 2% y el tratamiento 24 es la
A B C
concentración más alta 2.5% con el mayor tiempo de inmersión (15 minutos), esto
puede sugerir que tanto las concentraciones más altas como los tiempos más
prolongados de inmersión de los explantes pueden causar mayor porcentaje de
oxidación.
La oxidación fenólica (Figura 9) fue un gran inconveniente para la introducción de
los explantes, en el primer experimento no se utilizó ningún tipo de antioxidante y la
oxidación fue del 100% en todos los tratamientos, ya fuera en los bordes de los
explantes o todo el explante. En el segundo experimento se utilizó ácido cítrico
(0.5%) lo cual disminuyó un poco la oxidación de los explantes en todos los
tratamientos pero no fue suficiente. En el tercer experimento no se utilizó ningún tipo
de antioxidante por lo cual la oxidación fue muy alta a pesar de cortar los explantes
después del tratamiento con NaClO, sin embargo, el tratamiento 22 presentó una
diferencia significativa con los otros tratamientos ya que los explantes se mantuvieron
completamente verdes, además no tuvo ningún tipo de contaminación ni presento
clorosis, por esto se decidió utilizar este tratamiento de desinfección para la fase de
los tratamientos hormonales.
La oxidación de los explantes de D. chimaera se dio principalmente en los bordes,
probablemente a causa de las heridas al momento del corte, por la manipulación con
las pinzas y por la desinfección superficial que generalmente agrava el problema de
la oxidación. La oxidación también se da algunas veces por causa de componentes
específicos en el medio de cultivo, como los cationes metálicos (Benson, 2000). En
algunos casos la oxidación se extendió a todo el explante y causó el oscurecimiento
del medio de cultivo (Figura 10). También se observó que los explantes de menor
tamaño se oxidaban más rápidamente que los de mayor tamaño.
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Oxi
daci
ón (%
)
T1: 100%
T2: 100%
T3: 100%
T4: 100%
T5: 100%
T6: 100%
T7: 100%
T8: 100%
T9: 100%
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Oxi
daci
ón (%
)
T10:33%
T11: 55%
T12: 44%
T13: 88%
T14: 100%
T15: 44%
T16: 11%
T17: 77%
T18: 44%
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3
Semanas
Oxi
daci
ón
T19: 66%
T20: 100%
T21: 100%
T22: 0%
T23: 33%
T24: 100%
Figura 9. Porcentaje de oxidación por tratamiento 1, 2 y 3 semanas después de la siembra para cada
experimento de desinfección realizado: A. Primer experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer
experimento.
A
B
C
Figura 10. Segmentos de hoja de D. chimaera: A. Oxidado en el borde, B. Completamente oxidados
y C. Completamente verdes en un medio con 2% de carbón activado.
El hecho de utilizar plantas adultas puede ser un factor importante para explicar los
altos niveles de oxidación. Alonso (2002) encontró al comparar la oxidación en
explantes procedentes de plantas in vitro con explantes de plantas de invernadero de
Geranio que los explantes de plántulas in vitro no presentaban oxidación mientras que
los explantes de plantas de invernadero presentan un porcentaje de oxidación muy
alto, ya sea colocándolos en oscuridad o en luz. Esto se puede deber a que las
plantas pequeñas tienen menor tendencia a producir exudados fenólicos que las
plantas adultas. A diferencia de lo sucedido con D. chimaera donde la oxidación de
los explantes fue muy alta, sobre todo en los bordes de los explantes (Figura 11), en
los experimentos con hojas de plantas adultas de Phalaenopsis y Renantanda no se
hace mención a ningún tipo de oxidación a pesar de que en dichos estudios se
utilizaron concentraciones de hipoclorito mayores y por tiempos más largos.
A B C
0
20
40
60
80
100
Oxi
daci
ón (%
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
Totalmenteoxidados
Bordesoxidados
0
20
40
60
80
100
Oxi
daci
ón (%
)
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tratamiento
Totalmenteoxidados
Bordesoxidados
0
20
40
60
80
100
Oxi
daci
ón (%
)
1 2 3 4 5 6
Tratamiento
Totalmenteoxidados
Bordesoxidados
Figura 11 Porcentaje de oxidación en bordes y en todo el explante para cada uno de los tratamientos
con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A. Primer
experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras iguales no
son significativamente diferentes.
A
B
C
A A A A A A A A A
A A A B B B B B C
A A A B B C
Los explantes de diferentes partes de la planta responden de manera muy diferente
durante la fase de iniciación del cultivo y por lo tanto los niveles de estrés oxidativo
varían de un explante a otro, esto es algo que se debe tener en cuenta a la hora de
elegir el tipo de estructura para tomar el explante ya que de esto depende el éxito del
cultivo (Benson, 2000a).
Cuando un tejido vegetal se somete a algún tipo de estrés por una patología,
envejecimiento o daño físico, se da una producción incontrolada de radicales libres
que son componentes esenciales del metabolismo normal. Está producción
incontrolada es muy nociva debido a que son moléculas altamente reactivas por que
tienden a aparear el electrón libre con los dominios celulares ricos en electrones como
la membrana lipídica. Aunque las plantas han desarrollado un sistema complejo de
antioxidantes para protegerse contra el ataque de los radicales libres cuando se da el
estrés la protección antioxidante se satura y los radicales libres atacan la membrana
lipídica produciéndose productos de descomposición tóxicos que causan el estrés
oxidativo secundario. La oxidación de las membranas produce la pérdida de la
integridad estructural y por tanto de la funcionalidad que a su vez pueden conducir a
la necrosis y a la muerte del tejido (Benson, 2000a).
El porcentaje de sobrevivencia (explantes totalmente verdes) a las tres semanas de
cultivos para el primer y segundo experimento de desinfección fue de 0% debido a
los altos porcentajes de contaminación, clorosis y oxidación. En el tercer
experimento de desinfección el porcentaje de sobrevivencia de los explantes fue
mayor (Figura 12.
0
20
40
60
80
100
Sobr
eviv
enci
a (%
)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Tratamiento de desinfección
Figura 12 Porcentaje de sobrevivencia de los explantes para los diferentes tratamientos de
desinfección.
Cortar los explantes antes de sumergirlos en el hipoclorito de sodio y no usar otro
desinfectante junto con el hipoclorito incidió en los altos porcentajes de
contaminación, oxidación y clorosis. El tratamiento 22 fue el único de los tres
experimentos de desinfección en el que todos los explantes se mantuvieron verdes y
sin contaminación luego de las 3 semanas de observación por lo cual fue escogido
para la fase de inducción de respuesta morfogénica.
6.2. Inducción de respuesta morfogénica
Tanto en el primer experimento con hormonas como en el segundo no se observó
ningún tipo de respuesta morfológica de los explantes. En el primer experimento
pudo deberse a los altos niveles de oxidación, ya que todos los explantes presentaron
oxidación. Muchas veces los compuestos fenólicos exudados por los explantes
debido a los cortes y a los tratamientos de desinfección inhiben el crecimiento e
inclusive pueden causar la muerte del tejido, en especial en tejidos con altos
contenidos de fenoles. En el segundo experimento se agregó carbón activado y ácido
cítrico al medio de cultivo con lo cual disminuyó la oxidación de los explantes que se
conservaron verdes por más tiempo sin embargo tomaron una coloración oscura por
el carbón activado del medio.
El genotipo de la planta donadora es fundamental para la respuesta morfogénica del
explante, los genotipos recalcitrantes presentan altos niveles de antocianinas y
fenoles. Además los explantes tomados de plantas adultas tienen un menor potencial
de desdiferenciación pues las células están más especializadas y hay interacciones
más complejas entre las células lo cual hace más difícil la obtención de cualquier tipo
de respuesta (Cassells & Curry, 2001).
La planta donadora juega un papel fundamental en el éxito del cultivo in vitro, se
sabe que los tejidos maduros son muy recalcitrantes, el ciclo de vida de la planta
donadora también puede afectar la respuesta in vitro, las especias de las regiones
ecuatoriales muestran ritmos de crecimiento que pueden afectar las respuestas in
vitro. La manipulación in vitro también puede causar recalcitrancia cuando se dan
interacciones inhibitorias entre los reguladores de crecimiento endógenos y exógenos,
para esto se recomienda utilizar reguladores de crecimiento más potentes como el
thidiazuron, las interacciones entre auxinas y citoquininas también pueden fomentar
la producción de etileno el cual puede actuar tanto como inhibidor o promotor de la
morfogénesis in vitro. La composición del medio también es importante, muchas
especies necesitan modificaciones específicas en el medio de cultivo, el agente
gelificante y la fuente de carbono también son importantes. Otros aspectos
importantes son la ventilación que ayuda a que no se acumule etileno, la luz que tiene
gran influencia en las respuestas morfogénicas dependiendo de su calidad, intensidad
y fotoperiodo, y la temperatura que depende del lugar de origen de la planta
donadora. Otro factor importante en la recalcitrancia es el estrés oxidativo que se da
como consecuencia de los daños físicos causados al explante durante la desinfección
y al cortarlos (Benson, 2000).
Tanaka cultivó hojas jóvenes de plantas adultas de Phalaenopsis en un medio MS
modificado y obtuvo cuerpos protocórmicos, sin embargo el rendimiento fue pobre.
En este estudio se concluyó que el resultado depende bastante del material usado,
algunos explantes se tornaron negros y se murieron, otros se mantuvieron verdes por
7 meses sin producir ninguna respuesta ni callo ni cuerpos protocórmicos. Goh y Tan
(1979) al sembrar segmentos de hojas jóvenes de plantas adultas de Renantanda
utilizaron un medio líquido lo cual reduce la oxidación y obtuvieron callos y cuerpos
protocórmicos que luego se transfirieron a otros medios (Arditti & Ernest, 1993).
Chen y Chang (2001) encontraron que las auxinas 2,4-D, AIA, AIB y ANA retardan
la capacidad de formar embriones en los explantes de Oncidium e inclusive pueden
inhibirla completamente a bajas concentraciones mientras que todas las citoquininas
promovieron su formación (2iP, zeatina, BA, kinetina y TDZ). Además encontraron
que se da un mayor porcentaje de formación de embriones por la parte adaxial del
explante. Sheelavanthmath et al. (2005) compararon el porcentaje de formación de
cuerpos protocórmicos usando protocormos y segmentos de hojas de plántulas con
diferentes hormonas (ANA, AIA, BA, TDZ y K) y encontraron que el mayor
porcentaje de producción se dio en los tratamientos a los que se les aplicó únicamente
BA.
7. Conclusiones
El hecho de que los explantes procedan de plantas adultas cultivadas en invernadero
hace necesario un adecuado tratamiento de desinfección debido a los altos niveles de
contaminación. Para los explantes de hojas de D. chimaera la contaminación se
controló eficazmente con la inmersión de los explantes en Venturina (2ml/L) por 20
minutos y en NaClO (2.5%) por 5 minutos. También es importante para la
disminución de la contaminación que durante la desinfección los explantes se
mantengan en un frasco esterilizado y a este adicionar la venturina, el NaClO y el
agua para evitar que los explantes entren en contacto con una superficie contaminada.
La oxidación fenólica y la clorosis se reducen en gran medida al cortar las hojas
después de la inmersión en NaClO, sin embargo, es necesario el uso de antioxidantes
ya sea para inmersión de los explantes antes de la siembra o en el medio de cultivo,
aunque fue mucho más efectiva la adición al medio de carbón activado (2%) y ácido
cítrico (1g/L) que la inmersión de los explantes en ácido cítrico (0.5%) antes de la
siembra.
En cuanto a la recalcitrancia de los explantes, esta se puede dar por muchos factores
entre ellos la fisiología de la planta donadora (ciclo de vida), la manipulación in vitro
(componentes del medio de cultivo, la relación de las concentraciones hormonales y
condiciones de cultivo) y el estrés fisiológico que sufre el explante por los métodos
de desinfección y los cortes que pueden generar estrés oxidativo.
8. Recomendaciones
Para controlar la oxidación de los explantes de hojas de D. Chimaera, que fue un gran
obstáculo para la introducción in vitro, se podría evaluar la eficacia de otros
antioxidantes como PVP y cisteina que han sido utilizados con éxito en otros
estudios, también se podría utilizar un medio líquido o realizar cambio del medio de
cultivo cada cierto tiempo, pero esto sería más dispendioso.
La recalcitrancia se puede mitigar utilizando reguladores de crecimiento sintéticos
como el thidiazuron (TDZ) que es un regulador muy eficaz y que produce una amplia
gama de respuestas de diferenciación y desdiferenciación. Además se pueden usar
concentraciones de otras citoquininas como el BA sin presencia de auxinas ya que en
varios estudios se ha observado que las auxinas inhiben la respuesta morfogénica del
explante.
Para la microprogación por cultivo de tejidos de D. chimaera también se podría
trabajar con las cubiertas que protegen las hojas jóvenes ya que poseen una capacidad
alta de regeneración y pueden ser removidas sin dañar la planta.
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Agricultura Tropical). Cali, Colombia.
10. Anexos Anexo 1. Fotografía de una hoja adulta y de una hoja joven de D. chimaera.
22cm
5cm
Anexo 2. Composición del medio de cultivo Murashige & Skoog (MS).
Componente
Concentración (mg/L)
Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
1650
1900
Cloruro de calcio dihidratado 440
Fosfato de potasio 170
Ácido bórico
Molibtado de sódio dihidratado
Cloruro de cobalto hexahidratado
Yoduro de potasio
6.2
0.25
0.025
0.83
Sulfato de magnesio heptahidratado
Sulfato de magnésio tetrahidratado
Sulfato de zinc heptahidratado
Sulfato de cobre pentahidratado
370
22.3
8.6
0.025
EDTA de sodio
Sulfato y hierro heptahiratado
3.73
27.8
Tiamina
Niacina
Piridoxina
Glicina
0.1
0.5
0.5
2
Mio-inositol
Sacarosa
Agar
100
20000
8000
Anexo 3. Formato donde se consignaron los datos obtenidos con los tratamientos de
desinfección realizados, los datos se recolectaron a lo largo de 3 semanas, teniendo en
cuenta la fecha de la observación, los diferentes tratamientos y las variables a
observar. Para diligenciar el formato se marco una x en la casilla que correspondiera
y se anotaban las observaciones generales.
Experimento: Fecha: Número de tratamientos: Número de repeticiones: Número de explantes por repetición:
Unidad experimental variables Contaminación Oxidación Clorosis Tratamiento Repetición Explante
No Bacterial Fúngica si no Si No
Observaciones
generales 1 2
1
3 1 2
2
3 1 2
1
3
3 1 2
1
3 1 2
2
3 1 2
2
3
3 1 2
1
3 1 2
2
3 1 2
3
3
3 1 2
1
3 1 2
2
3 1 2
4
3
3
Anexo 4. Formato donde se consignaron los datos obtenidos con los tratamientos
hormonales realizados, teniendo en cuenta la fecha de la observación, los diferentes
tratamientos y las variables a observar. Contaminación: N= no, B= bacterial, F=
fúngica; Oxidación: M= en el medio de cultivo, B= bordes del explante, T= todo el
explante.
Experimento: Hormonas Fecha: Número de tratamientos: Número de repeticiones: Número de explantes por repetición: BAP (mg/L) ANA (mg/L) Repetición Explante Contaminación Oxidación Días tomados
para desdiferenciación
Tipo de respuesta
del explante 1
1 2 1
2 2 1
0
0
3 2
1 1 2
1 2 2
1
0
0.5
3 2
1 1 2
1 2 2
1
0
1
3 2
1 1 2
1 2 2
1
0
2
3 2
1 1 2
1 2 2
1
0
3
3 2
1 1 2
1 2 2
1
0.5
0
3 2
Anexo 5. Formato donde se consignaron los datos obtenidos con los tratamientos de
desinfección para su análisis estadístico. Para diligenciar el formato se utilizaron las
siguientes convenciones: Contaminación: 0 = explante no contaminado y 1 = explante
contaminado; Clorosis: 0 = explante sin clorosis, 1 = explante con clorosis en los
bordes y 2 = explante totalmente clorótico; Oxidación: 0 = explante sin oxidación, 1
= explante con oxidación en los bordes y 2 = explante totalmente oxidado.
Fecha Experimento Desinfección Contaminación Tratamiento Repetición Explante Fúngica Bacterial Total Clorosis Oxidación
1 1 2
1 2 1 2 3 1 2 1 1 2
2 2 1 2 3 1 2 1 1 2
3 2 1 2 3 1 2 1 1 2
4 2 1 2 3 1 2 1 1 2
5 2 1 2 3 1
2
Anexo 6. Análisis de varianza para los datos de contaminación del primer
experimento de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa
(DMS), Duncan y Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 7.6296 0.7662
Error 18 0.2174 0.2174
Total 26 58.0740
F R2 CV
3.51 * 0.1313 77.0817
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 0.9259 T1 A 0.9259 T1 A 0.9259 T1
A 0.9259 T4 A 0.9259 T4 A 0.9259 T4
A 0.9259 T5 A 0.9259 T5 A 0.9259 T5
A 0.9259 T9 A 0.9259 T9 A 0.9259 T9
B 0.4444 T2 B 0.4444 T2 B 0.4444 T2
B 0.4444 T3 B 0.4444 T3 B 0.4444 T3
B 0.4444 T6 B 0.4444 T6 B 0.4444 T6
B 0.4444 T7 B 0.4444 T7 B 0.4444 T7
B 0.4444 T8 B 0.4444 T8 B 0.4444 T8
�
Anexo 7. Análisis de varianza para los datos de contaminación del segundo
experimento de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa
(DMS), Duncan y Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 10.5843 1.0584
Error 18 50.0411 0.2156
Total 26 60.6255
F R2 CV
4.91 ** 0.1745 97.2899
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 1.0000 T10 A 1.0000 T10 A 1.0000 T10
A 1.0000 T11 A 1.0000 T11 A 1.0000 T11
A 1.0000 T14 A 1.0000 T14 A 1.0000 T14
A 1.0000 T16 A 1.0000 T16 A 1.0000 T16
A 1.0000 T17 A 1.0000 T17 A 1.0000 T17
A 1.0000 T18 A 1.0000 T18 A 1.0000 T18
B 0.4444 T12 B 0.4444 T12 B 0.4444 T12
B 0.4815 T13 B 0.4815 T13 B 0.4815 T13
C 0.1111 T15 C 0.1111 T15 C 0.1111 T15
�
Anexo 8. Análisis de varianza para los datos de contaminación del tercer experimento
de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 5 13.8148 1.9735
Error 12 6.9259 0.0692
Total 17 20.7407
F R2 CV
28.50 ** 0.6660 101.5090
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 0.9444 T21 A 0.9444 T21 A 0.9444 T21
B 0.4444 T17 B 0.4444 T17 B 0.4444 T17
C 0.1666 T20 C 0.1666 T20 C 0.1666 T20
C 0.0000 T18 C 0.0000 T18 C 0.0000 T18
C 0.0000 T16 C 0.0000 T16 C 0.0000 T16
C 0.0000 T19 C 0.0000 T19 C 0.0000 T19
Anexo 9. Análisis de varianza para los datos de clorosis del primer experimento de
desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 6.2386 0.6238
Error 18 48.5349 0.2092
Total 26 54.7736
F R2 CV
2.98 * 0.1138 51.6953
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 1.0000 T9 A 1.0000 T9 A 1.0000 T9
A 1.0000 T8 A 1.0000 T8 A 1.0000 T8
A 1.0000 T7 A 1.0000 T7 A 1.0000 T7
A 1.0000 T6 A 1.0000 T6 A 1.0000 T6
A 1.0000 T5 A 1.0000 T5 A 1.0000 T5
B 0.8148 T4 B 0.8148 T4 B 0.8148 T4
B 0.7037 T3 B 0.7037 T3 B 0.7037 T3
B 0.7037 T1 B 0.7037 T1 B 0.7037 T1
B 0.6667 T2 B 0.6667 T2 B 0.6667 T2 �
�
�
Anexo 10. Análisis de varianza para los datos de clorosis del segundo experimento de
desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 2.0246 0.2024
Error 18 74.4638 0.3210
Total 26 76.5185
F R2 CV
0.63 ns 0.0264 120.7863
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 1.000 T11 A 1.000 T11 A 1.000 T11
A 1.000 T10 A 1.000 T10 A 1.000 T10
A 1.000 T18 A 1.000 T18 A 1.000 T18
A 1.000 T15 A 1.000 T15 A 1.000 T15
A 1.000 T12 A 1.000 T12 A 1.000 T12
A 1.000 T17 A 1.000 T17 A 1.000 T17
A 1.000 T13 A 1.000 T13 A 1.000 T13
A 1.000 T16 A 1.000 T16 A 1.000 T16
A 1.000 T14 A 1.000 T14 A 1.000 T14 �
�
�
Anexo 11. Análisis de varianza para los datos de clorosis del tercer experimento de
desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.��
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 5 21.8333 3.1190
Error 12 11.8333 0.1183
Total 17 33.6666
F R2 CV
26.36 ** 0.6485 123.8386
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 0.6667 T23 A 0.6667 T23 A 0.6667 T23
B 0.1666 T19 B 0.1666 T19 B 0.1666 T19
C 0.0000 T20 C 0.0000 T20 C 0.0000 T20
C 0.0000 T21 C 0.0000 T21 C 0.0000 T21
C 0.0000 T22 C 0.0000 T22 C 0.0000 T22
C 0.0000 T24 C 0.0000 T24 C 0.0000 T24
Anexo 12. Análisis de varianza para los datos de oxidación del primer experimento
de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 7.5226 0.7522
Error 18 127.2752 0.5486
Total 26 134.7983
F R2 CV
1.37 ns 0.0558 71.9637
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 1.0000 T9 A 1.0000 T9 A 1.0000 T9
A 1.0000 T7 A 1.0000 T7 A 1.0000 T7
A 1.0000 T6 A 1.0000 T6 A 1.0000 T6
A 1.0000 T5 A 1.0000 T5 A 1.0000 T5
A 1.0000 T4 A 1.0000 T4 A 1.0000 T4
A 1.0000 T3 A 1.0000 T3 A 1.0000 T3
A 1.0000 T2 A 1.0000 T2 A 1.0000 T2
A 1.0000 T1 A 1.0000 T1 A 1.0000 T1
A 0.8889 T8 A 0.8889 T8 A 0.8889 T8
Anexo 13. Análisis de varianza para los datos de oxidación del segundo experimento
de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 8 17.1275 1.7127
Error 18 158.7572 0.6842
Total 26 175.8847
F R2 CV
2.50 * 0.0973 147.8053
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 1.0000 T14 A 1.0000 T14 A 1.0000 T14
A 0.8889 T13 A 0.8889 T13 A 0.8889 T13
A 0.7407 T17 A 0.7407 T17 A 0.7407 T17
B 0.5444 T11 B 0.5444 T11 B 0.5444 T11
B 0.4444 T12 B 0.4444 T12 B 0.4444 T12
B 0.4444 T15 B 0.4444 T15 B 0.4444 T15
B 0.4444 T18 B 0.4444 T18 B 0.4444 T18
B 0.2963 T10 B 0.2963 T10 B 0.2963 T10
C 0.1852 T16 C 0.1852 T16 C 0.1852 T16 �
Anexo 14. Análisis de varianza para los datos de oxidación del tercer experimento de
desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa (DMS), Duncan y
Turkey.
Fuente de variación
GL
SC
CM
Tratamiento 5 27.0370 3.8624
Error 12 21.2592 0.2125
Total 17 48.2962
F R2 CV
18.17 ** 0.5598 56.5868
DMS Prueba de Duncan Prueba de Tukey Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T Agrupamiento Media T
A 0.6667 T20 A 0.6667 T20 A 0.6667 T20
A 0.6667 T21 A 0.6667 T21 A 0.6667 T21
A 0.6667 T24 A 0.6667 T24 A 0.6667 T24
B 0.4444 T19 B 0.4444 T19 B 0.4444 T19
B 0.2963 T23 B 0.2963 T23 B 0.2963 T23
C 0.0000 T22 C 0.0000 T22 C 0.0000 T22